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1. (WO2018062859) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE PETITS ARN OU DE PROTÉINES ASSOCIÉES À DE PETITS ARN
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2  

배경기술

3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

14   15   16  

과제 해결 수단

17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109  

발명의 효과

110   111   112  

도면의 간단한 설명

113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123  

발명의 실시를 위한 최선의 형태

124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140   141   142   143   144   145   146   147   148   149   150  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

도면

1 (R91)   2 (R91)   3 (R91)   4 (R91)   5 (R91)   6 (R91)   7 (R91)   8 (R91)   9 (R91)   10 (R91)  

명세서

발명의 명칭 : 소형 RNA 또는 소형 RNA와 연관된 단백질을 탐지하는 방법

기술분야

[1]
본 발명은 소형 RNA 또는 소형 RNA와 연관된 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 X-Y-Z의 구조를 가지며, 탐지하고자 하는 소형 RNA(small RNA)의 전체 또는 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 단일핵산을 사용하여 소형 RNA 또는 소형 RNA와 연관된 단백질을 탐지하는 방법에 관한 것이다.
[2]

배경기술

[3]
마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 세포에 존재하는 소형 RNA(small RNA) 중 하나로, 세포의 발생과 분화 및 세포 예정사와 같은 생물학적 과정에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 세포에서 특정 miRNA의 발현 정도의 차이는 암을 포함한 다양한 질병과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 특정 마이크로 RNA(miRNA)를 탐지하는 것은 근래에 과학연구 분야에서 중요한 부분으로 부각되고 있다. 구체적으로, 특정 miRNA나 이와 연관된 단백질을 탐지하고 동정함으로써 유전적, 생물학적 마커로 활용되어 사람의 건강상태를 나타내는 지표로 활용이 가능하다. 상기 탐지와 동정을 통하여 간단하게 말초혈액, 호르몬, 척수액을 활용한 키트와 체외에서( in vitro) 이용할 수 있는 진단키트의 개발이 가능하게 되었다. 이러한 키트는 치매질환(알츠하이머, 파킨슨 등)과 당뇨, 암 등의 검사에 적용할 수 있다. 그러나, miRNA는 약 22개의 뉴클레오타이드(nucleotide)로 매우 짧기 때문에 검출 및 탐지가 어려워 유효한 바이오 마커로의 사용에 제한점을 가지고 있다.
[4]
일반적으로 miRNA의 검출은 핵산 증폭방법에 기반으로 하고 있으며, 이런 방법의 예로는 PCR(polymerase chain reaction), NASBA(nucleic acid sequence based amplification) 등이 있다. 이러한 핵산 증폭반응을 이용한 종래의 검출방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게는 공지된 것이라 할 것이다. 이런 검출방법은 보통 핵산 증폭 후에 증폭된 핵산을 검출할 수 있는 전기영동 또는 프로브 또는 블로팅 기술의 이용과 같은 노동집약적인 처리과정이 필요하다.
[5]
가장 널리 공지된 miRNA 검출을 위한 실시간 탐지는 RT-PCR, qRCR 등을 통해 이루어진다. 이러한 방법들은 표적 물질과 혼성화되지 않은 경우 형광이 소멸되는 이차 구조를 형성하는 형광 혼성화 프로브(florescent hybridization probe), 혼성화 이후 Taq polymerase에 의해 절단되어 형광이 증가하는 hydrolysis probe, dsDNA-binding agents 등에 기초한다. 각 측정시점에서 각각의 증폭산물에 프로브(probe)가 혼성화되면서 펼쳐지거나, 절단되어 형광광도가 증가한다. 이 경우, 1개의 프로브에 대하여 1개의 증폭자 비율로 증폭자가 검출된다. 주어진 사이클에서 하나의 증폭자는 프로브의 혼성화 또는 절단에 의해 검출되는 하나의 프로브(예, molecular beacon, Taqman probe, MGB probe 등)를 나타낸다. 또한, 실시간 검출 방법 중에 분자비콘(molecular beacon)을 이용하여 증폭과 동시에 NASBA 산물을 검출하는 방법도 알려져 있다.
[6]
이러한 miRNA를 검출하는 구체적인 예로는 도 1과 같이 TaqMan probe와 Stem-loop primer를 이용하는 방법과 poly-A Tailing을 이용하여 oligo-dT Adapter primer를 이용하는 방법이 널리 사용되어지고 있다.
[7]
그러나 상기 서술한 기술은 몇몇의 단점이 있다.
[8]
첫째, 상기 기술들은 miRNA의 분석을 위한 프로브(probe)와 프라이머(primer)가 표적 miRNA에 위치하지 못하여 추가적인 올리고의 신장을 요구한다. 도 1의 경우 표기 되어 있는 Stem-loop primer, oligo-dT Adapter primer 등이 신장된 올리고이다. 이때 결정적인 문제점은 증폭되는 miRNA 표적에 전적으로 의존하는 형광의 증가가 아니라 신장된 올리고의 증폭에 따른 형광의 증가를 측정하게 되고, 이는 비특이적인 증폭 및 결합에 의해 부정확한 결과를 초래한다.
[9]
둘째, 프라이머(primer)와 프로브(probe)간에 일정한 이격 거리를 필요로 한다. 예로서 taq-man probe와 MGB probe의 경우 5' 말단에 공여체 발색단이 표지되며, DNA 폴리머라아제(DNA polymerase)가 프라이머(primer)를 신장시키는 과정에서 프로브와 마주치게 되면 폴리머라아제(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성이 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 프로브(probe)를 분해하게 된다. 이때 프라이머(primer)와 프로브(probe)의 간격은 최소 7~10개의 뉴클레오티드(nucleotide)인 상황에서 클리베이지(cleavage)가 가능하다. 또한 프라이머(primer)와 3'말단의 소광체 사이의 간격은 최소 2~4개의 뉴클레오티드(nucleotide)를 요구한다. 이러한 제한적 사항은 짧은 RNA 또는 DNA의 분석에 제한적 요소로 작용된다.
[10]
셋째, NASBA를 이용한 방법은 프로브(probe)가 공여자의 형광광도를 소진시키는 이차 구조를 형성해야 하므로, 비콘(beacon)의 융해온도가 정교하게 조절되어야 한다. 이러한 조절은 NASBA나 RCA와 같이 일정한 온도에서 반응시키는 경우에는 적용하기 곤란하다. 또한 상기 비콘(beacon)은 표적과 결합하지 않을 때에는 헤어핀 구조를 유지하고, 표적과 결합하는 반응온도에서는 펼쳐지도록 고안해야만 한다. 이것은 프로브의 고안을 매우 어렵게 하며, 또한 반응온도에서 비콘(beacon)이 펴질 때 프로브가 종종 배경 형광을 방출하기 때문에 노이즈에 대한 신호와 관련된 문제를 유발한다.
[11]
넷째, miRNA와 같은 소형 RNA의 이소폼(isoform)의 구별이 어렵다. miRNA의 경우 짧은 길이로 인하여 1~3개 만이 다른 다수의 이소폼(isoform)들이 존재한다. 일예로 let-7, miR-18, miR-30 등과 같은 miRNA는 유사한 이소폼(isoform)들의 구분이 난해한 것으로 알려져 있다.
[12]
이에 본 발명자들은 상기와 같은 단점을 극복하는 동시에 miRNA, siRNA와 같은 소형 RNA(small RNA)를 신속하고 정확하게 탐지하는 방법을 개발하고자 연구하던 중, 한국 특허출원 제10-2016-0017359호를 우선권 기초로 하여 한국 특허출원 제10-2017-0020238호에 기술한 단일핵산으로 핵산 또는 단백질을 정확하고 빠르게 실시간 검출할 수 있는 단일핵산을 소형 RNA(small RNA) 또는 소형 RNA(small RNA)의 cDNA와 혼성화시킨 후 핵산 내부를 절단시약으로 절단시켜 분리된 형광 단편의 양을 측정함으로써 극소량의 시료로부터 소형 RNA(small RNA)을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
[13]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[14]
본 발명의 하나의 목적은 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법을 제공하는데 있다.
[15]
본 발명의 다른 하나의 목적은 실시간 증폭 반응과 연계하여 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 탐지하는 방법을 제공하는데 있다.
[16]

과제 해결 수단

[17]
하나의 양태로서, 본 발명은 소형 RNA(small RNA) 또는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질의 실시간 검출을 위해 프라이머 및 프로브로 사용되는 단일핵산을 제공한다.
[18]
상기 단일핵산은 한국 특허출원 제10-2016-0017359호를 우선권 기초로 하여 한국 특허출원 제10-2017-0020238호에 기술된 단일핵산으로부터 유래된 것으로, 본 발명에 있어서 상기 한국 특허출원들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
[19]
구체적으로, 본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다. 이때 부착되는 탐지 가능한 마커의 위치는 특정 부위에 국한하지 않으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 탐지 가능한 마커가 분리되는 위치라면 어느 곳이든 가능하다.
[20]
또한, 상기 단일핵산은 실시간 검출을 목적으로 하는 표적 소형 RNA(small RNA) 또는 표적 소형 RNA(small RNA)와 연관된 표적 단백질의 특정 부위에 결합하여 복합체를 형성하고, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시, Y 및 Z는 표적 소형 RNA(small RNA) 또는 표적 소형 RNA(small RNA)와 연관된 표적 단백질의 특정 부위로부터 분리되지만 X 부위는 분리되지 않고 복합체를 유지하며 증폭을 위한 프라이머로 사용되는 것을 특징으로 한다.
[21]
상기 단일핵산은 본 발명에서 "프로머(promer)"라고 명명하였으며, 이하에서는 별도의 언급이 없는 한 단일핵산은 프로머(promer)로서 프라이머(primer)와 프로브(probe)로 동시에 사용가능한 단일핵산을 의미한다.
[22]
본 발명의 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 각각의 X, Y, 및 Z는 다양한 개수의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가질 수 있다.
[23]
하나의 예로, 상기 X는 1 내지 60개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 2 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 4 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 6 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 7 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 8 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. X가 60개를 초과한 염기서열을 포함하는 경우 핵산 또는 단백질의 실시간 검출시 비특이적 반응이 발생할 수도 있다.
[24]
하나의 예로, 상기 Y는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 9개, 보다 바람직하게는 1 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 3개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. 또한, 상기 Y는 Z가 0개의 염기로 구성될 때 최소 3개 이상, 바람직하게는 3 내지 10개, 보다 바람직하게는 3 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 4개의 염기 서열로 구성된다. 또한, 상기 Y는 Z가 1개의 염기로 구성될 때 최소 2개 이상, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 9개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 8개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 7개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 6개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 4개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 3개의 염기 서열로 구성된다. Y를 구성하는 염기 서열이 상기 범위를 벗어난 경우에는 핵산 또는 단백질의 실시간 검출시 비특이적 반응이 발생하여 민감도가 감소할 수도 있다.
[25]
하나의 예로, 상기 Z는 0 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이다. Z를 구성하는 염기 서열이 상기 범위를 벗어난 경우에는 Y가 절단(cleavage)된 후 표적 핵산 또는 단백질에 결합된 Z가 표적 핵산 또는 표적 단백질로부터 이탈이 되지 않고 그대로 결합되어 있어서 핵산 또는 단백질의 검출을 할 수 없는 문제가 있다.
[26]
이때, 상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA이다. 바람직하게는 상기 X, Y 및 Z는 순서대로 DNA, RNA 및 DNA 또는 RNA, DNA 및 RNA이다.
[27]
하나의 구체적 예로, X가 DNA일 때 Y 또는 Z 중 어느 하나는 RNA, 예를 들면 Y는 RNA이고 Z는 DNA이거나, Y는 DNA이고 Z는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 0개 이상일 수 있으며, 상기 X, Y, 및 Z에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
[28]
다른 하나의 구체적 예로, X가 RNA일 때 Y 또는 Z 중 어느 하나는 RNA, 예를 들면 Y는 RNA이고 Z는 DNA이거나, Y는 DNA이고 Z는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 0개 이상일 수 있으며, 상기 X, Y, 및 Z에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
[29]
또 다른 하나의 구체적 예로, Z가 0일 때 X 또는 Y 중 어느 하나는 DNA이고 다른 하나는 RNA이다. 여기서 상기 DNA와 RNA는 1개 이상으로 상기 X 및 Y에서 정의하고 있는 개수의 DNA와 RNA를 가진다.
[30]
또한, 상기 X, Y 및 Z는 비특이적인 절단을 막기 위해 전체적으로 메틸화되어 있거나 부분적으로 메틸화되도록 합성된 것일 수 있다.
[31]
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 시료로부터 실시간 검출하고자 하는 DNA 또는 RNA를 의미한다.
[32]
본 발명에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
[33]
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[34]
본 발명에서 탐지 가능한 마커로 형광쌍을 사용하는 경우, 형광물질과 소광물질의 위치는 X 또는 Z에 위치한 형태이거나 Y 부위에 위치할 수 있으며, 그 어느 것에 한정되는 것은 아니다. 하나의 예로서, 형광물질은 X에 위치하고 소광물질은 Y 또는 Z에 위치할 수 있다.
[35]
본 발명의 단일핵산은 소형 RNA(small RNA) 또는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 검출하는데 있어서, i) 소형 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 RT 프라이머; ii) 소형 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머; iii) 소형 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 역방향 프라이머; iv 소형 RNA으로부터 합성된 cDNA를 증폭하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머; 또는 v) 검출하고자 하는 소형 RNA 또는 이와 연관된 단백질을 실시간으로 확인하기 위한 프로브로 사용될 수 있다.
[36]
이러한 일련의 구체적인 양태에서, 본 발명의 단일핵산은 단일핵산의 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단된 후 Y 및 Z 부위는 분리되고 X 부위는 표적 소형 RNA 또는 이와 연관된 표적 단백질과 복합체를 유지하여 프라이머로 사용되어 소형 RNA를 합성 및 증폭할 수 있으며, 단일핵산의 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부분만이 절단되므로 종래 DNA 중합효소에 의해 분해되는 프로브에 비해 검출하고자 하는 소형 RNA(small RNA) 또는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 보다 정확하게 탐지할 수 있다.
[37]
특히, 본 발명의 단일핵산에서 Y 또는 Z의 3` 말단에 형광물질 또는 소광물질이 결합되어 있는 경우 단일핵산의 Y 부위가 절단되지 않는 한 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 핵산이 중합효소에 의해 증폭되는 것을 차단할 수 있으므로 비특이적인 증폭에 의한 오류를 줄일 수 있다.
[38]
따라서, 본 발명의 단일핵산을 소형 RNA 또는 이와 연관된 단백질을 검출하는데 사용하는 경우, 종래 기술에 비해, 추가적인 별도의 과정(예로, RT 프라이머의 루프 형태 제작, 폴리 A의 형성 등), 그리고 분석시간과 비용을 절감시킬 수 있으며, 종래 방법에 비해 검출하고자 하는 소형 RNA 또는 이와 연관된 단백질을 보다 정확하게 특이적으로 탐지할 수 있으므로, 본 발명의 단일핵산은 소형 RNA 또는 이와 연관된 단백질을 실시간으로 검출하기 위한 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
[39]
본 발명의 단일핵산을 소형 RNA 또는 이와 연관된 단백질을 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 이외에 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소를 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
[40]
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2등을 사용하는 것이 바람직하다.
[41]
본 발명의 단일핵산을 핵산 또는 단백질을 검출하기 위한 키트로 사용하는 경우, 상기 키트는 본 발명의 단일핵산 및 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소 이외에 DNA의 증폭반응에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.
[42]
상기 증폭반응에 필요한 시약은 예를 들어, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg 2+),완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH 2O)을 들 수 있다. 또한, 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 있다
[43]
[44]
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법을 제공한다.
[45]
본 발명에 따른 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
[46]
a) 생물학적 시료로부터 주형 핵산을 수득하는 단계이다.
[47]
본 발명에 있어서, 상기 주형 핵산은 생물학적 시료로부터 탐지하고자 하는 소형 RNA(small RNA)를 포함하는 RNA를 말한다. 상기 소형 RNA(small RNA)는 생체의 생명현상을 유지해야 하거나 조절이 필요한 상황에서 이를 위한 단백질을 만들기 위해 또는 단백질 생성을 조절하기 위해 발현하는 것이다.
[48]
상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻은 각종 유형의 시료, 구체적으로 고체 조직 시료, 액체 조직 시료, 생물학적 액체, 기관지 흡입액, 세포 및 세포 단편을 이용할 수 있다. 생물학적 시료의 구체적인 예로는 수술과정에서 개체로부터 제거한 고체 조직 시료, 병리학적 표본, 보존된 시료 또는 생검 표본, 조직 배양액 또는 이들로부터 유래된 세포 및 이들의 자손으로부터 제조된 절편 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[49]
상기 보존된 생물학적 시료는 당업계에 통상적으로 알려진 보관방법으로 1주일 이상, 1년 이상, 예를 들면 1년 내지 10년 동안 보관되거나, 냉동 보관, 또는 포르말린으로 고정된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
[50]
본 발명에 있어서, 시료로부터 RNA의 추출은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 하나의 예로, 트리졸(trizol) 또는 트리톤 X-100 등을 이용하여 이루어질 수 있다.
[51]
[52]
b) 소형 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계이다.
[53]
구체적으로, 본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계에서 추출한 소형 RNA에 별도의 RT 프라이머를 혼합하여 cDNA를 합성하는 단계이다.
[54]
본 발명에 있어서, 상기 RT 프라이머는 검출하고자 하는 RNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 핵산이다. 이때, RT 프라이머는 당업계에 일반적으로 공지된 RT 프라이머 또는 본 발명의 단일핵산일 수 있다.
[55]
본 발명에 있어서, RT 프라이머로 본 발명의 단일핵산을 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 검출하고자 하는 소형 RNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.
[56]
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 합성은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 이루어질 수 있으며, 하나의 예로, 시료로부터 수득된 소형 RNA를 주형으로 역전사 효소와 DNA 중합효소에 의해 이루어질 수 있다. 또한 상기에 언급한 RT 프라이머는 polyA tail 이후에 추가적인 핵산으로 신장된 oligo dT primer 또는 roof 형태의 RT primer일 수 있다.
[57]
[58]
c) cDNA를 증폭하는 단계이다.
[59]
구체적으로, 본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA에 본 발명의 단일핵산 또는 이를 포함하는 키트, 및/또는 상기 cDNA와 상보적인 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머를 혼합하여 신장반응을 통해 cDNA를 증폭시키는 단계이다.
[60]
상기 단일핵산을 포함하는 키트는 본 발명의 단일핵산과 상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소로 이루어진 것을 말한다.
[61]
상기 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소는 단일핵산의 Y 부위를 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 예를 들어 Y 부위가 DNA인 경우 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소 등을 사용하는 것이 바람직하며, Y 부위가 RNA인 경우 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T 2 등을 사용하는 것이 바람직하다.
[62]
본 발명에 있어서, 상기 단일핵산은 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것으로, cDNA를 증폭하기 위한 i) 정방향 프라이머 및 프로브, ii) 역방향 프라이머 및 프로브, 또는 iii) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있으며, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 Y 및 Z는 분리되고 X는 분리되지 않고 프라이머로 작동한다. 이러한 단일핵산의 구조는 상술한 바와 같다.
[63]
상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍을 사용할 수 있다.
[64]
상기 형광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 Cy3, Cy5, Cy5.5, Bodipy, Alexa 488, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568, Alexa 594, Alexa 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, Fluor X, ROX, Texas Red, ORNAge green 488X, ORNAge green 514X, HEX, TET, JOE, Oyster 556, Oyster 645, Bodipy 630/650, Bodipy 650/665, Calfluor ORNAge 546, Calfluor red 610, Quasar 670 및 비오틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한 상기 소광물질은 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 DDQ-1, Dabcyl, Eclipase, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, lowa Black RQ-Sp, QSY-7, QSY-2 및 MGBNFQ로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[65]
하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산은 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 구성된 것을 특징으로 한다.
[66]
다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 단일핵산 이외에 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머가 사용될 수 있다. 이때, 상기 별도의 역방향 프라이머 또는 정방향 프라이머는 상기 b) 단계에서 합성된 cDNA와 상보적 결합이 가능하며, 5 내지 30개, 바람직하게는 10 내지 30개의 염기서열로 구성된 DNA이다. 여기서, 상기 역방향 프라이머는 상기 b) 단계의 RT 프라이머와 동일한 것일 수 있다.
[67]
또 다른 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 단일핵산을 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용하는 경우, 상기 역방향 프라이머로 사용되는 단일핵산은 상기 b) 단계의 단일핵산과 동일한 것일 수 있으며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 부착된 탐지 가능한 마커는 상기 b) 단계의 단일핵산과 동일하거나 서로 다른 것일 수 있다.
[68]
본 발명에 있어서, cDNA의 증폭은 A) 정방향 프라이머 및 프로브, 또는 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산과 당업계에서 일반적으로 사용되는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머에 의해 어닐링되거나, B) 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 본 발명의 단일핵산에 의해 어닐링되며, 사용되는 효소의 활성을 실질적으로 억제하지 않는 등온온도에서 수행되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 등온이란 열 순환(thermal cycling)이 없다는 것을 의미하는 것으로, 반드시 물리적으로 동일한 온도를 의미하는 것은 아니다.
[69]
하나의 구체적 예로, 본 발명에서 증폭반응이 수행되는 등온온도는 40 내지 80℃, 바람직하게는 55 내지 75℃, 보다 바람직하게는 60 내지 75℃일 수 있다.
[70]
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 핵산가득 전치 증폭(stRNAd displacement amplification) 및 핵산서열기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 방법으로 이루어질 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
[71]
본 발명에 있어서, 상기 cDNA의 증폭반응은 본 발명의 단일핵산을 포함하는 키트 이외에 증폭이 필요한 시약, 예컨대, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg 2+), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH 2O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 추가로 사용하여 이루어질 수 있다.
[72]
[73]
d) 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계이다.
[74]
본 발명에 있어서, 단일핵산 단편의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
[75]
상기 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 real-time PCR machine, 트라이애드 멀티모드 디렉터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer) LightCycler96, Applied Biosystems 7500, 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 않는다.
[76]
본 발명에 따라 절단된 단일핵산 단편의 양 측정과 검출방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 가능한 마커의 종류에 따라 달라질 수 있다.
[77]
예를 들어, X 말단에 형광 공여체가 부착되고 Z 말단에 퀀쳐가 부착된 단일핵산(promer)이 표적 소형 RNA 또는 cDNA와 혼성화를 이루고 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 Y 및 Z 부위가 분리되기 전에는 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 의해 크게 감소된 상태를 유지한다. 그러나, Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 X 부위는 분리되지 않고 Y 및 Z 부위만이 표적 소형 RNA 또는 cDNA으로부터 분리되어 반응용액으로 분산되면 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광이 Z 말단에 부착된 퀀쳐에 영향을 받지 않고 증가하게 된다. 이때 X 말단에 부착된 형광 공여체의 형광 방출의 증가를 상술한 기기를 이용하여 표적 소형 RNA 또는 cDNA을 실시간으로 검출할 수 있다.
[78]
하나의 구체적 예로서, 소형 RNA(small RNA)와 상보적인 결합을 나타내는 RT 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성한 후, 본 발명에 따라 cDNA와 상보적인 결합을 나타내며, FAM이 부착된 단일핵산을 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머로 사용하여 cDNA를 증폭한 결과, 종래 탐지 가능한 마커가 부착되지 않은 정방향 프라이머를 사용하여 증폭된 cDNA와 달리 cDNA가 증폭하는 과정 중에 증폭 곡선이 나타났음을 확인하였다.
[79]
본 발명에 따른 소형 RNA(small RNA)의 탐지방법은 Taqman 프로브, MGB 프로브 또는 Sybr Green과 같은 Intercalator type의 dsDNA-binding agents 등을 사용하는 종래 방법과는 달리 X-Y-Z의 구조를 갖는 핵산을 프로브와 프라이머로 동시에 사용하므로, 탐지하고자 하는 소형 RNA(small RNA)를 정확하게 증폭하는 것이 가능하다. 또한, 주형 핵산을 증폭하는 동시에 DNA 중합효소에 의해 분해된 프로브의 양을 측정하는 종래 기술에 비해 극소량의 시료로부터 소형 RNA(small RNA)을 정확하게 탐지할 수 있는 장점이 있다.
[80]
하나의 구체적 실시로서, 본 발명에 따른 소형 RNA(small RNA)의 탐지방법을 이용하여 인체 유래 miRNA를 분석한 결과, miRNA의 농도가 1/10000배로 희석된 경우에서도 정확한 분석이 가능하였다(실시예 1 및 2 참조).
[81]
다른 하나의 구체적 실시로서, 본 발명에 따른 소형 RNA(small RNA)의 탐지방법을 이용하여 실시간 let-7 miRNA를 분석한 결과, let-7 miRNA가 극소량 존재하는 경우, 예로 1aM 농도에서도 안정적으로 빠르게 정확한 let-7 miRNA 분석이 가능하였다(실시예 3 및 4 참조).
[82]
[83]
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 핵산을 이용하여 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법을 제공한다.
[84]
구체적으로, 본 발명은 a) X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; b) 생물학적 시료로부터 수득한 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질과 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계; c) 상기 복합체에 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산을 혼성화시켜 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계; 및 d) 상기 단백질-항체-단일핵산 복합체에 절단시약을 처리하여 단일핵산의 단편을 항체로부터 분리시킨 다음, 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하여 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 검출하는 단계;를 포함하는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법을 제공한다.
[85]
[86]
본 발명에 따른 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
[87]
a) X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계이다.
[88]
본 발명에 있어서, 상기 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산의 구조, 특징 등은 상술한 바와 같으므로 이하에서는 생략한다.
[89]
본 발명에 있어서, 상기 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산은 X-Y-Z의 구조를 갖는 핵산의 염기서열을 주형으로 하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 증폭반응을 통해 합성된 것이다.
[90]
본 발명에 있어서, 상기 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체는 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산이 항체의 Fc 영역에 연결고리(linker)로 연결되어 이루어진 구조를 가진다. 상기 연결고리는 통상적으로 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA이다.
[91]
상기 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 서열을 가지는 핵산과 항체를 연결시키는 방법은 통상적으로 2가지 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 방법은, 숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; SMMCC), 술포숙시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로핵산-1-카르복실레이트(Sulfo Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethl)Cyclohexane-1-Carboxylate; Sulfo-SMCC), n-숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(n-Succinimidyl-3-(2-Pyridylthio)Propionate; SPDP), N-숙시니미딜-6-(3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도)헥사노에이트(N-Succinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionamido)hexanoate; NHS-Ic-SPDP), 또는 술포숙시니미딜-3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(SulfoSuccinimidyl-6-(3'-(2-pyridyldithio)-propionaamido)hexanoate; Sulfo-NHS-Ic-SPDP) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 시약을 사용하여 5'-말단이 티올(thiol)로 변형된 DNA를 항체의 유리 아미노 그룹들에 연결시키는 것이다. 상기 시약들은 그들 간격을 띄우는 그룹(spacer)의 길이와 물에 대한 용해도 정도가 다르다. 만약 필요하다면, 추가적인 조작을 위하여 DNA를 방출시키는 티올화(thiolation) 시약으로 연결 부위를 절단할 수 있다.
[92]
두 번째 방법은, 사량체(tetrameric) 단백질인 스트렙아비딘(strepavidin)에 의해서 항체-DNA 사이의 연결 부위를 제공함에 의해서, 상기 단백질은 비오틴(biotin)과 충분히 비가역적인 결합을 형성하는 것이다. 항체의 유리 아미노 그룹들은 비오틴-n-하이드록시숙시니미드(biotin-nhydroxysuccinimide)와 반응하여 비오틴으로 표지된다. DNA의 비오틴화는 5'-비오틴 포스포아마다이트(5'-biotin phoshporamidite)의 사용 또는 5'-말단의 아미노기 표지 뒤에, 비오틴-n-하이드록시숙시니미드와 반응시켜 이루어질 수 있다. DNA, 스트랩아비딘 및 항체의 결합(conjugate)은 1 몰당량의 항체를 DNA-스트랩아비딘 결합체에 첨가하여 제조될 수 있다.
[93]
상기한 방법에 따라 핵산이 결합된 항체는 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 항체-핵산 결합체를 슈퍼덱스(Superdex) 200 겔 컬럼으로 정제함으로써 항체-핵산 결합체를 수득할 수 있다.
[94]
본 발명에 따라 제조된 항체는 검출하고자 하는 특정 단백질만을 특이적으로 인식함과 동시에 본 발명의 단일핵산과 혼성화될 수 있으므로 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 검출하는데 용이하게 사용될 수 있다.
[95]
[96]
b) 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질과 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계이다.
[97]
본 발명에 있어서, 상기 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질은 항체, 리간드, 천연화합물, 추출물, 합성 펩타이드 및 신약 후보물질 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[98]
본 발명에 있어서, 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질과 항체의 결합은 표적 단백질과 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 혼합하여 이루어질 수 있다.
[99]
[100]
c) 단백질-항체 복합체에 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산을 혼성화시켜 단백질-항체-단일핵산 복합체를 형성시키는 단계이다.
[101]
본 발명에 있어서, 단백질-항체 복합체와 단일핵산의 혼성화는 단백질-항체 복합체에 단일핵산을 첨가하여 이루어질 수 있다.
[102]
[103]
d) 단백질-항체-단일핵산 복합체에 절단시약을 처리하여 단일핵산 단편을 항체로부터 분리시킨 다음, 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하여 표적 단백질 분자를 검출하는 단계이다.
[104]
본 발명에 있어서, 상기 절단시약은 효소를 매개로 하며, 상기 단일핵산의 Y 부위만을 특이적으로 절단할 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 예를 들어 디옥시리보핵산 가수분해효소(deoxyribonuclease, DNase), 리보핵산가수분해효소(ribonuclease, RNase), 헬리카제(helicase), 엑소뉴클리아제, 및 엔도 뉴클리아제 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나, 바람직하게는 리보핵산가수분해효소(ribonuclease, RNase)를 사용할 수 있다.
[105]
본 발명에 있어서, 단일핵산의 양 측정은 다양한 검출방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따라 분리된 단일핵산의 단편은 실시간 또는 반응이 종료된 후에 측정되는 것이 바람직하며, 형광광도의 변화 또는 화학발광의 측정으로 이루어질 수 있다.
[106]
상기 형광광도의 변화 또는 화학발관의 측정은 당업계에 공지된 형광 표지자 검출이 가능한 모든 측정 장치를 이용할 수 있으며, 예를 들어 트라이애드 멀티모드 디렉터(TRIAD Multimode Detector), 활락/빅터 형광(Wallac/Victor fluorescence) 또는 퍼킨-엘머 LB50B 형광분광광도계(Perkin-Elmer LB50B luminescence spectrometer) 등을 이용하여 이루어질 수 있으며, 이에 한정하지 아니한다.
[107]
상기와 같은 분리된 단일핵산의 양 측정과 탐지방법은 단일핵산 또는 반응액 내로 유입된 표지 또는 탐지 마커의 형태에 따라 달라질 수 있다.
[108]
본 발명에 따른 표적 단백질을 탐지하는 방법은 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산 과 상보적인 서열을 가지는 핵산이 결합된 항체와 X-Y-Z의 구조를 갖는 핵산을 사용함으로써 검출하고자 하는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 탐지하는 속도와 정확도를 향상시킬 수 있는 이점이 있다.
[109]

발명의 효과

[110]
기존의 소형 RNA(small RNA)를 분석하기 위해서는 임의로 신장된 oligo를 이용하여 cDNA를 합성하고 신장된 oligo에 의존하여 탐지가 이루어졌다. 그러나 본 발명에 따른 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산은 임의로 연장된 올리고 시퀀스(oligo sequence)에 의존하지 않고 순수하게 소형 RNA(small RNA)의 서열에서 증폭 및 탐지가 가능하다. 이는 임의로 연장된 서열에 의존하여 탐지하는 방법에 의한 잘못된 증폭 및 탐지를 방지할 수 있다. 또한, 상기 단일핵산은 절단시약에 의해서만 절단되므로 종래 DNA 중합효소에 의해 분해되는 프로브에 비해 탐지하고자 하는 단일핵산의 양을 보다 정확하게 측정할 수 있는 이점이 있다.
[111]
따라서, 본 발명의 X-Y-Z의 구조를 갖는 핵산을 사용하여 소형 RNA(small RNA) 또는 상기 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 탐지하는 방법은 소형 RNA(small RNA) 또는 상기 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 신속하고 정확하게 탐지할 수 있으므로, 다양한 질병의 진단 및 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
[112]

도면의 간단한 설명

[113]
도 1은 종래 소형 RNA를 검출하기 위하여 사용하는 방법 중 TaqMan probe와 Stem-loop primer를 이용하는 방법과 poly-A Tailing을 이용하여 oligo-dT Adapter primer를 이용하는 방법을 나타낸 모식도이다.
[114]
도 2는 miRNA를 poly-(A) tailing 후에 신장된 oligo dT primer를 이용하여 cDNA를 합성하고 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 소형 RNA(samll RNA)를 탐지하는 방법을 나타낸 모식도이다.
[115]
도 3은 miRNA를 poly-(A) tailing을 하지 않고 RT primer를 이용하여 cDNA를 합성한 후에 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 miRNA를 탐지하는 방법을 나타낸 모식도이다.
[116]
도 4는 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 miRNA-21의 유전자 발현 여부를 관찰한 그래프이다.
[117]
도 5는 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 miRNA-155의 유전자 발현 여부를 관찰한 그래프이다.
[118]
도 6은 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 miRNA-21의 cDNA를 다양한 농도별로 희석한 후 발현 여부를 관찰한 그림이다.
[119]
도 7은 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 miRNA-155의 cDNA를 다양한 농도별로 희석한 후 발현 여부를 관찰한 그림이다.
[120]
도 8은 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 let-7a miRNA의 유전자 발현 여부를 관찰한 그림이다.
[121]
도 9는 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 let-7d miRNA의 유전자 발현 여부를 관찰한 그림이다.
[122]
도 10은 본 발명에 따른 단일핵산(promer)을 이용하여 let-7d 1pM 존재하에 let-7a miRNA의 cDNA를 다양한 농도별로 희석한 후 발현 여부를 관찰한 그림이다.
[123]

발명의 실시를 위한 최선의 형태

[124]
이하, 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[125]
[126]
실시예 1: 본 발명에 따른 프을 이용한 실시간 인체 유래 miRNA 분석
[127]
miRNA-21(5' - uag cuu auc aga cug aug uug a), miRNA-155(5' - uua aug cua auc gug aua ggg gu)의 유전자 발현 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 단일핵산(promer)과 프라이머(primer), RT-primer를 하기 표 1에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다(표 1 참조). 여기서 본 발명에 따른 단일핵산(promer)의 경우 5' 말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 3' 말단에는 3IABkFG를 부착하였으며, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
[128]
[표1]
miRNA-21 단일핵산 5'-CCCTGTAGCTTATCAGACTGATrGTT 서열번호 1
miRNA-21 R primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT 서열번호 2
miRNA-21 RT primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTGT(TTT)nTCA 서열번호 3
miRNA-155 단일핵산 5'-GGCTGTTAATGCTAATCGTGATCrGGG 서열번호 4
miRNA-155 R primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT 서열번호 5
miRNA-155 RT primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGTTGTGT(TTT)nACC 서열번호 6

[129]
[130]
제놀루션(Genolution Co., Ltd.)의 Exosomal miRNA purification Kit를 이용하여 정상인 혈액의 혈청 200㎕에서 11.9ng/㎕ 농도의 miRNA를 추출하였다. 추출한 miRNA 1㎕, 0.1㎕, 및 0.01㎕ 각각을 Ambion사의 poly-(A) tailing kit와 Roche사의 Nxtscript RT kit (Total 20㎕)를 이용하여 45℃에서 상기 표 1의 각각의 RT primer 10μM 농도의 1㎕ 존재하에 30분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
[131]
상기 표 1의 단일핵산 및 프라이머 각각이 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에서, 상기 합성한 각각의 cDNA 1㎕, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63 ~ 64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45cycle을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
[132]
그 결과, total miRNA 119pg만을 사용하여 합성한 cDNA의 1/20만을 사용한 5.95pg의 극소량의 total miRNA만으로 안정적인 분석이 가능한 것을 확인하였다.
[133]
[134]
실시예 2: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 인체 유래 miRNA 분석
[135]
상기 실시예 1의 11.9ng/㎕ 농도의 miRNA 1㎕로부터 합성된 cDNA를 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000배로 희석하였다.
[136]
상기 표 1의 단일핵산 및 프라이머 각각이 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에, 상기 희석한 각각의 cDNA 1㎕, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63 ~ 64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 55cycle을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
[137]
그 결과, 1/1000까지 희석한 cDNA까지 증폭곡선을 그렸으며 그 이후의 희석된 cDNA에서는 증폭곡선이 나타나지 않았다. 이는 극소량의 타켓(target)까지 비특이적인 증폭이 없음을 확인하였으며, 이를 통해 극소량의 miRNA만을 사용하여 10copy 미만의 특정 miRNA의 분석이 가능함을 확인하였다.
[138]
[139]
실시예 3: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 분석
[140]
let-7 miRNA는 miRNA중에서 가장 많은 isoform이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이러한 let-7의 isoform을 구별하는 것은 상당히 어려운 분석으로 알려져 있으며 통상 1% 미만의 특이도의 구별은 특히 어려운 것으로 알려져 있다. 본 실시예에서는 그 중에서도 가장 어려운 let-7a(5' - uga ggu agu agg uug uau agu u)와 let-7d(5' - aga ggu agu agg uug cau agu u)의 유전자 발현 여부를 측정하기 위하여, 본 발명에 따른 단일핵산과 프라이머(primer), RT-primer를 하기 표 2에서와 같이 IDT(Integrated DNA Technologies, USA)에 의뢰하여 제조하였다(표 2 참조). 또한 정확한 정량을 위하여 상기 let-7의 miRNA를 IDT에 의뢰하여 제조하였다. 여기서 단일 핵산의 경우 5' 말단에는 FAM(fluorescein succinimidyl ester)을, 3' 말단에는 3IABkFG를 부착하였으며, 리보뉴클레오티드(RNA)는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)와의 구별을 위하여 서열 앞에 첨자 "r"로 표시하였다.
[141]
[표2]
let-7a 단일핵산 5'-GCTGCTTGAGGTAGTAGGTTGrUAT 서열번호 7
let-7a R primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT 서열번호 8
let-7a RT primer 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT 서열번호 9
let-7d 단일핵산 5'-GCTGCTAGAGGTAGTAGGTTGrCAT 서열번호 10
let-7d R primer 5'-GCCGCTGAGGTAGTAGGT 서열번호 11
let-7d RT primer 5'-GCTAACGTCTGTACTTCGTCA(TTT)nAACT 서열번호 12

[142]
[143]
합성한 각각의 20pM 농도의 miRNA 1㎕와 Ambion의 poly-(A) tailing kit와 Roche의 Nxtscript RT kit (Total 20㎕)를 이용하여 45℃에서 상기 표 2의 각각의 RT primer 10μM 농도의 1㎕ 존재하에 30분간 반응하여 cDNA를 합성하였다.
[144]
합성한 cDNA를 100fM에서 1aM농도까지 희석하였다.
[145]
상기 표 2의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에서, 상기 합성한 후 희석한 각각의 cDNA 2㎕, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63 ~ 64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45cycle을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
[146]
그 결과, miRNA 1aM농도의 희석한 cDNA 2㎕(약 1copy)만을 사용하여 각각의 miRNA 분석이 가능한 것을 확인하였다.
[147]
[148]
실시예 4: 본 발명에 따른 단일핵산을 이용한 실시간 let-7 miRNA 특이도 검출
[149]
상기 표 2의 단일핵산 및 프라이머가 각각 10μM 농도의 0.5㎕ 존재하에, 상기 실시예 3에서 제작한 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩을 첨가하고, 10m unit의 내열성 RNase H, AptaTaq DNA Master(Roche 제조) 4㎕를 넣고 3차 증류수로 총 부피(total volume)가 20㎕로 되도록 조정한 후 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction; PCR)을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 95℃에서 5분, 63 ~ 64℃에서 60초, 95℃에서 10초였으며 45cycle을 수행하였다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
[150]
그 결과, 1pM 농도의 let-7d cDNA 2㎕ 에 1/10씩 100fM에서 1aM 농도까지 희석한 let-7a cDNA 2㎕씩 첨가한 실험군에서 100fM에서 1fM 농도까지는 안정적으로 분석이 가능하나 100aM에서 그래프가 무너지는 것을 확인하였다. 이는 isoform의 miRNA를 0.1%까지 특이도를 유지하면서 분석이 가능함을 확인하였다.

청구범위

[청구항 1]
a) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 소형 RNA(small RNA)를 포함하는 RNA를 수득하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 수득한 RNA로부터 탐지하고자 하는 소형 RNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열이 포함된 X-Y-Z 구조의 단일핵산을 이용하여 cDNA를 합성하는 단계; c) 상기 b) 단계의 cDNA를 증폭하는 단계; d) 상기 b) 단계의 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하거나, 또는 a-1) 생물학적 시료로부터 검출하고자 하는 소형 RNA(small RNA)를 포함하는 RNA를 수득하는 단계; b-1) 상기 a-1) 단계에서 수득한 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; c-1) 상기 b-1) 단계의 cDNA에 상기 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열을 포함하며 (i) 정방향 프라이머 및 프로브, (ii) 역방향 프라이머 및 프로브, 또는 (iii) 정방향 프라이머와 역방향 프라이머와 프로브로 사용 가능한 단일핵산을 혼합하여 상기 cDNA를 증폭하는 단계; d-1) 상기 c-1) 단계의 단일핵산의 Y 부위를 절단할 수 있는 효소에 의해 절단된 단일핵산 단편의 양을 측정하는 단계;를 포함하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법으로, 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있고, 실시간 검출을 목적으로 하는 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위에 결합하여 복합체를 형성하고, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 X 부위는 표적 핵산 또는 표적 단백질과 복합체를 유지하면서 프라이머로 작용하며, Y 및 Z는 상기 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위로부터 분리되는 것을 특징으로 하며, 상기 X, Y, 및 Z는 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며, 상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA인 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 X는 1 내지 60개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA; 상기 Y는 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA; 및 상기 Z는 0 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며, 상기 Z가 0일 때 Y는 3 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며, 상기 Z가 1일 때 Y는 2 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA로 구성된 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 탐지 가능한 마커는 단일핵산에 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 결합하는 형광물질, 또는 형광물질과 소광물질로 이루어진 형광쌍인 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 단일핵산(promer)의 X, Y 및 Z는 비특이적인 절단을 막기 위해 전체적으로 메틸화되어 있거나 부분적으로 메틸화되도록 합성된 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 단일핵산(promer)의 X는 10 내지30개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이고, Y는 1 내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이고, 상기 Z는 2내지 10개의 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 6]
제1항에 있어서, 상기 효소는 Y 부위가 DNA일 때 DNA 뉴클라아제(DNA nuclease, DNase), 구체적으로 DNase Ⅰ, DNase Ⅱ, S1 핵산 가수분해효소, 핵산가수분해효소 P1, AP 핵산내부가수분해효소, 또는 UvrABSC 핵산가수분해효소를 사용하며, X 부위가 RNA일 때 RNA 가수분해효소(ribonuclease, RNase), 구체적으로 RNase Ⅱ, RNase Ⅲ, RNase Ⅳ, RNaseH, 또는 RNase T2를 사용하는 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 c) 단계 또는 c-1) 단계는 상기 b) 단계 또는 b-1) 단계에서 합성된 cDNA와 결합한 단일핵산이 단일핵산의 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단되어 Y 및 Z 부위가 분리되고 X 부위가 프라이머로 작동하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 8]
제1항에 있어서, 상기 c-1) 단계는 (i) 단일핵산이 정방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 경우 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머가 추가로 포함되고, (ii) 단일핵산이 역방향 프라이머 및 프로브로 사용되는 경우 cDNA의 일부 염기서열과 상보적 결합이 가능한 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)를 탐지하는 방법.
[청구항 9]
a) X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산과 상보적인 염기서열을 가지는 핵산이 부착되어 있는 항체를 제조하는 단계; b) 생물학적 시료로부터 수득한 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질과 상기 a) 단계에서 제조한 항체를 결합시켜 단백질-항체 복합체를 형성시키는 단계; c) 상기 복합체에 X-Y-Z의 구조를 갖는 단일핵산을 혼성화시켜 단백질-항체-프로브 복합체를 형성시키는 단계; 및 d) 상기 단백질-항체-단일핵산 복합체에 절단시약을 처리하여 단일핵산의 단편을 항체로부터 분리시킨 다음, 분리된 단일핵산 단편의 양을 측정하여 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질을 검출하는 단계;를 포함하는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법으로, 상기 단일핵산은 X-Y-Z의 구조를 가지며, 단일핵산의 양 말단 또는 내부에 하나 또는 그 이상의 탐지 가능한 마커가 부착되어 있고, 실시간 검출을 목적으로 하는 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위에 결합하여 복합체를 형성하고, 특정 효소에 의해 Y 부위 절단 시 X 부위는 표적 핵산 또는 표적 단백질과 복합체를 유지하면서 프라이머로 작용하며, Y 및 Z는 상기 표적 핵산 또는 표적 단백질의 특정 부위로부터 분리되는 것을 특징으로 하며, 상기 X, Y, 및 Z는 염기서열로 구성된 DNA 또는 RNA이며, 상기 X, Y, 및 Z 중 어느 하나가 DNA일 때 다른 두 개 중의 하나 이상은 RNA인 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법.
[청구항 10]
제9항에 있어서, 상기 d) 단계는 상기 a) 단계에서 제조한 항체와 결합한 단일핵산이 Y 부위를 절단하는 효소에 의해 단일핵산의 Y 부위가 절단되어 Y 및 Z 부위가 분리되고 X 부위가 프라이머로 작동하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 소형 RNA(small RNA)와 연관된 단백질 분자를 탐지하는 방법.

도면

[도1]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도2]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도3]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도4]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도5]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도6]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도7]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도8]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도9]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017] 

[도10]   [규칙 제91조에 의한 정정03.11.2017]