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1. (WO2017144653) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE NUCLÉOTIDES SIMPLES
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N° de publication : WO/2017/144653 N° de la demande internationale : PCT/EP2017/054306
Date de publication : 31.08.2017 Date de dépôt international : 24.02.2017
CIB :
C12Q 1/68 (2006.01)
C CHIMIE; MÉTALLURGIE
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BIOCHIMIE; BIÈRE; SPIRITUEUX; VIN; VINAIGRE; MICROBIOLOGIE; ENZYMOLOGIE; TECHNIQUES DE MUTATION OU DE GÉNÉTIQUE
Q
PROCÉDÉS DE MESURE, DE RECHERCHE OU D'ANALYSE FAISANT INTERVENIR DES ENZYMES OU DES MICRO-ORGANISMES; COMPOSITIONS OU PAPIERS RÉACTIFS À CET EFFET; PROCÉDÉS POUR PRÉPARER CES COMPOSITIONS; PROCÉDÉS DE COMMANDE SENSIBLES AUX CONDITIONS DU MILIEU DANS LES PROCÉDÉS MICROBIOLOGIQUES OU ENZYMOLOGIQUES
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Procédés de mesure, de recherche ou d'analyse faisant intervenir des enzymes ou des micro-organismes; Compositions à cet effet; Procédés pour préparer ces compositions
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faisant intervenir des acides nucléiques
Déposants :
BASE4 INNOVATION LIMITED [GB/GB]; Broers Building JJ Thomson Avenue Cambridge, Cambridgeshire CB3 0FA, GB
Inventeurs :
BALMFORTH, Barnaby; GB
Mandataire :
BRISCOE, Paul Brian; GB
Données relatives à la priorité :
16157229.224.02.2016EP
Titre (EN) SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD
(FR) PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE NUCLÉOTIDES SIMPLES
Abrégé :
(EN) A method of sequencing a nucleic acid characterised by the steps of (1) generating a stream of single nucleotides by progressive pyrophosphorolysis of the nucleic acid; (2) producing at least one substantially double-stranded oligonucleotide used probe by reacting, in the presence of a polymerase and a ligase, one of the single nucleotides with a corresponding probe system comprising (a) a first single-stranded oligonucleotide labelled with first and second regions of characteristic detectable element types in an undetectable state located respectively on the X' and Y' end sides of a third region comprising a restriction enzyme recognition site element including the capture site and an exonuclease-blocking site on the X' side thereof (wherein either X' is 3' and Y' is 5' or X' is 5' and Y' is 3') and (b) second and third single-stranded oligonucleotides capable of hybridising to complementary regions on the first oligonucleotide flanking the capture site; (2a) either (i) treating the used probe with a conventional or nicking substitution-dependent restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site if and only if the single nucleotide captured comprises a nucleobase which is substituted or (ii) treating the used probe with a conventional or nicking substitution-sensitive restriction endonuclease to cut the first oligonucleotide strand at the recognition site if and only if the single nucleotide captured comprises a nucleobase which is unsubstituted; (3) digesting the first oligonucleotide strand of the used probe with an enzyme having double-stranded exonucleolytic activity in the X'-Y' direction corresponding to the first oligonucleotide to yield detectable elements derived from either the first region, the second region, or the first and second regions in a detectable state and a single-stranded fourth oligonucleotide which is at least in part the sequence complement of the first oligonucleotide; (4) reacting the fourth oligonucleotide with another first oligonucleotide to produce a substantially double-stranded oligonucleotide product corresponding to the used probe; (5) repeating steps (2a), (3) and (4) in a cycle and (6) detecting the detectable elements released in each iteration of step (3) wherein if the endonuclease employed is of the conventional type the second or third oligonucleotide includes an endonucleolysis directing linkage at or close to its X' or Y' end respectively. Corresponding biological probe systems are also disclosed.
(FR) L'invention concerne un procédé de séquençage d'un acide nucléique, caractérisé par les étapes consistant à (1) générer un flux de nucléotides simples par pyrophosphorolyse progressive de l'acide nucléique ; (2) produire au moins une sonde utilisée oligonucléotidique substantiellement à double brin par réaction, en présence d'une polymérase et d'une ligase, d'un des nucléotides simples avec un système de sonde correspondant comprenant (a) un premier oligonucléotide monobrin marqué par une première et une deuxième région de types d'éléments détectables caractéristiques dans un état indétectable, situées respectivement sur les côtés d'extrémité X' et Y' d'une troisième région comprenant un élément de site de reconnaissance par une enzyme de restriction, comprenant le site de capture et un site de blocage d'une exonucléase sur le côté X' correspondant (où, soit X' représente 3' et Y' représente 5', soit X' représente 5' et Y' représente 3') et (b) un deuxième et un troisième oligonucléotide monobrin pouvant s'hybrider à des régions complémentaires sur le premier oligonucléotide flanquant le site de capture ; (2a) soit (i) traiter la sonde utilisée par une endonucléase de restriction classique ou de coupure dépendant de la substitution pour couper le premier brin oligonucléotidique au site de reconnaissance si et seulement si le nucléotide simple capturé comprend une nucléobase qui est substituée, soit (ii) traiter la sonde utilisée par une endonucléase de restriction classique ou de coupure dépendant de la substitution pour couper le premier brin oligonucléotidique au site de reconnaissance si et seulement si le nucléotide simple capturé comprend une nucléobase qui est non substituée ; (3) digérer le premier brin oligonucléotidique de la sonde utilisée avec une enzyme présentant une activité exonucléolytique double brin dans la direction X'-Y' correspondant au premier oligonucléotide pour obtenir des éléments détectables dérivés, soit de la première région, soit de la deuxième région, soit de la première et de la deuxième région, dans un état détectable et un quatrième oligonucléotide monobrin qui est au moins en partie le complément de séquence du premier oligonucléotide ; (4) faire réagir le quatrième oligonucléotide avec un autre premier oligonucléotide pour produire un produit oligonucléotidique substantiellement double brin correspondant à la sonde utilisée ; (5) répéter les étapes (2a), (3) et (4) dans un cycle et (6) détecter les éléments détectables libérés dans chaque itération de l'étape (3), où, si l'endonucléase utilisée est de type classique, le deuxième ou le troisième oligonucléotide comprend une liaison dirigeant l'endonucléolyse au niveau ou à proximité respectivement de son extrémité X' ou Y'. Des systèmes de sonde biologique correspondants sont également divulgués.
États désignés : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DJ, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KH, KN, KP, KR, KW, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Office eurasien des brevets (OEAB) (AM, AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM)
Office européen des brevets (OEB (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG)
Langue de publication : anglais (EN)
Langue de dépôt : anglais (EN)