Certains contenus de cette application ne sont pas disponibles pour le moment.
Si cette situation persiste, veuillez nous contacter àObservations et contact
1. (WO2017003125) COMPOSITION CONTENANT DE LA TRIIODIDETHYRONINE, DE LA TYROXINE, OU LEUR SEL, POUR PRÉVENIR, SOULAGER, OU TRAITER DES MALADIES DES NERFS CRÂNIENS
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1  (R91)   2   3  

배경기술

4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

18   19   20   21  

과제 해결 수단

22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46  

발명의 효과

47   48   49  

도면의 간단한 설명

50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66  

발명의 실시를 위한 형태

67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7  

도면

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17  

명세서

발명의 명칭 : 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 염을 포함하는 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

기술분야

[1]
[규칙 제91조에 의한 정정 24.10.2016] 
[2]
본 특허출원은 2015년 6월 29일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2015-0092547호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
[3]
본 발명은 트리요오드티로닌(T 3), 티록신(T 4) 또는 이의 염을 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

배경기술

[4]
파킨슨병은 안정떨림, 경직, 운동완만 및 자세 불안정이 특징적으로 나타나는 뇌신경계의 만성 진행성 퇴행성 질환으로, 뇌의 흑질에 분포하는 도파민 신경세포가 점차 소실되는 신경병리학적 특징을 나타낸다. 파킨슨병 환자는 대략 60세 이상에서 인구의 약 1% 정도로 추정되고 있다.
[5]
파킨슨병 치료를 위한 약물로서, 도파민 수용체 촉진제와 엘-도파(l-dopa) 제제가 사용되고 있다. 그러나 도파민 수용체 촉진제는 치료 효율이 낮으며, 엘-도파 제제는 장기간 동안의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리고 손이나 발이 저절로 움직이는 이상운동이 생기는 등의 부작용이 발생하는 문제가 있다. 약물 치료 외에 고주파를 이용한 신경자극술인 고주파 파괴술과 심부 뇌자극술 등의 수술 치료도 행해지고 있으나, 침습적인 수술을 필요로 하고 또한 많은 비용이 소요되는 문제가 있다. 또한, 줄기세포치료를 적용하려는 시도가 있으나, 매우 초기 단계로서 효과가 검증되지 않았으며, 시술이 어려운 문제가 있다. 이에 따라, 파킨슨병 치료를 위한 보다 효과적인 약물 개발이 요구되고 있다.
[6]
Nurr1(NR4A2)은 스테로이드 수용체 타입 전사 인자로서, 중뇌에서 발현되며 중뇌 도파민 뉴런 발생에 결정적인 인자이다. Nurr1은 발생하는 중뇌 뿐 아니라, 성체의 중뇌 도파민 뉴런에서도 발현되는데, 이 전사인자의 지속적 발현은 도파민 반응성(dopaminergic) 표현형의 유지[3] 및 생존[4][5]에 결정적이라고 보고되었다. 또한 성체 중뇌 도파민 병리 상태에서 Nurr1의 농도 감소나 유전적 변형이 관찰되었다[6][7].
[7]
Nurr1-녹아웃 마우스의 중뇌에서 도파민 뉴런이 발생되지 않는 것으로 보고되었고, 노년층이나 파킨슨병 대뇌 부검에서 Nurr1의 발현이 감소되어 있음이 알려져 있다. 이는 중뇌 도파민 뉴런 발생에 있어서 Nurr1이 특이적이고 필수적인 역할을 담당하고 있음을 의미하며, 이에 따라 Nurr1의 발현을 조절하는 물질을 파킨슨병의 치료제로서 개발할 수 있다.
[8]
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
[9]
(선행기술문헌)
[10]
(비특허문헌)
[11]
(비특허문헌 0001) Zetterstrom, R.H. et al., Science 276, 248-250, 1997
[12]
(비특허문헌 0002) Saucedo-Cardenas, O. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95, 4013-4018, 1998
[13]
(비특허문헌 0003) Eells, J.B., et al., Behav . Brain Res. 136, 267-275, 2002
[14]
(비특허문헌 0004) Wallen, A. et al., Exp . Cell Res. 253, 737-746, 1999
[15]
(비특허문헌 0005) Sousa, K.M. et al., Stem cells 25, 511-519, 2007
[16]
(비특허문헌 0006) Jankovic, J. et al., Prog . Neurobiol. 77, 128-138, 2005
[17]
(비특허문헌 0007) Chu, Y. et al., J. Comp. Neurol. 494, 495-514, 2006

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[18]
본 발명자들은 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환 치료용 약물을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 갑상샘 질환 치료제로 사용 중인 트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 티록신(thyroxine)이 도파민 뉴런의 발현 및 증식을 촉진함으로써 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환에 대한 치료 효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
[19]
따라서 본 발명의 목적은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
[20]
본 발명의 다른 목적은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 데 있다.
[21]
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

과제 해결 수단

[22]
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
[23]
본 발명자들은 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환 치료용 약물을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 갑상샘 질환 치료제로 사용 중인 트리요오드티로닌, 티록신이 도파민 뉴런의 발현 및 증식을 촉진함으로써 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환에 대한 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
[24]
본 명세서에서 사용된 용어, “예방”은 본 발명의 조성물의 투여로 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환을 억제시키거나 진행을 지연시키는 것을 의미하며, 용어 “개선” 및 “치료”는 조성물 투여에 의해 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것을 의미한다.
[25]
본 명세서에서 사용된 용어, “도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환”은 중추신경계에서의 도파민 부족 또는 도파민 수준의 감소로 인하여 야기되거나, 증상이 악화되는 질환을 의미한다. 도파민 부족과 도파민 수준 감소의 대표적인 원인은 도파민 뉴런의 소실이다.
[26]
본 명세서에서 사용된 용어, “도파민 뉴런” 또는 “도파민 신경세포”는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH)를 발현하는 신경세포를 의미한다.
[27]
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경인지기능 장애, 주의력결핍 과잉행동 장애, 하지불안증후군 및 불안증을 포함한다.
[28]
하나의 특정예에서, 상기 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환은 파킨슨병이다. 파킨슨병은 도파민 수준의 감소로 인하여 발병되는 대표적인 뇌신경계 질환으로서, 안정떨림, 경직, 운동완만(운동느림) 및 자세 불안정성이 특징적으로 나타나는 질환이다. 또한, 파킨슨병은 자율신경계증상, 신경정신과적 증상, 인지기능장애, 수면장애, 통증, 피로, 후각장애, 위장관 장애, 침흘림, 삼킴곤란, 변비, 기립저혈압, 다한증, 배뇨장애 및 안구건조증 등의 임상적 증상을 나타낸다. 본 발명의 조성물은 도파민 뉴런의 발현 및 증식을 촉진하는바, 위와 같은 다양한 임상적 증상을 갖는 파킨슨병의 치료에 적용될 수 있다.
[29]
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 트리요오드티로닌, 티록신은 중추신경계의 도파민 수준을 증가시킨다.
[30]
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 트리요오드티로닌, 티록신은 도파민 뉴런의 증식 또는 신경전구세포의 도파민 뉴런으로의 분화를 촉진한다.
[31]
본 발명의 약제학적 조성물은 트리요오드티로닌, 티록신의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
[32]
본 명세서에서 사용된 용어, "약제학적으로 허용 가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적 염은, 본 발명의 화합물을, 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 숙신산, 프탈산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 트리요오드티로닌 또는 티록신을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜 제조할 수 있다.
[33]
또한 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 염은 트리요오드티로닌 또는 티록신을 염기와 반응시켜, 암모니움 염, 나트륨 또는 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘염 등의 알칼리 토금속염 등의 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민 등의 유기염기들의 염, 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산 염을 형성함으로써 얻어질 수도 있다.
[34]
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 염은 하기 화학식 1의 트리요오드티로닌 나트륨염과 화학식 2의 티록신 나트륨염이다.
[35]
[화학식1]


[36]
[화학식2]


[37]
본 발명의 범위에는 상기 트리요오드티로닌, 티록신 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 수화물 및 입체이성질체 등도 포함된다. 또한, 도파민 뉴런의 발현 또는 증식 촉진 효과를 보유하는 한 트리요오드티로닌과 티록신의 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.
[38]
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
[39]
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다.
[40]
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
[41]
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
[42]
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 염을 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
[43]
본 발명의 건강기능식품 조성물에는 상술한 약제학적 조성물의 성분이 포함되기 때문에, 이들 간에 공통된 내용은 명세서의 과도한 복잡성을 방지하기 위하여 그 기재를 생략한다.
[44]
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분으로서 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 염뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
[45]
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
[46]
식품에 대한 용이한 접근성을 고려한다면, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 및 개선에 매우 유용하다.

발명의 효과

[47]
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
[48]
본 발명은 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 염을 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[49]
본 발명에 따르면, 트리요오드티로닌, 티록신 또는 이의 염은 도파민 뉴런의 발현 및 증식을 현저하게 증진시킴으로써 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 및 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다.

도면의 간단한 설명

[50]
도 1은 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 우태아혈청(FBS)을 농도별로 처리한 경우, 농도 의존적으로 도파민 신경세포의 표지인 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)의 발현이 증가하였음을 보여준다.
[51]
도 2는 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 0.01% FBS를 처리한 경우, 분화 날짜가 경과될수록 TH의 발현 증가가 대조군에 비하여 월등하게 증가하였음을 보여준다.
[52]
도 3은 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 0.01% FBS를 처리한 경우, 분화 날짜에 따라 TH와 Nurr1의 mRNA 및 단백질이 증가하였음을 보여준다.
[53]
도 4는 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, FBS 성분에 포함된 후보물질 18개(표 1)를 혼합하여 처리한 경우, 0.1% 혼합물(chemical mixture)에서 0.01% FBS를 처리한 경우와 유사하게 TH의 발현이 증가하였음을 보여준다.
[54]
도 5는 표 1의 혼합물 중에서 가장 유효한 효과를 나타내는 성분을 발굴하기 위하여, 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 18개의 후보물질을 각각 하나씩 처리한 후, TH 프로모터 활성을 측정한 결과를 보여준다.
[55]
도 6은 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 18개의 후보물질을 각각 하나씩 처리하면서 분화시켰을 때 TH의 발현을 보여준다.
[56]
도 7은 그 중 효과가 있다고 판단된 후보물질 4번, 5번, 16번을 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 18개의 후보물질에서 하나씩 혹은 여러 조합으로 제거하여 처리한 후 TH 프로모터 활성을 확인한 결과를 보여준다.
[57]
도 8은 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 후보물질 4번, 5번, 16번을 18개의 후보물질에서 하나씩 혹은 여러 조합으로 제거하여 처리하면서 분화시켰을 때 TH의 발현의 변화를 보여준다.
[58]
도 9는 래트 신경줄기세포에서 Nurr1 유전자를 발현시키고, 트리요오드티로닌 (T 3)을 농도별로 처리한 경우, 농도 의존적으로 TH의 발현이 크게 증가하고, 6 pg/㎖ 이상의 T 3 처리 시에는 0.01% FBS나 0.1% 혼합물(chemical mixture)을 처리한 경우보다 더 효과적이었음을 보여준다.
[59]
도 10은 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, T 3를 농도별로 처리한 경우, TH 프로모터 활성이 농도 의존적으로 증가하였음을 보여준다.
[60]
도 11은 래트 태아 중뇌 신경전구세포를 분화시키며 T 3와 티록신 (T 4)을 각각 처리한 경우, 인위적으로 래트 태아의 대뇌 피질 신경전구세포에 Nurr1을 발현시킨 경우와 마찬가지로, 중뇌 도파민 신경세포에서 발생하는 TH의 발현이 T 3와 T 4 투여 시에 농도 의존적으로 증가하였음을 보여준다.
[61]
도 12는 사람 신경줄기세포주에 Nurr1 유전자를 발현시키고 T 3와 T 4를 각각 처리한 경우, TH의 발현과 TH 프로모터 활성이 증가하였음을 보여준다.
[62]
도 13은 Nurr1이 자체적으로 발현되고 있는 사람 신경줄기세포주에 T 3와 T 4를 각각 처리한 경우 역시 TH 프로모터 활성이 증가하였음을 보여준다.
[63]
도 14는 사람 배아줄기세포주를 신경전구세포로 직접 분화시킨 세포에 T 3와 T 4를 각각 처리한 경우 TH 발현이 증가하였음을 보여준다.
[64]
도 15는 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 6-hydroxydopamine (6-OHDA)과 활성산소 (H 2O 2)와 같은 신경독성물질을 처리하여 도파민 신경세포 손상을 유발신킨 후에 T 3와 T 4를 각각 처리한 결과 TH 발현이 회복되었음을 보여준다.
[65]
도 16은 래트 태아 중뇌 신경전구세포에 6-OHDA를 처리하여 도파민 신경세포 손상을 유발시킨 후에 T 3와 T 4를 각각 처리한 결과 TH 발현이 회복되었음을 보여준다.
[66]
도 17은 사람 배아줄기세포주를 신경전구세포로 직접 분화시킨 세포에 6-OHDA를 처리하여 도파민 신경세포 손상을 유발시킨 후에 T 3와 T 4를 각각 처리한 결과 TH 발현이 회복되었음을 보여준다.

발명의 실시를 위한 형태

[67]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[68]
실시예
[69]
실시예 1 : 래트 태아 도파민 신경세포의 발현 및 분화 증진에 미치는 FBS의 효과 확인
[70]
본 발명에서 사용한 레트로바이러스는 하기와 같이 제조하였다. 레트로바이러스 제조에 사용한 292GPG 세포는 DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamine, 1 % penicillin-streptomycin에 1 ㎍/㎖ doxycycline, 2 ㎍/㎖ puromycin, 0.3 mg/㎖ G418을 넣은 배지로 유지하였다. 형질전환하기 하루 전날 6well plate에 1.8x10 6/well개의 293GPG 세포를 깔았다. 293GPG 세포는 DMEM 배지 (Invitrogen)에 10 %의 FBS (Invitrogen), 2 mM L-glutamine (Sigma)이 첨가되어있는 배지를 넣고 5 % CO 2, 37 ℃ incubate 조건 하에서 다음 날까지 배양하였다. 2개의 튜브를 준비한 뒤 하나에는 Opti-MEM (Gibco) 250 ㎕에 레트로바이러스 벡터 플라스미드 4 ㎍을 넣고 나머지 하나에는 Opti-MEM 250 ㎕에 Lipofectamine2000™ (Invitrogen) 10 ㎕을 넣고 vortex한 뒤 상온에서 5분 두었다. 5분 후 2개의 튜브를 천천히 pipet을 이용하여 섞어주었다. 20분간 실온에서 반응시킨 뒤 전날 깔아둔 293GPG 세포의 배지를 제거하고 Opti-MEM 배지를 이용하여 1회 세척한 뒤 이 시약을 293GPG 세포에 첨가하였다. 이를 5 % CO 2, 37 ℃ 배양조건에서 4시간 배양한 후 배지를 제거하고 DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamine, 1 % penicillin-streptomycin 배지 1.2 ㎖로 교환하였다. 다음 날 DMEM, 10 % FBS, 2 mM L-Glutamine, 1 % penicillin-streptomycin 배지 1.2 ㎖로 교환하고 24시간 간격으로 293GPG 세포가 사멸할 때까지 바이러스 상층액을 얻어서 polybrene (hexadimethrine bromide: Sigma H9268)을 2 ㎍/㎖이 되도록 첨가하고 70 ℃에 보관하였다가 레트로바이러스 형질 도입 전에 녹여 사용하였다.
[71]
래트 태아(태령 14.5일)로부터 대뇌 피질 신경줄기세포를 분리한 후, bFGF 존재 하에서 Nurr1 유전자를 발현하는 레트로 바이러스로 감염시켰다. bFGF를 제거하여 신경줄기세포의 분화를 유도하였으며, 이때부터 FBS(fetal bovine serum)를 농도별로 처리하였다.
[72]
이후, 도파민 신경세포의 표지인자인 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase, TH)에 반응하는 항체(Sigma-Aldrich 또는 Pel-Freez)를 이용하여 면역형광염색법을 실시한 결과, FBS 0.001%부터 TH의 발현이 증가하기 시작하였으며, 0.1%까지 농도 의존적으로 증가하였다(도 1). 면역형광염샙법은 하기와 같이 실시하였다.
[73]
배양한 세포를 4 % 파라포름알데하이드로 20분간 고정하였다. 그 후 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 0.1 % BSA/PBS 용액과 10 % normal goat serum, 0.03 % Triton X-100 (Sigma)을 혼합하여 1차 항체 반응 전 blocking을 1시간 실시하였다. 1차 항체를 0.1 % BSA/PBS 용액과 10 % normal goat serum의 혼합액에 희석하여 첨가한 뒤 4 ℃에서 다음 날까지 incubation하였다. TH (1;2000, Sigma), HA (1;1000, Covance), Nurr1 (1;500, Santa Cruz) 1차 항체는 다음 날 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하였다. Biotin-conjugated 2차 항체를 0.1 % BSA/PBS 용액에 희석하여 첨가한 뒤 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하였다. 형광이 달린 (DTAF, 1;1000 or Rhodamine, 1;400) 2차 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)는 0.1 % BSA/PBS 용액에 희석하여 1시간동안 암실에서 반응한 뒤 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하고 3차 D.W로 1회 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 슬라이드에 VECTASHIELD with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) mounting 용액을 떨어뜨린 후 세포가 붙어있는 coverslip을 붙였다.
[74]
0.01% FBS를 처리하며 도파민 신경세포의 분화 날짜별로 TH 면역형광염색을 실시한 결과, 분화 날짜가 경과될수록 TH의 발현 증가가 대조군에 비하여 월등하였다(도 2). 도파민 신경세포 발현과 관련된 mRNA 및 단백질의 발현을 확인한 결과, 분화 날짜에 따라 TH와 Nurr1 mRNA의 증가가 관찰되었으며, 웨스턴 블랏으로 TH와 Nurr1 단백질이 증가함을 관찰하였다(도 3).
[75]
mRNA 측정은 하기와 같이 실시하였다. cDNA를 합성하기 위해서 배양한 세포를 떼어내어 Trizol (TRI Reagent, Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 역전사 반응은 Superscript kit (Invitrogen)을 이용하여 총 20 ㎕로 반응시켜 수행하였다. SuperscriptⅡ 1 ㎕, 5x Superscript 용액 4 ㎕, 10 mM dNTP mixture 1 ㎕, random primer 1 ㎕, RNase inhibitor 0.5 ㎕, 0.1 mM DTT 2 ㎕, RNA (5 ㎍)를 0.5 ㎖ 튜브에 넣고 15분 동안 25 ℃, 45분 동안 42 ℃, 15분 동안 70 ℃, 15분 동안 4 ℃에서 반응하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로 quantitative RT-PCR을 실시하였다. 총 30 ㎕를 기준으로 10x reaction 용액 3 ㎕, 2.5 mM dNTP mixture 3 ㎕, cDNA 0.5 ㎕, DNA polymerase (Cosmo genetech) 0.5 ㎕, primer mixture (100p upper; 0.15 ㎕, 100p lower; 0.15 ㎕, D.W.; 0.7 ㎕)와 D.W. 22 ㎕를 0.5 ㎖ 튜브에 넣고 반응시켰다.
[76]
웨스턴 블랏은 하기와 같이 실시하였다. 배양한 신경전구세포를 PBS로 2회 세척한 뒤 수거하여 protease inhibitor (phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)가 포함된 용해 용액 (0.5 % Triton X, 20 mM Tris 7.4, 10 mM EDTA)를 넣고 4 ℃ rocker에 30분 반응시켰다. 스크래퍼를 이용하여 단백질 용해물을 수거하였다. 단백질 샘플을 protein assay solution (Bid-rad, CA)으로 정량하여 4x sampling 용액을 넣고 10분간 끓였다. 그 후 SDS-PAGE 젤에 전기영동 하였다. 전기영동 후 transfer 용액 (25 mM Tris base, 0.2 M glycin, 20 % methanol, pH 8.5)을 사용하여 미리 methanol로 활성화시킨 PVDF membrane으로 30 V에서 1시간 transfer하였다. 다음 blocking 용액 (5 % skim milk)로 1시간 blocking하고 세척 용액에 1차 항체를 1:1000 비율로 희석하여 4 ℃에서 overnight 반응시켰다. 그 후 세척 용액 (1X TBS, 0.1 % Tween20)으로 5분 간격으로 3회 세척하고 Biotin-conjugated 2차 항체를 1;2000 비율로 희석하여 넣고 4 ℃에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 세척 용액으로 5분 간격으로 3회 세척하고 horseradish peroxidase (HRP)을 1:3000으로 희석하여 15분간 반응시킨 뒤 세척 용액으로 5분 간격으로 3회 세척하였다. 단백질의 발현 양상을 눈으로 확인하기 위하여 enhanced chemiluminescence(ECL) solution(Perkinelmer, MA)을 처리하여 chemiDoc으로 확인하였다.
[77]
실시예 2 : FBS 성분의 도파민 신경세포 발현에 미치는 효과 확인
[78]
래트 태아(태령 14.5일)로부터 대뇌 피질 신경줄기세포를 분리하고, 실시예 1과 같이 bFGF 존재 하에서 Nurr1 유전자를 발현하는 레트로 바이러스로 감염시켰다. bFGF를 제거하여 신경줄기세포의 분화를 유도하였고, 이때부터 FBS와 표 1의 혼합물(chemical mixture)을 농도별로 처리하였다. 표 1의 농도를 100% FBS의 농도로 고려하였다. 도파민 신경세포의 표지인자인 티로신 수산화효소(TH)에 반응하는 항체를 이용하여 실시예 1과 같이 면역형광염색법을 실시하였다.
[79]
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 0.1% 혼합물 처리 시 0.01% FBS를 처리한 경우와 유사하게 TH의 발현이 증가하였다(도 4).
[80]
[표1]
[81]
from Lindl, T. (2002): "Zell und Gewebekultur". 5th ed. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
[82]
실시예 3 : 혼합물 내 유효물질 동정
[83]
혼합물 중에서 가장 유효한 효과를 나타내는 성분을 동정하기 위하여, 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, 18개의 후보물질에서 각각 하나씩의 후보물질을 처리하였다. TH 프로모터 활성측정 (TH promoter assay)은 하기와 같이 실시하였다. 6.0TH-GL3B 플라스미드와 pRSV-R-Luc 플라스미드를 lipofectamine2000으로 transfection후 다음 날, 세포를 차가운 PBS로 washing 한 후 lysis buffer 100ul씩 넣고 10분간 교반하였다. 세포 lysate는 튜브에 옮겨 원심분리 한 후 supernatant를 20ul씩 흰색 96well plate에 옮겼다. promoter 발현 값은 firefly luciferase reagent와 반응시킨 발현 값을 luminometer로 측정하고 renilla luciferase reagent와 반응시킨 값은 보정 값으로 사용하였다.)으로 관찰한 결과, 후보물질 4번[C4, triiodo- L-thyronine (T 3)], 5번[C5, L-thyroxine (T 4)], 16번(C16, alkaline phosphatase)이 처리된 실험군에서 프로모터 활성이 가장 많이 나타났다(도 5).
[84]
TH의 발현은 면역형광염색으로 확인하였다(도 6). 면역형광염색은 하기와 같이 실시하였다. 배양한 세포를 4 % 파라포름알데하이드로 20분간 고정하였다. 그 후 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 0.1 % BSA/PBS 용액과 10 % normal goat serum, 0.03 % Triton X-100 (Sigma)을 혼합하여 1차 항체 반응 전 blocking을 1시간 실시하였다. 1차 항체를 0.1 % BSA/PBS 용액과 10 % normal goat serum의 혼합액에 희석하여 첨가한 뒤 4 ℃에서 다음 날까지 incubation하였다. TH (1;2000, Sigma), HA (1;1000, Covance), Nurr1 (1;500, Santa Cruz) 1차 항체는 다음 날 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하였다. Biotin-conjugated 2차 항체를 0.1 % BSA/PBS 용액에 희석하여 첨가한 뒤 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하였다. 형광이 달린 (DTAF, 1;1000 or Rhodamine, 1;400) 2차 항체 (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA)는 0.1 % BSA/PBS 용액에 희석하여 1시간동안 암실에서 반응한 뒤 0.1 % BSA/PBS 용액으로 5분간 3회 세척하고 3차 D.W로 1회 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 슬라이드에 VECTASHIELD with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) mounting 용액을 떨어뜨린 후 세포가 붙어있는 coverslip을 붙였다.
[85]
도파민신경세포 활성에 효과가 있다고 생각되는 후보물질들이 정말 FBS 처리 효능에 있어 중요한 인자인지 확인하기 위하여 18개 후보물질에서 4번, 5번, 16번을 각각 제거, 또는 여러 조합으로 제거하여 처리 후 TH 프로모터 활성측정을 실시하였다. 그 결과 후보물질 4번, 5번이 함께 제거된 실험군에서 프로모터 활성이 매우 감소하였고(도 7), 형광면역염색 결과 역시 TH 발현이 매우 감소하는 것을 보였다(도 8). 이러한 결과는, T 3, T 4가 FBS 처리 효과의 주된 인자임을 보여준다.
[86]
실시예 4 : T3 농도 별 처리에 의한 도파민 신경세포의 발현 및 분화 증진 효과
[87]
래트 신경줄기세포에서 Nurr1 유전자를 발현시키고, T 3를 200 pg/㎖부터 2단계로 계단 희석하여 농도별로 처리한 경우, 농도 의존적으로 TH의 발현이 크게 증가하였으며, 6 pg/㎖ 이상의 T 3 처리 시에는 0.01% FBS나 0.1% 혼합물을 처리한 경우보다 효과가 더 우수하였다(도 9). 또한, TH 프로모터 활성측정에서도 프로모터 활성이 농도 의존적으로 증가하였다(도 10).
[88]
실시예 5 : 중뇌 도파민 신경세포의 발현 및 분화 증진에 미치는 T3, T4의 효과 확인
[89]
래트 태아의 중뇌 신경전구세포를 분화시키면서 T 3와 T 4를 각각 처리하였다. 신경전구세포 배양은 하기와 같이 실시하였다. 암컷 Sprague Dawley (SD) rat 임신 14일차의 자궁으로부터 배아를 적출한 뒤 배아의 배쪽 중뇌 부분을 분리하였다. 이를 단일 세포로 분리시킨 것으로부터 신경전구세포를 준비하였다. 세포는 미리 PLO [poly-L-ornithine (15 mg/㎖, sigma, St Louis, MO)]/ FN [fibronectin (1 mg/㎖, sigma)]으로 코팅된 24well plate에 0.2 x 10 6/well으로 깔아주었다. 다음 날 37 ℃, 5 % CO 2 incubate 조건 하에서 20 ng/㎖의 basic fibroblast growth factor (bFGF; R&D Systems)가 첨가된 serum-free media (N2, Johe et al. 1996)를 이용하여 1일간 배양한 후 다음 날부터 분화를 위해 N2 + 0.2 mM ascorbicacid (Sigma)를 넣어 2일 마다 배지를 교환해주었다.
[90]
T 3와 T 4를 신경줄기세포 분화시에 처리한 결과, 인위적으로 래트 태아의 대뇌 피질 신경전구세포에 Nurr1을 발현시킨 경우와 마찬가지로, 래트 태아의 중뇌 신경전구세포를 분화시키면서 T 3와 T 4를 처리한 경우, 중뇌 도파민 신경세포에서 발생하는 TH의 발현이 농도 의존적으로 증가하였다(도 11). 이러한 결과는, T 3와 T 4를 인 비보(in vivo)로 처리할 경우 생체 내에서 도파민 신경세포의 발현을 향상시킬 수 있음을 보여주는 결과로서, T 3와 T 4를 파킨슨병과 같은 도파민 결핍으로 인한 질환의 치료제로 사용할 수 있음을 보여준다.
[91]
실시예 6 : 사람 세포주에서 확인한 T3와 T4의 도파민 신경세포 발현 및 증진 효과
[92]
사람 신경 줄기 세포주인 BE(2)C 세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, T 3와 T 4를 각각 처리하여 분화시키고 면역형광염색과 TH 프로모터 활성측정을 실시한 결과, T 3, T 4가 모두 도파민 신경세포 발현 증가에 효과가 있음을 보였다(도 12). 뿐만 아니라 자체적으로 Nurr1이 발현되고 있는 사람 신경 줄기 세포주인 SH-SY5Y 세포에서도 마찬가지로 T 3와 T 4 모두 TH 프로모터 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 13). 또한 사람 배아줄기세포주 H9을 신경줄기세포로 직접 분화시킨 H9 신경전구세포에 T 3와 T 4를 각각 처리하면서 신경세포로 분화시킨 결과, 동일한 효과가 나타나는 것을 확인하였다(도 14). 이러한 결과는 T 3와 T 4가 실제로 사람에게 약물로 적용하였을 때 효능을 보일 수 있는 가능성을 나타낸다고 할 수 있다.
[93]
실시예 7 : 신경 독성 물질에 대한 T3와 T4의 도파민 신경세포 회복 효과
[94]
실제로 치료제로서 사용하기 위해서는 도파민 신경세포에 손상이 생겼을 때 손상에 대한 회복 효과를 확인해야 하므로 래트 신경줄기세포에 Nurr1 유전자를 발현시키고, catecholamine 신경세포 특이적 신경독소로 알려져 있는 6-hydroxydopamine (6-OHDA)(20uM, MP biomedical)과 신경세포에 세포 사멸을 유도하는 활성산소 (H 2O 2)(100uM, sigma)를 각각 처리하여 도파민 신경세포의 감소를 유도하였다. 그리고 일주일 동안 T 3와 T 4를 각각 처리하여 도파민 신경세포의 회복을 살펴본 결과, 처리하지 않은 군에 비하여 도파민 신경세포가 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였다(도 15). 래트 태아의 중뇌 신경전구세포와 사람 배아줄기세포 유래 신경전구세포에도 6-OHDA (10uM)를 처리하고 2주 동안 T 3와 T 4를 각각 처리한 결과 역시 마찬가지로 도파민 신경세포가 회복됨을 확인하였다 (도 16, 도 17). 이러한 결과는 T 3와 T 4가 실제로 신경 독성 물질에 대한 회복 효과가 있음을 보여주며 이는 곧 파킨슨병 치료제로 사용할 수 있음을 나타낸다.
[95]
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

청구범위

[청구항 1]
트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 티록신(Thyroxine) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
[청구항 2]
제 1 항에 있어서, 상기 도파민 결핍으로 인한 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경인지기능 장애, 주의력결핍 과잉행동 장애, 하지불안증후군 및 불안증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 3]
제 1 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 염은 트리요오드티로닌 나트륨염과 티록신 나트륨염인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 트리요오드티로닌과 티록신은 중추신경계의 도파민 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 트리요오드티로닌과 티록신은 도파민 뉴런의 증식 또는 신경전구세포의 도파민 뉴런으로의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 6]
제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 시럽, 에어로졸, 피복정, 환제, 겔, 즙, 액제 및 유제로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 7]
트리요오드티로닌(Triiodothyronine), 티록신(Thyroxine) 또는 이의 염을 포함하는 도파민 결핍으로 인한 뇌신경 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]

[도11]

[도12]

[도13]

[도14]

[도15]

[도16]

[도17]