Recherche dans les collections de brevets nationales et internationales
Certains contenus de cette application ne sont pas disponibles pour le moment.
Si cette situation persiste, veuillez nous contacter àObservations et contact
1. (WO2017002978) PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE SUCRE RARE
Document

明 細 書

発明の名称 希少糖の製造法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005  

先行技術文献

特許文献

0006  

非特許文献

0007  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0008   0009   0010   0011  

課題を解決するための手段

0012   0013  

発明の効果

0014   0015  

図面の簡単な説明

0016  

発明を実施するための形態

0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214  

実施例

0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257   0258   0259   0260   0261   0262   0263   0264   0265   0266   0267   0268   0269   0270   0271   0272   0273  

産業上の利用可能性

0274   0275  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

図面

1   2  

明 細 書

発明の名称 : 希少糖の製造法

技術分野

[0001]
 本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた希少糖の効率的な製造法、より詳しくはD-プシコースの製造法およびD-アロヘプツロースの製造法に関する。

背景技術

[0002]
 希少糖は国際希少糖学会の定義によれば「自然界に希にしか存在しない糖」と定義されており、自然界における存在量が少ない単糖である。希少糖は、一般に有機化学的合成方法における合成反応においては収量の少ないものが多い。
[0003]
 希少糖の一種であるD-プシコースは、砂糖の7割程度の甘味がありながらカロリーはほとんどなく、そのため低カロリー甘味料として用いることが出来る。また血圧上昇の抑制作用および内臓脂肪蓄積の抑制作用なども認められている。
[0004]
 プシコースの製造法としては、アルカリを用いた化学異性化反応および酵素法が知られている。特許文献1には、化学異性化反応を用いたプシコースの製造法が開示されている。また、特許文献2および3並びに非特許文献1~4には、D-プシコースの生合成に係る酵素が開示されている。また、非特許文献5には、ホウ素を用いて反応効率を上げる方法が開示されている。
[0005]
 また、希少糖の一種であるD-アロヘプツロースは、7炭糖の一種であり、黄花九輪桜の根に微量含まれていることが確認されているが(非特許文献6)、その生理機能についての報告はほとんどされていない。D-アロヘプツロースの製造法としては、Escherichia coli由来の酵素を用いた酵素法やCorynebacterium glutamicumを用いた発酵法が開示されている(非特許文献7)。

先行技術文献

特許文献

[0006]
特許文献1 : 国際公開第2010113785号
特許文献2 : 日本国特開平6-125776号公報
特許文献3 : 日本国特表2013-501519号公報

非特許文献

[0007]
非特許文献1 : Journal of fermentation and bioengineering (1995) vol. 80, p. 101-103.
非特許文献2 : Appl. Environ. Microbiol.(2006)vol. 72, p. 981-985
非特許文献3 : Biotechnology Letters (2009)vol. 31, p. 857-862
非特許文献4 : World Journal of Microbiology and Biotechnology(2007) vol. 23, p. 559-563
非特許文献5 : Appl. Environ. Microbiol.(2008)vol. 74, p. 3008-3013
非特許文献6 : Carbohydrate Research 2.4 (1966): 272-288.
非特許文献7 : Biotechnology and bioengineering 112.1 (2015): 168-180.

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0008]
 化学異性化反応を用いたD-プシコースの製造法は、特異的にD-プシコースを製造することができないため、D-プシコース以外の副生糖も大量に生成される他、反応効率が低く、基質となる異性化糖が多く残存する。
[0009]
 また、D-プシコースの生合成に係る酵素を用いたD-プシコースの製造法は、反応効率は良くて33%程度である。さらに、ホウ素を用いてD-プシコースへの反応効率を上げた場合でもその変換率は60%程度となっている。
[0010]
 このように、これまでの方法はいずれも可逆的な反応を用いたものであり、基質となるグルコースまたはフルクトースの残存が避けられないという問題があった。
[0011]
 したがって、本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0012]
 本発明者らは上記課題を検討した結果、親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を利用することにより、効率的にD-プシコースを製造できることを見出した。また、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物を利用することにより、効率的にD-アロヘプツロースを製造できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
[0013]
 すなわち、本発明は以下に関する。
<1>(i)酵素源として、親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法。
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
<2>親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法。
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
<3>糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、以下の[4]~[7]のいずれか1に記載のDNAを含む組換え体DNAで親株を形質転換して得られる、該親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、<1>または<2>に記載の製造法。
[4]<1>または<2>の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNA
[5]配列番号50または51で表される塩基配列からなるDNA
[6]配列番号50または51で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[7]配列番号50または51で表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
<4>糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物である、<1>~<3>のいずれか1に記載の製造法。
<5>糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、<1>~<4>のいずれか1に記載の製造法。
<6>糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、<1>~<5>のいずれか1に記載の製造法。
<7>(i)酵素源として、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法。
<8>親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物を培地に培養し、培養物中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法。
<9>前記微生物が糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物である<7>または<8>に記載の製造法。
<10>前記微生物がD-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物である<7>~<9>のいずれか1に記載の製造法。
<11>親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物が、以下の[8]~[10]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、<7>~<10>のいずれか1に記載の製造法。
[8]配列番号52で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[9]配列番号52で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
[10]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
<12>D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物が、前記親株に比べ、以下の[11]~[13]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、<10>または<11>に記載の製造法。
[11]配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[12]配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[13]配列番号1で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
<13>糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、<9>~<12>のいずれか1に記載の製造法。
<14>糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも1の糖である、<1>~<13>のいずれか1に記載の製造法。
<15>親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、<1>~<14>のいずれか1に記載の製造法。

発明の効果

[0014]
 本発明により、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法が提供される。本発明のD-プシコースの製造法によれば、親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を用いることにより、該微生物が有するD-アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でD-プシコースを製造することができる。
[0015]
 また、本発明のD-アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物を用いることにより、該微生物が有するセドヘプツロース-7-リン酸をD-アロヘプツロース-7-リン酸へ異性化する活性を効率的に利用することができ、高効率でD-アロヘプツロースを製造することができる。

図面の簡単な説明

[0016]
[図1] 図1(a)は、エシェリヒア属に属する微生物が有するD-アロースの代謝系の概略図を示す。図1(b)は本発明のD-プシコースの製造法に用いられる微生物によるD-プシコース製造の具体例の概略図を示す。
[図2] 図2はエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図を示す。

発明を実施するための形態

[0017]
1.本発明のD-プシコースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
 本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の(1)~(4)に記載の微生物を挙げることができる。
(1)親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
(2)前記(1)の微生物を親株として、該親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物
(3)前記(1)または(2)の微生物を親株として、該親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
(4)前記(1)~(3)のいずれか1の微生物を親株として、該親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
 以下、(1)~(4)について説明する。
[0018]
(1)親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
[0019]
 D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性とは、D-プシコース-6-リン酸を基質として、脱リン酸化する活性をいう。また、「糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物」とは、該微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてD-プシコース-6-リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積する微生物をいう。
[0020]
 変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
[0021]
 相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
[0022]
 上記[2]の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個である。
[0023]
 欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、L-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、L-システインなどが挙げられる。
[0024]
 以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
C群:アスパラギン、グルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン、ホモセリンG群:フェニルアラニン、チロシン
[0025]
 上記の変異蛋白質または相同蛋白質が、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有していることは、後述する方法により該蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAを作製し、該組換え体DNAでD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を確認することができない微生物、例えばエシェリヒア・コリW3110株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるD-プシコース-6-リン酸と接触させ、結果として生成するD-プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
[0026]
 親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
[0027]
 親株は、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。
[0028]
 微生物に、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する能力を人工的に付与する方法としては、(a)糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも1つを緩和又は解除する方法、(b)糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、(c)糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、(d)糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化又は遮断する方法、及び(e)野生型株に比べ、D-プシコース-6-リン酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
[0029]
 このような親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Escherichia coli MG1655、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli BL21 codon plus(ストラタジーン社製)、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratiamarcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium ammoniagenes、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、若しくはPseudomonas sp. D-0110等の原核生物、またはSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Pichia pastoris、若しくはCandida utilis等の酵母菌株を挙げることができる。
[0030]
 微生物が糖からD-プシコース-6-リン酸を生成することのできる微生物であることは、配列番号1または2で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするDNAを有する組換え体DNAで該微生物を形質転換し、形質転換した該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したD-プシコースを後述のHPLCを用いて検出することにより確認することができる。
[0031]
 親株の微生物に比べ前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、以下の(a)および(b)の微生物が挙げられる。(a)親株の染色体DNA上にある前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、(b)該蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
[0032]
 (a)親株の染色体DNA上にある前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有する前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質のアミノ酸配列において1~10個のアミノ酸、好ましくは1~5個のアミノ酸、最も好ましくは1~5個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。
[0033]
 (a)親株の染色体DNA上にある前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、親株の前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
[0034]
 突然変異処理法としては、例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)を用いる方法(微生物実験マニュアル、1986年、131頁、講談社サイエンティフィック社)、紫外線照射法等を挙げることができる。
[0035]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法は、前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在する前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0036]
 前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAは、例えば、配列番号50または51で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、1(1)において後述するPCRを用いた方法等により取得することができる。
[0037]
 相同組換え法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体DNAを導入する方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)]を挙げることができる。
[0038]
 さらに、組換え体DNAと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体DNA上の目的の領域が組換え体DNAに置換された微生物を取得することができる。
[0039]
 親株に比べ、前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にD-プシコース-6-リン酸とその他の基質を加え、結果として生成するD-プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出して比較することで確認することができる。
[0040]
 (a)親株の染色体DNA上にある前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体DNA上に存在する前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において1塩基以上、好ましくは1~10塩基、より好ましくは1~5塩基、さらに好ましくは1~3塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。
[0041]
 (a)親株の染色体DNA上にある前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、親株の前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
[0042]
 突然変異処理法は、上記に記載の方法を挙げることができる。
[0043]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法は、親株が有する前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するDNAを試験管内における変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在する前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、上記の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0044]
 また、親株の前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株より前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
[0045]
 そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリで機能するtrpプロモーター(Ptrp)、lacプロモーター(Plac)、P プロモーター、P プロモーター、P SEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、例えば、Ptrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーターおよびletIプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターも挙げることができる。
 親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合は、例えば、バチルス・サチルスで機能するSPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター等を挙げることができる。
[0046]
 親株としてコリネ型細菌を用いる場合は、例えば、P54-6プロモーター[Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)]等を挙げることができる。
[0047]
 親株として酵母菌株を用いる場合は、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等を挙げることができる。
[0048]
 上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株とそれと比較することにより確認することができる。
[0049]
 (b)前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、染色体DNA上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
[0050]
 前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAとしては、前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするDNAであればいずれでもよいが、具体的には以下の[4]~[7]からなる群より選ばれる1のDNAが挙げられる。
[4]前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNA
[5]配列番号50または51で表される塩基配列からなるDNA
[6]配列番号50または51で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[7]配列番号50または51で表される塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[0051]
 前記[4]~[7]のいずれか1に記載のDNAを含む組換え体DNAとは、該DNAが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該DNAを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体DNAをいう。
[0052]
 アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[J. Mol. Biol., 215, 403(1990)]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
[0053]
 上記[6]において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するDNAまたは該DNAの一部にDNAがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するDNAまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またPCR解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるDNAである。
[0054]
 プローブとして用いられるDNAとしては、少なくとも100塩基以上、好ましくは200塩基以上、より好ましくは500塩基以上のDNAを挙げることができる。プライマーとして用いられるDNAとしては、少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上のDNAを上げることができる。
[0055]
 DNAのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第2版、第3版(2001年)、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press(1994)、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
[0056]
 また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドDNAラベリングキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)などを挙げることができる。
[0057]
 上記のストリンジェントな条件とは、DNAを固定化したフィルターとプローブDNAとを50%ホルムアミド、5×SSC(750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム)、50mmol/lのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子DNAを含む溶液中で42℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
[0058]
 上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号50または51で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
[0059]
 (b)前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
[0060]
 上記の方法で得られる前記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
[0061]
 前記DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。該組換え体DNAで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
[0062]
 細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体DNAは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の[4]~[7]のいずれか1に記載のDNA、および転写終結配列により構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
[0063]
 リボソーム結合配列であるシャイン-ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6~18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体DNAにおいては、該DNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
[0064]
 また、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
[0065]
 親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b(いずれもノバジェン社製)、pMAL-c2x(ニューイングランドバイオラブス社製)、pGEX-4T-1(ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、pTrcHis(インビトロジェン社製)、pSE280(インビトロジェン社製)、pGEMEX-1(プロメガ社製)、pQE-30(キアゲン社製)、pET-3(ノバジェン社製)、pKYP10(日本国特開昭58-110600号公報)、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)(ストラタジーン社製)、pTrS30[エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32[エシェリヒア・コリJM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385]pPAC31(国際公開第1998/12343号)、pUC19[Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118(タカラバイオ社製)、pPA1(日本国特開昭63-233798号公報)等を挙げることができる。
[0066]
 上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター(P trp)、lacプロモーター(P lac)、P プロモーター、P プロモーター、P SEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ptrpを2つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、letIプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
[0067]
 親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、pCG1(日本国特開昭57-134500号公報)、pCG2(日本国特開昭58-35197号公報)、pCG4(日本国特開昭57-183799号公報)、pCG11(日本国特開昭57-134500号公報)、pCG116、pCE54、pCB101(いずれも日本国特開昭58-105999号公報)、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。
[0068]
 上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、P54-6プロモーター[Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)]を用いることができる。
[0069]
 親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等を挙げることができる。
[0070]
 上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
[0071]
 該組換え体DNAが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体DNA上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてPCRにより増幅産物を確認する方法等により確認することができる。また、該DNAの転写量若しくは該DNAがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認することができる。
[0072]
 上記[1]の蛋白質をコードするDNA、および上記[5]のDNAは、例えば、配列番号50で表される塩基配列(yniC遺伝子)または配列番号51で表される塩基配列(ybiV遺伝子)に基づき設計することができるプローブDNAを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア・コリ属に属する微生物、より好ましくは、エシェリヒア・コリMG1655株の染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーDNAを用いた、上記微生物の染色体DNAを鋳型としたPCR[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
[0073]
 エシェリヒア・コリMG1655株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター(NITE Biological Resource Center)から入手することができる。
[0074]
 上記[2]の変異蛋白質をコードするDNAは、例えば、配列番号50または51で表される塩基配列からなるDNAを鋳型としてエラープローンPCR等に供することにより取得することができる。
[0075]
 または、目的の変異(欠失、置換、挿入または付加)が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの5’端に持つ1組のPCRプライマーを用いたPCR[Gene, 77, 51(1989)]によっても、上記[2]のDNAを取得することができる。
[0076]
 すなわち、まず該DNAの5’端に対応するセンスプライマーと、5’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前(5’側)の配列に対応するアンチセンスプライマーで該DNAを鋳型にしてPCRを行い、該DNAの5’端から変異導入部位までの断片A(3’端に変異が導入されている)を増幅する。次いで、5’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後(3’側)の配列に対応するセンスプライマーと、該DNAの3’端に対応するアンチセンスプライマーで該DNAを鋳型にしてPCRを行い、5’端に変異が導入された該DNAの変異導入部位から3’端までの断片Bを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにPCRを行うと、増幅断片Aのセンス鎖と増幅断片Bのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてPCRの反応が進行し、変異が導入されたDNAが増幅する。
[0077]
 上記[3]の相同蛋白質をコードするDNA、並びに上記[6]および[7]のDNAは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号50または51で表される塩基配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号2または4で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブDNAまたはプライマーDNA、および当該DNAを有する微生物を用いて、上記のDNAを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
[0078]
 取得した上記の[4]~[7]のいずれか1に記載のDNAは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体DNAを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]または3700 DNAアナライザー(アプライドバイオシステムズ社製)等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該DNAの塩基配列を決定することができる。
[0079]
 前記宿主細胞としては、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli MP347およびEscherichia coli NM522が挙げられる。
[0080]
 上記のベクターとしては、例えば、pBluescriptIIKS(+)(ストラタジーン社製)、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)(ストラタジーン社製)、pT7Blue(ノバジェン社製)、pCR II(インビトロジェン社製)およびpCR-TRAP(ジーンハンター社製)が挙げられる。
[0081]
 組換え体DNAの導入方法としては、宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法(日本国特開昭63-248394号公報)、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等が挙げられる。
[0082]
 塩基配列を決定した結果、取得されたDNAが部分長であった場合は、該部分長DNAをプローブに用いた、染色体DNAライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長DNAを取得することができる。
[0083]
 更に、決定されたDNAの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするDNAを調製することもできる。
[0084]
 該DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる組換え体DNAを作製することができる。このような組換え体DNAとしては、例えば、実施例において後述するPtrp-yniCおよびPtrp-ybiVが挙げられる。
[0085]
 組換え体DNAを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法(日本国特開昭63-248394号公報)およびエレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等の方法が挙げられる。
[0086]
 組換え体DNAを親株の染色体中に組み込む方法としては、上記において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0087]
 上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、上述の方法により、上記[4]~[7]のいずれか1に記載のDNAの転写量、上記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の生産量、または該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
[0088]
 このような微生物の例としては、実施例において後述するMGCおよびMGVを挙げることができる。
[0089]
(2)前記(1)の微生物を親株として、該親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物
 アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性とは、フルクトース-6-リン酸を異性化してD-プシコース-6-リン酸とする活性をいう。
[0090]
 親株の微生物に比べアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、以下の(a)および(b)の微生物が挙げられる。
(a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、
(b)該蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
[0091]
 (a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するアルロース-6-リン酸
 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列において1~10個のアミノ酸、好ましくは1~8個のアミノ酸、最も好ましくは1~5個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。
[0092]
 (a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記1(1)に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
[0093]
 突然変異処理法は、上記1(1)に記載の方法を挙げることができる。
[0094]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法は、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在するアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記1(1)において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0095]
 アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAは、例えば、配列番号42で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記1(1)において記載したPCRを用いた方法等により取得することができる。
[0096]
 親株に比べ、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にフルクトース-6-リン酸とその他の基質を加え、合成されたD-プシコース-6-リン酸量をHPLCで測定、比較することにより確認することができる。
[0097]
 (a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体DNA上に存在するアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において1塩基以上、好ましくは1~10塩基、より好ましくは1~5塩基、さらに好ましくは1~3塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体DNA上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。
[0098]
 (a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記1(1)に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
[0099]
 突然変異処理法は、上記1(1)に記載の方法を挙げることができる。
[0100]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法は、親株が有するアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するDNAを試験管内における変異処理、またはエラープローンPCRなどに供することにより該DNAに変異を導入した後、親株の染色体DNA上に存在するアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記1(1)に記載の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0101]
 また、親株のアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
[0102]
 そのようなプロモーターとしては、上記1(1)に記載のプロモーターを挙げることができる。
[0103]
 上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
[0104]
 (b)アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより、染色体DNA上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドDNAとして染色体DNA外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
[0105]
 アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[3]からなる群より選ばれる1の蛋白質が挙げられる。
[1]配列番号52で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
[2]配列番号52で表されるアミノ酸配列において、1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質、
[3]配列番号52で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
[0106]
 上記において、1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号52で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
[0107]
 欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個である。
[0108]
 配列番号52で表されるアミノ酸配列において1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、1個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
[0109]
 配列番号52で表されるアミノ酸配列において1~10個、好ましくは1~8個、最も好ましくは1~5個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質が、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質であることは、例えば、DNA組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して、培地で培養し、培養物中のD-プシコース-6-リン酸を測定することにより確認することができる。
[0110]
 アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAとしては、該活性を有する蛋白質をコードするDNAであればいずれでもよいが、具体的には以下の[4]~[7]からなる群より選ばれる1のDNAが挙げられる。
[4]上記[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNA、
[5]配列番号42で表される塩基配列を有するDNA、
[6]配列番号42で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA、
[7]配列番号42で表される塩基配列と少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[0111]
 上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記1(1)の記載と同じである。上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号42で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
[0112]
 (b)アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
[0113]
 上記の方法で得られるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのDNA断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
[0114]
 前記DNA断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体DNAを作製する。該組換え体DNAで、上記1(1)に記載の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
[0115]
 リボソーム結合配列であるシャイン-ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離(例えば6~18塩基)に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
[0116]
 アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
[0117]
 発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
[0118]
 原核生物を宿主細胞として用いる場合は、前記DNAを含む組換え体DNAは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該DNA、転写終結配列より構成された組換え体DNAであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
[0119]
 発現ベクターおよび該発現ベクターを用いる場合のプロモーターは、上記1(1)において記載したものと同様の発現ベクターおよびプロモーターが挙げられる。アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに結合させた組換え体DNAとしては、例えば、実施例において後述するpUC19_alsEを挙げることができる。
[0120]
 また、上記の方法で得られるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNAを、上記1(1)に記載の相同組換え法を用いることで、染色体DNAの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
[0121]
 上記の方法で取得した微生物が、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記1(1)に記載の方法を用いて確認することができる。
[0122]
 このような微生物の例としては、実施例において後述するMGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEおよびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEを挙げることができる。
[0123]
(3)前記(1)または(2)の微生物を親株として、該親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質、およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
 D-アロース-6-リン酸イソメラーゼは、D-アロース-6-リン酸をD-プシコース-6-リン酸に異性化する活性を有する蛋白質である。RpiRは、リプレッサーとしてアロース資化オペロンのオペレーター部分に結合して、それに連なるオペロンの転写を阻止することにより遺伝子の発現を抑制する活性を有する蛋白質である。
[0124]
 D-アロース輸送蛋白質は、D-アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質である。D-アロースキナーゼとは、D-アロースをD-アロース-6-リン酸にする活性を有する蛋白質である。
[0125]
 親株に比べD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型の該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、(a)親株に比べ、該蛋白質の比活性が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物、および(b)親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。
[0126]
 D-アロース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子としては、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる1の遺伝子が挙げられる。
[1]配列番号53で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
[2]配列番号53で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
[3]配列番号43で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
[4]配列番号43で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
[0127]
 RpiRをコードする遺伝子としては、リプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる1の遺伝子が挙げられる。
[1]配列番号54で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
[2]配列番号54で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
[3]配列番号44で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
[4]配列番号44で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
[0128]
 D-アロース輸送蛋白質をコードする遺伝子としては、D-アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる1の遺伝子が挙げられる。
[1]配列番号55~57のいずれか1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
[2]配列番号55~57のいずれか1で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
[3]配列番号45~47のいずれか1で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
[4]配列番号45~47のいずれか1で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
[0129]
 D-アロースキナーゼをコードする遺伝子としては、D-アロースキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる1の遺伝子が挙げられる。
[1]配列番号58で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
[2]配列番号58で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-アロースキナーゼ活性を細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
[3]配列番号48で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
[4]配列番号48で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-アロースキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
[0130]
 D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記1(1)の記載と同じである。
[0131]
 上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記1(1)の記載と同じである。
[0132]
 上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えば、BLASTまたはFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号43~48のいずれか1で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
[0133]
 親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記1(1)または(2)の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株のD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質、およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
[0134]
 突然変異処理法は、上記1(1)に記載の方法を挙げることができる。
[0135]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、試験管内でD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記1(1)の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0136]
 D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼをコードする遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号43~48で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記1(1)に記載のPCRを用いた方法等により取得することができる。
[0137]
 試験管内でD-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質、およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体DNA上の目的の領域と置換する方法は、上記1(1)の方法と同じである。
[0138]
 親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をD-アロース-6-リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のD-プシコース-6-リン酸比を比較することにより確認することができる。
[0139]
 親株に比べ、RpiRの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株の図2に示すアロース資化オペロンの転写量と該微生物のそれとをノーザン・ブロッティングにより比較することにより確認することができる。
[0140]
 親株に比べ、D-アロース輸送蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をD-アロースを含む培地で培養し、培養液中のD-アロース比を比較することにより確認することができる。
[0141]
 親株に比べ、D-アロースキナーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をD-アロースを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のD-アロース-6-リン酸比を比較することにより確認することができる。
[0142]
 親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
[0143]
 D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、アロース資化オペロンが欠損した微生物が挙げられる。具体的には、例えば、実施例において後述するMG1655 Δalsを挙げることができる。
[0144]
(4)前記(1)~(3)のいずれか1の微生物を親株として、該親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
 6-ホスホフルクトキナーゼ活性とは、フルクトース-6-リン酸に作用してフルクトース1,6-二リン酸またはフルクトース2,6-二リン酸とする活性である。
[0145]
 親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下、または喪失した微生物は、染色体DNA上に存在する変異が入っていない野生型の6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、(a)親株に比べ、該蛋白質の比活性が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物、および(b)親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%以下、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは0%に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。
[0146]
 6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子としては、6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の[1]~[4]からなる群より選ばれる1の遺伝子が挙げられる。
[1]配列番号37で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
[2]配列番号37で表されるアミノ酸配列と95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
[3]配列番号49で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
[4]配列番号49で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
[0147]
 6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記1(1)の記載と同じである。
[0148]
 上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、DNAのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記1(1)の記載と同じである。
[0149]
 上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なDNAとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号49で表される塩基配列からなるDNAと少なくとも95%以上、好ましくは97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の同一性を有するDNAを挙げることができる。
[0150]
 親株に比べ、6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記1(1)~(3)のいずれか1の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株の6-ホスホフルクトキナーゼ活性を、通常の突然変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
[0151]
 突然変異処理法は、上記1(1)に記載の方法を挙げることができる。
[0152]
 組換えDNA技術による遺伝子置換法としては、試験管内で6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記1(1)の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
[0153]
 6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば、配列番号49で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブDNAを用いて、上記1(1)に記載のPCRを用いた方法等により取得することができる。
[0154]
 試験管内で6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に1以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体DNA上の目的の領域と置換する方法は、上記1(1)に記載の方法と同じである。
[0155]
 親株に比べ、6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をフルクトース-6-リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のフルクトース1,6-二リン酸またはフルクトース2,6-二リン酸比を比較することにより確認することができる。
[0156]
 親株に比べ、6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
[0157]
 6-ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、実施例において後述するMG1655 ΔalsΔpfkAを挙げることができる。
[0158]
2.本発明のD-プシコースの製造法
2.1.糖を基質として用いるD-プシコースの製造法
 本発明のD-プシコースの製造法のうち、(i)酵素源として、上記1の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物(以下、2.1の微生物という。)の培養物または該培養物の処理物、および(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法について、以下説明する。
[0159]
 2.1の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
[0160]
 炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
[0161]
 窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
[0162]
 無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が挙げられる。
[0163]
 培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は15~40℃が好ましく、培養時間は、通常5時間~7日間である。培養中のpHは3.0~9.0に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
[0164]
 また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
[0165]
 例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
[0166]
 上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該媒体からD-プシコースを採取することにより、D-プシコースを製造することができる。
[0167]
 本明細書において、培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。
[0168]
 これらの中でも、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物が挙げられ、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものが挙げられる。
[0169]
 酵素源の量は、用いる各酵素源について、1~500g/lであることが好ましく、より好ましくは1~300g/lである。
[0170]
 糖の濃度は、0.1mM~10Mであることが好ましく、より好ましくは1mM~1Mである。糖としては、例えば、グルコース、フルクトースおよびシュクロースが挙げられる。
[0171]
 水性媒体としては、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩およびトリスなどの緩衝液、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、並びにアセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
[0172]
 D-プシコースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン(例えばナイミーンS-215、日本油脂社製)などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド(例えばカチオンF2-40E、日本油脂社製)などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン(例えば三級アミンFB、日本油脂社製)などの三級アミン類など、D-プシコースの生成を促進するものであればいずれでもよく、1種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常0.1~50g/lの濃度で用いられる。
[0173]
 有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常0.1~50ml/lの濃度で用いられる。D-プシコースの生成反応は、水性媒体中、pH5~10、好ましくはpH6~8、20~50℃の条件で1~96時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン-5’-一リン酸(AMP)、アデノシン-5’-三リン酸(ATP)、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、AMP、ATPは、通常0.01~100mmol/lの濃度で用いられる。
[0174]
 水性媒体中に生成したD-プシコースの定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したD-プシコースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
[0175]
2.2.発酵法によるD-プシコースの製造法
 本発明のD-プシコースの製造法のうち、上記1の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法について、以下説明する。
[0176]
 前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
[0177]
 上記の培養により、培養物中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-プシコースを採取することにより、D-プシコースを製造することができる。D-プシコースの定量方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。
[0178]
 該培養物中からのD-プシコースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にD-プシコースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、D-プシコースを採取することができる。
[0179]
 図1(a)に、エシェリヒア属に属する微生物が有するD-アロースの代謝系の概略図を示す。また、図1(b)に本発明のD-プシコースの製造法に用いられる微生物によるD-プシコース製造の具体例の概略図を示す。
[0180]
 図1(b)の具体例においては、〔1〕アロース資化オペロンが破壊され、且つ親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼをコードする遺伝子(alsE)の発現が増強され、〔2〕6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子(pfkA)が破壊され、〔3〕親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物を用いて、発酵法によりD-プシコースを製造する場合を説明する。
[0181]
 図2にエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図(J. Bacteriol. 181, 7126-7130, 1999)を示す。図2に示すように、エシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンは、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子(rpiB)、リプレッサーをコードする遺伝子(rpiR)、D-アロース輸送蛋白質(結合蛋白質)をコードする遺伝子(alsB)、D-アロース輸送蛋白質(ATPアーゼ)をコードする遺伝子(alsA)、D-アロース輸送蛋白質(膜蛋白質)をコードする遺伝子(alsC)、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性をコードする遺伝子(alsE)およびyjct(alsK)から構成される。
[0182]
 図1(b)の具体例においては、親株における微生物が元来有するアロース資化オペロンが破壊されているので、該親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ(RpiB)、RpiR、D-アロース輸送蛋白質(AlsA、AlsBおよびAlsC)およびD-アロースキナーゼ(alsK)の活性が喪失している。また、該親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼをコードする遺伝子(alsE)の発現が特異的に増強されていることにより、フルクトース-6-リン酸からの異性化でプシコース-6-リン酸が効率的に生産される。
[0183]
 また、図1(b)に示すように、6-ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子(pfkA)が破壊されていることにより、フルクトース-6-リン酸が代謝されてフルクトース-6-リン酸に作用してフルクトース1,6-二リン酸またはフルクトース2,6-二リン酸となるのを抑制することができ、基質となるフルクトース-6-リン酸を微生物内に蓄積することができる。
[0184]
 さらに、図1(b)に示す具体例においては、親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強されていることにより、D-プシコース-6-リン酸を脱リン酸化して、D-プシコースを高効率で生産することができる。
[0185]
3.本発明のD-アロヘプツロースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
 本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の(2A)~(2C)に記載の微生物を挙げることができる。
(2A)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物
(2B)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物
(2C)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつD-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物
 以下、(2A)、(2B)および(2C)について説明する。
[0186]
(2A)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物
 親株は、上記1(1)に記載の親株を用いることができる。親株の微生物に比べアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、上記1(2)に記載したものと同様の以下の(a)および(b)の微生物が挙げられる。(a)親株の染色体DNA上にあるアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、i)親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびii)親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、(b)該蛋白質をコードするDNAを含む組換え体DNAで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
[0187]
 前記微生物が親株に比べ、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および当該微生物を培養し、培養物を超音波処理した後、該処理物にセドヘプツロース-7-リン酸とその他基質を加え、合成されたD-アロヘプツロース-7-リン酸量をHPLCで測定、比較することにより確認することができる。
[0188]
 また、親株に比べ、アルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記1(2)に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
[0189]
 親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、例えば、親株よりも以下の[8]~[10]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
[8]配列番号52で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[9]配列番号52で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
[10]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
[0190]
 親株に比べ前記[8]~[10]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記1(1)に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記1(1)に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
[0191]
 前記[8]~[10]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物はセドヘプツロース-7-リン酸をD-アロヘプツロース-7-リン酸へ異性化する活性を有している。該蛋白質の当該活性は本発明において初めて明らかになったものである。
[0192]
 このような微生物の例としては、実施例において後述するMG 1655/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、を挙げることができる。
[0193]
(2B)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物
 「糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する」とは、微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてセドヘプツロース-7-リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。
[0194]
 親株は、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。
[0195]
 親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からD-アロヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物は上記1(2)に記載の方法と同様の方法により取得することができる。
[0196]
 糖からD-アロヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物としては、親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物が挙げられる。親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、上記1(4)に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記1(4)に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
[0197]
 親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した上で、さらに6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失することにより、中央代謝へのカーボンの流れが減少し、ペントースリン酸経路への流入が増えることによりD-アロヘプツロースの生産性が向上すると考えられる。
[0198]
 このような微生物の例としては、実施例において後述するMG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、を挙げることができる。
[0199]
(2C)親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつD-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物
 「D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物」とは、微生物を培地に培養したときに、D-アロヘプツロース-7-リン酸を出発基質としてD-アロヘプツロースを該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。
[0200]
 また、「糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつD-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する」とは、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、セドヘプツロース-7-リン酸を異性化して得られたD-アロヘプツロース-7-リン酸を基質としてD-アロヘプツロースを生成することをいう。
[0201]
 親株は、糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつ、D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつ、D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成し、かつ、D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する能力を付与した育種株であってもよい。
[0202]
 D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物としては、例えば、親株よりも以下の[11]~[13]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
[11]配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[12]配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[13]配列番号1で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
[0203]
 親株に比べ前記[11]~[13]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記1(1)に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記1(1)に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
[0204]
 このような微生物としては、実施例において後述するMGC/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEを挙げることができる。
[0205]
4.本発明のD-アロヘプツロースの製造法4.1.糖を基質として用いるD-アロヘプツロースの製造法
 本発明のD-アロヘプツロースの製造法のうち、(i)酵素源として、上記3.に記載の(2A)~(2C)の微生物(以下、4.1の微生物という。)の培養物または該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素、並びに(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。
[0206]
 4.1の微生物を培養する方法は、上記2.1に記載の方法を用いることができる。4.1の微生物の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該媒体からD-アロヘプツロースを採取することにより、D-アロヘプツロースを製造することができる。
[0207]
 前記培養物の処理物としては、上記2.1に記載の培養物の処理物と同様に、前記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。
[0208]
 脱リン酸化酵素としては、D-アロヘプツロース-7-リン酸を脱リン酸化する活性を有する脱リン酸化酵素であればいずれでもよいが、例えば、上記1(1)に記載の親株が元来有する脱リン酸化酵素を、好ましくは、yniC遺伝子がコードする脱リン酸化酵素を挙げることができる。
[0209]
 D-アロヘプツロースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤および有機溶媒は2.1に記載したものを用いることができる。
[0210]
 水性媒体中に生成したD-アロヘプツロースの定量はDionex社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したD-アロヘプツロースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
[0211]
4.2.発酵法によるD-アロヘプツロースの製造法
 本発明のD-アロヘプツロースの製造法のうち、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からD-アロヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。
[0212]
 前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記2.1に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
[0213]
 上記の培養により、培養物中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-アロヘプツロースを採取することにより、D-アロヘプツロースを製造することができる。D-アロヘプツロースの定量方法は、上記4.1に記載の方法を用いることができる。
[0214]
 該培養物中からのD-アロヘプツロースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にD-アロヘプツロースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、D-アロヘプツロースを採取することができる。
実施例
[0215]
 以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
[0216]
[実施例1]
D-プシコースの製造に用いる微生物の造成
(1)遺伝子欠損および遺伝子置換の際にマーカーとして用いるDNA断片の取得
 表1の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして、表1の「鋳型」に記載されたDNAを鋳型としてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
[0217]
[表1]


[0218]
 バチルス・サチルス 168株のゲノムDNAは定法により調製した。増幅DNA断片のcatは、cat遺伝子の上流約200bpから下流約100bpを含む。増幅DNA断片のsacBは、sacB遺伝子の上流約300bpから下流約100bpを含む。配列番号38および40で表される塩基配列からなるDNAにはSalI認識サイトが付与されている。
[0219]
 増幅DNA断片のcatおよびsacBを制限酵素SalIで切断し、DNA ligation Kit Ver.2(タカラバイオ社製)を用いて連結した。該連結反応液を鋳型とし、配列番号39および41で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含むDNA(以下、cat-sacBという。)断片を得た。
[0220]
(2)アロース資化オペロンが欠損した微生物の造成
 常法により調製したエシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、表2の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
[0221]
[表2]


[0222]
 alsK上流1およびalsK上流2は、alsK遺伝子の開始コドンからその上流約1000bpを含む。rpiB下流1およびrpiB下流2は、rpiB遺伝子の終止コドンからその下流約1000bpを含む。
[0223]
 alsK上流1、rpiB下流1、およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号3および6で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、cat-sacB断片が挿入されたアロース資化オペロンを含むDNA(以下、als::cat-sacBという。)断片を得た。
[0224]
 alsK上流2およびrpiB下流2を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号3および6で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、rpiB、ripR、alsA、alsB、alsC、alsE、およびalsKが欠損したアロース資化オペロン周辺領域を含むDNA(以下、Δalsという。)断片を得た。
[0225]
 als::cat-sacB断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46[Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645(2000)]を保持するエシェリヒア・コリ MG1655株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体(アロース資化オペロンがals::cat-sacBに置換した形質転換体)を得た。
[0226]
 Δals断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体(als::cat-sacBがΔalsに置換した形質転換体)を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体(pKD46が脱落した形質転換体)を得た。当該微生物をMG1655 Δalsと命名した。
[0227]
(3)アロース資化オペロンおよびpfkA遺伝子が欠損した微生物の造成
 常法により調製したエシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、表2の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
[0228]
[表3]


[0229]
 pfkA上流1およびpfkA上流2は、pfkA遺伝子の開始コドンからその上流約700bpを含む。pfkA下流1およびpfkA下流2は、pfkA遺伝子の終止コドンからその下流約800bpを含む。
[0230]
 pfkA上流1、pfkA下流1、およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号9および12で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、cat-sacB断片が挿入されたpfkA周辺領域を含むDNA(以下、pfkA::cat-sacBという。)断片を得た。
[0231]
 pfkA上流2およびpfkA下流2を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号9および12で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、pfkA遺伝子が欠損したpfkA周辺領域を含むDNA(以下、ΔpfkAという。)断片を得た。
[0232]
 pfkA::cat-sacBを、pKD46を保持するMG1655 Δals株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体(pfkA遺伝子がpfkA::cat-sacBに置換した形質転換体)を得た。
[0233]
 ΔpfkA断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体(pfkA::cat-sacBがΔpfkAに置換した形質転換体)を得た。さらに、pKD46が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をMG1655 ΔalsΔpfkAと命名した。
[0234]
(4)yniC遺伝子の発現が増強した微生物の造成
 yniC遺伝子の開始コドン上流に、trpプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。
[0235]
 trpプロモーターについてはpTK31(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p. 6378-6385)を鋳型とし、その他の増幅DNA断片についてはエシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、表4の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
[0236]
[表4]


[0237]
 yniC上流1およびyniC上流2は、yniC遺伝子の開始コドンからその上流約1000bpを含む。yniC下流1は、yniC遺伝子の終止コドンからその下流約1000bpを含む。yniC下流2は、yniC遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約1000bpを含む。
[0238]
 yniC上流1、yniC下流1、およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号17および20で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、cat-sacB断片が挿入されたyniC周辺領域を含むDNA(以下、yniC::cat-sacBという。)断片を得た。
[0239]
 trpプロモーター、yniC上流2、yniC下流2断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号17および20で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、yniC遺伝子の上流にtrpプロモーターが挿入されたDNA(以下、Ptrp-yniCという。)断片を得た。
[0240]
 yniC::cat-sacB断片を、pKD46を保持するエシェリヒア・コリMG1655株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体(yniC遺伝子がyniC::cat-sacBに置換した形質転換体)を得た。
[0241]
 Ptrp-yniC断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体(yniC::cat-sacBがPtrp-yniCに置換した形質転換体)を得た。さらに、pKD46が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をMGCと命名した。
[0242]
(5)ybiV遺伝子の発現が増強した微生物の造成
 ybiV遺伝子の開始コドン上流に、trpプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。
[0243]
 trpプロモーターについてはpTK31を鋳型として、その他の断片についてはエシェリヒア・コリ MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、表5の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるDNAをプライマーセットとして用いてPCRを行い、各DNA断片を増幅した。
[0244]
[表5]


[0245]
 増幅DNA断片のybiV上流1およびybiV上流2は、ybiV遺伝子の開始コドンからその上流約1000bpを含む。ybiV下流1は、ybiV遺伝子の終止コドンからその下流約1000bpを含む。ybiV下流2は、ybiV遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約1000bpを含む。
[0246]
 ybiV上流1、ybiV下流、およびcat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号29および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、cat-sacB断片が挿入されたybiV周辺領域を含むDNA(以下、ybiV::cat-sacBという。)断片を得た。
[0247]
 trpプロモーター、ybiV上流2、ybiV下流2断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号29および32で表される塩基配列からなるDNAをプライマーセットに用いてPCRを行い、ybiV遺伝子の上流にtrpプロモーターが挿入されたDNA(以下、Ptrp-ybiVという。)断片を得た。
[0248]
 ybiV::cat-sacB断片を、pKD46を保持するエシェリヒア・コリ MG1655株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体(ybiV遺伝子がybiV::cat-sacBに置換した形質転換体)を得た。
[0249]
 Ptrp-ybiV断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体(ybiV::cat-sacBがPtrp-ybiVに置換した形質転換体)を得た。さらに、pKD46が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をMGVと命名した。
[0250]
 同様の方法で、MG1655 ΔalsΔpfkAのybiV遺伝子の上流にtrpプロモーターを挿入したMGV ΔalsΔpfkAを造成した。
[0251]
(6)alsE遺伝子の発現が増強した微生物の造成
 エシェリヒア・コリMG1655株の染色体DNAを鋳型として、配列番号35および36で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、PCR反応を行い、制限酵素切断領域を含むalsE遺伝子を増幅した。該PCRによって得られた増幅産物をHindIIIおよびSalIで切断し、HindIIIおよびSalIで切断した発現ベクターpUC19(タカラバイオ社製)に連結することにより、発現プラスミドpUC19_alsEを得た。
[0252]
 pUC19_alsEで、MGC、MGV、MGC ΔalsΔpfkAおよびMGV ΔalsΔpfkAを形質転換し、それぞれ、MGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEおよびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEを得た。
[0253]
 また、コントロールとして、pUC19_alsEでエシェリヒア・コリMG1655およびMG1655 ΔalsΔpfkAを形質転換し、それぞれ、MG1655/pUC19_alsE、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEを得た。
[0254]
[実施例2]
D-プシコースの製造
 実施例1で得られた、MG1655/pUC19_alsE、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、およびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE をLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mg/Lのアンピシリンを添加した。試験管生産培地[グルコース 20g/L、硫酸マグネシウム7水和物 2g/L、カザミノ酸 5g/L、硫酸アンモニウム 2g/L、クエン酸 1g/L、リン酸二水素カリウム 14g/L、リン酸水素二カリウム 16g/L、チアミン塩酸塩 10mg/L、硫酸第一鉄七水和物 50mg/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.2に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム7水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合]が4mL入った太型試験管に0.04mL植菌し、30℃で5時間培養した後、終濃度が0.1mMになるようにIPTGを添加して、MG1655/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、およびMGV/pUC19_alsEについては30℃で32時間、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、およびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEについては30℃で48時間振盪培養した。
[0255]
 培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ICS-5000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にて定量した。結果を表6に示す。
[0256]
[表6]


[0257]
 表6に示すように、yniC遺伝子およびybiV遺伝子が、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有すること、および当該遺伝子を形質転換して得られる、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にD-プシコースを製造することができることがわかった。
[0258]
[実施例3]
微生物の培養物の処理物を用いたD-プシコースの製造
 実施例1で得られた、MG1655/pUC19_alsE、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、およびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEをアンピシリン50mg/mlを含むLB培地[バクトトリプトン(ディフコ社製)10g/l、酵母エキス(ディフコ社製)5g/l、塩化ナトリウム5g/l]5mlの入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養する。
[0259]
 該培養液をアンピシリン50mg/mlを含むLB培地 50mlの入ったバッフル付三角フラスコに10%接種し、30℃、220rpmで8時間培養する。該培養液 40ml分を遠心分離し湿菌体を取得する。
[0260]
 各菌株の培養液各40ml分を、反応バッファー(0.1Mビシンバッファー(pH8.0)、10mM 塩化マンガン)で一回洗浄したのち、4mlの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後18,000×gで5分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。
[0261]
 反応は12.5mMのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度0.25mg/mlになるように添加して、30℃、330rpmで振とうすることによって行う。反応開始後90分が経過した時点で1/4量の6.7Mリン酸を添加することで反応を終了させる。
[0262]
 反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ICS-5000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にて定量する。
[0263]
[実施例4]
D-アロへプツロースの製造
 実施例1で得られた、MG1655/pUC19_alsE、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MG1655、およびMG1655 ΔalsΔpfkAをLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。
[0264]
 必要に応じて、100mg/Lのアンピシリンを添加した。試験管生産培地[グルコース 20g/L、硫酸マグネシウム7水和物 2g/L、カザミノ酸 5g/L、硫酸アンモニウム 2g/L、クエン酸 1g/L、リン酸二水素カリウム 14g/L、リン酸水素二カリウム 16g/L、チアミン塩酸塩 10mg/L、硫酸第一鉄七水和物 50mg/L、硫酸マンガン五水和物 10mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.2に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム7水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合]が4mL入った太型試験管に0.04mL植菌し、30℃で5時間培養した後、終濃度が0.1mMになるようにIPTGを添加して、30℃で48時間振盪培養した。
[0265]
 培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ICS-5000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にて定量した。結果を表7に示す。
[0266]
[表7]


[0267]
 表7に示すように、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からD-セドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にD-アロヘプツロースを製造できることがわかった。
[0268]
[実施例5]
微生物の培養物の処理物を用いたD-アロヘプツロースの製造
 実施例1で得られた、MG1655/pUC19_alsE、MG1655 ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、MGC/pUC19_alsE、MGV/pUC19_alsE、MGC ΔalsΔpfkA/pUC19_alsE、およびMGV ΔalsΔpfkA/pUC19_alsEをアンピシリン50mg/mlを含むLB培地[バクトトリプトン(ディフコ社製)10g/l、酵母エキス(ディフコ社製)5g/l、塩化ナトリウム5g/l]5mlの入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養する。
[0269]
 該培養液をアンピシリン50mg/mlを含むLB培地 50mlの入ったバッフル付三角フラスコに10%接種し、30℃、220rpmで8時間培養する。該培養液 40ml分を遠心分離し湿菌体を取得する。
[0270]
 各菌株の培養液各40ml分を、反応バッファー(0.1Mビシンバッファー(pH8.0)、10mM 塩化マンガン)で一回洗浄したのち、4mlの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後18,000×gで5分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。
[0271]
 反応は12.5mMのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度0.25mg/mlになるように添加して、30℃、330rpmで振とうすることによって行う。反応開始後90分が経過した時点で1/4量の6.7Mリン酸を添加することで反応を終了させる。
[0272]
 反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ICS-5000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)にて定量する。
[0273]
 本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、2015年7月2日付けで出願された日本特許出願(特願2015-133709)および2016年3月25日付けで出願された日本特許出願(特願2016-62331)に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

産業上の利用可能性

[0274]
 本発明のD-プシコースの製造法によれば、親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を用いることにより、微生物が有するD-アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でD-プシコースを製造することができる。また、本発明のD-アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した、糖からD-アロヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物を用いることにより、高効率でD-アロヘプツロースを製造することができる。
[0275]
配列番号1-yniCのアミノ酸配列
配列番号2-ybiVのアミノ酸配列
配列番号3-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号4-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号5-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号6-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号7-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号8-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号9-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号10-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号11-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号12-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号13-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号14-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号15-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号16-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号17-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号18-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号19-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号20-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号21-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号22-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号23-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号24-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号25-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号26-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号27-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号28-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号29-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号30-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号31-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号32-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号33-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号34-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号35-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号36-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号37-pfkAのアミノ酸配列
配列番号38-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号39-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号40-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号41-人工配列の説明:合成DNAの塩基配列
配列番号42-alsEの塩基配列
配列番号43-rpiBの塩基配列
配列番号44-rpiRの塩基配列
配列番号45-alsAの塩基配列
配列番号46-alsBの塩基配列
配列番号47-alsCの塩基配列
配列番号48-alsKの塩基配列
配列番号49-pfkAの塩基配列
配列番号50-yniCの塩基配列
配列番号51-ybiVの塩基配列
配列番号52-alsEのアミノ酸配列
配列番号53-rpiBのアミノ酸配列
配列番号54-rpiRのアミノ酸配列
配列番号55-alsAのアミノ酸配列
配列番号56-alsBのアミノ酸配列
配列番号57-alsCのアミノ酸配列
配列番号58-alsKのアミノ酸配列

請求の範囲

[請求項1]
 (i)酵素源として、親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法。
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
[請求項2]
 親株よりも、以下の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にD-プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-プシコースを採取することを特徴とする、D-プシコースの製造法。
[1]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[2]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[3]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
[請求項3]
 糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、以下の[4]~[7]のいずれか1に記載のDNAを含む組換え体DNAで親株を形質転換して得られる、該親株よりもD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、請求項1または2に記載の製造法。
[4]請求項1または2の[1]~[3]のいずれか1に記載の蛋白質をコードするDNA
[5]配列番号50または51で表される塩基配列からなるDNA
[6]配列番号50または51で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[7]配列番号50または51で表される塩基配列と95%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、D-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするDNA
[請求項4]
 糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項5]
 糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、D-アロース-6-リン酸イソメラーゼ、RpiR、D-アロース輸送蛋白質およびD-アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも1の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、請求項1~4のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項6]
 糖からD-プシコース-6-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項7]
 (i)酵素源として、親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び(ii)基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法。
[請求項8]
 親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物を培地に培養し、培養物中にD-アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からD-アロヘプツロースを採取することを特徴とする、D-アロヘプツロースの製造法。
[請求項9]
 前記微生物が糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物である請求項7または8に記載の製造法。
[請求項10]
 前記微生物がD-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物である請求項7~9のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項11]
 親株よりもアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性が増強した微生物が、以下の[8]~[10]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、請求項7~10のいずれか1項に記載の製造法。
[8]配列番号52で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[9]配列番号52で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
[10]配列番号1または2で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース-6-リン酸 3-エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
[請求項12]
 D-アロヘプツロース-7-リン酸からD-アロヘプツロースを生成する微生物が、前記親株に比べ、以下の[11]~[13]のいずれか1に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、請求項10または11に記載の製造法。
[11]配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
[12]配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
[13]配列番号1で表されるアミノ酸配列と95%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつD-プシコース-6-リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
[請求項13]
 糖からセドヘプツロース-7-リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ6-ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項9~12のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項14]
 糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも1の糖である、請求項1~13のいずれか1項に記載の製造法。
[請求項15]
 親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項1~14のいずれか1項に記載の製造法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]