Certains contenus de cette application ne sont pas disponibles pour le moment.
Si cette situation persiste, veuillez nous contacter àObservations et contact
1. (WO2017002504) PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE PARTICULES DE CAOUTCHOUC AUXQUELLES SONT LIÉES DES PROTÉINES DE LIAISON DE MEMBRANE, PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE PNEUMATIQUE, ET PROCÉDÉ DE PRODUCTION DE PRODUIT EN CAOUTCHOUC
Document

明 細 書

発明の名称 膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004  

先行技術文献

特許文献

0005  

発明の概要

発明が解決しようとする課題

0006   0007  

課題を解決するための手段

0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018  

発明の効果

0019   0020   0021  

図面の簡単な説明

0022  

発明を実施するための形態

0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079  

実施例

0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11  

図面

1   2   3  

明 細 書

発明の名称 : 膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法及びゴム製品の製造方法

技術分野

[0001]
本発明は、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法、空気入りタイヤの製造方法、及びゴム製品の製造方法に関する。

背景技術

[0002]
これまで膜結合蛋白質の調製には、膜結合蛋白質を過剰発現させた細胞(大腸菌や酵母など)を大量に培養し、界面活性剤によって膜結合蛋白質を抽出し、精製する必要があった。しかしながら、膜結合蛋白質を抽出するために最適な界面活性剤は蛋白質ごとに異なり、どれだけ適当な界面活性剤を選択できるかが膜結合蛋白質を調製する際の重要なポイントとなっていた。
また、膜結合蛋白質は、その疎水的性質ゆえに精製自体が困難なばかりか、一度界面活性剤で可溶化させると構造が変化してしまうことから、再度膜上に結合させても本来の構造をとっているとは限らないものであった。
[0003]
膜結合蛋白質の真の機能・活性を明らかにするためには正しい構造をとった蛋白質を膜に結合させた状態で機能評価を行う必要があるが、上述のような理由から、技術的に難しいとされてきた。
[0004]
最近になって、生物学的機能を担持した(native状態の)膜タンパク質の合成、回収を行うために、培養細胞に膜結合蛋白質を作らせるのではなく、無細胞蛋白合成法を使って膜結合蛋白質を作製し、細胞膜の代わりにリポソーム(人工的に作製した膜)を共存させる試みが報告されてきた(例えば、特許文献1参照)。また、無細胞蛋白合成法により膜蛋白質を合成し、生成した膜蛋白質を基板上に固定化された脂質二分子膜中に埋め込んで固定化する方法や、無細胞蛋白合成法を膜小胞の存在下に行うことで膜結合蛋白質の高収率合成が達成されることが開示されている(例えば、特許文献2、3参照)。

先行技術文献

特許文献

[0005]
特許文献1 : 特開2005-225796号公報
特許文献2 : 特開2010-132594号公報
特許文献3 : 特許第5383197号公報

発明の概要

発明が解決しようとする課題

[0006]
上述のように、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をリポソームや、脂質二分子膜、膜小胞との共存下で行うことが検討されている。ここで、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造される。そのため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していない。
他方、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。また、一般的にゴム粒子の脂質膜は一重膜といわれている。
このような状況下、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行うことは、いまだ試みられていない。
[0007]
本発明は、前記課題を解決し、無細胞蛋白合成法を用いて、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造する方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008]
本発明は、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法に関する。
[0009]
上記無細胞蛋白合成溶液は、胚芽抽出物を含むことが好ましい。
[0010]
上記胚芽抽出物は、小麦由来であることが好ましい。
[0011]
上記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、5~50g/Lであることが好ましい。
[0012]
上記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものであることが好ましい。
[0013]
上記界面活性剤は、両性界面活性剤であり、上記ゴム粒子を洗浄する際の該界面活性剤の濃度は、臨界ミセル濃度の3倍以内であることが好ましい。
[0014]
上記界面活性剤は、CHAPSであることが好ましい。
[0015]
上記蛋白質合成は、透析法により行われることが好ましい。
[0016]
上記蛋白質合成反応中に、前記膜結合蛋白質をコードするmRNAを更に加えることが好ましい。
[0017]
本発明はまた、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法に関する。
[0018]
本発明はまた、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法に関する。

発明の効果

[0019]
本発明によれば、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法であるので、無細胞蛋白合成法を用いて、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造することができ、ゴム粒子に膜結合蛋白質を本来の構造のまま結合させることができるため、ゴム粒子の性能を改変することができる。
[0020]
本発明の空気入りタイヤの製造方法は、本発明のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法であるので、ゴム粒子製造時にゴム粒子の性能を改変できる手法で得られたゴム粒子から得られるゴムから空気入りタイヤを製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮して空気入りタイヤを製造することができる。
[0021]
本発明のゴム製品の製造方法は、本発明のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法であるので、ゴム粒子製造時にゴム粒子の性能を改変できる手法で得られたゴム粒子から得られるゴムからゴム製品を製造するため、植物資源を有効に利用でき、環境に配慮してゴム製品を製造することができる。

図面の簡単な説明

[0022]
[図1] 実施例において透析法を行っている様子を示す概略図である。
[図2] 実施例1~3、比較例1におけるSDS-PAGEの試験結果を示す泳動写真である。
[図3] 比較例2におけるSDS-PAGEの試験結果を示す泳動写真である。

発明を実施するための形態

[0023]
本発明の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法は、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む。すなわち、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて(より具体的には、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを混合して)蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させることができる。
上述したように、リポソームはリン脂質、グリセロ糖脂質、コレステロール等から構成される脂質二重膜として人工的に製造されるため、製造されたリポソームの表面には蛋白質は結合していないのに対して、ゴム産生植物のラテックスから採取されるゴム粒子も脂質膜で覆われた粒子であるが、その膜は天然由来の膜であるため、その表面には植物体内で合成された蛋白質が既に結合している。このことから、蛋白質が結合していないリポソームなどに比べて、既に蛋白質が結合しており、蛋白質で覆われた状態にあるゴム粒子に更に蛋白質を結合させるのは困難であることが予想される。また、ゴム粒子に既に結合している蛋白質が無細胞蛋白合成を阻害することも懸念される。
以上のような点から、ゴム粒子共存下での無細胞蛋白合成は実現が困難であると考えられてきた。このような状況下、本発明者らは、これまでに試みられていなかった、膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成をゴム粒子の共存下で行うことを検討したところ、ゴム粒子の共存下で無細胞蛋白合成を行うことで膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を製造することができることを初めて見出した。これにより、ゴム粒子に膜結合蛋白質を本来の構造のまま結合させることができるため、ゴム粒子の性能を改変することが可能となる。
なお、本発明の製造方法は、上記工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、また、各工程は1回行われてもよいし、複数回繰り返し行われてもよい。
また、本発明において、ゴム粒子に結合する膜結合蛋白質の量は特に限定されない。
[0024]
ここで、本明細書において、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下、蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質が結合するとは、当該蛋白質合成により合成された膜結合蛋白質の全部又は一部がゴム粒子中に取り込まれる又はゴム粒子の膜構造に挿入される、といったことを意味するが、これに限らず、ゴム粒子表面又は内部に局在する等の場合をも意味する。また更には、上述のようにゴム粒子に結合している膜結合蛋白質と複合体を形成し、複合体としてゴム粒子上に存在する蛋白質もゴム粒子に結合している膜結合蛋白質の概念範囲に含まれる。
[0025]
上記ゴム粒子の由来は特に限定されず、例えば、パラゴムノキ、ロシアンタンポポ、グアユール、ノゲシ、インドゴムノキなどのゴム産生植物のラテックス由来であればよい。
[0026]
また、上記ゴム粒子の粒子径も特に限定されず、所定の粒子径のものを分取して用いてもよいし、様々な粒子径のものが含まれた状態のものを使用してもよく、所定の粒子径のものを分取して用いる場合であっても、用いられるゴム粒子としては、粒子径の小さいSmall Rubber Particles(SRP)を用いてもよいし、粒子径の大きいLarge Rubber Particles(LRP)を用いてもよい。
[0027]
上記所定の粒子径のゴム粒子を分取する方法としては、通常行われる方法を採用することができるが、例えば、遠心分離処理、より好ましくは多段階の遠心分離処理、を行う方法などが挙げられる。具体的には、500~1500×gでの遠心分離処理、1700~2500×gでの遠心分離処理、7000~9000×gでの遠心分離処理、15000~25000×gでの遠心分離処理、40000~60000×gでの遠心分離処理を順に行う方法が挙げられる。なお、各遠心分離処理の処理時間としては、20分以上が好ましく、30分以上がより好ましく、40分以上が更に好ましい。一方、120分以下が好ましく、90分以下がより好ましい。また、各遠心分離処理の処理温度としては、0~10℃が好ましく、2~8℃がより好ましく、4℃が特に好ましい。
[0028]
上記膜結合蛋白質をコードするmRNAは、翻訳されて当該膜結合蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であるが、本発明の製造方法においては、1種類の膜結合蛋白質をコードするmRNAを用いてもよいし、2種類以上の膜結合蛋白質をコードするmRNAの混合物を用いてもよい。すなわち、本発明においては、ゴム粒子に結合させる膜結合蛋白質は1種類であってもよいし、2種類以上であってもよい。
[0029]
上記膜結合蛋白質をコードするmRNAは、翻訳されて当該膜結合蛋白質を合成しうる翻訳鋳型であればその調製方法は特に制限されないが、例えば、生物由来の組織等からホットフェノール法などによりTotal RNAを抽出し、得られたTotal RNAからcDNAを合成し、目的とする膜結合蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報を元に作製したプライマーを用いて目的とする膜結合蛋白質をコードする遺伝子のDNA断片を取得して、該DNA断片を元に通常行われるインビトロでの転写反応を行うことなどにより調製することができる。
[0030]
上記膜結合蛋白質をコードするmRNAの由来は特に制限されないが、植物由来であることが好ましく、Hevea属、Sonchus属、Taraxacum属、及びParthenium属からなる群より選択される少なくとも1種の属に属する植物由来であることがより好ましい。中でも、パラゴムノキ、ノゲシ、グアユール及びロシアンタンポポからなる群より選択される少なくとも1種の植物由来であることが更に好ましく、特に好ましくは、パラゴムノキ由来であることである。
[0031]
上記植物としては、特に限定されず、例えば、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)等のHevea属;ノゲシ(Sonchus oleraceus)、オニノゲシ(Sonchus asper)、ハチジョウナ(Sonchus brachyotus)等のSonchus属;セイタカアワダチソウ(Solidago altissima)、アキノキリンソウ(Solidago virgaurea subsp. asiatica)、ミヤマアキノキリンソウ(Solidago virgaurea subsp. leipcarpa)、キリガミネアキノキリンソウ(Solidago virgaurea subsp. leipcarpa f. paludosa)、オオアキノキリンソウ(Solidago virgaurea subsp. gigantea)、オオアワダチソウ(Solidago gigantea Ait. var. leiophylla Fernald)等のSolidago属;ヒマワリ(Helianthus annuus)、シロタエヒマワリ(Helianthus argophyllus)、ヘリアンサス・アトロルベンス(Helianthus atrorubens)、ヒメヒマワリ(Helianthus debilis)、コヒマワリ(Helianthus decapetalus)、ジャイアントサンフラワー(Helianthus giganteus)等のHelianthus属;タンポポ(Taraxacum)、エゾタンポポ(Taraxacum venustum H.Koidz)、シナノタンポポ(Taraxacum hondoense Nakai)、カントウタンポポ(Taraxacum platycarpum Dahlst)、カンサイタンポポ(Taraxacum japonicum)、セイヨウタンポポ(Taraxacum officinale Weber)、ロシアンタンポポ(Taraxacum koksaghyz)、Taraxacum brevicorniculatum等のTaraxacum属;イチジク(Ficus carica)、インドゴムノキ(Ficus elastica)、オオイタビ(Ficus pumila L.)、イヌビワ(Ficus erecta Thumb.)、ホソバムクイヌビワ(Ficus ampelas Burm.f.)、コウトウイヌビワ(Ficus benguetensis Merr.)、ムクイヌビワ(Ficus irisana Elm.)、ガジュマル(Ficus microcarpa L.f.)、オオバイヌビワ(Ficus septica Burm.f.)、ベンガルボダイジュ(Ficus benghalensis)等のFicus属;グアユール(Parthenium argentatum)、アメリカブクリョウサイ(Parthenium hysterophorus)、ブタクサ(Parthenium hysterophorus)等のParthenium属;レタス(Lactuca sativa)、ベンガルボダイジュ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)等が挙げられる。
[0032]
上記膜結合蛋白質としては、生物体内においてもともと膜に結合する性質を有する蛋白質である限り特に制限されず、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質であってもよいし、自然界ではゴム粒子上には存在しない蛋白質であってもよいが、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する蛋白質が好ましい。また、当該膜結合蛋白質の膜への結合様式も特に限定されず、大きく膜表面に結合する膜結合蛋白質であってもよいし、膜に挿入されるように結合する膜結合蛋白質であってもよいし、上記膜結合蛋白質と複合体を形成して膜表面上に存在することになる蛋白質であってもよい。
[0033]
上記ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在する膜結合蛋白質としては、例えば、シス型プレニルトランスフェラーゼ(CPT)、Nogo-B receptor(NgBR)、Rubber Elongation Factor(REF)、Small Rubber Particle Protein(SRPP)、β-1,3-グルカナーゼ、Heveinなどが挙げられる。
[0034]
上記膜結合蛋白質は、結合様式の観点から、脂質膜に埋め込まれている1つ又は複数の部位を有する内在性膜結合蛋白質と、脂質膜表面のみに結合する表在性膜結合蛋白質とに大別され、ほとんどの内在性膜結合蛋白質は脂質膜全体を貫通する膜貫通ドメインを1つ又は複数有している。
[0035]
上記内在性膜結合蛋白質としては、例えば、Gタンパク質共役型受容体などの受容体として機能する蛋白質、イオンチャネルなどのチャネルとして機能する蛋白質などが挙げられ、具体的には、チトクロムb561及びムスカリン性アセチルコリン受容体(数回膜貫通型)、P450-レダクターゼ(N末一回膜貫通型)などが挙げられる。
他方、上記表在性膜結合蛋白質としては、具体的には、チトクロムb5(C末アンカー型)などが挙げられる。
[0036]
上記膜結合蛋白質としては、中でも、ゴム産生植物体内でもともとゴム粒子上に存在し、ゴム合成に関与する蛋白質であることが好ましい。このようなゴム合成に関与する蛋白質をゴム粒子に結合させることで、ゴム粒子のゴム合成能力を増強し、より効率的に反応槽(試験管、プラントなど)内でゴムを生産することが可能となる。
具体的には、CPT、NgBR、REF、及びSRPPからなる群より選択される少なくとも1種であることがより好ましく、CPT、NgBR、及びREFからなる群より選択される少なくとも1種であることが更に好ましく、CPT及び/又はNgBRが特に好ましい。
[0037]
本発明においては、ゴム粒子の共存下で膜結合蛋白質の無細胞蛋白合成が行われるが、本発明における無細胞蛋白合成溶液を用いて、従来と同様の方法で行うことができる。用いられる無細胞蛋白合成系としては、通常用いられる無細胞蛋白質合成手段を採用することができる。例えば、Rapid Translation System RTS500(Roshe Diagnostics社製)やProc.Natl.Acad.Sci.USA,97:559-564(2000)、特開2000-236896号公報、特開2002-125693号公報、特開2002-204689号公報に従って調製された小麦胚芽抽出液及びその無細胞蛋白質合成系(特開2002-204689号公報、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:14652-14657(2002))を使用することができる。中でも、胚芽抽出物を用いる系が好ましい。すなわち、上記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
[0038]
上記胚芽抽出物の由来は特に限定されないが、翻訳効率の観点からは、植物の膜結合蛋白質を無細胞蛋白合成法で合成する場合には植物由来の胚芽抽出物を用いることが好ましい。特に好ましくは小麦由来の胚芽抽出物を用いることである。すなわち、上記胚芽抽出物が小麦由来であることもまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
[0039]
上記胚芽抽出物の調製方法としては特に制限されず、通常の胚芽抽出物調製方法を採用することができるが、例えば、特開2005-218357号公報に記載された方法を採用すればよい。
[0040]
本発明において用いられる無細胞蛋白合成溶液は、更にサイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩(以降、単に「活性増強物質」とも称する。)を含むことが好ましい。該活性増強物質を含有することにより、蛋白質合成活性を更に増強させることができる。
[0041]
上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体又はその塩としては、無細胞蛋白合成活性を増強しうるものであれば特に制限されず、例えば、アデノシン-3’,5’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン-3’,5’サイクリックチオ一リン酸(Spアイソマー)及びその塩、アデノシン-3’,5’サイクリックチオ一リン酸(Rpアイソマー)及びその塩、グアノシン-3’,5’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン-3’,5’サイクリックチオ一リン酸(Spアイソマー)及びその塩、グアノシン-3’,5’サイクリックチオ一リン酸(Rpアイソマー)及びその塩、8-ブロモアデノシン-3’,5’-サイクリック一リン酸(ブロモcAMP)及びその塩、8-(4-クロロフェニルチオ)アデノシン-3’,5’-サイクリック一リン酸(クロロフェニルチオcAMP)及びその塩、5,6-ジクロロ-1-β-D-リボフラノシルべンジミダゾルアデノシン-3’,5’-サイクリック一リン酸(ジクロロリボフラノシルべンジミダゾルcAMP)及びその塩、アデノシン-2’,5’サイクリック一リン酸及びその塩、アデノシン-2’,5’サイクリックチオ一リン酸(Spアイソマー)及びその塩、アデノシン-2’,5’サイクリックチオ一リン酸(Rpアイソマー)及びその塩、グアノシン-2’,5’サイクリック一リン酸及びその塩、グアノシン-2’,5’サイクリックチオ一リン酸(Spアイソマー)及びその塩、グアノシン-2’,5’サイクリックチオ一リン酸(Rpアイソマー)及びその塩等が挙げられる。
[0042]
上記サイクリックヌクレオシド一リン酸誘導体との塩を形成する塩基としては、生化学的に許容しうるもので、当該誘導体と塩を形成するものであれば特に制限されないが、中でも好ましいものとしては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子、トリスヒドロキシアミノメタン等の有機塩基が挙げられる。
[0043]
上記活性増強物質としては、中でも、アデノシン-3’,5’サイクリック一リン酸、アデノシン-3’,5’サイクリック一リン酸ナトリウムが特に好ましい。また、これら活性増強物質は、単独で用いてもよいし、2種類以上を組み合わせて用いてもよい。
[0044]
上記活性増強物質は、あらかじめ本発明における無細胞蛋白合成溶液に加えておいてもよいが、当該溶液中で不安定である場合には、無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成反応を行う際に加えるのが好ましい。
[0045]
上記活性増強物質の添加量としては、本発明における無細胞蛋白合成溶液による蛋白質合成反応が活性化(増加)しうる濃度であれば特に制限されない。具体的には、反応系中の最終濃度として、通常0.1ミリモル/リットル以上であればよい。濃度の下限は、好ましくは0.2ミリモル/リットル、より好ましくは0.4ミリモル/リットル、特に好ましくは0.8ミリモル/リットルである。他方、濃度の上限は、好ましくは24ミリモル/リットル、より好ましくは6.4ミリモル/リットル、特に好ましくは3.2ミリモル/リットルである。
[0046]
上記活性増強物質を本発明における無細胞蛋白合成溶液に加える際の無細胞蛋白合成溶液の温度としては特に限定されないが、0~30℃が好ましく、10~26℃がより好ましい。
[0047]
本発明における無細胞蛋白合成溶液は、膜結合蛋白質をコードするmRNA(翻訳鋳型)に加え、蛋白質合成に必須の成分であるATP、GTP、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、L型アミノ酸、カリウムイオン及びマグネシウムイオン等を含有し、更には必要に応じて活性増強物質を含むものであり、このような無細胞蛋白合成溶液を用いることにより無細胞蛋白合成反応系とすることができる。
なお、上記特開2005-218357号公報に記載された方法で調製された胚芽抽出物には蛋白質合成反応に必要とされる量のtRNAが含まれているため、当該方法により調製された胚芽抽出物を無細胞蛋白合成溶液に用いる場合には、別途調製したtRNAを追加することは必須要件ではない。すなわち、無細胞蛋白合成溶液には、必要に応じてtRNAを追加すればよい。
[0048]
本発明においては、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うものであるが、具体的には蛋白質の合成前又は合成後の適当な時期に、好ましくは蛋白質合成前に、上記無細胞蛋白合成溶液にゴム粒子を加えることにより行うことができる。
また、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度は、5~50g/Lであることが好ましい。すなわち、無細胞蛋白合成溶液1Lに対してゴム粒子を5~50g共存させることが好ましい。無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が5g/L未満であると、合成された膜結合蛋白質が結合したゴム粒子を回収するために、超遠心分離等による分離処理を行った際に、ゴム層が形成されず、合成された膜結合蛋白質が結合したゴム粒子を回収することが困難になる場合がある。一方、無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が50g/Lを超えると、ゴム粒子同士が凝集し、合成された膜結合蛋白質がうまくゴム粒子に結合できなくなるおそれがある。上記ゴム粒子の濃度としてより好ましくは10~40g/L、更に好ましくは15~35g/L、特に好ましくは15~30g/Lである。
[0049]
また、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子との共存下での蛋白質合成は、その反応の進展に伴い、適宜ゴム粒子を追加していってもよい。ゴム粒子を上記無細胞蛋白合成溶液に加えてから例えば3~48時間(好ましくは3~30時間、より好ましくは3~24時間)など無細胞蛋白合成系が活性な間、上記無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とが共存するようにしておくことが好ましい。
[0050]
上記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に前処理等の特段の処理を行う必要はない。ただし、ゴム粒子上に存在する膜結合蛋白質の内、本発明の方法により結合させたい膜結合蛋白質の割合を高めるために、予め界面活性剤によりゴム粒子から膜結合蛋白質を除去してもよい。このように、本発明において用いられるゴム粒子が、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものであることもまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
[0051]
上記界面活性剤としては特に限定されず、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などが挙げられる。これらの中でも、膜上の蛋白質の変性作用が小さい点で、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤が好適に用いられ、両性界面活性剤が特に好適に用いられる。すなわち、上記界面活性剤が、両性界面活性剤であることもまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
これら界面活性剤は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用してもよい。
[0052]
上記非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンエーテル系、ポリオキシアルキレンエステル系、多価アルコール脂肪酸エステル系、糖脂肪酸エステル系、アルキルポリグリコシド系、ポリオキシアルキレンポリグルコシド系の非イオン性界面活性剤や、ポリオキシアルキレンアルキルアミン、アルキルアルカノールアミド等が挙げられる。
これらの中でも、ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤、多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤が好ましい。
[0053]
上記ポリオキシアルキレンエーテル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンポリオールアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンモノ、ジ、又はトリスチリルフェニルエーテル等が挙げられる。これらの中でも、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適に使用される。なお、前記ポリオールとしては、炭素数2~12の多価アルコールが好ましく、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、グルコース、スクロース、ペンタエリトリトール、ソルビタン等が挙げられる。
[0054]
上記ポリオキシアルキレンエステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルロジン酸エステル等が挙げられる。
上記多価アルコール脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、炭素数2~12の多価アルコールの脂肪酸エステル又はポリオキシアルキレン多価アルコールの脂肪酸エステル等が挙げられる。より具体的には、例えば、ソルビトール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル等が挙げられる。また、これらのポリアルキレンオキサイド付加物(例えば、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル等)も使用可能である。これらの中でも、ソルビタン脂肪酸エステルが好適に使用される。
上記糖脂肪酸エステル系の非イオン性界面活性剤としては、例えば、ショ糖、グルコース、マルトース、フルクトース、多糖類の脂肪酸エステル等が挙げられ、これらのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
上記アルキルポリグリコシド系の非イオン性界面活性剤としては、グリコシドとしてグルコース、マルトース、フルクトース、ショ糖などが挙げられ、例えば、アルキルグルコシド、アルキルポリグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルグルコシド、ポリオキシアルキレンアルキルポリグルコシドなどが挙げられ、これらの脂肪酸エステル類も挙げられる。また、これらすべてのポリアルキレンオキサイド付加物も使用可能である。
[0055]
これら非イオン性界面活性剤におけるアルキル基としては、例えば、炭素数4~30の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和のアルキル基が挙げられる。また、ポリオキシアルキレン基としては、炭素数2~4のアルキレン基を有するものが挙げられ、例えば、酸化エチレンの付加モル数が1~50モル程度のものが挙げられる。また、前記脂肪酸としては、例えば、炭素数4~30の直鎖又は分岐した飽和若しくは不飽和の脂肪酸が挙げられる。
[0056]
上記非イオン性界面活性剤としては、中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で、かつ蛋白質の変性作用が小さい状態で、適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、ポリオキシエチレンエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(Triton X-100)、ソルビタンモノラウレート(Span 20)が特に好ましい。
[0057]
上記両性界面活性剤としては、例えば、四級アンモニウム塩基/スルホン酸基(-SO H)タイプ、四級アンモニウム塩基/リン酸酸基タイプ(水に可溶)、四級アンモニウム塩基/リン酸酸基タイプ(水に不溶)、四級アンモニウム塩基/カルボキシル基タイプなどの両性イオン界面活性剤が挙げられる。なお、前記の酸基は塩であってもよい。
特に、前記の両性イオン界面活性剤が一分子中に+と-の両電荷を有することが好ましく、前記の酸基の酸解離定数(pKa)が、5以下であることが好ましく、4以下であることがより好ましく、3以下であることが更に好ましい。
[0058]
上記両性界面活性剤としては、具体的には、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸(CHAPSO)、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-プロパンスルホン酸(CHAPS)、N,N-ビス(3-D-グルコナミドプロピル)-コラミド、n-オクタデシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸、n-デシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸、n-ドデシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸、n-テトラデシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸{Zwittergent(商標)-3-14}、n-ヘキサデシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸、n-オクタデシル-N,N’-ジメチル-3-アミノ-1-プロパンスルホン酸等のアンモニウムスルホベタイン類、n-オクチルホスホコリン、n-ノニルホスホコリン、n-デシルホスホコリン、n-ドデシルホスホコリン、n-テトラデシルホスホコリン、n-ヘキサデシルホスホコリン等のホスホコリン類、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン類が挙げられる。これらの中でも、ゴム粒子の膜を安定化させた状態で適度に膜結合蛋白質を除去できるという理由から、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-プロパンスルホン酸(CHAPS)が特に好ましい。
[0059]
上記界面活性剤の処理濃度は、使用する界面活性剤の臨界ミセル濃度(CMC)の3倍以内であることが好ましい。臨界ミセル濃度の3倍を超える濃度の界面活性剤で処理するとゴム粒子の膜安定性が低下するおそれがある。より好ましくは2.5倍以内であり、更に好ましくは2.0倍以内である。また下限としては、0.05倍以上であることが好ましく、0.1倍以上であることがより好ましく、0.3倍以上であることが更に好ましい。
[0060]
本発明における蛋白質合成のための反応システムまたは装置としては、バッチ(回分)法(Pratt,J.M.et al.,Transcription and Tranlation,Hames,179-209,B.D.&Higgins,S.J.,eds,IRL Press,Oxford(1984))や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム(Spirin,A.S.et al.,Science,242,1162-1164(1988))、透析法(木川等、第21回日本分子生物学会、WID6)、重層法(PROTEIOS TM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書:TOYOBO社製)等が挙げられる。その他、蛋白質合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法等も用いることができる。
[0061]
中でも、重層法は操作が簡便であるという利点はあるものの反応溶液中でゴム粒子が分散してしまい、合成される膜結合蛋白質をゴム粒子に効率よく結合させることが困難であるのに対して、透析法では、合成される膜結合蛋白質の原料となるアミノ酸は透析膜を透過できるがゴム粒子は透過しないため、ゴム粒子の分散を防ぐことができ、効率的にゴム粒子に合成される膜結合蛋白質を結合させることができることから、透析法が好ましい。
[0062]
なお、上記透析法とは、本発明における蛋白質合成の合成反応液を透析内液とし、透析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、蛋白質合成を行う方法である。具体的には、例えば、翻訳鋳型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後、翻訳鋳型を添加して、適当な透析容器に入れ反応内液とする。透析容器としては、底部に透析膜が付加されている容器(第一化学社製の透析カップ12,000等)や、透析用チューブ(三光純薬社製の12,000等)が挙げられる。透析膜は、10,000ダルトン以上の分子量限界を有するものが用いられるが、12,000ダルトン程度の分子量限界を有するものが好ましい。
[0063]
上記透析外液としては、アミノ酸を含む緩衝液が用いられる。透析外液は反応速度が低下した時点で、新鮮なものと交換することにより透析効率を上昇させることができる。反応温度及び時間は用いる蛋白質合成系において適宜選択されるが、例えば、小麦由来の胚芽抽出物を用いた系においては、通常10~40℃、好ましくは18~30℃、より好ましくは20~26℃で、10分~48時間(好ましくは10分~30時間、より好ましくは10分~24時間)行うことができる。
[0064]
また、本発明における無細胞蛋白合成溶液に含まれる膜結合蛋白質をコードするmRNAは、分解されやすいことから、上記蛋白質合成反応中に適宜当該mRNAを追加することで、蛋白質の合成をより効率的に行うことができる。すなわち、上記蛋白質合成反応中に、上記膜結合蛋白質をコードするmRNAを更に加えることもまた、本発明の好適な実施形態の1つである。
なお、上記mRNAの添加時間、添加回数、添加量等は特に制限されず、適宜設定することができる。
[0065]
本発明の製造方法においては、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を行った後、必要に応じてゴム粒子を回収する工程を行ってもよい。
[0066]
上記ゴム粒子回収工程は、ゴム粒子を回収することができればその手法は特に制限されず、ゴム粒子を回収する通常行われる方法により行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離により行う方法などが挙げられる。当該遠心分離によりゴム粒子を回収する場合、その遠心力や、遠心分離処理時間、遠心分離処理温度はゴム粒子を回収できるよう適宜設定することができるが、例えば、遠心分離処理の遠心力としては、15000×g以上が好ましく、20000×g以上がより好ましく、25000×g以上が更に好ましい。一方、遠心力は大きくしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心力の上限としては、50000×g以下が好ましく、45000×g以下がより好ましい。遠心分離処理時間としては、20分以上が好ましく、30分以上がより好ましく、40分以上が更に好ましい。一方、遠心分離処理時間を長くしすぎてもそれに見合うだけの分離効果が望めないことから、遠心分離処理時間の上限としては、120分以下が好ましく、90分以下がより好ましい。
また、遠心分離処理温度としては、ゴム粒子に結合した膜結合蛋白質のタンパク活性を維持するという観点から、0~10℃が好ましく、2~8℃がより好ましく、4℃が特に好ましい。
[0067]
上記遠心分離処理を行うと、ゴム粒子が上層に、無細胞蛋白合成溶液が下層に分離される。その後、下層の無細胞蛋白合成溶液を除去することで、膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子を回収することができる。回収したゴム粒子はpHが中性の適当な緩衝液に再懸濁することで保存することができる。
[0068]
このように、本発明によれば、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行うことで、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させることができる。すなわち、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる方法であって、該方法は、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含むゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる方法もまた、本発明の1つである。
なお、膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程については、上述したとおりである。
[0069]
(ゴム製品の製造方法)
本発明のゴム製品の製造方法は、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び上記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法である。
[0070]
ゴム製品としては、ゴム(好ましくは天然ゴム)を使用して製造できるゴム製品であれば特に限定されず、例えば、空気入りタイヤ、ゴムローラ、ゴム防舷材、手袋、医療用ゴムチューブ等が挙げられる。
[0071]
ゴム製品が空気入りタイヤの場合、すなわち、本発明のゴム製品の製造方法が本発明の空気入りタイヤの製造方法の場合、上記生ゴム製品成形工程は、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程に、上記加硫工程は、上記生タイヤを加硫する加硫工程に相当する。すなわち、本発明の空気入りタイヤの製造方法は、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、上記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、上記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び上記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法である。
[0072]
<合成工程>
合成工程では、上記ゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する。ゴム粒子を用いてゴムを合成するには、例えば、反応槽(試験管、プラントなど)内などでゴム粒子とゴムの原料となる基質とを混合するなどして従来公知の方法で行うことができる。
[0073]
<混練工程>
混練工程では、上記合成工程で得られるゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る。
[0074]
上記合成工程で得られるゴムは、上記合成工程後のゴム粒子を以下の固化工程に供することにより得られる。
[0075]
<固化工程>
上記合成工程後のゴム粒子は、固化工程に供される。固化する方法としては、特に限定されず、エタノール、メタノール、アセトン等のポリイソプレノイド(天然ゴム)を溶解しない溶媒にゴム粒子を添加する方法やゴム粒子に酸を添加する方法等が挙げられる。固化工程を行うことにより、ゴム粒子からゴム(天然ゴム)を固形分として回収できる。得られたゴム(天然ゴム)は、必要に応じて乾燥してから使用すればよい。
[0076]
添加剤としては特に限定されず、ゴム製品の製造に用いられる添加剤を使用できる。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、例えば、上記ゴム粒子から得られたゴム以外のゴム成分、カーボンブラック、シリカ、炭酸カルシウム、アルミナ、クレー、タルクなどの補強用充填剤、シランカップリング剤、酸化亜鉛、ステアリン酸、加工助剤、各種老化防止剤、オイルなどの軟化剤、ワックス、硫黄などの加硫剤、加硫促進剤等が挙げられる。
[0077]
混練工程における混練は、オープンロール、バンバリーミキサー、密閉式混練機などのゴム混練装置を用いて行えばよい。
[0078]
<生ゴム製品成形工程(タイヤの場合は生タイヤ成形工程)>
生ゴム製品成形工程では、混練工程により得られた混練物から生ゴム製品(タイヤの場合は生タイヤ)を成形する。
生ゴム製品の成形方法としては特に限定されず、生ゴム製品の成形に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、混練工程により得られた混練物を、各タイヤ部材の形状に合わせて押し出し加工し、タイヤ成型機上にて通常の方法にて成形し、各タイヤ部材を貼り合わせ、生タイヤ(未加硫タイヤ)を成形すればよい。
[0079]
<加硫工程>
加硫工程では、生ゴム製品成形工程により得られた生ゴム製品を加硫することにより、ゴム製品が得られる。
生ゴム製品を加硫する方法としては特に限定されず、生ゴム製品の加硫に用いられる方法を適宜適用すればよい。例えば、ゴム製品が空気入りタイヤの場合、生ゴム製品成形工程により得られた生タイヤ(未加硫タイヤ)を加硫機中で加熱加圧して加硫することにより空気入りタイヤが得られる。
実施例
[0080]
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
[0081]
(実施例1)
〔HeveaラテックスからのTotal RNA抽出〕
パラゴムノキのラテックスからホットフェノール法により、Total RNAを抽出した。ラテックス6mLに100mM酢酸ナトリウム緩衝液6mL、10%SDS溶液1mLを添加し、さらに65℃で予温しておいた水飽和フェノールを12mL添加した。65℃で5分間インキュベートしたのち、ボルテックスで撹拌し、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った。遠心後、上清を新しいチューブに移し、フェノール:クロロホルム(1:1)溶液12mLを添加し、2分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1)溶液12mLを添加し、2分間振盪撹拌した。撹拌後、再度、室温、7000rpmで10分間遠心分離を行った後、上清を新しいチューブに移し、3M酢酸ナトリウム溶液1.2mLとイソプロパノール13mLを添加し、ボルテックスで撹拌した。Total RNAを沈殿させるために、-20℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、4℃、15000rpmで10分間遠心し、上清を取除くことでTotal RNAの沈殿を回収した。回収したTotal RNAは70%エタノールで2度洗浄したのち、RNase freeの水で溶解させた。
[0082]
〔Total RNAからcDNAの合成〕
回収したTotal RNAをもとに、cDNAを合成した。cDNAの合成はPrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara)の説明書に従って行った。
[0083]
〔cDNAからCPT遺伝子の取得〕
作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT遺伝子の取得を行った。PCRはKOD-plus-Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー1:5’-tttggatccgatggaattatacaacggtgagagg-3’
プライマー2:5’-tttgcggccgcttattttaagtattccttatgtttctcc-3’
を使用した。
[0084]
上述の方法により、CPTの遺伝子(HRT1)が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。HRT1の塩基配列を配列番号3に示した。また、HRT1のアミノ酸配列を配列番号4に示した。
[0085]
〔ベクターの構築〕
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM-T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM-T Easy Vectorに挿入し、pGEM-HRT1を作製した。
[0086]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとX-galを含むLB寒天培地上で培養し、青/白スクリーニング法によって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
[0087]
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、LB液体培地上で37℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はFast Geneプラスミドミニキット(日本ジェネティクス社製)を使用した。
回収したプラスミドに挿入された遺伝子の塩基配列に変異がないことをシークエンス解析により確認した。
[0088]
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM-HRT1を制限酵素Bam HIとNot Iで処理したのち、同様にBam HIとNot Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-MCS-N2に挿入し、pEU-His-N2-HRT1を作製した。
[0089]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、形質転換体はアンピシリンとX-galを含むLB寒天培地上で培養し、コロニーPCRによって目的遺伝子を導入した大腸菌の選別を行った。
[0090]
〔プラスミドの抽出〕
目的遺伝子を含むプラスミドで形質転換された大腸菌は、LB液体培地上で37℃で一晩培養したのち、菌体を回収し、プラスミドの回収を行った。プラスミドの回収はFast Geneプラスミドミニキット(日本ジェネティクス社製)を使用した。
[0091]
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、5段階の遠心分離によってHeveaラテックスから調製した。Heveaラテックス900mLに、20mMのジチオスレイトール(DTT)を含む1M Tris緩衝液(pH7.5)100mLを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、1000×g、2000×g、8000×g、20000×g、50000×gの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも4℃、45分で行った。50000×gでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-プロパンスルホン酸(CHAPS)を終濃度0.1~2.0×CMC(臨界ミセル濃度CMCの0.1~2.0倍)になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0092]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP1 mRNAの転写反応)〕
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したpEU-His-N2-HRT1を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
[0093]
〔mRNAの精製〕
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
[0094]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP2 透析法による蛋白合成)〕
透析カップ(MWCO 12000)(Bio-Teck社製)中に、以下の量をそれぞれ添加した。WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って全量60μLで反応溶液を調整した。反応溶液にゴム粒子を1~2mg添加した。さらに、PP容器No.2(マルエム容器)にSUB-AMIX 650μLを添加した。
透析カップをPP容器No.2にはめ、26℃で蛋白合成反応を開始した。反応開始から2度のmRNAの追加と透析外液(SUB-AMIX)の交換を行った。
反応は24時間行った。透析法を行っている様子の概略図を図1に示す。
[0095]
〔反応後のゴム粒子の回収〕
透析カップの溶液を新しい1.5μLチューブに移し、反応後のゴム粒子を超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0096]
〔ゴム粒子へのCPTの結合の確認〕
ゴム粒子へのCPTの結合は、SDS-PAGEによって確認した。蛋白質の染色はCBB染色で行った。
SDS-PAGEは日本エイドー社製のミニスラブゲル電気泳動槽を用いて行った。SDS-PAGEの分離ゲルは15%アクリルアミドゲルを使用し、泳動条件は一般的な方法で行った。マーカーとしてXL-ladder(Broad)(株式会社アプロサイエンス製)を使用した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液(蛋白合成溶液分離前)、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清(分離後上清)を少量採取しておき、合わせてSDS-PAGEに供した。
[0097]
実施例1におけるSDS-PAGEの泳動写真を図2に示す(レーン4~6)。図2より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液(蛋白合成溶液分離前)で発現が確認されたCPTがゴム粒子回収のための分離後の上清(分離後上清)には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したCPTがゴム粒子に結合したことが証明された。
[0098]
(実施例2)
〔HeveaラテックスからのTotal RNA抽出〕
実施例1と同様にして行った。
[0099]
〔Total RNAからcDNAの合成〕
実施例1と同様にして行った。
[0100]
〔cDNAからNgBR遺伝子の取得〕
作製した1st strand cDNAを鋳型にNgBR遺伝子の取得を行った。PCRはKOD-plus-Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
NgBR遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー3:5’-tttctcgagatggatttgaaacctggagctg -3’
プライマー4:5’-tttctcgagtcatgtaccataattttgctgcac -3’
を使用した。
[0101]
上述の方法により、NgBR遺伝子(HRTBP)が得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。HRTBPの塩基配列を配列番号7に示した。また、HRTBPのアミノ酸配列を配列番号8に示した。
[0102]
〔ベクターの構築〕
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM-T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM-T Easy Vectorに挿入し、pGEM-HRTBPを作製した。
[0103]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
[0104]
〔プラスミドの抽出〕
実施例1と同様にして行った。
[0105]
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM-HRTBPを制限酵素Xho Iで処理したのち、同様にXho Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU-E01-MCS-TEV-His-C1に挿入し、pEU-C1-HRTBPを作製した。
[0106]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
[0107]
〔プラスミドの抽出〕
実施例1と同様にして行った。
[0108]
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
[0109]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP1 mRNAの転写反応)〕
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したpEU-C1-HRTBPと実施例1における〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したpEU-His-N2-HRT1を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
[0110]
〔mRNAの精製〕
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
[0111]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP2 透析法による蛋白合成)〕
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
[0112]
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0113]
〔ゴム粒子へのCPT及びNgBRの結合の確認〕
ゴム粒子へのCPT及びNgBRの結合は、実施例1と同様にしてSDS-PAGEによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液(蛋白合成溶液分離前)、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清(分離後上清)を少量採取しておき、合わせてSDS-PAGEに供した。
[0114]
実施例2におけるSDS-PAGEの泳動写真を図2に示す(レーン7~9)。図2より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液(蛋白合成溶液分離前)で発現が確認されたCPT及びNgBRがゴム粒子回収のための分離後の上清(分離後上清)には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したCPT及びNgBRがゴム粒子に結合したことが証明された。
[0115]
(比較例1)
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
[0116]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP1 mRNAの転写反応)〕
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。無細胞発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-MCS-N2を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
[0117]
〔mRNAの精製〕
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
[0118]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP2 透析法による蛋白合成)〕
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
[0119]
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0120]
〔SDS-PAGE〕
反応後のゴム粒子を実施例1と同様にしてSDS-PAGEに供した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液(蛋白合成溶液分離前)、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清(分離後上清)を少量採取しておき、合わせてSDS-PAGEに供した。
[0121]
比較例1におけるSDS-PAGEの泳動写真を図2に示す(レーン1~3)。比較例1は、ベクターに発現対象遺伝子を導入していない対照実験であり、図2に示される蛋白質のバンドは主に無細胞蛋白合成反応に試薬に予め含まれる蛋白質である。比較例1と実施例1~3との比較により、発現蛋白質が実施例1~3に新たに検出される蛋白質のバンドとして確認された。
[0122]
(実施例3)
〔ArabidopsisからのTotal RNA抽出〕
シロイヌナズナからホットフェノール法によりTotal RNAを抽出した。実生を液体窒素で凍結後、乳鉢で破砕した後、80℃の水飽和フェノール、80℃のRNA抽出バッファー(100mM LiCl、100mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、1%SDS)をそれぞれ400μLずつ加え30秒間ボルテックスした。さらにクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)を400μL加え30秒間ボルテックスした。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上層を回収した。4M LiClを500μL加え混合し、-80℃で1時間静置した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を400μLのDEPC処理水に溶解した。エタノールを880μL、3M NaOAcを40μL加え混合した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を300μLの70%エタノールで洗浄した。4℃、15,000rpmで5分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を30μLのDEPC処理水に溶解した。抽出したTotal RNAから混入したゲノムDNAを除去するため、DNase処理を行った。DNase処理にはDNase I(TaKaRa社製)もしくはDNase I recombinant,RNase-free(Roche社製)を使用した。いずれの場合もメーカー推奨の条件に従い50μLの反応溶液を調製し、37℃で30分間インキュベートした。反応後にDEPC処理水を350μLとフェノールを400μL加え混合し、室温、15,000rpmで15分間遠心分離した。上層を回収し、エタノールを880μL、3M NaOAcを40μL加え混合した。4℃、15,000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を300μLの70%エタノールで洗浄した。4℃、15,000rpmで遠心分離し、上清を除去後に得られた沈殿を50μLのDEPC処理水に溶解した。
[0123]
〔Total RNAからcDNAの合成〕
実施例1と同様にして行った。
[0124]
〔cDNAからCPT遺伝子の取得〕
作製した1st strand cDNAを鋳型にCPT遺伝子の取得を行った。PCRはKOD-plus-Neo(TOYOBO社製)を使用し、説明書に従って行った。PCRは、98℃で10秒、58℃で30秒、68℃で1分を1サイクルとして、35サイクル行った。
CPT遺伝子の取得は、プライマーとして、
プライマー5:5‘-ggatccgatgttgtctattctctcttc -3’
プライマー6:5‘-actagttcaaacccgacagccaaatcg -3’
を使用した。
[0125]
上述の方法により、CPTの遺伝子が1種類(AtCPT5)得られた。得られた遺伝子について、その配列を同定し、全長の塩基配列及びアミノ酸配列を同定した。AtCPT5の塩基配列を配列番号11に示した。また、AtCPT5のアミノ酸配列を配列番号12に示した。
[0126]
〔ベクターの構築〕
上記取得したDNA断片にdA付加を行った後、pGEM-T Easy Vector System(Promega)を利用してpGEM-T Easy Vectorに挿入し、pGEM-AtCPT5を作製した。
[0127]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
[0128]
〔プラスミドの抽出〕
実施例1と同様にして行った。
[0129]
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
上記〔ベクターの構築〕で獲得したpGEM-AtCPT5を制限酵素Bam HIとSpe Iで処理したのち、同様にBam HIとSpe Iで制限酵素処理した無細胞発現用ベクターpEU-E01-His-TEV-MCS-N2に挿入し、pEU-His-N2-AtCPT5を作製した。
[0130]
〔大腸菌の形質転換〕
上記作製したVectorを用いて、実施例1と同様にして行った。
[0131]
〔プラスミドの抽出〕
実施例1と同様にして行った。
[0132]
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
[0133]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP1 mRNAの転写反応)〕
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したpEU-His-N2-AtCPT5を鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
[0134]
〔mRNAの精製〕
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
[0135]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP2 透析法による蛋白合成)〕
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
[0136]
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0137]
〔ゴム粒子へのAtCPT5の結合の確認〕
ゴム粒子へのAtCPT5の結合は、実施例1と同様にしてSDS-PAGEによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液(蛋白合成溶液分離前)、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清(分離後上清)を少量採取しておき、合わせてSDS-PAGEに供した。
[0138]
実施例3におけるSDS-PAGEの泳動写真を図2に示す(レーン10~12)。図2より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液(蛋白合成溶液分離前)で発現が確認されたAtCPT5がゴム粒子回収のための分離後の上清(分離後上清)には見られず、反応後のゴム粒子側にのみ確認できることが見て取れる。そのため、発現したAtCPT5がゴム粒子に結合したことが証明された。
[0139]
〔ゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
また、実施例1及び比較例1で回収された反応後のゴム粒子について、ゴム合成活性を以下の方法により測定した。
まず、50mM Tris-HCl(pH7.5)、2mM DTT、5mM MgCl 、15μM ファルネシル二リン酸(FPP)、100μM 1-14Cイソペンテニル二リン酸([1-14C]IPP)(比活性:5Ci/mol)、10μL ゴム粒子溶液を混合した反応溶液(Total 100μL)を調製し、30℃で16時間反応させた。
反応後、飽和NaClを200μL加え、1mLのジエチルエーテルでイソペンテノールなどを抽出した。次に、水相のポリプレニル二リン酸を1mLの食塩水飽和BuOHで抽出し、その後さらに、水相の超長鎖ポリイソプレノイド(天然ゴム)を1mLのトルエン/ヘキサン(1:1)で抽出し、放射活性を計測した。各層の放射活性は液体シンチレーションカウンターで14Cのカウントを計測した。放射活性(dpm)が高いほど、天然ゴムが多く生産されており、ゴム合成活性が高いことを示す。
[0140]
比較例1で回収された反応後のゴム粒子のゴム合成活性を100%としたときの、実施例1で回収された反応後のゴム粒子のゴム合成活性は、200%であった。
この結果から、CPT結合後のゴム粒子は、CPTが結合していないゴム粒子と比較して、ゴム粒子のゴム合成活性が上昇していることが分かる。このことからも実施例1において、CPTがゴム粒子に結合していることが証明された。
[0141]
(比較例2)
〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕
無細胞蛋白合成法用ベクターには、特開2005-218357号公報に記載されるGFP遺伝子を含むプラスミドGFP/pEU(国際公開01/27260号公報)を使用した。
[0142]
〔ゴム粒子の調製〕
実施例1と同様にして行った。
[0143]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP1 mRNAの転写反応)〕
無細胞蛋白合成は、WEPRO7240H Expression kit((株)セルフリーサイエンス製)を使用して行った。上記〔無細胞蛋白合成法用ベクターの作製〕で獲得したGFP/pEUを鋳型に、WEPRO7240H Expression kitのプロトコルに従って、mRNAの転写反応を行った。
[0144]
〔mRNAの精製〕
転写反応後、得られたmRNAはエタノール沈殿により精製した。
[0145]
〔無細胞蛋白合成反応(STEP2 透析法による蛋白合成)〕
上記mRNAを用いた以外は、実施例1と同様にして行った。
[0146]
〔反応後のゴム粒子の回収〕
実施例1と同様にして反応後のゴム粒子を回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0147]
〔ゴム粒子へのGFP(Green Fluorescent Protein)の結合の確認〕
ゴム粒子へのGFPの結合は、実施例1と同様にしてSDS-PAGEによって確認した。
なお、無細胞蛋白合成反応後の透析カップの溶液(蛋白合成溶液分離前)、及び、反応後のゴム粒子を回収するための超遠心分離を行った後の上清(分離後上清)を少量採取しておき、合わせてSDS-PAGEに供した。
[0148]
比較例2におけるSDS-PAGEの泳動写真を図3に示す(レーン1~3)。図3より、矢印部分で示した反応直後の無細胞蛋白合成溶液(蛋白合成溶液分離前)で発現が確認されたGFPがゴム粒子回収のための分離後の上清(分離後上清)にしか見られず、反応後のゴム粒子側に確認できないことが見て取れる。そのため、発現した非膜結合型のGFPはゴム粒子に結合しなかったことが証明された。
[0149]
(比較例3)
〔ゴム粒子の調製〕
ゴム粒子は、5段階の遠心分離によってHeveaラテックスから調製した。Heveaラテックス900mLに、20mMのジチオスレイトール(DTT)を含む1M Tris緩衝液(pH7.5)100mLを添加し、ラテックス溶液を調製した。得られたラテックス溶液を、1000×g、2000×g、8000×g、20000×g、50000×gの異なる遠心速度で段階的に遠心分離した。遠心分離はいずれも4℃、45分で行った。50000×gでの遠心分離で残ったゴム粒子層に、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアミノ]-プロパンスルホン酸(CHAPS)を終濃度1.0~2.0×CMC(臨界ミセル濃度CMCの1.0~2.0倍)になるように加え、ゴム粒子を洗浄した。洗浄処理後、洗浄されたゴム粒子を超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって回収し、等量の2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5)に再懸濁した。
[0150]
〔ゴム粒子からの蛋白質の引きはがし〕
ゴム粒子を10×CMC(臨界ミセル濃度CMCの10倍)の濃度のCHAPSで4℃で一晩処理することで蛋白質の引きはがしを行った。処理後、超遠心分離(40000×g、4℃、45分)によって洗浄済みゴム粒子と剥がれた蛋白質を含む水層に分離した。
[0151]
〔透析法によるゴム粒子への蛋白質の再結合〕
得られた洗浄済みゴム粒子に蛋白質を再結合させるために、洗浄済みゴム粒子と剥がれた蛋白質を含む水層を再度混合し、透析膜で包んだ。透析膜は内溶液の1000倍量の外液(2mMのジチオスレイトール(DTT)を含む100M Tris緩衝液(pH7.5))中に沈め、透析を行った。外液は2時間ごとに新しいものに変え、計8時間透析を行い、界面活性剤を除去した。
[0152]
〔ゴム粒子のゴム合成活性の測定〕
上記透析によりゴム粒子に蛋白質が再結合していれば、ゴム粒子のゴム合成活性は透析前より回復しているはずである。そのため、ゴム粒子のゴム合成活性を透析前と透析後で比較した。ゴム粒子のゴム合成活性の測定は、上記と同様にして行った。
そして、上記〔ゴム粒子の調製〕で回収されたゴム粒子(無処理ゴム粒子)のゴム合成活性を100%としたときの、ゴム合成活性量を百分率表示した。
結果を表1に示す。
[0153]
[表1]


[0154]
表1より、ゴム粒子のゴム合成活性は、透析前後で回復していないことが分かる。このことから、ゴム粒子と蛋白質を混合しただけではゴム粒子に蛋白質を結合させることはできない、ということが示された。
[0155]
(配列表フリーテキスト)
配列番号1:プライマー1
配列番号2:プライマー2
配列番号3:パラゴムノキ由来のHRT1をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号4:パラゴムノキ由来のHRT1のアミノ酸配列
配列番号5:プライマー3
配列番号6:プライマー4
配列番号7:パラゴムノキ由来のHRTBPをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号8:パラゴムノキ由来のHRTBPのアミノ酸配列
配列番号9:プライマー5
配列番号10:プライマー6
配列番号11:アラビドプシス由来のAtCPT5をコードする遺伝子の塩基配列
配列番号12:アラビドプシス由来のAtCPT5のアミノ酸配列

請求の範囲

[請求項1]
膜結合蛋白質をコードするmRNAを含む無細胞蛋白合成溶液とゴム粒子とを共存させて蛋白質合成を行い、ゴム粒子に膜結合蛋白質を結合させる工程を含む膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項2]
前記無細胞蛋白合成溶液が、胚芽抽出物を含む請求項1記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項3]
前記胚芽抽出物が、小麦由来である請求項2記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項4]
前記無細胞蛋白合成溶液と共存させるゴム粒子の濃度が、5~50g/Lである請求項1~3のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項5]
前記ゴム粒子は、前記無細胞蛋白合成溶液と共存させる前に、界面活性剤で洗浄されたものである請求項1~4のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項6]
前記界面活性剤が、両性界面活性剤であり、
前記ゴム粒子を洗浄する際の該界面活性剤の濃度が、臨界ミセル濃度の3倍以内である請求項5記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項7]
前記界面活性剤が、CHAPSである請求項5又は6記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項8]
前記蛋白質合成が、透析法により行われる請求項1~7のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項9]
前記蛋白質合成反応中に、前記膜結合蛋白質をコードするmRNAを更に加える請求項1~8のいずれかに記載の膜結合蛋白質を結合させたゴム粒子の製造方法。
[請求項10]
請求項1~9のいずれかに記載のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、前記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生タイヤを成形する生タイヤ成形工程、及び前記生タイヤを加硫する加硫工程を含む空気入りタイヤの製造方法。
[請求項11]
請求項1~9のいずれかに記載のゴム粒子の製造方法により得られるゴム粒子を用いてゴムを合成する合成工程、前記ゴムと、添加剤とを混練して混練物を得る混練工程、前記混練物から生ゴム製品を成形する生ゴム製品成形工程、及び前記生ゴム製品を加硫する加硫工程を含むゴム製品の製造方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]