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1. (WO2016199898) NOUVELLE ENZYME MUTANTE SOUS FORME ACTIVE, ET PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'UNE PROTÉINE MUTANTE SOLUBILISÉE
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N° de publication : WO/2016/199898 N° de la demande internationale : PCT/JP2016/067392
Date de publication : 15.12.2016 Date de dépôt international : 10.06.2016
Demande présentée en vertu du Chapitre 2 : 08.02.2017
CIB :
C12N 15/09 (2006.01) ,C12N 9/00 (2006.01) ,C12N 9/02 (2006.01) ,C12N 9/04 (2006.01) ,C12N 9/88 (2006.01) ,C12N 15/01 (2006.01)
Déposants : TOYAMA PREFECTURAL UNIVERSITY[JP/JP]; 5180, Kurokawa, Imizu-shi, Toyama 9390398, JP
Inventeurs : ASANO Yasuhisa; JP
MATSUI Daisuke; JP
OKU Yuko; JP
Mandataire : SIKS & CO.; 8th Floor, Kyobashi-Nisshoku Bldg., 8-7, Kyobashi 1-chome, Chuo-ku, Tokyo 1040031, JP
Données relatives à la priorité :
2015-11780810.06.2015JP
Titre (EN) ACTIVE-FORM MUTANT ENZYME PRODUCTION METHOD, NEW ACTIVE-FORM MUTANT ENZYME, AND SOLUBILIZED MUTANT PROTEIN PRODUCTION METHOD
(FR) NOUVELLE ENZYME MUTANTE SOUS FORME ACTIVE, ET PROCÉDÉ DE PRODUCTION D'UNE PROTÉINE MUTANTE SOLUBILISÉE
(JA) 活性型変異酵素の製造方法および新規活性型変異酵素、並びに可溶性化変異タンパク質の製造方法
Abrégé :
(EN) The present invention provides a method for expressing, as a soluble protein or an active-form mutant enzyme, an enzyme that cannot be expressed as a soluble protein or an active-form enzyme in a heterologous expression system or that is obtained in a minute amount even when an active-form enzyme is expressed, the method including a technique for selecting an effective mutation introduction site and a mutated amino acid. The present invention also provides a new active-form mutant enzyme obtained from this technique. The present invention pertains to a method for producing a solubilized mutant protein or an active-form mutant enzyme and involves: specifying an insoluble protein or an inactive-form enzyme; specifying a hydrophilic amino acid that is present in a hydrophobic domain and/or a hydrophobic amino acid that is present in a hydrophilic domain of an α-helix structure portion of the insoluble protein or the inactive-form enzyme and preparing a gene that codes for an amino acid sequence in which a substitution is made to the hydrophilic amino acid that is present in the hydrophobic domain and/or the hydrophobic amino acid that is present in the hydrophilic domain, or specifying an amino acid that is relatively less preserved in terms of sequence identity in an amino acid sequence of the inactive-form enzyme, and preparing a gene that codes for an amino acid sequence in which this amino acid is substituted with an amino acid that is more preserved than the amino acid; obtaining proteins by expressing the gene in a heterologous expression system; and selecting, from the obtained proteins, a solubilized mutant protein or an active-form mutant enzyme.
(FR) La présente invention concerne un procédé permettant d'exprimer, sous forme d'une protéine soluble ou d'une enzyme mutante sous forme active, une enzyme ne pouvant être exprimée sous forme d'une protéine soluble ou d'une enzyme sous forme active dans un système d'expression hétérologue ou qui est obtenue en quantité infime, même lorsqu'une enzyme sous forme active est exprimée, le procédé comprenant une technique pour la sélection d'un site d'introduction de mutation efficace et d'un acide aminé muté. La présente invention concerne également une nouvelle enzyme mutante sous forme active obtenue par le biais de cette technique. La présente invention se rapporte à un procédé de production d'une protéine mutante solubilisée ou d'une enzyme mutante sous forme active et comprenant les étapes consistant : à spécifier une protéine insoluble ou une enzyme sous forme inactive; à spécifier un acide aminé hydrophile qui est présent dans un domaine hydrophobe et/ou un acide aminé hydrophobe qui est présent dans un domaine hydrophile d'un partie structure en hélice α de la protéine insoluble ou de l'enzyme sous forme inactive et à préparer un gène qui code pour une séquence d'acides aminés dans laquelle une substitution est réalisée sur l'acide aminé hydrophile qui est présent dans le domaine hydrophobe et/ou l'acide aminé hydrophobe qui est présent dans le domaine hydrophile, ou à spécifier un acide aminé qui est relativement moins conservé en termes d'identité de séquence dans une séquence d'acides aminés de l'enzyme sous forme inactive, et à préparer un gène qui code pour une séquence d'acides aminés dans laquelle l'acide aminé est substitué par un acide aminé qui est plus conservé que l'acide aminé; à obtenir des protéines par l'expression du gène dans un système d'expression hétérologue; et à sélectionner, à partir des protéines obtenues, une protéine mutante solubilisée ou une enzyme mutante sous forme active.
(JA) 本発明は、異種発現系で活性型酵素または可溶性タンパク質として発現されない、または活性型酵素が発現しても微量である酵素を活性型変異酵素または可溶性タンパク質として発現させる方法であって、有効な変異導入位置及び変異後のアミノ酸を選定する手法を含む方法を提供する。さらにこの手法により得られた新規な活性型変異酵素も提供する。本発明は、不活性型酵素または不溶性タンパク質を特定し、不活性型酵素または不溶性タンパク質のαへリックス構造部分の親水性領域に存在する疎水性アミノ酸、疎水性領域に存在する親水性アミノ酸を特定し、親水性領域に存在する疎水性アミノ酸、疎水性領域に存在する親水性アミノ酸を置換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を調製し、または、不活性型酵素のアミノ酸配列中の配列同一性の保存性が相対的に低いアミノ酸を特定し、このアミノ酸を、当該アミノ酸より保存性が高いアミノ酸で置換したアミノ酸配列をコードする遺伝子を調製し、この遺伝子を、異種発現系で発現させてタンパク質を得、得られたタンパク質から活性型変異酵素または可溶性化変異タンパク質を選択する、活性型変異酵素または可溶性化変異タンパク質の製造方法に関する。
États désignés : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IR, IS, JP, KE, KG, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PA, PE, PG, PH, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SA, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, RW, SD, SL, ST, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
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Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, KM, ML, MR, NE, SN, TD, TG)
Langue de publication : japonais (JA)
Langue de dépôt : japonais (JA)