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1. (WO2011131192) NOUVEAU PROCÉDÉ D'AMPLIFICATION DE SÉQUENCES NUCLÉOTIDIQUES
Dernières données bibliographiques dont dispose le Bureau international   

N° de publication :    WO/2011/131192    N° de la demande internationale :    PCT/DK2011/000026
Date de publication : 27.10.2011 Date de dépôt international : 14.04.2011
CIB :
C12Q 1/68 (2006.01)
Déposants : STATENS SERUM INSTITUT [DK/DK]; Orestads Boulevard 5 DK-2300 Copenhagen S (DK) (Tous Sauf US).
ERLANDSSON, Lena [SE/SE]; (SE) (US Seulement).
FOMSGAARD, Anders [DK/DK]; (DK) (US Seulement).
NIELSEN, Lars-Peter [DK/DK]; (DK) (US Seulement)
Inventeurs : ERLANDSSON, Lena; (SE).
FOMSGAARD, Anders; (DK).
NIELSEN, Lars-Peter; (DK)
Mandataire : TOFT, Lars; Statens Serum Institut Corporate Affairs Orestads Boulevard 5 DK-2300 Copenhagen S (DK)
Données relatives à la priorité :
PA 2010 00356 22.04.2010 DK
Titre (EN) NEW NUCLEOTIDE SEQUENCE AMPLIFICATION METHOD
(FR) NOUVEAU PROCÉDÉ D'AMPLIFICATION DE SÉQUENCES NUCLÉOTIDIQUES
Abrégé : front page image
(EN)Current method of choice for virus identification in many diagnostic laboratories is specific real-time polymerase chain reaction (PCR), where sequence-specific primer pairs are used for each virus, or a group of viruses. This is a rapid, sensitive and specific method that is easy to perform, but can have limited sensitivity that may lead to falsely negative results. A random pre-amplification of the sample prior to a specific PCR could be helpful in clinical cases where the detection limit of the real-time PCR assay is not sensitive enough. This could be when only very limited amount of sample is available or where the pathogen is present at very low amounts. The present invention discloses a nucleotide amplification method comprising of random unbiased whole genome amplification (WGA) pre-amplification followed by a specific amplification performed in the same vial or tube. The two reaction mixtures are separated by a wax layer so the reaction mixture on top of the wax layer is the pre-amplification mixture and the reaction mixture under the wax layer is the specific amplification mixture. Performing a random pre-amplification before the real-time PCR would considerably increase the sensitivity of the specific real-time PCR when testing samples with expected low copy number or precious and irretrievable samples. Performing the two reactions after each other in the same tube minimize the risk for PCR contamination since no transfer of pre-amplified sample is needed. The described method would work on any DNA of any origin, both from non-cellular sources (virus) and from cellular sources (bacteria, archae, eukaryotes), as well as on cDNA.
(FR)Le procédé courant choisi pour l'identification de virus dans de nombreux laboratoires de diagnostic est la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel spécifique, où des paires d'amorces spécifiques de la séquence sont utilisées pour chaque virus ou pour un groupe de virus. Ceci est un procédé rapide, sensible et spécifique qui est facile à mettre en œuvre, mais peut présenter une sensibilité limitée qui peut conduire à des résultats de faux négatifs. Selon l'invention, une pré-amplification aléatoire de l'échantillon avant une PCR spécifique pourrait être utile dans des cas cliniques où la limite de détection de l'essai de PCR en temps réel n'est pas suffisamment sensible. Ceci pourrait avoir lieu quand seulement une quantité très limitée de l'échantillon est disponible ou lorsque le pathogène est présent en quantités très faibles. La présente invention concerne un procédé d'amplification de nucléotides comprenant une pré-amplification aléatoire non biaisée du type amplification du génome entier (WGA), suivie par une amplification spécifique réalisée dans le même flacon ou tube. Les deux mélanges réactionnels sont séparés par une couche de cire afin que le mélange réactionnel au-dessus de la couche de cire soit le mélange de pré-amplification et le mélange réactionnel au-dessous de la couche de cire soit l'amplification spécifique. La mise en œuvre d'une pré-amplification aléatoire avant la PCR en temps réel augmenterait considérablement la sensibilité de la PCR en temps réel spécifique lors de tests d'échantillons pour lesquels on s'attend à un faible nombre de copies ou d'échantillons précieux ou non récupérables. La mise en œuvre des deux réactions l'une après l'autre dans le même tube réduit a un minimum le risque de contamination de la PCR puisqu'aucun transfert d'échantillon pré-amplifié n'est nécessaire. Le procédé décrit fonctionnerait sur tout ADN de n'importe quelle origine, provenant à la fois de sources non cellulaires (virus) et de sources cellulaires (bactéries, archées, eucaryotes) ainsi que sur de l'ADNc.
États désignés : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CL, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PE, PG, PH, PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TH, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LR, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Office eurasien des brevets (OEAB) (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM)
Office européen des brevets (OEB) (AL, AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, RS, SE, SI, SK, SM, TR)
Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Langue de publication : anglais (EN)
Langue de dépôt : anglais (EN)