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1. (WO2009141121) PROCÉDÉ DE GÉNÉRATION RAPIDE DE PROFILS DE PHOSPHORYLATION, DÉTECTION DE SITES DE PHOSPHORYLATION IN VIVO DE KINASES ET DE PHOSPHATASES ET LEUR UTILISATION EN TANT QUE MARQUEURS DE DIAGNOSTIC DANS DES CELLULES, DES TISSUS ET DES LIQUIDES CORPORELS
Dernières données bibliographiques dont dispose le Bureau international   

N° de publication :    WO/2009/141121    N° de la demande internationale :    PCT/EP2009/003573
Date de publication : 26.11.2009 Date de dépôt international : 19.05.2009
CIB :
G01N 33/50 (2006.01), G01N 33/68 (2006.01), C12Q 1/37 (2006.01)
Déposants : ETH ZURICH [CH/CH]; ETH Transfer Rämistrasse 101 CH-8092 Zürich (CH) (Tous Sauf US).
AEBERSOLD, Ruedi [CH/CH]; (CH) (US Seulement).
BODENMILLER, Bernd [DE/CH]; (CH) (US Seulement).
PICOTTI, Paola [IT/CH]; (CH) (US Seulement)
Inventeurs : AEBERSOLD, Ruedi; (CH).
BODENMILLER, Bernd; (CH).
PICOTTI, Paola; (CH)
Données relatives à la priorité :
08009456.8 23.05.2008 EP
Titre (EN) METHOD FOR RAPID GENERATION OF PHOSPHORYLATION PROFILES, THE DETECTION OF IN VIVO PHOSPHORYLATION SITES OF KINASES AND PHOSPHATASES AND THEIR USE AS DIAGNOSTIC MARKERS IN CELLS, TISSUES AND BODY FLUIDS
(FR) PROCÉDÉ DE GÉNÉRATION RAPIDE DE PROFILS DE PHOSPHORYLATION, DÉTECTION DE SITES DE PHOSPHORYLATION IN VIVO DE KINASES ET DE PHOSPHATASES ET LEUR UTILISATION EN TANT QUE MARQUEURS DE DIAGNOSTIC DANS DES CELLULES, DES TISSUS ET DES LIQUIDES CORPORELS
Abrégé : front page image
(EN)The invention relates to a new method for the detection and identification of direct and/or indirect phosphorylation/dephosphorylation sites of protein kinases and phosphatases as well as to generate phosphorylation profiles of cells, tissues and body fluids at different physiological states. The such identified phosphorylation/dephosphorylation sites and phosphorylation profiles and their diagnostic markers can be used to monitor kinase and/or phosphatase activity, to support drug target discovery (e.g. by identifying which kinases/pathways are disregulated in a given diseased state), to classify diseased tissues for optimal treatment and for drug development (e.g. kinase inhibitor screens, off target effect assessment, pharmacokinetics,...). It furthermore comprises the generation of corresponding specific mass spectrometry assays for the detection and quantification of a list or library of identified specific kinase and/or phosphatase targets. Furthermore it pertains to the use of such a selective diagnostic marker and/or of such a mass spectrometry assay, respectively, for the measurement and/or analysis of kinase and/or phosphatase activity, preferentially under differentially influenced conditions by comparison of proteome samples subjected to and not subjected to physiologically/biologically/chemically active compounds. The method in particular includes the following steps: (1a) selective isolation of phosphopeptides from a digest of a reference (sub)proteome to form at least one reference phosphopeptide isolate; (1b) selective isolation of phosphopeptides from a cell state which yields the (sub)proteome of interest (POI). The cell states and therefore the POI can comprise first, a proteome in which a defined kinase or phosphatase gene was knocked-out, knocked down, over expressed or the kinase or phosphatase was inhibited or activated or was temperature sensitive or lacked its activity (kinase dead) or second, a proteome in which a kinase and/or phosphatase or signalling pathway was disregulated (e.g. cancer cells/tissue) or third, a proteome from diseased tissue in which one or several kinases or phosphatases or signalling pathways were disregulated to form at least one phosphopeptide isolate of interest; (2) generation of individual LC-MS(/MS) maps (phosphoproteome patterns) for each phosphopeptide isolate using quantitative (label-free) mass spectrometry; (3) correlation and comparison of the at least one phosphoproteome pattern of the reference phosphopeptide isolate with the at least one phosphoproteome pattern of the POI phosphopeptide isolate and determination of phosphopeptide features showing differential behaviour between the wild-type and the POI phosphopeptide isolate; (4) collecting data and determination of correspondingly regulated phosphopeptide features according to steps (1b)-(3) for at least one further or several or all possible POI(s) (as defined under 1b) (5) the determination of at least one or a list of regulated phosphopeptide feature(s) uniquely regulated by a specific kinase or phosphatase, between cell states (POIs) yielding its selective diagnostic marker(s).
(FR)L'invention porte sur un nouveau procédé pour la détection et l'identification de sites de phosphorylation/déphosphorylation directe et/ou indirecte de protéines kinases et phosphatases ainsi que pour générer des profils de phosphorylation de cellules, de tissus et de liquides corporels à différents états physiologiques. Ces sites de phosphorylation/déphosphorylation identifiés et profils de phosphorylation et leurs marqueurs de diagnostic peuvent être utilisés pour surveiller une activité kinase et/ou phosphatase, pour venir à l'appui d'une découverte de cible de médicament (par exemple, par identification des kinases/voies qui sont dérégulées dans un état de maladie donné), pour classer les tissus atteints de maladies pour un traitement optimal et pour un développement de médicament (par exemple, cribles d'inhibiteur de kinase, évaluation d'effet hors cible, pharmacocinétique,…). L'invention comprend de plus la génération d'essais par spectrométrie de masse spécifiques correspondants pour la détection et la quantification d'une liste ou d'une bibliothèque de cibles de kinase et/ou phosphatase spécifiques identifiées. De plus, l'invention porte sur l'utilisation d'un tel marqueur de diagnostic sélectif et/ou d'un tel essai par spectrométrie de masse respectivement pour la mesure et/ou l'analyse d'une activité kinase et/ou phosphatase, de préférence dans les conditions influencées de façon différentielle par comparaison à des échantillons de protéome soumis et non soumis à des composés physiologiquement/biologiquement/chimiquement actifs. Le procédé comprend notamment : (1a) l'isolement sélectif de phosphopeptides à partir d'un produit de digestion d'un (sous)protéome de référence pour former au moins un isolat de phosphopeptide de référence; (1b) l'isolement sélectif de phosphopeptides à partir d'un état de cellule qui produit le (sous)protéome d'intérêt (POI). Les états de cellule et, par conséquent, le POI peuvent comprendre tout d'abord un protéome dans lequel un gène de kinase ou de phosphatase défini a été inactivé, désactivé, surexprimé, ou la kinase ou phosphatase a été inhibée ou activée ou était sensible à la température ou était dépourvue de son activité (kinase morte) ou en second lieu, un protéome dans lequel une kinase et/ou phosphatase ou voie de signalisation a été dérégulée (par exemple, cellules cancéreuses/tissu cancéreux) ou, en troisième lieu, un protéome provenant d'un tissu atteint de maladie dans lequel une ou plusieurs kinases ou phosphatases ou voies de signalisation ont été dérégulées pour former au moins un isolat de phosphopeptide d'intérêt; (2) la génération de cartes LC-MS(/MS) individuelles (motifs de phosphoprotéome) pour chaque isolat de phosphopeptide à l'aide d'une spectrométrie de masse quantitative (sans marqueur); (3) la corrélation et la comparaison du ou des motifs de phosphoprotéome de l'isolat de phosphopeptide de référence avec le ou les motifs de phosphoprotéome de l'isolat de phosphopeptide de POI et la détermination de caractéristique de phosphopeptide présentant un comportement différentiel entre le type sauvage et l'isolat de phosphopeptide de POI; (4) la collecte de données et la détermination des caractéristiques de phosphopeptide régulées en correspondance selon les étapes (1b) à (3) pour au moins une autre ou plusieurs ou la totalité des POI possibles (tel que défini sous 1b) (5) la détermination d'au moins une caractéristique de phosphopeptide régulée ou d'une liste de ces caractéristiques, qui ont été régulées de manière unique par une kinase ou phosphatase spécifique, entre des états de cellule (POI) produisant son marqueur ou ses marqueurs de diagnostic sélectifs.
États désignés : AE, AG, AL, AM, AO, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, RO, RS, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, ST, SV, SY, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW.
Organisation régionale africaine de la propriété intellectuelle (ARIPO) (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW)
Office eurasien des brevets (OEAB) (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM)
Office européen des brevets (OEB) (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, HR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MK, MT, NL, NO, PL, PT, RO, SE, SI, SK, TR)
Organisation africaine de la propriété intellectuelle (OAPI) (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
Langue de publication : anglais (EN)
Langue de dépôt : anglais (EN)