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1. (WO2007018047) PEPTIDE DÉRIVÉ D’ANTIGÈNE DE CARCINOME À CELLULES SQUAMEUSES SE LIANT À LA MOLÉCULE HLA-A24
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HLA-A24分子結合性扁平上皮癌抗原由来ペプチド

技術分野

[0001] 本発明は、 HLA-A24陽性扁平上皮癌患者に対する特異的免疫療法に有用な扁 平上皮癌抗原由来ペプチドに関する。

背景技術

[0002] 扁平上皮癌抗原 (SCCA)は、扁平上皮癌 (SCC)細胞に発現する癌関連抗原である

(非特許文献 1)。 SCCAは、正常扁平上皮や健常人の唾液、気道内分泌物、および 羊水でも検出されるが (非特許文献 2、 3)、 SCCの有用なマーカーと考えられている( 非特許文献 4)。現在 SCCAは、頭頸部、肺、および外陰の SCCで無病生存率および 全生存率の予測に使用されている(非特許文献 5— 7)。さらに、子宮頸部 SCC患者 で SCCAレベルの上昇が疾患の重症度と相関すること力いくつかの研究によって確 認された(非特許文献 8— 12)。これら一連の証拠は、 SCCAが扁平上皮癌に対する 抗腫瘍免疫療法の開発にとって有望な候補分子であることを示唆する。

[0003] 本発明者らは、各種癌関連抗原および癌反応性の細胞傷害性 T細胞 (CTL)に認 識されるそれらのェピトープペプチドを同定し (非特許文献 13— 15)、各種癌に対す るペプチド基盤ワクチンの臨床試験を行っている(非特許文献 16— 19)。この臨床試 験において、幾つかの CTL誘導性ペプチドは、 in vivoで細胞性免疫応答と液性免疫 応答の両方を引き起こす能力を示した。さらに、ペプチドワクチン投与をうけた進行 性癌患者のワクチン投与後の血清中の抗ペプチド抗体のレベルは、その全生存率と 非常によく一致した (非特許文献 20)。

[0004] 特午文献 1 : Kato H, Tongoe T. Radioimmunoassay for tumor antigen of human ce rvical squamous cell carcinoma. Cancer 1977;40:1621-8.

非特許文献 2 : Kato H, Morioka H, Aramaki S, Torigoe T. Radioimmunoassay for tu mor— antigen of human cervical squamous cell carcinoma. Cell Mol Biol 1979;25:51-6

非特許文献 3 : Takeshima S, Suminami Y, Takeda O, Abe H, Kato H. Origin of CA1

25 and SCC antigen in human amniotic fluid. Asia Oceania J Obstet Gynaecol 1993; 19: 199-204.

非特言午文献 4 : Kato H, Miyauchi F, Morioka H, Fujino T, Torigoe T. Tumor antigen of human cervical squamous cell carcinoma: correlation of circulation levels with dis ease progress. Cancer 1979;43:585-90.

非特言午文献 5 : Lara PC, Cuyas JM. The role of squamous cell carcinoma antigen in t he management of laryngeal and hypopharyngeal cancer. Cancer 1995;76:758-64. 非特言午文献 b : Snyderman CH, D 5 Amico F, Wagner R, Eibling DE. A reappraisal of t he squamous cell carcinoma antigen as a tumor marker in head and neck cancer. Arc h Otolaryngol Head Neck Surg 1995;121:1294-7.

非特言午文献 7 : Hefler L, Obermair A, Tempfer C, et al. Serum concentration of squa mous cell carcinoma antigen in patients with vulvar intraepithelial neoplasia and velv ar cancer. Int J Cancer 1999;84 :299—303.

非特許文献 8 : Senekjian EK, Young JM, Weiser PA, Spencer CE, Magic SE, Herbst AL. An evaluation of squamous cell carcinoma antigen in patients with cervical squa mous cell carcinoma. Am J Obstet Gynecol 1987;157:433-9.

非特許文献 9 : Duk JM, de Bruijn HWA, Groenier KH, et al. Cancer of the uterine c ervix: sensitivity and specificity of serum squamous cell carcinoma antigen determina tions. Gynecol Oncol 1009;89:186-94.

非特言午文献 10 : Bolli JA, Doering DL, Bosscher JR, et al. Squamous cell carcinoma a ntigen: clinical utility in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Gynecol One ol 1994;55:169-73.

非特言午文献 11 : Daver A, Dalifard I, Pons- Anicet D, et al. Diagnosis value of SCC - T A— 4 determination in 4 localizations of epidermoid cancers. An experience of the FN CLCC subgroup of ratio— nalaysis. Bull Cancer 1990;77:781-92.

非特許文献 12 : Bolger BS, Dabbas M, Lopes A, Monaghan JM. Prognostic value of p reoperative squamous cell carcinoma antigen level in patients surgically treated cerv ical carcinoma. Gynecol Oncol 1997;65:309-13.

非特許文献 13 : Ito M, Shichijo S, Tsuda N, Ochi M, Harashima N, Saito N, Itoh K. Molecular Basis of T Cell-mediated Recognition of Pancreatic Cancer Cells. Cancer Res 2001;61: 2038-46·

非特言午文献 14 : Shichijo S, Nako M, Imai Y, et al. A gene encoding antigenic peptide s of human squamous cell carcinoma recognized by cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med 1998;187:277-88.

非特言午文献 15 : Yang D, Nako M, Shichijo S, et al. Identification of a gene coding for a protein possising shared tumor epitope capable of inducing HLA—A24— restricted c ytotoxic T lymphocytes in cancer patients. Cancer Res 1999;59:4056-63.

非特言午文献 16 : Noguchi M, Kobayashi K, Suetsugu N, et al. Induction of cellular an d humoral immune responses to tumor cells and peptides in HLA-A24 positive horm one-refractory prostate cancer patients by peptide vaccination. Prostate 2003;57: 8 0-92.

非特言午文献 17 : Sato Y, Shomura H, Maeda Y, et al. Immunological evaluation of pep tide vaccination for patients with gastric cancer based on pre-existing cellular respo nse to peptide. Cancer Sci 2003;94: 802 - 8.

非特言午文献 18 : Mine T, Gouhara R, Hida N, et al. Immunological evaluation of CTL precursor- oriented vaccines for advanced lung cancer patients. Cancer Sci 2003;94 : 548-56.

非特言午文献 19 : Tsuda N, Mochizu i , Harada M, et al. Vaccination with predesigna ted or evidence-based peptides for patients with recurrent gynecologic cancers. J I mmunother 2004;27:60-72.

非特言午文献 20 : Mine T, Sato Y, Noguchi M, et al. Humoral responses to peptides co rrelated with overall survival in advanced cancer patients vaccinated with peptides b ased on pre-existing, peptide— specific cellular responses. Clin Cancer Res 2004;10: 929-37.

上記文献を含む本願明細書に記載の文献の内容は、引用により本願明細書の一 部を構成する。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 本発明は、日本人の約 6割が発現する HLA-A24分子に提示され、 SCC細胞を傷害 しうる CTLを誘導可能な SCCA由来ペプチドを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明は、 SCCA由来ペプチドであって、 HLA-A24分子に結合でき、かつ細胞性 免疫に認識されるペプチドを提供する。具体的には、本発明は、配列番号 5または 7 に示すアミノ酸配列からなるペプチドまたはその誘導体を提供する。また本発明は、 本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター を提供する。

[0008] 本発明はまた、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを含む扁平上皮癌を処 置または予防するための医薬組成物、特に癌ワクチンである該医薬組成物、を提供 する。

[0009] 本発明はまた、本発明のペプチド、誘導体、またはベクターを被験者に投与するこ とを含む扁平上皮癌を処置または予防するための方法、特に該ペプチド、誘導体、 またはベクターを癌ワクチンとして投与する該方法、を提供する。

[0010] 本発明はまた、扁平上皮癌を処置または予防するための医薬の製造における本発 明のペプチド、誘導体またはベクターの使用、特に医薬が癌ワクチンである該使用、 を提供する。

[0011] さらに、本発明は、 HLA-A24分子陽性扁平上皮癌患者より採取された末梢血単核 細胞を本発明のペプチドまたは誘導体と接触させることを含む、扁平上皮癌反応性 細胞傷害性 T細胞を誘導する方法を提供する。

[0012] また、本発明は、 HLA-A24分子陽性扁平上皮癌患者に由来する抗原提示能を有 する細胞に、本発明のペプチドまたは誘導体を取り込ませること、または本発明のベ クタ一を導入することを含む、扁平上皮癌抗原由来ペプチドまたはその誘導体と HL A-A24分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を調製する方法を提供 する。

発明の効果

[0013] 本発明により、 HLA-A24陽性癌患者において SCCA発現癌細胞を傷害しうる CTL を誘導することができる SCCA由来ペプチドが提供された。本発明は、 HLA-A24陽性 SCC患者に対する特異的免疫療法を可能とする。 SCCは上皮性癌の大部分を占め ることから、本発明は多数の癌患者の治療に有用である。

図面の簡単な説明

[0014] [図 1]図 1は、各種 SCCおよび非 SCC細胞株における SCCA mRNA発現を示す。 A力 CC細胞株、 Bが非 SCC細胞株の結果である。縦軸およびグラフ上部の値は、 YES-1 の SCCA mRNA発現量を 1とした場合の相対的発現量を示す。

[図 2]図 2は、抗 SCCA抗体による免疫組織ィ匕学染色の結果を示す。写真は、食道 SC C (A_C)、肺 SCC (D_F)、および胃腺癌(G_I)の代表的結果である。 A、 D、およ び Gがへマトキシリン'ェォジン染色であり、 C、 F、および Iがゥサギ Igによる対照染色 である。矢印は正常気管支上皮を示す。点線で囲まれた部分が、 SCCA発現部位で ある。倍率は、 Aが 200倍、他の 8枚が 100倍である。 SCC組織は大部分が SCCAを発 現して、たが、非 SCC糸且織では SCCA発現はわずかであった。

[図 3]図 3は、癌患者血漿由来の IgGのペプチド特異性を示す。アスタリスクは、両側 スチューデント t検定で P< 0.05を意味する。対応ペプチドによる吸収試験により、ぺ プチド反応性 IgGのペプチド特異性が確認された。

[図 4A]図 4Aは、 2種類の食道 SCC細胞株(YES-1および YES-2)における HLA-A24 分子の発現を示す。点線は、一次抗体を使用しなかった場合の結果を示す。 YES-1 は HLA-A24分子陰性であり、 YES-2は HLA-A24分子陽性であった。

[図 4B]図 4Bは、 SCCAペプチド反応性 CTLの細胞傷害活性を示す。以下の細胞を 標的細胞として使用し、標準的 6時間51 Cr放出試験を行った: YES-1 (HLA-A24分子 陰性、 SCCA陽性)、 YES- 2 (HLA- A24分子陽性、 SCCA陽性)、および PHA刺激 T芽 球ィ匕細胞 (HLA-A24分子陽性、 SCCA陰性)。癌患者 4人 (Pts. 2、 5、 7、および 8)の代 表的結果を示す。アスタリスクは、両側スチューデント t検定で P< 0.05を意味する。 S CCAペプチド刺激により誘導された CTLは、 YES-2に対して、 YES-1および PHA刺激 T芽球化細胞に対してよりも高レベルの細胞傷害活性示した。

[図 5A]図 5Aは、 SCCAペプチド反応性 CTLの、 HLAクラス I拘束性および CD8陽性 T 細胞依存性の細胞傷害活性を示す。標的細胞として、 YES-2(HLA-A24分子陽性、 S CCA陽性)を使用した。アスタリスクは、両側スチューデント t検定で P< 0.05を意味す る。 SCCAペプチド刺激により誘導された CTLの細胞傷害活性は、抗 HLAクラス I抗体 および抗 CD8抗体によって有意に抑制された。

[図 5B]図 5Bは、 SCCAペプチド反応性 CTLの細胞傷害活性のペプチド特異性を示 す。アスタリスクは、両側スチューデント t検定で P< 0.05を意味する。 SCCAペプチド 反応性 CTLの細胞傷害活性は、対応ペプチドをパルスした CIR-A24細胞により阻害 された。

発明を実施するための最良の形態

[0015] 本発明において「SCCA由来ペプチド」または「SCCAペプチド」とは、 SCCAのァミノ 酸配列の一部からなるペプチド断片を意味する。 SCCAのアミノ酸配列は、 Genebank ァクセシヨン番号 U19556にて開示されて!、る。

[0016] 「HLA-A24分子に結合できる」とは、ペプチドが HLA-A24分子と複合体を形成し細 胞表面に提示されうることを意味する。一般に HLA分子に結合するペプチドは、 HLA の型に依存する規則性あるアミノ酸配列を有する。その規則性あるアミノ酸配列は、 結合モチーフと呼ばれる。 HLA-A24分子に対する結合モチーフとは、 N末端から第 2 番目のアミノ酸がチロシンまたはフエ-ルァラニンであり、 C末端アミノ酸がイソ口イシ ン、ロイシン、またはフエ-ルァラニンである配列をいう。 HLA-A24分子結合モチーフ を有するペプチドの HLA-A24分子に対する結合は、 Bioinformatics and Molecular A nalysis Section (NIH, Bethesda, MD)等のコンピューター解析により決定することがで きる(Parker KC, et al, J. Immunol, 152: 163-175, 1994)。

[0017] ペプチドが「細胞性免疫に認識される」とは、そのペプチドが特異的な CTLに認識 される、言、換えればペプチド特異的 CTLを誘導する能力を有することを意味する。 ペプチドが CTLに認識されるか否かは、例えば CTLがそのペプチドをパルスした抗 原提示細胞に反応してサイト力イン (例えば IFN- γ )を産生するカゝ否かを ELISA法等 により測定して判断することができる。また、誘導された CTLの細胞傷害活性は、 51Cr 放出試験等により確認することができる。 CTLによる認識性を考慮すると、本発明の

ペプチドのアミノ酸残基数は 8〜 14個の範囲内であることが好ましく、より好ましくは 8 〜: L 1個、特に好ましくは 9または 10個である。

[0018] ペプチドが「液性免疫に認識される」とは、そのペプチドに特異的な IgGが生体内に 存在すること、つまりはペプチド特異的 IgGが血漿力も検出されることを意味する。細 胞性免疫と液性免疫の両方に認識されるペプチドは、免疫原性が高く CTL誘導能に 優れると期待されるため、本発明のペプチドとして好ましい。血漿中の特異的 IgGは、 常套的な ELISA法等によって測定することができる。

[0019] 本発明のペプチドとして特に好ましいのは、配列番号 5または 7に示すアミノ酸配列 力 なるペプチドである。

[0020] 本発明において、 SCCA由来ペプチドの誘導体とは、 SCCA由来ペプチドのアミノ酸 配列において 1または 2個のアミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加が導入された アミノ酸配列からなり、かつ HLA-A24分子に結合でき、細胞性免疫に認識されうるべ プチドを意味する。誘導体が所望の性質を有するか否かは、前述の方法により調べ ることがでさる。

[0021] アミノ酸の置換は、ペプチドの性質を変化させな、観点から、同族アミノ酸 (極性ァ ミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷 電ァミノおよび芳香族アミノ酸等)の間で行うことが好ましい。アミノ酸の欠失および付 加は、誘導体のアミノ酸残基数が 8〜: L 1個となるように行うことが好ま、。

[0022] また、アミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加は、 HLA分子結合モチーフ上許容 されるものが好ましい。すなわち、アミノ酸の置換、欠失および Zまたは付加は、誘導 体のアミノ酸配列の N末端から第 2番目のアミノ酸がチロシンまたはフエ-ルァラニン であり、 C末端アミノ酸がイソロイシン、ロイシン、またはフエ-ルァラニンとなるように行 うことが好ましい。

[0023] 本発明に特に好適な誘導体は、配列番号 5のアミノ酸配列の N末端から第 2番目の アミノ酸をフエ-ルァラニンで置換し、および/または C末端アミノ酸をイソロイシンま たはフエ二ルァラニンで置換したアミノ酸配列力なる誘導体、および配列番号 7の アミノ酸配列の N末端から第 2番目のアミノ酸をフエ-ルァラニンで置換し、および Z または C末端アミノ酸をイソロイシンまたはフエ-ルァラニンで置換したアミノ酸配列か らなる誘導体である。

[0024] SCCA由来ペプチドおよびその誘導体を構成するアミノ酸は、天然のアミノ酸または アミノ酸アナログであってよぐアミノ酸アナログとしては、アミノ酸の N-ァシルイ匕物、 0 -ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。 SCCA由 来ペプチドおよびその誘導体は、機能を著しく損なわな、限りにお、てその構成アミ ノ酸またはカルボキシル基などが修飾されていてもよい。修飾は、 N末端や遊離のァ ミノ基にホルミル基、ァセチル基、 t-ブトキシカルボ二ル基等を結合するものや、 C末 端や遊離のカルボキシル基にメチル基、ェチル基、 t-ブチル基、ベンジル基等を結 合するものが挙げられる。

[0025] 本発明のペプチドおよび誘導体は、通常のペプチド合成により製造することができ る。そのような方法として、例えば、 Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ; The Proteins, Vol2, Academic Press Inc., New York, 1976 ;ペプチド合成、丸善(株) 、 1975 ;ペプチド合成の基礎と実験、丸善 (株)、 1985 ;医薬品の開発続第十四卷' ペプチド合成、広川書店、 1991)などに記載されている方法が挙げられる。

[0026] 本発明のペプチドおよび誘導体は、本発明のペプチドまたは誘導体のアミノ酸配 列を含む長いペプチドが細胞内で断片化されることで生じる場合もある。本発明は、 そのような態様で本発明のペプチドまたは誘導体を利用することも包含する。本発明 のペプチドまたは誘導体を提供できる限り、本発明のペプチドまたは誘導体のァミノ 酸配列を含むペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。

[0027] 本発明のペプチドおよび誘導体は、 HLA-A24分子陽性 SCCA発現癌細胞を傷害 する CTLを効率的に誘導し増殖させることができ、 SCCAを発現する各種癌の治療に 有用である。 SCCAは、 SCC患者における腫瘍マーカーとして知られている(非特許 文献 4)。さらに本発明者らは、実施例において大部分の SCCが SCCAを発現すること を示している。それゆえ本発明のペプチドおよび誘導体は、 SCCの治療に特に有用 である。 SCCとしては、例えば食道癌、子宮頸癌、および肺 SCC等が挙げられる。

[0028] 本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体を含む、 SCCを処置または予防するた めの医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、 1種類のペプチドまたは誘導 体を含むものであってもよぐ 2種類以上のペプチドおよび Zまたは誘導体を組み合

わせて含んでも良、。癌患者の CTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集 合なので、複数種類のペプチドおよび Zまた誘導体を組み合わせて使用するとさら に効果的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良、。

[0029] 本発明の医薬組成物は、ペプチドまたは誘導体に加えて、医薬上許容される担体 などを含むことができる。担体としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使 用できる。本発明の医薬組成物は、リボソーム製剤、直径数 mのビーズに結合させ た粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などであってもよい。また、免疫応答が効 果的に成立するように、従来力もワクチン投与に用いられることが知られて、るアジュ バントとともに投与することもできる。投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与な どである。

[0030] 本発明の医薬組成物は、癌ワクチンとして使用可能である。投与量は、疾患の状態 、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中 のペプチドまたは誘導体の量は、 0. OOOlmg〜: LOOOmg、好ましくは 0. 001mg〜 lOOmg、より好ましく ίま 0. Olmg〜: LOmg、より一層好ましく ίま 0. l〜5mgまた ίま 0. 5〜3mgである。これを数日、数週または数ケ月に 1回、 1〜3年間継続して投与する ことが好ましい。

[0031] 本発明は、本発明のペプチドまたは誘導体をコードする核酸分子および前記核酸 分子を含むベクターを提供する。本発明の核酸分子を含むベクターは、抗原提示細 胞に導入されると本発明のペプチドまたは誘導体を発現し、それらを HLA分子との複 合体として細胞表面に提示させる。この抗原提示細胞は、ペプチド特異的に SCCA 発現癌細胞を傷害する CTLを効率的に増殖させることができる。

[0032] 本発明の核酸分子を組み込むベクターとしては、各種プラスミドおよびウィルスべク ター、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウィルス、レトロウイルス、ワクシニアウィルス 等が挙げられる(Liu M, Acres B, Balloul JM, Bizouarne N, Paul S, Slos P, Squiban P . ene— based vaccines and immunotherapeutics . Proc Natl Acad Sci U S A 101 Sup pi, 14567-71, 2004) 0ベクターの調製方法は当業界にて周知である(Molecular Clon ing: A laooraroy manual, 2nd edn. New York, Cold bpnng Harbor Laboratory)。

[0033] 本発明のベクターは、患者体内の抗原提示細胞において SCCA由来ペプチドまた

はその誘導体を発現させるため患者に投与することができる。あるいは、患者体外に おいて例えば患者由来の榭状細胞に本発明のベクターを導入し、 SCCA由来べプチ ドまたは誘導体を発現させた細胞を患者に戻しても良い。これら方法は当業界にお ヽて J司知で fcO (Hrouda D, Dalgleish Au. Gene therapy for prostate cancer. Gene Ther 3: 845-52, 1996)。

[0034] 本発明のベクターを患者に投与する場合、投与量は疾患の状態、個々の患者の年 齢、体重等により変化する力例えば DNA量として、 0.1 μ g〜100mg、好ましくは 1 μ g 〜50mgである。投与方法には、静脈注射、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。

[0035] 本発明の CTL誘導方法は、 HLA-A24分子陽性 SCCA発現癌細胞を傷害する CTL を誘導するものである。 CTLについて「SCC反応性」とは、 SCC細胞上の癌抗原ぺプ チドと HLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することを意味す る。 CTLの誘導は、例えば、 HLA-A24陽性 SCC患者カゝら採取された末梢血単核細胞 (PBMC)を、 in vitroで本発明のペプチドまたは誘導体の存在下培養することにより行 う。本発明の CTL誘導方法は、 PBMCを採取した患者の体内に誘導した CTLを戻し て癌細胞を傷害する養子免疫療法に有用である。

[0036] 本発明の CTL誘導キットは、前記 CTL誘導方法を実施するために用いられる。本発 明のキットは、本発明のペプチドおよび Zまたは誘導体を 1または 2種類以上含み、 さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。

[0037] 本発明の抗原提示細胞調製方法は、 HLA-A24分子陽性 SCCA発現癌細胞を傷害 する CTLを誘導しうる抗原提示細胞を調製するものである。本発明の抗原提示細胞 調製方法は、例えば、 HLA-A24陽性 SCC患者由来の抗原提示能を有する細胞を本 発明のペプチドまたは誘導体とともに培養し、そのペプチドまたは誘導体を HLA分子 に結合および提示させることにより行う。あるいはそのようなペプチドを発現可能なベ クタ一を、 HLA-A24陽性 SCC患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し発現さ せてもよい。抗原提示能を有する細胞は、例えば榭状細胞である。患者由来の榭状 細胞は、例えば、患者より採取した PBMCから培養プレート接着細胞を分離し、その 細胞を IL-4および GM- CSFの存在下で約 1週間培養することで得られる。本発明の 方法により調製された抗原提示細胞は、その細胞表面に提示するペプチドまたは誘

導体と HLA-A24分子との複合体を特異的に認識する CTLを誘導することができ、 SC C患者に投与された場合患者体内で SCC反応性 CTLの誘導を促進することができる

[0038] 本発明の抗原提示細胞調製キットは、前記抗原提示細胞調製方法を行うために用 いられる。本発明のキットは、本発明のペプチドおよび Zまたは誘導体を 1または 2種 類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。

[0039] 上記記載から明らかなように、本発明はさらに、本発明のペプチド、誘導体、または ベクターを患者に投与することを含む、 SCCを処置または予防する方法を提供する。 また本発明は、 SCCを処置または予防するための医薬を製造するための本発明のぺ プチド、誘導体、またはベクターの使用を提供する。

[0040] 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する力本発明はいかなる意味に お!ヽてもこれら実施例により制限されるものではな!/、。

実施例

[0041] 1.方法

1. 1 患者および細胞株

久留米大学病院において、食道癌、子宮頸癌、肺癌、胃癌、大腸癌、および乳癌 の患者、並びに健常人(HD)より、 PBMCおよび血漿を採取した。被験者はすべてヒト 免疫不全ウィルス(HIV)〖こ感染していなカゝつた。血漿および PBMCは、使用するまで それぞれ- 80°Cおよび- 196°Cで低温保存した。 PBMC上の HLAクラス I抗原の発現は 、フローサイトメトリー解析により調べた。一次抗体として抗 HLA- A24モノクローナル 抗体(mAb) (One Lambda, Inc.) ,二次抗体として FITC結合抗マウス IgG mAb (Cappe 1)を使用した。「YES-1」および「YES- 2」は、山口大学外科部門において常法に従い 確立した食道 SCC細胞株である。本実施例で使用した他の癌細胞株は、図 1A(SCC )および図 IB (腺癌および肺小細胞癌)に示す。

[0042] 1. 2 定量的 PCR

ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いたリアルタイ ム PCRにより、 SCCA mRNA発現量を調べた (Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. R eal time quatitative PCR. Genome Res 1996;6:986— 94)。 RNAは、 RNA— Bee RNA Isol ation Reagent (TeFTest, Inc., Friendswood, TX, USA)を用いて、製造元の説明に従 い抽出した。 mRNA由来の cDNAは、 5 μ gのトータル RNAより、 Superscript Preamplific ation System (Invitrogen)を用いて製造元の説明に従い調製した。 cDNA試料のリア ルタイム PCRは、 IX TaqMan Master Mix (Applied Biosystems)およびプライマーとプ ローブとの混合物(1.25 μ 1)を含む、全量 12.5 μ 1中で行った。本実施例で使用したプ ライマーおよび TaqManプローブは、 Applied Biosystemsより購入した (Assay ID#: HsO 0199468_ml)o PCRは、 50°C 2分間、 95°C 10分間、そして 95°C 15秒間の変性と 60°C 1分間のアニーリング伸長を 40サイクル、として行った。 SCCA mRNAの発現量は、 β -了クチン mRNAの発現量により標準化した。

[0043] 1. 3 免疫組織化学

ホルマリン固定パラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、リン酸緩衝生理食塩水( PBS)中で 0.02 U/ml Vibrio Cholerae由来 α 2—3,6,8—-ユーラミニダーゼ(CALBIOC HEM EMD Biosciences, Inc., La Jolla, CA, USA)と室温で 1時間インキュベートして 抗原性を回復した。続いてその切片を 3% H 202含有 PBSで処理し、内因性ペルォキシ ダーゼ活性をブロックした。免疫組織化学的試験は、 1:100希釈のゥサギポリクローナ ル抗 SCCA1/2抗体(H- 390: Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) および HISTONE, SAB- PO (登録商標)キット(Nichirei Co., Ltd., Tokyo, Japan)を使 用して行った。ペルォキシダーゼ反応は 3,3-ジァミノべンジジンテトラヒドロクロリドに より可視化し、核はへマトキシリンで対比染色した。

[0044] 1. 4 ペプチド

SCCA由来ペプチドは、 BioSynthesis (Lewisville, TX, USA)から購入した。 HLA-A2 4結合モチーフを有する HIVペプチド (RYLRQQLLGI:配列番号 10)を陰性対照とし て使用した。ペプチドは全て、ジメチルスルホキシドに 10 mg/mlの用量で溶解した。

[0045] 1. 5 抗ペプチド抗体の測定

抗ペプチド抗体 (IgG)のレベルは、既報のように Luminex (商標)システムにより測定 した (Komatsu N, Shichijo S, Nakagawa M, Itoh K. New multiplexed flow cytometric assay to measure anti— peptide antibody: a novel tool for monitoring immune respons es to peptides used for immunization. Scand J Clin Lab Invest 2004;64: 1— 11)。育兄明 すると、血漿をプレートシェーカーでペプチド結合カラーコードビーズ (25 1)ととも に室温で 2時間インキュベートした。インキュベーション後、その混合物を真空吸引機 器を用いて洗浄し、ピオチン化ャギ抗ヒト IgG ( γ鎖特異的) (BA-3080, Vector Labor atories, Burlingame, CA, USA) (100 1)と室温で 1時間インキュベートした。そのプレ ートを洗浄し、続いてストレプトアビジン- PE (S- 866, Molecular Probes, Eugene, Oreg on, USA) (100 1)をゥエルに添カ卩し、プレートシェーカーにおいて室温で 30分間イン キュペートした。ビーズを 3回洗浄し、続いて Tween-PBS (100 μ 1)を各ゥエルに添カロし た。 50 1の試料を Luminex (商標)システムにより測定した。 SCCAペプチドに対する I gGの特異性を確認するため、血漿試料を対応 SCCAペプチドまたは無関係な SCCA ペプチドをコートしたプレートで 37°Cにて培養した。この吸収操作を 3回繰り返し、得ら れた上清中の対応 SCCAペプチド特異的 IgGのレベルを Luminex (商標)システムによ り測定した。

[0046] 1. 6 ペプチド反応性 CTLの誘導

HLA-A24陽性癌患者および HD由来の PBMCを CTL誘導試験に使用した。ぺプチ ド反応性 CTLを誘導するため、既報のように、 96ウェルマイク口カルチャープレー KN unc)の 4ゥエルにおいて、 PBMC(1.5 X 105細胞/ゥエル)を各ペプチド(10 μ g/ml)とと もにインターロイキン (IL) -2含有培養培地 (200 μ 1)中でインキュベートした (非特許 文献 18)。 3または 4日毎に、培養培地の半分を除去し、対応ペプチド (20 μ g/ml)お よび IL-2 (100 U/ml)を含有する新しい培地と置き換えた。 14日目に各ゥエルより細胞 を回収し、洗浄した。その細胞を 4ゥエルに分け、対応ペプチドまたは陰性対照である HIVペプチドをパルスした C1R-A24細胞に応答してインターフェロン(IFN) yを産生 する能力について、二つ組(duplicate)にて調べた。 C1R- A24は、 HLA- A2402を発 現する C1Rリンパ腫の亜細胞株である(Dr. M. Takiguchi, Kumamoto University, Jap an)。 18時間インキュベートした後上清を回収し、 IFN- γのレベルを ELISAにて測定し た。

[0047] 1. 7 細胞傷害性試験

標準的 6時間51 Cr放出試験を行うのに十分な数の細胞を得るため、対応ペプチドに 応答して IFN- γを産生するゥエル中の培養細胞を回収し、 IL-2のみで更に 10-14日

間培養した。以下の癌細胞株を標的として使用した: YES-1 (HLA-A24分子陰性、 S CCA陽性食道扁平上皮癌)、および YES- 2 (HLA- A24分子陽性、 SCCA陽性食道扁 平上皮癌)。フイトへマダルチュン (PHA)刺激芽球化 T細胞を陰性対照として使用した 。抗体による阻害試験では、試験開始時に 20 μ g/mlの抗 HLAクラス I (W6/32, IgG2 a) (BioLegend, Camino Santa Fe, SanDiego, CA, USA),抗 HLAクラス II mAb (H— DR -1, IgG2a) (熊本大学西村泰治先生より供与)、抗 CD4 mAb (Nu-Th/i, IgGl) (久留 米大学免疫学講座にて榭立)、または抗 CD8 mAb (Nu-Ts/c, IgG2a) (久留米大学 免疫学講座にて榭立)を各ゥエルに添カ卩した。抗 CD14 mAb 0ML-H14, IgG2a) (久 留米大学免疫学講座にて榭立)を陰性対照として使用した。コールド阻害試験では 、対応 SCCAペプチドまたは HIVペプチドを事前にノルスした非標識 C1R-A24細胞を 、コールド標的細胞/ホット標的細胞の比を 10/1として各ゥエルに添加した。エフエタ ター細胞 (CTL) /標的細胞の比は 10/1とした。

[0048] 1. 8 統計

統計学的解析は、両側スチューデント t検定により行った。

[0049] 2.結果

2. 1 SCCおよび非 SCC細胞株における SCCA mRNAの発現

始めに、 SCC細胞株における SCCA mRNA発現を定量的リアルタイム PCR法により 調べた。 SCC細胞株である YES-1の SCCA mRNAの発現を発現レベル 1とみなし、 SC CA mRNAの発現を相対的に示した。その結果、 SCCA mRNAは、調べた食道癌細 胞株 5種類のうち 4種類、肺癌細胞株 4種類のうち 1種類、および子宮頸癌細胞株 4種 類のうち 3種類にお!、て発現して!/、ることがわかった(図 1A)。

[0050] さらに、非 SCCにおける SCCA発現に関する報告はなかったため、 SCCAが非 SCC 細胞株にぉ、て発現してヽるか否かにつ、て調べた。 2種類の肺小細胞癌細胞株を 除き、癌細胞株は全て腺癌であった。 SCCA mRNAは、試験した脾臓癌細胞株 4種類 のうち 2種類、肺癌細胞株 10種類のうち 4種類、胃癌細胞株 6種類のうち 2種類、およ び大腸癌細胞株 6種類のうち 1種類にぉ、て発現して、ることがわ力つた(図 1B)。肺 小細胞癌細胞株はいずれも SCCA mRNAの発現が陽性であった力 4種類の乳腺癌 細胞株は全て陰性であった。正常 PBMCにおける発現は陰性であった。全体として、

SCCA mRNAの発現量のレベルは、非 SCC細胞株より SCC細胞株の方が咼カつた。

[0051] 2. 2 SCCおよび非 SCC組織における SCCAの発現

SCCおよび非 SCC組織における SCCAの発現を免疫組織ィ匕学染色により検討した 。その結果、食 S道 SCC組織 3

w 種類全て、子宮頸癌 5種類のうち 4種類、および肺 SCC 肺肺宮!

組織 5種類のうち頸瘙癌癢癦 4種類が SCCA陽性であった。 SCCA発現は、肺腺癌組織 5種類およ び肺小細胞癌組織 3種類では、ずれも検出されなカゝつた。胃癌組織 6種類のうち 1種 類は SCCA陽性であつたが、大腸癌組織は 6種類全てが陰性であった。全体結果を 表 1に示し、代表的結果を図 2に示す。

[表 1] 小 ^ %腺細腺腺 ^ ^癌胞癌瘗

表 1 各種瘙組鱲における SCCA発現

癌 組織学 陽性/全体

食道攝 3/3 (100%)

癌 4/5 (80%)

4/5 (80%)

0/5 (0%)

0/3 (0%)

1/6 (17%)

大鼸癍 0/6 (0%)

[0052] SCCA発現は、食道 SCC (図 2B)および肺 SCC (図 2E)、並びに正常気管支上皮( 図中矢印)の一部で観察された。胃腺癌では、 SCCA発現はわずかに観察されるの みであった(図 2H)。

[0053] これらの結果は、 SCCAは大部分の SCC組織で発現している力非 SCC組織ではあ まり発現して、な、ことを示す。

[0054] 2. 3 癌患者および HD血漿中の SCCAペプチド特異的 IgG

HLA-A24分子に対する結合モチーフに基づき、 9種類の SCCA由来ペプチドを調 製した (表 2)。以下 SCCAペプチドは、アミノ酸配列の開始位置により表す。

[表 2]

表 2 SCCA由来ペプチド

位置 配到 配列番号 結合スコア a

10-19 KFMFDLFQQF 1 512

84-92 QFQKLLTEF 2 19.8

98-107 AYELK!AN L 3

107-116 LFGEKTYLFL 4 24

112-120 TYLFLQEYL 5 360

118-126 EYLDAIKKF 6 198

215-224 QYTSFHFASL 7 240

286-295 RFKVEESYDL 8 40

362-370 EFHCNHPFL 9 20 aペプチド結合スコアは、ゥ Iブサイ卜で得た HLAクラス!分子か Sの予¾解難半減期に 基づき計箅レた iBioinformatics and Molecular Analysis Section, Computational Bioscience and Engineering Laboratory, Division of Computer & Technology, Ml H)。

これら 9種類の SCCA由来ペプチドを、癌患者の IgGに認識される能力に基づき選別 した。ペプチド反応性 IgGは、マルチプレックスフローサイトメトリーアツセィ (Luminex( 商標))により測定した。血漿は、子宮頸部 SCC患者 35人、乳腺癌患者 10人、脾臓腺 癌患者 10人、胃腺癌 10人、大腸腺癌患者 6人、および HD10人より採取した。蛍光強 度のレベルは、 1/100希釈血漿の蛍光強度が 100を上回った場合に有意と判断した。 結果を表 3に示す。

[表 3-1]

衷 3 - 1 SCCA由来べプチドに対する液性免疫応答

患 ぺ?

者 Ι0Ι¾ SCCA 10 SCCAft4 SCCA9S SCCA 107 SCC ¾A 1112 SCCA 118 SCCA 215 SCCA 29S SCCA3S2 蛍光強度

子宮頻 0癌 25 20 11 20 i

[表 3- 2]


[0056] SCCA107, SCCA112, SCCA215,および SCCA286ペプチドに反応する IgGは、他 の 5ペプチドに反応する IgGよりも頻繁に患者血漿中に検出された。その頻度はそれ ぞれ、 27/71、 23/71、 24/71、および 19/71であった。 HD10人の血漿も同様の結果を 示した。 SCCA107、 SCCA112、 SCCA215および SCCA286ペプチドそれぞれに反応 する IgGの特異性は、吸収試験により確認した(図 3)。 4種類の SCCAペプチドそれぞ れに反応する IgGは、対応 SCCAペプチドをコートしたゥエルで血漿試料を培養するこ とにより吸収された力無関係な SCCAペプチドをコートしたゥエルでは吸収されなか つた o

[0057] これらの知見に基づき、以下の実施例では SCCA107、 SCCA112、 SCCA215および SCCA286ペプチドに焦点をしぼった。

2. 4 癌患者由来ペプチド反応性 CTLの誘導

SCCA107, SCCA112, SCCA215および SCCA286ペプチドが、 HLA- A24陽性癌患 者 20人および HLA-A24陽性健常人 8人の PBMC力ペプチド反応性 CTLを誘導しう るかについて検討した。癌患者 20人の内訳は、食道 SCC患者 4人、子宫頸部 SCC患 者 4人、肺癌患者 4人 (腺癌 2人、小細胞癌 1人、 SCC1人)、胃腺癌患者 4人、および 大腸腺癌患者 4人であった。試験は、四つ組 (quadruplicate)にて行った。 1つのゥェ ルの培養細胞を 4つのゥエルに分け、 2つは SCCAペプチドをパルスした C1R-A24細 胞に、他の 2つは HIVペプチドをパルスした C1R-A24細胞に使用した。ペプチド反応 性 CTLの誘導は、少なくとも 1つのゥエルの上清が 50 pg/mlを上回る IFN- γ産生を示 し、統計学的有意差 (Ρ値く 0.05)を伴った場合に陽性と判断した。最良の応答を示 した結果を示し、 HIVペプチドに応答したバックグラウンドの IFN- γ産生を差し引いた ο結果を表 4に示す。

[表 4]


[0059] SCCA112または SCCA215ペプチドは、いずれも癌患者 20人のうち 12人の PBMCか らペプチド反応性 CTLを誘導した。 SCCA107および SCCA286ペプチドは、いずれも 癌患者 20人のうち 3人にぉ、てペプチド反応性 CTLを誘導した。一方これら 4種類の S CCAペプチドは、健常人 8人の PBMC力ペプチド反応性 CTLを誘導する効率は低 かった。

[0060] これらの結果は、 SCCA112ペプチドおよび SCCA215ペプチドが HLA-A24陽性の S CC患者および非 SCC患者において効率的にペプチド反応性 CTLを誘導できること

を示す。

[0061] 2. 5 SCCAペプチド特異的 CD8陽性 T細胞依存性の細胞傷害活性

SCCA112ペプチドまたは SCCA215ペプチドで誘導した SCC患者由来 CTL力癌細 胞に対して細胞傷害活性を示しうるかについて検討した。図 4Αに示すように、 YES-1 および YES-2はいずれも SCCである力 YES-2のみが HLA-A24分子陽性である。そ れゆえ、 YES-2を SCCAおよび HLA-A24分子の両方を発現する陽性標的細胞として 使用した。

[0062] 4人の SCC癌患者 (Pts. 2、 5、 7および 8)に由来する SCCAペプチド刺激 PBMCは、 Y ES-2に対して、 YES-1および HLA-A24分子陽性 PHA刺激 T芽球ィ匕細胞に対してより も高レベルの細胞傷害活性を示した(図 4B)。陰性対照として使用した HIVペプチド 刺激 PBMCは、細胞傷害活性を示さな力つた (データ非提示)。

[0063] 次に、細胞傷害活性に関与する細胞につ!、て調べた。 SCCAペプチドで刺激され た PBMCの YES-2に対する細胞傷害活性は、抗 HLAクラスほたは抗 CD8mAbの添カロ により有意に阻害された力他の mAbの添カ卩によっては阻害されな力つた(図 5A)。 コールド阻害試験において、 SCCAペプチド刺激 PBMCの細胞傷害活性は、対応 SC CAペプチドをパルスした非標識 C1R-A24細胞の添カ卩により阻害された力 HIVぺプ チドをパルスした非標識 C1R-A24細胞の添カ卩によっては阻害されな力つた(図 5B)。

[0064] なお、 SCC患者と同様に、 SCCA112ペプチドまたは SCCA215ペプチドで刺激した 腺癌患者 (Pts. 10、 15および 20)由来の PBMCは、 YES- 2細胞に対して HLAクラス I拘 束性に細胞傷害活性を示した (データ非提示)。

[0065] これらの結果は、 SCCAペプチド刺激 PBMCの YES-2に対する細胞傷害活性力主 に HLAクラス I拘束性 SCCAペプチド特異的 CD8陽性 T細胞によることを示す。

[0066] 3.まとめ

以上の結果より、 SCCA由来ペプチド、特に SCCA112ペプチドおよび SCCA215ぺ プチドが、 HLA-A24陽性 SCC患者にぉ、て SCC反応性 CTLを効率的に誘導できる ことが明ら力となった。