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1. (WO2005064016) PROCÉDÉ DE DÉTECTION MULTIPLEX DE MICRO-ORGANISMES
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請求の範囲

[1] 食品中の 2種以上の異なる特性の微生物を、 1本の PCR反応チューブで複数の標 的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い 感度で検出する方法であって、

(A)少なくとも、溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤と タンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物の DNAを抽出する工程 と、

(B)検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックス PCRを行うェ 程と

を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法。

[2] 検出対象微生物の DNAを抽出する工程の前に、 lCFUZlOOgの微生物が 24時 間培養後に 103CFU/ml以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴と する請求項 1記載の微生物の多重検出方法。

[3] 2種以上の異なる特性の微生物力リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする 請求項 1又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[4] 特異的なプライマーカ、配列番号 5及び 6に示される塩基配列からなるプライマーで あることを特徴とする請求項 3記載の微生物の多重検出方法。

[5] 2種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌 0157を含むことを特徴とする請 求項 1又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[6] 特異的なプライマーカ、配列番号 1及び 2、又は配列番号 7及び 8に示される塩基配 列からなるプライマーであることを特徴とする請求項 5記載の微生物の多重検出方法

[7] 2種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする請求項 1 又は 2記載の微生物の多重検出方法。

[8] 特異的なプライマーカ、配列番号 3及び 4、又は配列番号 9及び 10に示される塩基 配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項 7記載の微生物の多重検出方 法。

[9] 培養後の pHが 5. 1以上となる培養条件下で培養することを特徴とする請求項 1一 8 の!、ずれか記載の微生物の多重検出方法。

[10] グルコース濃度が 0. 15%以下の培地、及び Z又は、リン酸緩衝液の濃度が 50mM 以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする請求項 1 一 9のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[11] 溶菌酵素及び Z又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤と タンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿に より DNAを析出して抽出することを特徴とする請求項 1一 10のいずれか記載の微生 物の多重検出方法。

[12] 溶菌酵素が、ァクロモぺプチダーゼ及び Z又はリゾチームであることを特徴とする請 求項 1一 11のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[13] 溶菌活性を持つバクテリオシン力ェンテロリシンであることを特徴とする請求項 1一 1

2の 、ずれか記載の微生物の多重検出方法。

[14] 界面活性剤力ソルビタンモノラウラートのエチレンォキシド縮合物であることを特徴 とする請求項 1一 13のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[15] タンパク質変性剤力グァ-ジンイソチオシァネートであることを特徴とする請求項 1 一 14のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[16] プライマーとして、配列番号 1一 6で示される塩基配列からなる DNAを合計 750nM 以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする請求項 1一

15のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[17] プライマーとして、配列番号 5— 10で示される塩基配列からなる DNAを合計 750η

Μ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックス PCRを行うことを特徴とする請求項 1 一 15のいずれか記載の微生物の多重検出方法。

[18] 食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする請求項 1一 17のいずれか記載 の微生物の多重検出方法。