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1. WO2005015983 - PROCEDE DE PRODUCTION A TERRE DES ALGUES ROUGES DE LA FAMILLE DES BONNEMAISONIACEES

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PROCEDE DE PRODUCTION A TERRE DES ALGUES ROUGES DE LA FAMILLE DES BONNEMAISONIACEES

La présente invention se rapporte au domaine de la production d'algues présentant un intérêt industriel. En particulier, l'invention s'intéresse aux procédés de culture et production d'algues rouges de la famille des Bonnemaisoniacées.
Plus précisément, la présente invention propose un procédé de production intensive et contrôlée, à terre, d'une algue rouge appartenant à la famille des Bonnemaisoniacées, via l'utilisation de la forme tétrasporophytique de ladite algue rouge.
En outre, l'invention concerne l'application d'un tel procédé à l'extraction de composés halogènes utiles pour leurs propriétés antibiotiques.
Les activités antibactériennes et antifongiques des extraits d'algues rouges appartenant à la famille des Bonnemaisoniacées, en particulier des extraits d'Asparagopsis armata et de son sporophyte filamenteux microscopique Falkenbergia rufonalosa, sont connues.
Les composés responsables de ces activités ont été en partie identifiés et quantifiés (Etude comparative des composés halogènes du Falkenbergia rufolanosa et de YAsparagopsis armata : Rhodophycées Bonnemaisoniales. Bruneau et al. Compte rendu de l'Académie des Sciences du 27 février 1978). Ce sont principalement des dérivés bromes et/ou chlorés de la propanone-2. D'autres composés halogènes, tels que des bromoforme et chloroforme, ainsi que des dérivés halogènes de l'acide acrylique ou de l'acide acétique (sous forme libre ou d'ester), sont également présents en quantités moindres.
Les techniques de propagation d'Asparagopsis armata (Codomier et al, 1978) par bouturage sont connues.

Le brevet FR 2 732 022 décrit la culture en mer de l'algue A. armata par microbouturage. L'algue produite est destinée à l'extraction de dérivés organiques du silicium.
Le brevet FR 2 753 101 , et les brevets correspondants (EP 0 926 956 et US 6 346 252), concernent l'utilisation d'un extrait d'A armata présentant une activité antibactérienne et/ou anti-fongique et contenant des molécules halogénées ayant un poids moléculaire supérieur à 10 000. Selon ces documents, l'activité antibactérienne de l'extrait est avérée sur les souches bactériennes Vibrio anguillarum, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter gergoviae, Staphylococcus aureus ainsi que sur la souche de levure Candida albicans. Cette activité dépend en partie de la présence de dérivés halogènes de poids moléculaire supérieur à 10 000. Ces macromolécules n'ont pas été caractérisées dans les documents en cause.
Asparagopsis armata est décrite morphologiquement sous sa forme macroscopique atteignant quelques dizaines de cm. Elle est organisée morphologiquement, différenciée anatomiquement, et représente, dans le cycle de reproduction de l'algue, la génération macroscopique ou gamétophytique. Actuellement, A. armata est produite sur filières en mer. Ce procédé de production présente un certain nombre d'inconvénients. D'une part, il ne permet pas le contrôle des conditions de culture qui influencent la biosynthèse par l'algue de composés halogènes. D'autre part, il ne résout qu'en partie les difficultés d'approvisionnement en cette algue, compte tenu des faibles quantités produites. En outre, la morphologie et la physiologie de A. armata ne permettent pas de la cultiver en suspension dans des bassins à terre.
La présente invention vise donc à obvier aux inconvénients susmentionnés, en tirant avantage du fait que, contrairement à la forme macroscopique de A. armata, sa génération microscopique filamenteuse, dite sporophytique et dont elle est issue, est adaptée à la production en bassin à terre. Cette génération a été décrite séparément sous le nom de Falkenbergia rufalonosa par les premiers algologues qui ignoraient qu'un même cycle de reproduction reliait les deux formes.
Ainsi, la solution selon la présente invention propose de détourner la culture d'Asparagopsis armata en cultivant plutôt sa phase filamenteuse que l'on maintient en suspensions denses en bassins à terre, à la manière d'une culture phytoplanctonique.
Il est donc désormais possible, grâce à l'invention, de produire la biomasse algale à terre, en conditions intensives, tout en contrôlant sa teneur en composés halogènes et, par suite, d'utiliser cette biomasse pour la production d'un extrait antibiotique dont l'activité est standardisée.
Evidemment, par extension, le procédé selon l'invention peut être appliqué à d'autres espèces de la famille des Bonnemaisoniacées, telles que Bonnemaisonia sp. et son tétrasporophyte, Trailliela sp.
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production intensive et contrôlée, à terre, d'une algue rouge appartenant à la famille des Bonnemaisoniacées, ledit procédé comprenant au moins :
a) la mise en suspension de la forme tétrasporophytique de ladite algue rouge dans un milieu de culture contenant de l'eau de mer ;
b) la culture de ladite forme tétrasporophytique sous agitation, à une température comprise entre environ 10°C et environ 29°C, avec renouvellement du milieu de culture ; et
c) la récolte de ladite forme tétrasporophytique à partir de la culture obtenue à l'étape b).
Contrairement à la pratique habituelle s'agissant de la production d'algues rouges, le procédé conforme à l'invention est mis en œuvre à terre, et non en mer. Ce procédé peut notamment être mis en œuvre en bassins ou dans des bioréacteurs clos. Les bioréacteurs clos permettent d'optimiser le contrôle des conditions de culture, et en particulier de prévenir les contaminations extérieures. Néanmoins, la mise en oeuvre en bassins est préférée. En ce cas, les bassins peuvent être de différentes tailles, formes, capacités, profondeurs, etc., de sorte qu'une ou plusieurs conditions de production des algues sont contrôlées, comme indiqué ci-dessous.
Par l'expression « production intensive », l'on entend une production en quantités importantes rapportées à la surface ou au volume de culture, ladite production pouvant atteindre par exemple 80 g de matière sèche par m2 et par jour. En effet, selon le procédé ci-dessus, l'algue est maintenue en suspension dense dans le milieu de culture. Dans ces conditions, elle se développe par croissance et multiplication végétative pour donner des productions par m2 particulièrement avantageuses. Comme le montre l'exemple 1.2 ci-après, les valeurs de production observées sont exceptionnelles, dans la mesure où elles représentent pratiquement le double de ce qui a été rapporté dans la littérature concernant d'autres petites macro-algues ayant déjà fait l'objet d'expérimentations de cultures en bassins (voir par exemple Neori et Shpigel. 1999. World Aquaculture. Pages 46-47).
La production d'algues est « contrôlée » en ce que les conditions de production susceptibles d'agir sur la composition chimique des algues sont à la fois surveillées et régulées par rapport à des valeurs ou niveaux de référence qui ont été déterminés empiriquement dans le cadre de la présente invention.
L'objectif de ce contrôle est d'obtenir une production surfacique maximale, tout en garantissant une qualité de la matière récoltée optimale. En outre, il sert à empêcher la contamination des bassins par des algues différentes de celles que l'on cherche à produire.
Conformément à cette définition, au sens de l'invention, au moins l'une des conditions suivantes est contrôlée :
- l'apport en sels nutritifs ;
- l'apport en gaz carbonique ;
- la température de la culture ;

- l'agitation du milieu de culture ;
- le renouvellement du milieu de culture ;
- l'exposition à la lumière ;
- la contamination par d'autres algues ; et
- la fréquence de la récolte.
De manière avantageuse, l'on contrôle également la teneur des algues récoltées en composés halogènes d'intérêt, ce qui permet de produire des extraits contenant ces composés qui présentent une activité, notamment antibiotique, standardisée (voir infra et exemples).
Selon un premier mode de réalisation, le milieu de culture utilisé dans le cadre de l'invention contient de l'eau de mer filtrée, enrichie en sels nutritifs et, le cas échéant, en gaz carbonique, de manière à contrôler les apports en ces éléments. Ce contrôle aide à optimiser la croissance et la composition chimique des algues.
Selon un deuxième mode de réalisation, lors de l'étape b) du procédé susmentionné, la culture est avantageusement maintenue à une température comprise entre environ 10°C et environ 24°C.
Selon un troisième mode de réalisation, lors de l'étape b), le milieu de culture est renouvelé de manière séquentielle ou continue, de préférence continue, afin d'éviter un confinement du milieu de culture des algues et aider à réguler la température des cultures.
Dans le cadre de la présente invention, l'agitation est utile à plusieurs titres : dans le contrôle des apports nutritifs, de la température et de l'exposition à la lumière, dans la circulation du milieu aux fins de son renouvellement, etc..
A cet égard, selon un quatrième mode de réalisation, lors de l'étape b), l'agitation est réalisée par bullage ou au moyen d'un dispositif mécanique tel que les roues à aubes des sytèmes de bassins dits « raceway », des hélices ou des pompes de circulation.

Selon un cinquième mode de réalisation, l'exposition à la lumière est contrôlée par divers moyens, à savoir la profondeur des bassins, la densité de la culture et l'agitation.
La profondeur des bassins dépend du type de bassins (forme et volume des bassins) et du niveau d'agitation. Elle se situe, le plus souvent, entre 50 cm et 1 m, mais peut atteindre plusieurs mètres, notamment lorsque les bassins se présentent sous la forme de colonnes. En règle générale, l'on préfère des profondeurs de l'ordre du mètre, ou en-deçà.
En outre, au démarrage, il convient de protéger la culture d'un excès de lumière solaire, par exemple à l'aide d'un grillage, d'une toile, d'un tissu, de planches disposées de manière à filtrer la lumière. En revanche, au fur et à mesure que les algues se développent, la culture se densifie et l'auto-ombrage par les algues elles-mêmes suffit à les protéger du rayonnement solaire (voir exemples ci-dessous).
Enfin, l'agitation participe au contrôle de l'exposition à la lumière en gouvernant le rythme de passage des algues au niveau de la surface éclairée du bassin.
Selon un sixième mode de réalisation, l'absence de contamination par des algues autres que celles que l'on veut produire est contrôlée. Pour ce faire, interviennent à la fois la filtration de l'eau de mer et la densité des cultures. Effectivement, à forte densité, les cultures se préservent elles-mêmes d'une contamination éventuelle par d'autres algues.
Selon un septième mode de réalisation, lors de l'étape c) du procédé objet de l'invention, la récolte des algues est effectuée de manière périodique, par exemple à une semaine d'intervalle.
Bien entendu, l'homme du métier retiendra des divers modes de réalisation énoncés ci-dessus qu'ils concernent tous le contrôle des conditions de production des algues. A ce titre, chaque mode de réalisation peut être considéré seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres modes de réalisation. Le procédé selon l'invention est de préférence mis en œuvre en combinant tous les modes de réalisation décrits supra.
Il est bien évident que l'homme du métier peut faire appel à ses connaissances générales dans le domaine technique de l'invention, ainsi qu'à des expériences de routine, pour déterminer, à la lumière de la présente description et des exemples ci-après, une ou plusieurs conditions de production des algues.
N'importe quelle algue rouge de la famille des Bonnemaisoniacées peut être utilisée pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention. En particulier, l'homme du métier peut choisir parmi les algues suivantes : Asparagopsis armata et la forme tétrasporophytique correspondante Falkenbergia rufalonosa, ou Bonnemaisonia sp. et sa forme tétrasporophytique Trailliela sp.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne l'application du procédé de production décrit ci-dessus, à l'extraction de composés halogènes utiles pour leurs propriétés antibiotiques.
L'on entend ici par « propriétés antibiotiques », des propriétés antibactériennes et/ou antifongiques.
Les composés halogènes d'intérêt ont une faible masse moléculaire. Il s'agit principalement de propanones et d'acétates d'alkyle. Il peut être également question, dans une moindre mesure, d'acrylates d'alkyle. Tous ces composés sont synthétisés par les algues au niveau de cellules spécialisées, sous la forme d'ultrastructures appelées vésicules. Ces vésicules participent aux mécanismes de défense des algues contre divers stress (oxydations, épyphites, bactéries, etc..)
L'extraction des composés halogènes, dans la mesure où ils sont de petite taille et possèdent une structure relativement simple, peut être réalisée de manière classique. En particulier, l'homme du métier peut faire appel au procédé d'extraction suivant, comprenant au moins :
d) la dispersion de la forme tétrasporophytique récoltée dans du propylène glycol ;

e) le broyage de ladite dispersion ;
f) l'extraction sous agitation, à température ambiante, pendant environ 2 heures ;
g) l'élimination de la phase insoluble ; et
h) la récupération de la phase soluble contenant lesdits composés halogènes.
De manière avantageuse, le procédé d'extraction ci-dessus comprend en outre une étape i) de purification des composés d'intérêt par séparation liquide-liquide, notamment à l'aide d'éther.
Les conditions de mise en œuvre du procédé d'extraction sus-cité font partie des connaissances générales dans le domaine de l'invention et sont, à ce titre, parfaitement connues de l'homme du métier. Par exemple, l'élimination lors de l'étape g) peut être effectuée par centrifugation et/ou filtration.
Les composés halogènes antibiotiques extraits à partir d'algues rouges produites selon le procédé objet de la présente invention sont destinés à être utilisés dans des domaines très variés, comprenant notamment :
- la pharmacie, en particulier la pharmacie vétérinaire ;
- la cosmétique, notamment comme stabilisateurs microbiens ou principes actifs pour lutter contre l'acné, l'état pelliculaire, etc.. ;
l'environnement, par exemple pour l'épuration biologique des eaux polluées telles que les rejets de piscicultures marines enrichis en sels nutritifs ; et
- les revêtements antisalissures (peintures, laques, enduits, c'est-à- dire les revêtements dits « anti-fouling »).
Les exemples qui suivent servent à illustrer, sans limiter, la présente invention.

EXEMPLES

I. Culture :
L'algue Falkenbergia rufolanosa a été introduite dans le sud de la France vers 1926, probablement en provenance d'Australie. Elle est conservée depuis 1978 dans la collection du Biologische Anstalt Helgoland (Allemagne). Les cultures en bassin extérieur réalisées à Faro dans le Sud du Portugal ont été réalisées à partir de cet échantillon, dont les cultures ont été redémarrées à 10°C dans de l'eau de mer enrichie avec du milieu de Von Stosch (Stein, J.R. 1973. Culture methods and growth measurements. Handbook of Phycological methods. Cambridge University Press).

/.1.Démarrage du stock initial :
Plusieurs thalles de Falkenbergia rufonalosa ont été nettoyés avec précaution, débarrassés des autres algues, puis incorporés dans un petit bac de culture sous flux continu d'un effluent filtré provenant des bassins d'élevage de poissons. Au démarrage, la culture a été protégée d'un excès de lumière solaire. Quand la culture est devenue dense (environ 5 g par litre), l'auto-ombrage des algues était une protection suffisante contre le rayonnement solaire. A forte densité, la culture était préservée de la contamination par d'autres espèces d'algues.

1.2. Procédé de production:
Des bacs circulaires en polyethylene de 1 ,5 m2 de surface et 1 m de profondeur ont été utilisés pour cultiver Falkenbergia rufonalosa. Un effluent filtré à 150 μm provenant des bassins d'élevage de poisson approvisionnait continuellement les bacs par un tuyau affleurant à leur surface. Le maintien des algues en suspension était assuré par une conduite annulaire en PVC perforée fixée au fond le long de la paroi du bac. Un bullage continu d'air comprimé déshuilé créait l'agitation du milieu. La conduite d'évacuation des bacs était munie d'une grille (diamètre des mailles de 0,5 mm).
Les algues ont été récoltées chaque semaine à l'aide d'une pompe submersible rejetant l'eau et les algues dans un caisson recouvert d'un filet et situé sous l'évacuation principale. Les algues ont alors été introduites dans des sacs en nylon (diamètre des mailles de 0,1 mm) et centrifugées jusqu'à poids frais constant à 3600 rpm. Au bout d'une semaine, la biomasse en excès par rapport à celle correspondant initialement à la densité de stock optimale représentait la production hebdomadaire. La matière première collectée a été emballée et congelée à -21 °C. La densité optimale du stock d'algue utilisable pour atteindre les productions les plus élevées (5 g de matière fraîche par litre) a été déterminée en testant différentes densités de culture et en mesurant la production. Pour déterminer la production en masse sèche, un échantillon d'algue a été déshydraté à l'étuve à 60°C. La matière sèche moyenne des algues était de 25 %. Les données de production de septembre 2002 à juillet 2003 ont montré des fluctuations saisonnières avec un pic de production de 738 +/- 25 g de matière sèche par m2 et par semaine en mai et une valeur minimale de 226 +/- 19 g de matière sèche par m2 et par semaine en janvier (voir Tableau I ci dessous). L'influence de la teneur en ion ammonium a également été testée. En augmentant le flux d'ions ammonium jusqu'à 300 μmol par litre et par heure, la production atteignait 800 g de matière sèche par m2 et par semaine.
La production hebdomadaire d'algue rouge tout au long de l'année dans le sud du Portugal est indiquée dans le Tableau I suivant.

TABLEAU I


II. Extraction :
1.46 kg d'algues fraîches ont été dispersées dans 3.82 kg de propylène glycol puis broyées au broyeur colloïdal pendant 10 mn. L'extraction a été mise en œuvre à température ambiante pendant 2 h.
La phase insoluble a été éliminée par centrifugation à 8000 g pendant 15 mn puis filtration à l'aide de terre filtrante. 3.34 kg d'extrait hydro- propylique (20% eau) ont été stockés à 4°C.

III. Analyses et caractérisation des composés halogènes:
300 g de matière première fraîche ont été broyées en présence de 600 g d'eau de mer pendant 10 mn à l'aide d'un broyeur colloïdal. Après un temps de contact de 20 mn, la suspension a été centrifugée à 8000 g pendant 15 mn. L'extraction a été renouvelée deux fois. Les trois surnageants ont été extraits par 1060 ml d'éther diéthylique.
L'éther diéthylique a été déshydraté par du sulfate de magnésium anhydre puis éliminé sous flux d'azote. L'huile obtenue a été pesée. Le rendement en huile était de 0.18 % par rapport à la masse sèche d'algues. Elle a été solubilisée dans du laurate de méthyl pour l'analyse des composés halogènes a été effectuée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

Le Tableau II suivant identifie les composés halogènes qui ont ainsi été mis en évidence:

TABLEAU II

Les composés dont l'indice de similitude est indiqué sont ceux qui existent dans la librairie. Les autres composés ont été retrouvés grâce aux ions spécifiques résultants des diverses fragmentations des molécules.

IV. Détermination des propriétés antibiotiques :

IV.1. Activité bactéricide et fongicide sur des microorganismes pathogènes humains :
Un témoin eau distillée et un témoin solvant ont été utilisés dans chaque test. L'extrait hydropropylique a été testé à la dilution 1/10, dilution pour laquelle il n'y a plus d'effet du propylène glycol. Les extraits ont été inoculés avec une densité initiale de 105 à 107 germes/g et maintenus en contact pendant 24 h pour Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis et 72 h pour Candida albicans, Propionibacterium acnés, Aspergillus niger et Pityrosporum ovale. Ils ont été neutralisés par ajout d'un mélange de lécithine, polysorbate et triton afin de stopper l'action des molécules antibactériennes et anti-fongiques (teneur finale en mélange de 10"2). Les extraits ont été incubés et le nombre de micro-organismes présents déterminé (densité finale).
Le Tableau III ci-dessous montre l'activité antibiotique de l'extrait hydropropylique.

TABLEAU III



a : l'« abattement » est la diminution de densité par rapport à la densité initiale N0.

Comme il ressort du Tableau III, l'extrait algal testé au 1/10eme a révélé une activité bactéricide et fongicide permettant un abattement des germes de 3 à 4 log comparativement au témoin initial (eau distillée).

IV.2. Activité antibiotique sur des micro-organismes pathogènes vis à vis des poissons et de l'homme (test de diffusion sur milieu gélose) : Les extraits de Falkenbergia rufolanosa (biomasse lyophilisée) ont été préparés à partir de différents solvants organiques, de polarité croissante (dichlorométhane, méthanol, eau). L'extraction a été effectuée dans chaque cas par un traitement de 24 heures à l'aide d'un extracteur Soxhiet. Après evaporation sous vide, les extraits obtenus ont été stockés à -20°C avant utilisation.
L'activité antibactérienne a été testée par diffusion sur milieu gélose, selon la méthode préconisée par la Pharmacopée Européenne, contre 5 bactéries pathogènes du poisson :
Vibrio anguillarum DSMZ 11323 ;
Aeromonas salmonicida ssp salmonicida ATCC 51413 ;
Aeromonas hydrophila ssp hydrophila DSMZ 6173 ;
Pseudomonas anguilliseptica DSMZ 12111 ;
Yersinia ruckeri ATCC 29493;
et contre 6 souches pathogènes pour l'homme :
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Bacillus subtilis ATCC 6051
Micrococcus flavus SBUG
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Escherichia coli ATCC 11229
Candida maltosa (levure) SBUG.

ATCC = American Type Culture Collection
DSMZ = Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen SBUG = Strain collection of the Institute of Biology of the University Greifswald, Germany.

Pour le test de diffusion sur milieu gélose, le contenu d'une boucle d'inoculation a été mis en suspension dans 3 ml de solution de NaCI à 0,9%., pour chaque souche. Les suspensions ainsi préparées ont été inoculées chacune sur un milieu nutritif gélose. Des disques de papier stériles préalablement imprégnés de l'extrait d'algue (2 mg) ont été déposés sur les boîtes de Pétri inoculées. Les disques témoins contenaient respectivement de l'oxytrétracycline et le solvant d'extraction utilisé. Les diamètres d'inhibition autour de ces disques ont été mesurés après 18 ou 48 heures d'incubation à 26°C, en excluant le diamètre des disques (6 mm).
Parallèlement, la concentration minimale inhibitrice (CMI) a été déterminée par dilutions successives de l'extrait, contre les bactéries les plus sensibles au test précédent : Vibrio anguillarum, Pseudomonas anguilliseptica et Staphylococcus aureus.

a) Préparation des suspensions bactériennes :
Le contenu d'une boucle d'inoculation a été mis en suspension dans 3 ml de solution de NaCI à 0,9%, pour chaque souche. Les suspensions ainsi préparées ont été inoculées chacune sur un milieu nutritif liquide. Après 18 heures d'incubation à 26°C (au bain-marie, avec agitation), les suspensions bactériennes ont été déposées dans des puits de micro-plaques contenant l'extrait d'algue à différentes concentrations :
Colonne 1 (puits A à H) : solution contenant l'extrait d'algue à tester Colonne 1 à 11 (puits A à H) : dilutions successives de cette solution (concentrations 1/1 ,5).
Les micro-plaques ont été incubées :
- 24 heures à 26°C, pour Vibrio anguillarum,
- 48 heures à 26°C, pour Pseudomonas anguilliseptica, - 24 heures à 37°C, pour Staphylococcus aureus.
La lecture des plaques a été faite à 620 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques ELISA, puis à 550 nm après révélation au iodonitrotétrazolium violet.

b) Résultats :
Les déterminations des activités antibactériennes ont été réalisées 10 fois pour les essais sur les souches pathogènes du poisson et deux fois pour les souches pathogènes de l'homme.
Le Tableau IV ci-dessous indique les résultats du test de diffusion sur milieu gélose sur les souches pathogènes du poisson.

TABLEAU IV


Le Tableau V suivant montre les résultats du test de diffusion sur milieu gélose sur les souches pathogènes de l'homme.

TABLEAU V

Les concentrations minimales inhibitrices ont été déterminées sur l'extrait au dichloromethane Les résultats sont de 105,5 μg/ml pour Vibrio anguillarum, pour Pseudomonas anguilliseptica et 222,5 μg/ml pour Staphylococcus aureus. Les concentrations minimales inhibitrices pour des molécules antibiotiques pures comme l'OTC sont de 0,08 μg/ml for Vibrio anguillarum et de 0,08 μg/ml pour Pseudomonas anguilliseptica. Pour l'ampicilline, la concentration minimale inhibitrice est de 20 μg/ml pour Staphylococcus aureus. La composition complexe des mélanges algaux explique les écarts par rapport aux molécules témoins pures.