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1. WO2004101771 - PROCEDE PERMETTANT DE SELECTIONNER DES CELLULES MYOCARDIQUES OU DES PRECURSEURS DE CELLULES MYOCARDIQUES DANS DES POPULATIONS CELLULAIRES MELANGEES

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[ DE ]

Patentansprüche

1. Verfahren zur in vitro Selektion von kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen aus einer Mischung mit anderen Zelltypen, enthaltend die Abfolge der folgenden Schritte:
A) Einbringen mindestens eines SeleMonskonstruktes, das auf einem nicht in das zelluläre Genom integrierenden Vektor enthalten ist, in die zu selektierenden Zellen, wobei auf dem Selektionskonstrukt mindestens ein Selektionsmarker kodiert ist, der spezifisch in kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen exprimiert wird,
B) Kultivierung der Zellen unter Zugäbe mindestens eines cytotoxischen oder cytostatischen Selektionsmittels

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bis zum Erhalt einer reinen Zellpopulation kardiomyogener Zellen oder

Herzmuskelzellen erfolgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor viraler Herkunft ist, bevorzugt abgeleitet aus der Gruppe bestehend aus
a) Epstein-Barr- Virus (EBV),
b) Simian Virus 40 (SV40),
c) BK-Virus,
d) JC-Virus,
e) Adenovirus.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die selektive Expression durch eine spezifisch in kardiomyogenen Zellen und/oder Herzmuskelzellen aktive Expressionssequenz bewirkt wird.

5. Verfahren gemäß Ansprach 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssequenz auf dem Seleldionskonstrukt oder auf einem separaten nicht in das zelluläre Genom integrierenden Vektor enthalten ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssequenz einen Promoter umfasst.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen für den Selektionsmarker unter Kontrolle einer Expressionssequenz steht, die einen Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) MLC-2v Promotor
b) α-Myosin-Heavy-Chain Promotor
c) GATA-4 Promotor
d) Cardiac Troponin I Promotor
e) Serca 2a Promotor
f) kardialer sarcomerer α -Actin Promotor
g) Nkx 2.5 Promotor
h) Myogenin Promotor
umfasst.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsmittel ein gegen tierische oder menschliche Zellen wirksames Antibiotikum enthält.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsmarkergen ausgewählt ist aus der Gruppe von Genen kodierend für
Neomycin-Phosphotransferase II, Neomycin-Phosphotransferase I, Hygromycin- Phosphotransferase, Blasticidin S Deaminase von Aspergillus terreus, Puromycin N-acetyl-Transferase, Sh ble von Streptoalloteichus Hindustanus, und dass das oder die Selektionsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus

Neomycm, Kanamycin, Paromomycin, Geneticin (G418), Hygromycin, Blasticidin, Puromycin, Zeocin Phleomycin.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung unter Zugabe des Selektionsmittels in Schritt B) für 2 bis 21 Tage, bevorzugt 3 bis 10 Tage und besonders bevorzugt für 3 bis 5 Tage erfolgt.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenzeichnet, dass die zu selektierenden Zellen eine Mischung aus kardiomyogenen Zellen und/oder Herzmuskelzellen und anderen Zelltypen sind.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zu selektierenden Zellen vor der Durchführung von Schritt B) einem Verfahren zur Differenzierung zu kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen unterzogen werden.

13. Verfahren gemäß Ansprach 12, dadurch gekennzeichnet, dass die zu selektierenden Zellen adulte Stammzellen, bevorzugt mesenchymale adulte Stammzellen sind.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen aus adulten Stammzellen, bevorzugt aus mesenchymalen adulten Stammzellen, differenziert wurden.

15. Verfahren gemäß Ansprach 14, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht integrierende Selektionskonstrukt in die adulten Stammzellen eingebracht wurde.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Differenzierung durch Kokultivierung mit Herzmuskelzellen ausgelöst wird oder durch Mittel enthaltend mindestens eine der Substanzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) DNA-demethylierende Substanzen, bevorzugt 5 '-Azacytidin
b) Inhibitoren der Histondeazetylierung, bevorzugt Trichostatin A
c) Amphotericin B
d) Dexamethason
e) Retinsäure
f) Proteine, die eine Differenzierung zu kardiomyogenen oder Herzmuskelzellen auslösen können, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Activin, TGF-beta, BMP-2, BMP-4, FGF-4, MyoD, GATA-4 und Nkx 2.5

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen gewebetypisiert wurden oder von Zellen eines gewebetypisierten Spenders abstammen.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Zellen während des Verfahrens vermehrt werden.

19. Verfahren zur Herstellung reiner Kulturen kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, zusätzlich enthaltend die Schritte
C) Entfernung des Selektionsmittels
D) Weiterkultivierung der Zellen bis zum Verlust des Selelrtionskonstruktes und gegebenenfalls des Selektionsmarkers.

20. Verfahren gemäß Ansprach 19, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem SeleMionskonstrukt zusätzlich ein sensitisierender Marker enthalten ist und in Schritt D) Zellen, in denen das Selektionskonstrukt noch verblieben ist, unter Zugabe eines dem sensitisierenden Marker entsprechenden Selektionsmittels abgetötet werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass während der Weiterkultivierung die Zellen vermehrt werden.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Weiterkultivierung in Schritt D) für 1 bis 12 Wochen, bevorzugt 4 bis 8 Wochen erfolgt.

23. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass während der Weiterkultivierung in Schritt D) mindestens zwei Zellpassagen durchgeführt werden.

24. Reine Kultur kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 23.

25. Reine Kultur gemäß Ansprach 24, dadurch gekennzeichnet, dass die kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen nicht immortalisiert sind.

26. Verwendung kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen erhältlich aus einer reinen Kultur gemäß Ansprach 24 oder 25 zur Herstellung eines Arzneimittels.

27. Arzneimittel enthaltend kardiomyogene Zellen oder Herzmuskelzellen erhältlich aus einer reinen Kultur gemäß Ansprach 24 oder 25, sowie gegebenenfalls einen geeigneten pharmazeutischen Träger.

28. Zelllαiltur-Bank enthaltend reine Kulturen kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die Kulturen gewebetypisiert sind.

29. Reine Zellpopulation kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

30. Verfahren zur Herstellung einer Gewebekultur enthaltend kardiomyogene Zellen oder Herzmuskelzellen, enthaltend die folgenden Schritte
a) Herstellung einer reinen Kultur kardiomyogener Zellen oder Herzmuskelzellen gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23,
b) Aufbringen von Zellen aus der Kultur aus Schritt a) auf eine Gewebekultur Matrix, c) Weiterkultivierung bis zur Entwicklung eines geschlossenen Zellverbandes auf der Gewebelαiltur-Matrix

31. Verfahren gemäß Ansprach 30, dadurch gekennzeichnet, dass die kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen nicht immortalisiert sind.

32. Gewebekultur erhältlich gemäß dem Verfahren nach Anspruch 30 oder 31.

33. Nicht in das zelluläre Genom integrierender Vektor viraler Herkunft, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine spezifisch in Herzmuskelzellen aktive

Expressionssequenz enthält, die die Expression eines Selektionsmarkergens kontrolliert.

34. Verwendung eines Vektors gemäß Ansprach 33 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23.

35. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels enthaltend kardiomyogene Zellen oder Herzmuskelzellen, enthaltend die Schritte
a) Selektion oder Herstellung der Zellen gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, und
b) die Zellen mit Hilfe eines pharmazeutisch geeigneten Trägers oder Trägerstoffs zu einem Arzneimittel formuliert werden.

36. Verfahren zur Behandlung eines Patienten, der einen Bedarf an kardiomyogenen Zellen oder Herzmuskelzellen hat, wobei dem Patienten eine reine Kultur gemäß

Anspruch 24 oder 25, ein Arzneimittel gemäß Ansprach 27, oder eine Gewebekultur gemäß Anspruch 34 verabreicht werden.