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1. WO2001077317 - PROCEDE D'AMPLIFICATION D'ACIDE NUCLEIQUE PAR UTILISATION D'ACIDE NUCLEIQUE A DOUBLE BRIN EN TANT QUE MODELE

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[ JA ]

請求の範囲

1. 次の工程を含む 2本鎖核酸を鎵型とする核酸の合成方法。

a) 2本鎖からなる錶型核酸と任意のプライマ一を、この任意のプライマ一 を起点とする相補鎖合成が可能な条件下で鎖置換を伴う相補鎖合成反応 を触媒する DNAポリメラーゼとともに前記 2本鎖核酸とインキュベート することによって、標的錡型核酸における等温で錶型核酸を増幅するこ とができるプライマーがァニ一ルすべき領域を塩基対結合が可能な状態 とする工程、

b ) 工程 a) において塩基対結合が可能な状態となった領域に、等温で铸型 核酸を増幅することができるプライマ一をァニールさせる工程、および c ) 前記プライマーを合成起点として相補鎖合成を行う工程

2. 工程 a ) を融解温度調整剤の存在下で行う請求項 1に記載の方法。

3. 融解温度調整剤が、ベ夕イン、プロリン、ジメチルスルホキシド、およびト リメチルァミン N-ォキシドからなる群から選択される少なくとも 1つの化合 物である請求項 2に記載の方法。

4. 以下の工程を含む相補的な塩基配列で構成される 2本鎖の錡型核酸の特定の 領域を構成する塩基配列が 1本鎖上に複数連結された核酸の合成方法。 a ) 2本鎖からなる錡型核酸と任意のプライマ一を、この任意のプライマ一 を起点とする相補鎖合成が可能な条件下で鎖置換を伴う相補鎖合成反応 を触媒する DNAポリメラ一ゼとともに前記 2本鎖核酸とインキュベート することによって、標的錶型核酸における第 2のプライマーがァニール すべき領域を塩基対結合が可能な状態とする工程、

b ) 工程 a ) において塩基対結合が可能となった領域に第 2のプライマ一を ァニールさせ、これを起点とする相補鎖合成反応を行う工程;ここで第 2のプライマーはその 3,末端において前記特定の領域を構成する一方の 鎖の 3'側を規定する領域に対してァニールし、かつ第 2のプライマーの 5'末端には、このプライマ一を起点とする相補鎖合成反応生成物の任意 の領域に対して相補的な塩基配列を備えるものである、

c ) 工程 b ) で合成された第 2のプライマ一の伸長産物における第 1のブラ イマ一がァニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とする工程;こ こで第 1のプライマ一はその 3,末端において前記第 2のプライマ一を起 点とする伸長産物における前記特定の領域の 3'側を規定する領域に対し てァニールする、

d ) 工程 c ) において塩基対結合が可能となった領域に第 1のプライマ一を ァニールさせ、これを起点とする相補鎖合成を行う工程、および e ) 工程 d ) によって合成された第 1のプライマ一の伸長生成物の 3'末端を 自身にァニールさせることによって自身を鎵型とする相補鎖合成を行い、 前記特定の領域を構成する塩基配列が 1本鎖上に複数連結された核酸を 得る工程

5. 工程 a ) における任意のプライマーが第 1のプライマ一である請求項 4に記 載の方法。

6. 工程 c ) が、錡型における第 2のプライマーの 3'側を起点とする第 4のブラ ィマーの相補鎖合成反応による置換によつて行われる請求項 4に記載の方法。

7. 工程 e ) が、錡型における第 1のプライマーがァニールすべき領域の 3,側を 起点とする第 3のプライマ一の相補鎖合成反応による置換によって第 1のプ ライマーの伸長生成物を 1本鎖とする工程を含む請求項 4に記載の方法。

8. 第 1のプライマーが、その 5'末端に、このプライマ一を起点とする相補鎖合 成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備えるものである請 求項 4に記載の方法。

9. 以下の工程を含む、相補的な塩基配列で構成される 2本鎖の錡型核酸の特定 の領域を構成する塩基配列が 1本鎖上に複数連結された核酸を増幅する方法。 1 )請求項 7に記載の方法によって生成された第 1のプライマーの伸長生成 物の 3'末端を自身にァニールさせ、これを起点とする相補鎖合成反応を 行う工程、

2 ) 3,末端の自身へのァニールによって形成されるループ領域に第 2のブラ イマ一、または第 1のプライマ一をァニールさせてそれを起点とする相 補鎖合成を行う工程、

3)工程 2) の相補鎖合成反応によって自身の 3'末端からの伸長生成物を置 換し、その 3'末端を塩基対結合が可能とする工程、

4) 工程 3) によって塩基対結合が可能となった 35末端を起点とし自身を踌 型とする相補鎖合成反応を行うことによって、工程 2) でループ領域を 起点として合成された相補鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程、 および

5)工程 2) —4) を繰り返して目的とする核酸を増幅する工程、

10.更に次の工程を含む、請求項 9に記載の方法。

6)工程 4) によって生成する 1本鎖の核酸の 3,末端を自身にァニールさせ て相補鎖合成反応を行う工程、

7) 3,末端の自身へのァニールによって形成されるループ領域に第 2のブラ イマ一、または第 1のプライマ一をァニールさせてそれを起点とする相 補鎖合成を行う工程、

8)工程 7) の相補鎖合成反応によって自身の 3'末端からの伸長生成物を置 換し、その 3'末端を塩基対結合が可能とする工程、

9)工程 8) によって塩基対結合が可能となった 3'末端を起点とし自身を铸 型とする相補鎖合成反応を行うことによって、工程 7)でループ領域を 起点として合成された相補鎖を置換して 1本鎖の核酸を生成する工程、 および

10)工程 7) -9) を繰り返して目的とする核酸を増幅する工程、

11.請求項 1 0に記載の増幅方法を行い、増幅反応生成物が生じたかどうかを観 察することにより試料中の標的塩基配列を検出する方法。

12.核酸の検出剤存在下で請求項 1 0に記載の方法を行い、検出剤のシグナル変 化に基づいて増幅反応生成物が生じたかどうかを観察する請求項 1 1に記載 の方法。

13.請求項 1 1に記載の検出方法によって変異を検出する方法であって、増幅対 象である塩基配列における変異が、増幅方法を構成する相補鎖合成の起点と なる少なくとも 1つの 3'末端において、相補鎖合成を妨げるものである方法 c

14.次の要素を、第 1のプライマーを起点とする相補鎖合成が可能な条件下でィ ンキュペートする工程からなる、相補的な塩基配列で構成される 2本鎖の錶. 型核酸の特定の領域を構成する塩基配列が 1本鎖上に複数連結された核酸を 増幅する方法。

•増幅すべき特定の領域を含む 2本鎖からなる標的錶型核酸

-鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する MAポリメラーゼ

■第 1のプライマー;ここで第 1のプライマ一はその 3,末端において前記特 定の領域を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール、か つ第 1のプライマ一の 5,末端には、このプライマ一を起点とする相補鎖合 成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備える、

'第 2のプライマ一;ここで第 2のプライマ一はその 3,末端において前記特 定の領域を構成する一方の鎖の 3'側を規定する領域に対してァニール、か つ第 2のプライマ一の 5,末端には、このプライマーを起点とする相補鎖合 成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備える、

•ヌクレオチド基質

15.更に付加的に次の要素を存在させる請求項 1 4に記載の方法。

'第 3のプライマ一;ここで第 3のプライマ一は、錶型における第 1のブラ ィマ一がァニールすべき領域の 33側を起点とする相補鎖合成反応の起点と なる、および

'第 4のプライマ一;ここで第 4のプライマ一は、錡型における第 2のブラ イマ一がァニールすべき領域の 3'側を起点とする相補鎖合成反応の起点と なる、

16.融解温度調整剤の存在下でィンキュベ一トする請求項 1 4に記載の方法。

17.融解温度調整剤が、ベ夕イン、プロリン、ジメチルスルホキシド、およびト リメチルァミン N-ォキシドからなる群から選択される少なくとも 1つの化合 物である請求項 1 6に記載の方法。

18. 2本鎖からなる鏡型核酸、任意のプライマ一、および等温で錡型核酸を増幅 することができるプライマーを、この任意のプライマ一を起点とする相補鎖 合成が可能な条件下で鎖置換を伴う相補鎖合成反応を触媒する DMポリメラ —ゼとともにインキュベートする工程を含む、標的錶型核酸における等温で 鎵型核酸を増幅する反応を開始するプライマ一がァニールすべき領域を塩基 対結合が可能な状態とする方法。