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1. WO2001075069 - PROCEDE DE PRODUCTION DE LIPIDES ET MICRO-ORGANISMES SECRETANT DES LIPIDES

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[ JA ]
明細書

脂質の製造法及び脂質分泌微生物

技術分野

本発明は、脂質、特に不飽和脂肪酸を菌体外に分泌する微生物及びそれを用い た脂質の製造法に関する。

従来の技術

油脂を微生物を用いた発酵法により製造する方法として、サッカロマイセス属 ( Saccharomyces ) に属する酵母を用いる方法が知られている。例えば、サッカ ロマイセス属酵母によるパルミトレイン酸含有量の高い脂質成分(トリグリセリ ドを含む)の製造法(特開昭 63 -287491号)、あるいはサッカロマイセス属酵母に よるパルミトレイン酸の菌内体製造等が知られている(特開昭 62 - 289191号)。 サッカロマイセス属酵母は、油脂を菌体内に蓄積するために、油脂を菌体から 抽出する工程が必要となる。この工程は、培養液からの菌体の分離、菌体の破砕、 及び溶媒による油脂の抽出、あるいは乾燥菌体からの溶媒による油脂の抽出等を 含み、煩雑かつ非効率的である。

一方、油脂を微生物の菌体外に製造する方法として、カビ類または藻類を界面 活性剤の存在下に培養する方法(特開昭 62- 3791号)が知られている。

また、トリコスポロン属、サッカロマイコプシス属、カンディダ属またはクリ プトコッカス属に属し、脂肪酸アルキルエステルまたは脂肪酸の存在下に培養す ることにより油脂を菌体外に生産させる方法(特開平 5- 91889号)、及び、トリ コスポロン属に属し、炭水化物の存在下に培養することにより油脂を菌体外に生 産する能力を有する微生物を炭水化物を含有する培地に培養して、培養液中菌体 外に油脂を生成蓄積せしめ、該培養液から生成蓄積した油脂を採 'することを特 徴とする油脂の製造方法〔特開平 7- 236492号)が提案されている。これらの方法 において菌体外に生産される油脂はトリグリセリドであり、遊離脂肪酸は分泌さ れない。

さらに、キャンディダ ' リポリティ力(Candida lypolytica) の変異株を用い て長鎖脂肪酸を菌体外生産させる方法(宮川ら、 Agri Biol. Chem., 48, 499 (1984)) が知られている。尚、キャンディダ ' リポリティ力は、現在ではヤロー ウイァ (Yarrowia) 属に分類されている。前記変異株は、ァシル一 C o Aシンセ ターゼ Iを欠損し、 ?一酸化を介する脂肪酸分解ができない親株を変異処理し、 パーコール密度勾配遠心による低細胞密度を示す株のスクリーニング、及び、脂 肪酸要求性変異株上に重層してそれらの変異株の生育を支持する株のスクリー二 ングによって得られた株であり、至適条件下では 1 m 1あたり 1 mgを超える量 の脂肪酸を産生する。

しかし、サッカ πマイセス属酵母では、実質的にアーリノレン酸等の遊離脂肪 酸を分泌する株は知られていない。

ところで、いくつかの脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子が単離されてお り、ラットの Δ 6デサチユラ一ゼ遺伝子が導入されたサヅカロマイセス ·セレビ シェ (Saccharomyces cerivisiae) は、培地中のリノール酸を菌体内に取り込み ァ一リノレン酸に変換し、菌体内に蓄積することが知られている(Biochem. Bio phys. Res. Commun., 255(3), 575 (1999)) 。また、モルティエレラ · アルピナ (Mortierella alpina) から分離された△ 6デサチユラーゼ遺伝子と厶 1 2デサ チユラ一ゼ遺伝子を導入したサヅカロマイセス · セレピシェは糖類から、 GLAを 生産し菌体内に蓄積することが知られている(Lipids, 34 (7), 649 (1999)) 。

しかし、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を、脂質の菌体外分泌に利用された例は知 られていない。

発明の開示

本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、脂質、特に不飽和脂肪酸を 分泌する微生物、及び同微生物を用いて脂質を製造する方法を提供することを課 題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、脂質を分泌 する能力を有する微生物に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入すると、不飽和脂肪 酸を効率よく分泌することを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下のとおりである。

( 1 ) 脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子で形質転換され、かつ、脂質を菌 体外に分泌する能力を有する微生物の形質転換体。

( 2 ) 前記脂質が不飽和脂肪酸である( 1 ) の微生物の形質転換体。

( 3 ) 脂肪酸不飽和化酵素が△ 6デサチユラーゼである( 1 ) 又は( 2 ) の微生 物の形質転換体。

(4 ) 前記微生物が酵母である( 1 ) 〜( 3 ) のいずれかの微生物の形質転換体。

( 5 ) 前記酵母がサッカロマイセス属酵母である(4 ) の微生物の形質転換体。

( 6 ) 前記サヅカロマイセス属酵母がサヅカロマイセス 'セレピシェである( 5 ) の微生物の形質転換体。

( 7 ) 前記不飽和脂肪酸が、アーリノレン酸、 cis-6,9, 12,15-ォク夕デカテトラ ェン酸である( 1 ) 〜( 6 ) のいずれかの微生物の形質転換体。

( 8) ( 1;) 〜( 7 ) のいずれかの微生物の形質転換体を液体培地に培養し、同 培地中に脂質を蓄積させることを特徴とする脂質の製造法。

( 9 ) 前記脂質が不飽和脂肪酸である( 8 ) の脂質の製造法。

( 1 0 ) 前記培地が脂肪酸不飽和化酵素の基質である脂質を含むことを特徴とす る (8 ) 又は( 9 ) の脂質の製造法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の微生物は、脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子で形質転換され、 かつ、脂質を菌体外に分泌する能力を有する微生物の形質転換体である。本発明 の微生物の形質転換体は、例えば、脂質を菌体外に分泌する能力を有する宿主微 生物を脂肪酸不飽和化酵素遺伝子で形質転換することによって得られる。宿主微 生物は、脂質を分泌する能力を元来有している微生物であってもよいし、脂質を 分泌する能力を獲得した微生物の変異体又は組換え体であってもよい。また、脂 肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された微生物の形質転換体に、脂質を分泌する能 力を付与することによつても、本発明の微生物を得ることができる。

本発明の微生物の宿主としては、脂肪酸分泌能を有するか、脂肪酸分泌能を付 与できるものであれば特に制限されないが、例えばサヅカロマイセス · セレビシ

ェ、サヅカロマイセス ' カールスベルゲンシス等のサヅカロマイセス属酵母、シ ゾサヅカロマイセス (Shizosaccharomyces) 属酵母、シュワンニォマイセス (Sc hwanniomyces) 属酵母、クロエッケラ(Kloeckera) 属酵母、卜リコスポロン属 酵母、クリプトコッカス属酵母、キャンディダ属に属する酵母(キャンディダ リポリティ力、キャンディダ · ュチリス(Candida utilis)) 、リポマイセス · ス 夕ーキ一(Lipomyces starkeyi) 等のリポマイセス酵母等の酵母、ムコール ' ル キシ—— (Mucor rouxii) 、ムコ一ノレ · シノレシ不ロイテス (Mucor ci cinelloides ) 、 モルティエレラ . アルピナ(Mortierella alpina) 等の糸状菌等が挙げられる。 脂質を分泌する能力を有する宿主微生物として具体的には、キャンディダ - リ ポリティ力の脂質分泌変異株(宫川ら、 Agri Biol. Chem., 48, 499 (1984)) 、 後述のサッカロマイセス · セレピシェの脂質分泌変異株である SFS-1株等が挙げ られる。

また、微生物の脂質分泌変異株は、微生物を通常の突然変異処理、例えばェチ ルメタンスルフォネート(EMS) や N—メチル一 N,一ニトロ一 N—ニトロソ グァニジン(NTG) 等の突然変異誘発剤による化学的処理、あるいは UV照射 等の物理的処理によって処理し、脂質を分泌するようになった変異株を選択する ことによって取得することができる。脂質を分泌する変異株は、変異処理した微 生物を、低窒素源培地、例えば炭素源含有量が炭素原子に換算して 0. 8%以上、 かつ、窒素源含有量が窒素原子に換算して 0. 00 2 %以下の培地で培養し、得 られる菌体を密度勾配遠心により分画し、高比重画分として分離される菌株を選 択することにより、選択することができる。

さらに、選択された候補株のコロニーを寒天培地上に形成させ、その上に脂肪 酸要求性変異株を懸濁させた寒天培地を重層し、脂肪酸要求性変異株が周囲に生 育する菌株を分離することによって、脂質分泌株が得られる。尚、本発明に用い る変異株は、自然突然変異株であってもよい。

上記のように本発明者らは、特定の培地で培養した微生物菌体を比重により分 画することによって、脂質分泌株を選択することができることを見い出した。こ れは、前記のような低窒素源培地で培養すると、本来余剰な脂質を生産しない微 生物であっても、余剰脂質を生産するようになり、また、脂質分泌株は、非分泌

株よりも脂肪酸等の脂質を細胞内に蓄積しにくいため、比重が大きいためである と考えられる。

前記サヅカロマイセス · セレピシェ SFS- 1株は、上記のようにして得られた変 異株である。

脂肪酸を分泌する微生物として具体的には、長鎖ァシル一 C 0 Aシンセ夕ーゼ (EC 6.2.1.3) を欠損した変異株又は組換え株が挙げられる。本発明者等は、 SF S- 朱の変異を復帰させる遺伝子をクローニングしたところ、公知の F A A 1遺 伝子と同一の配列を有することが判明し、サヅカロマイセス · セレピシェの脂肪 酸非分泌株の F A A 1遺伝子を破壊したところ、脂質を分泌するようになること を知見している。

脂質分泌能を有する微生物に導入する脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、宿 主微生物中で発現多能なものであれば特に制限されないが、△ 5デサチユラーゼ 遺伝子、 Δ 6デサチユラーゼ遺伝子、△ 9デサチユラーゼ遺伝子、△ 1 2デサチ ユラーゼ遺伝子等が挙げられる。

△ 5デサチユラーゼ遺伝子としては、モルチェラ ' アルピナ(Lipids, 34 (7), 649 (1999)) 及びヒト(J. Biol. Chem., 274, 471 (1999)) 由来の遺伝子が挙 げられる。

△ 6デサチユラ一ゼ遺伝子としては、モルチェラ ' アルピナ(Lipids, 34 (7), 649 ( 1999)) 、線虫(C. elegans) (Biochem. J., 330, 611 (1998)) 、植物

(Borago officinales) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4211 (1997)) 、 ヒ卜(J. Biol. Chem., 274, 471 (1999)) 、及びラット(Biochem. Biophys. R es. Co匪 un., 255(3), 575 ( 1999)) 由来の遺伝子が挙げられる。

△ 9デサチユラーゼ遺伝子としては、モルチェラ ' アルピナ(Lipids, 34 (7), 649 (1999)) 及びサッカロマイセス ' セレピシェ由来の遺伝子が挙げられる。

Δ 1 2デサチユラーゼ遺伝子としては、モルチェラ · アルピナ(Lipids, 34 (7), 649 (1999)) 、ムコール ' ルキシ一、植物(Borago officinallis) (Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4211 (1997)) 、及びヒト(J, Biol. Chem., 2 74, 471 (1999)) 由来の遺伝子が挙げられる。

上記の各遺伝子は、例えば、既知の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレ

ォチドをプライマーとする P CRにより、各々の生物の染色体 D N A又は c D N Aライブラリーから増幅することによって取得することができる。後記実施例で は、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 255(3), 575 ( 1999)に記載されているラ ヅトの Δ 6デサチユラーゼ遺伝子を含むプラスミド pYES2/r24a (図 1参照)を使 用した。これらの遺伝子及びプラスミドは、前記文献に記載の方法と同様にして 取得することができる。また、プラスミド pYES2/r24aは、通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所(郵便番号 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1 番 3号)に受託番号 F E RM BP— 7 09 7として寄託されているサッカロマ イセス . セレピシェ SFS- 2株から、通常のプラスミドの調製法により取得するこ とができる。 pYES2/r24a中に含まれるラットの Δ 6デサチユラーゼ遺伝子の塩基 配列及び同塩基配列によってコードされ得るアミノ酸配列を、配列番号 1及び 2 に示す。

染色体 DNAの調製、プラスミドの調製、 P C R等の手法周知であり、例えば、 モレキュラー ' クローニング:ァ ' ラボラトリ一 ' マニュアル(マニアテイス (Maniatis) 等、 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press (1989)) 等に記載されている。また、酵母の培養、形質転換等についても同様に 周知であり、 Ito, et al., (1983) J. Bacteriol., 153, 163- 168等に記載され ている。

脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子を脂質分泌微生物に導入し外来遺伝子を発現させ るための発現ベクターとしては特に制限されず、宿主微生物に応じた好適なべク ターを選択すればよい。例えば、サヅカロマイセス 'セレピシェにおいては、 YI p型べクタ—、 ΥΕρ型ベクター、 YRp型ベクター、 YCp型べクタ一等が知られている が、いずれも使用することができる(生物化学実験法 39 酵母分子遺伝学実験法、 P123-132 ( 1996)参照)。また、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を発現させるための プロモータ一としては、同遺伝子固有のプロモーターが宿主微生物中で機能する 場合にはそのプロモーターを使用することができるが、機能しないか又は不十分 な場合には、宿主微生物で効率よく機能するプロモータ一を用いてもよい。サッ カロマイセス ' セレピシェのプロモーターとしては、ガラクトースキナーゼ(G AL 1 ) 、アルコールデヒドロゲナーゼ(A D H) 、グリセルアルデヒド— 3— リン酸デヒドロゲナ一ゼ(GAP— DH) 、酸性ホスファ夕一ゼ(PH 05 ) 、 ガラクトース資化性酵素(GAL) 等のプロモーターが知られている。

本発明の微生物を液体培地に培養し、同培地中に脂質を蓄積させることにより、 脂質を製造することができる。脂質としては、不飽和脂肪酸が挙げられる。本発 明によって製造される脂質の種類は、宿主微生物の種類及び脂肪酸不飽和化酵素 の種類によって異なる。例えば、ォレイン酸(C18: 2 Δ9,12) の生産能は有す るがリノール酸(C18: 2 Δ9,12) の生産能を有しない脂質分泌株に Δ12デサチ ユラ一ゼ遺伝子を導入した場合にはリノール酸(C18: 1 Δ9) の菌体外生産が可 能となる。また、△ 6デサチユラーゼを導入した場合には培地中にリノール酸を 添加することによりァ一リノレン酸(C18: 3 Δ6,9,12) の菌体外生産が、ひ一 リノレン酸(C18: 3 Δ9, 12, 15)を培地中に添加することにより cis- 6, 9, 12,15-ォクタデカテトラェン酸の菌体外生産が可能となる。さらにその両方の遺伝子 (Δ12デサチユラーゼ及び Δ 6デサチユラーゼ)を導入した場合には、培地中へ のリノール酸の添加無しにアーリノレン酸の菌体外生産生産が可能となる。

他の微生物においても、例えばリノール酸の生産能を有すキャンディダ · リポ リティ力に Δ 6デサチユラ一ゼ遺伝子を導入した場合には培地中にリノール酸 を添加すること無しにアーリノレン酸の生産が可能となる。

本発明の微生物を培養する培地としては、特に制限されず、炭素源、窒素源、 無機イオン等を含む種々の培地を用いることができる。

主要炭素源としては、グルコース、シュクロース、フラクトース等の糖類、ェ 夕ノール、グリセリン等のアルコール類、グルタミン酸、ァスパラギン酸等のァ ミノ酸等が挙げられる。また、窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、硝酸アンモニゥム、塩化アンモニゥム、酵母エキス、肉ェキ ス、ペプトン、カゼイン加水分解物、コーンスティープリカ一等が挙げられる。 無機イオンとしては、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガ ンイオン、ナトリウムイオン、亜鉛イオン、銅イオン、モリブデンイオン、ヨウ 素イオン等が挙げられる。

培地には、ポリオキシエチレン( 2 0 ) セチルエーテル(Brij- 58) 、ポリグ ルコールエーテル(非イオン)界面活性剤(例えば Tergitol NP-40) 等の界面活 性剤を、 0 . 0 1〜 1 . 0 %添加することが好ましい。

また、前述のように、製造する脂質に応じた前駆体、具体的には脂肪酸不飽和 化酵素の基質である脂質を必要により培地に添加する。培地に添加する脂質は、 必ずしも遊離脂肪酸である必要はなく、トリグリセリド等であってもよい。

さらに、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現に誘導物質が必要な場合は、誘導物 質を培地に添加する。例えば、 G A L 1プロモーターを用いた場合は、培地にガ ラクトースを添加する。

培養条件は、用いる微生物の種類によって適宜設定すればよい。例えば、サッ カロマイセス ·セレビシェでは、 2 0〜 3 5 °Cで、 5 0〜 3 0 0 r p mで 1〜 7 曰好気的条件で培養する。尚、脂質の製造には、対数増殖期の菌体よりも、定常 期の菌体を用いることが好ましい。窒素源欠乏により、定常期に入った菌体の方 が、培地中の炭素源を脂質合成に用いるため、対等脂質収率は向上し、好ましい。 好ましい培地及び培養条件として、例えば、後述の低窒素源培地において硫酸 アンモニゥムを 0 . 0 5 %に変更した培地、 Y P D培地、あるいは後述の高窒素 源培地で培養した菌体を、低窒素源培地に移し換えた培養において高い菌体外脂 質生産性を示す。

培養液から脂質を採取するには、例えば、培養液から遠心分離、濾過等によつ て菌体等の不要物を除去し、得られる培養上清から適当な溶媒を用いて抽出する。 溶媒としては、クロ口ホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、 1, 2—ジクロロェ タン等のハロゲン化低級アルカン、ベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素等 が挙げられる。溶媒の量としては、脂質を十分に抽出できる量であれば特に制限 されないが、通常培養上清 1 Lに対して 1 0 0 m 1〜 1 Lである。

抽出された脂質は、目的によって、そのままあるいはさらに精製して使用する。 脂質の精製、あるいは特定の脂質の分離は、 T L C、液体クロマトグラフィー等、 通常の脂質の分離、精製法によって行えばよい。

図面の簡単な説明

図 1は、プラスミド pYES2/r24aの構造を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 本実施例で使用した培地等の組成は、以下のとおりである

( 1 ) YP D培地

グルコース 2 %

ポリペプトン 2 %

酵母エキス 1 %

( 2 ) YPD平板培地

グルコース 2 %

ポリペプトン 2 %

酵母エキス 1 %

寒天 2 %

(3) 高窒素源培地

グルコース 2 %

ィ-ス卜ニトロケ、、ンへ、、 -ス(不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 0. 1 7 % (Difco社)

硫酸アンモニゥム 0. 5 % カザミノ酸 0. 5 % ゥラシル 0. 0 02 % トリブトファン 0. 005 %

(4) 低窒素源培地

グルコース 2 % イ-ストニト ϋケ、、ンへ、、 -ス(不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 0. 1 7 % (Difco社)

硫酸アンモニゥム 0. 0 1 % ロイシン 0. 0 1 %

ゥラシル 0. 0 02 % トリブトファン 0. 005 %

( 5 ) 軟寒天培地( I )

グルコース 2 %

ポリペプトン 2 %

酵母エキス 1 %

ホ。リオキシエチレン(20)セチルェ -テル (Brij-58) 0. 5 %

0. 7 5 %

( 6) 軟寒天培地(II)

グルコース 2 %

ポリペプトン 0. 5 % 酵母エキス 0. 1 %

KH 2P 0 0. 1 %

M g S 0 0. 0 0 5 % ホ。リオキシュチレン(20)セチル I -テル (Brij-58) 0. 5 % 寒天 0. 7 5 %

( 7) 培地 A

グルコース 2 %

ポリペプトン 2 %

酵母エキス 1 %

グリセリン 2 %

Tergitol NP-40 1 %

( 8) 培地 B

グルコース 3 % イ-ストニト ϋケ、、ンへ、、-ス(不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 0. 1 7 %

(Difco社)

硫酸アンモニゥム 0. 0 1 %

ロイシン 0. 0 1 % ゥラシル 0. 0 02 % 卜リブ卜ファン 0. 00 5 %

Tergitol NP-40 1 %

( 9 ) EMS溶液

EMS (ェチルメタンスルフォン酸) 0. 3 m l 0. 2 Mリン酸緩衝液(p H 8. 0 ) 9. 2 m l 40 %グルコース溶液 0. 5 m l

( 1 0 ) 培地(a) i 1

1

グルコース 20 g

ヒスチジン 20 mg ロイシン 60 mg トリブトファン 40 mg イ-スト二卜 Dケ"ン V、-ス(不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 6.7 g

寒天 20 g

蒸留水 1000 ml

( 1 1 ) 培地( b )

グルコース 20 g

ガラクトース 10 g

トリプトファン 50 mg ヒスチジン 20 mg ロイシン 60 mg ィ-スにト Dケ、、ン Λ、、-ス (不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 6.7 g

(Difco社)

Tergitol NP-40 10 g

遊離リノール酸(純度: 99%) 280 mg 蒸留水 1000 ml

( 1 2 ) 培地( c )

グルコース 20 g トリブトファン 40 mg ヒスチジン 20 mg ロイシン 60 mg イ-スト二卜 ϋケ'、ン Λ、'-ス(不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 6.7 g (Difco社)

蒸留水 1000 ml

( 1 3 ) 培地( d )

ガラクトース 10 s トリブトファン 50 mg ヒスチジン 20 mg ロイシン 60 mg イ-スト二卜 ϋケ"ン -ス (不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 1.7 g (Difco社)

Tergitol NP-40 10 g 遊離リノール酸(純度: 99%) 280 mg 蒸留水 1000 ml

( 1 4 ) 培地( e )

グルコース 20 g ガラクトース 10 g トリブトファン 50 mg ヒスチジン 20 mg ロイシン 60 mg イ-スト二卜ロケ、、ンへ、、 -ス (不含硫酸アンモニゥム、アミノ酸) 6.7 g (Difco社)

Tergitol NP-40 10 g 遊離ひーリノレン酸 280 mg

(C18:3 Δ9,12,15純度: 99%)

蒸留水 1000 ml

実施例 1 サッカロマイセス · セレピシェの脂質分泌変異株の作製

く 1 >サヅカロマイセス ' セレピシェの脂肪酸分泌変異株の単離

サヅカロマイセス · セレビシェ CG378株(アメリカン ' タイプ . カルチヤ一 •コレクション(ATCC 204664) から入手)を 1 0 m 1の Y P D培地で、 3 0 °C、 1 00 r p mで 1 6時間振盪培養した。培養終了後、遠心( 3 000 r pm、 5 分)により集菌した。菌体を 0. 2Mリン酸緩衝液(pH 8. 0 ) 5 m lに懸濁 し、次いで遠心( 3 0 0 0 r pm、 5分)により集菌することによって菌体を洗 浄した。その後、菌体を EMS溶液 1 0 m 1に懸濁し、 3 0°Cで 3 0分間穏やか に振盪することによって、変異処理を行った。 6 %次亜硫酸ナトリウム溶液 9. 8mlを EMS処理液に添加して 1 0分間静置することによって変異処理を停止 させた。前記変異処理は、生存率 1 5 %を目安とした。

上記のようにして変異処理した菌体を遠心( 3 0 0 0 r pm、 5分)により集 め、高窒素源培地 5 0 m 1に植菌し、 30°C、 1 0 0 r p mで 1 6時間振盪培養 した。培養後、遠心( 3 0 0 0 r pm、 5分)による集菌及び 0. 2 Mリン酸緩 衝液 (pH 8. 0 ) 5 m 1への懸濁を 2回繰り返すことにより菌体を洗浄した。 次に、菌体を低窒素源培地 5 0 m 1に植菌し、 3 0°C、 l O O r pmで 1 6時間 振盪培養した。菌体を遠心( 3 0 00 r pm、 5分)により集め、 2 %グルコ一 ス溶液に懸濁(菌濃度 2 X 1 08個細胞/ m 1 ) した。この懸濁液 0. 2m lを、 パーコール(Percol、フアルマシア社)を各々 1 0 0 %、 9 0 %、 80 %及び 7 0 °/0となるように溶解した 0. 25 Mシュ一クロース溶液を順に重層した遠心管 の最上部に重層し、 5 0 0 0 x gで 5時間、密度勾配遠心を行った。遠心後、高 比重の菌体層を分離した。以上の操作を、 3回繰り返した。

上記のようにして得られた高比重菌株を YP D平板培地に塗布し、 3 0 °Cで 3 日間培養した。コロニーが形成した後、 5 0 cmの距離においた 1 5 W滅菌灯に より、 1 5分間 UV照射した。次に、この平板培地に、ォレイン酸要求性変異株

(KD 1 1 5株、アメリカンタイプカルチャーコレクション(登録番号 A T C C 2 0 4 9 9 1 ) から入手可能)を 1 05個細胞/ m 1含む懸濁軟寒天培地( I ) 1 0m lを重層し、ォレイン酸要求性変異株が周囲に生育しハロを形成した変異 株を分離した。この変異株を、 SFS- 1株と命名した。

SFS-1株は、は、 2000年 3月 17日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研 究所 (郵便番号 305- 8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号)に国際寄託 され、受託番号 F E RM B P— 7 0 9 6が付与されている。

< 2 >変異株が分泌する脂質の分析

く 1 〉で得られた変異株を培地 A 2 0 0 m lに植菌し、 3 0°C、 2 0 0 r p mで Ί 2時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離( 2 4 0 0 X g、 1 0分間) により湿菌体を分離した。この湿菌体に滅菌蒸留水 1 0 0 m 1を添加し、混合後、 再び遠心(同上)し、菌体を洗浄した。この菌体を、培地 B 1 0 0 m lに乾燥 菌体で約 5 g/Lになるように植菌し、 3 0 °C、 2 0 0 r p mで 9 6時間振盪培 養した。培養終了後、遠心分離(同上)により培養液中の菌体と培養上清を分離 し、培養上清に対して 3 0 m 1のクロ口ホルムを用いて 3回抽出した(計 9 0 m 1 ) 。クロ口ホルムを気化させて抽出物を濃縮し、 T L Cにより抽出物を分離し た。 T L Cは、シリカゲル 7 0プレート(ヮコ一)を用い、 n—へキサン:ジェ チルエーテル:酢酸 = 8 0 : 3 0 : 1で展開した。薄層をヨウ素で発色させたと ころ、 2つのスポットが見られた。これらのスポットの各々を回収し、ガスクロ マトグラフィ一(脂肪酸分析用: FFAP5% Uniport S 60/80、ステロール分析用: Silicone 0V-17 2% Uniport HP 60/80) により解析した結果、脂肪酸(パルミチ ン酸、ノレミトレイン酸、ステアリン酸、ォレイン酸)とエルゴステロールが検 出された。また、抽出物を液体クロマトグラフィー(カラム: 0DS、移動層:メ 夕ノール/エタノール = 65/35、流速: 1.0ml/分、検出: UV検出器(275nm)) に より分析した結果、ュビキノン(コェンザィム Q6) が検出された。尚、サッカ ロマイセス 'セレピシェの菌体中に存在するトリグリセリド及びエルゴステロ一 ルエステルは検出されなかった。

実施例 2 ラット由来△ 6デサチユラ一ゼ c D N Aを含むプラスミドの構築

サヅカロマイセス · セレピシェにラヅト由来 Δ 6デサチユラーゼ c DNAを導 入するためのプラスミドとして、同 c DNAを含むプラスミド pYES2/r24a (Bioc hem. Biophys. Res. Commun., 255 (3), 575-579 ( 1999)) (著者 T. Akiより供 与された)を用いた。プラスミド pYES2/r24aは、ラット由来 Δ 6デサチユラーゼ の c DNA ( 1335bp) のコード領域を含む配列を、酵母発現ベクター pYES2 (Inv itrogen社)に連結したものである。 pYES2は、サッカロマイセス 'セレピシェの GAL1プロモータ一と CYC1夕一ミネーターを含んでおり、 GAL1プロモーターの下流 に連結された c D N A断片は、このプロモーターの制御を受けて酵母内で発現す る。また、この PYES2は、酵母内で複製可能な 2〃m DN Aの複製起点と酵母に おけるマーカ一遺伝子として URA3、クロ一ニング部位として HindIII、 BamHK Xb al部位等を含むマルチクローニングサイト、大腸菌におけるマーカー遺伝子とし てアンピシリン耐性遺伝子および大腸菌で複製可能な複製起点等により構成され ている。

プラスミド pYES2/r24aを、サッカロマイセス ' セレピシェの脂質分泌変異株 SF S-1株に、酢酸リチウム法 (Itoh et al., J. Bacteriol., 153:163-168( 1983)) に準じて導入した。 SFS- 朱を 5 0 m 1の YP D培地中で 3 0 で 1 2時間培養 した。遠心分離( 24 0 0 X g、 5分間)により細胞を集め、 5 0 m lの TE緩 衝液 (10mM Tris-HCl, lmM EDTA) に懸濁し、再度遠心分離によりペレヅト状に した。このペレットを約 1 m 1の T E緩衝液に再懸濁し、その一部 0. 5 m lに 0. 5 mlの 0. 2M酢酸リチウム溶液を添加し、懸濁液を 3 0°Cで 1時間緩や かに振盪した。振盪後、上記酢酸リチウム · 菌体混合液に 1 0〃 1のプラスミド 溶液 (pYES2/r24a DNA約 1 0〃 gを含む)を添加し、 3 0 °Cで 3 0分間放置した。 次にポリエチレングリコール 4 0 0 0を最終濃度が約 3 5 % (w/v) になるよ うに添加して混合した。この細胞液を 3 0°Cで 2. 5時間維持した後、遠心分離 ( 24 00 X g、 5分間)により集菌した。遠心により得られた菌体ペレットを 0. 2 m 1の T E緩衝液(同上)に懸濁し、このうち 0. 1 m lを下記のゥラシ ルを含まない合成培地である培地(a) に広げて蒔き、 3 0°Cで 3日間静置培養

を行った。

上記のようにして、 pYES2/r24aが導入され、ゥラシル要求性が消失した形質転 換体 SFS- 2株が得られた。 SFS- 2株は、 2000年 3月 17日に、通商産業省工業技術院 生命工学工業技術研究所(郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1 番 3号)に国際寄託され、受託番号 F E R M B P— 7 0 9 7が付与されている。

実施例 3 Δ 6デサチユラーゼ c D N A発現条件下における形質転換株によるァ 一リノレン酸の生産の検討

培地(b ) 100mlに SFS- 2株を接種し、 30°C、 144時間培養した。培養終了後、 3 OOOrpmの遠心処理により培養液中の菌体を除去した。次に培養上清に対して 30ml のクロ口ホルムを加え、 3回抽出処理(計 90ml ) を行った。クロ口ホルム抽出液 に内部標準物質としてマーガリン酸 5 mgを加え、クロロホルムの気化により抽 出物を濃縮した後、 7%三フヅ化ホウ素/メタノール溶液を l ml添加し、 80°Cで 1 0分間加熱して遊離脂肪酸のメチルエステル化を行った。放冷後、 2 mlのへキサ ンと 4 mlの蒸留水を添加して撹拌した後、上層のへキサン層をガスクロマトグラ フィ一(FFAP5% Uniport S 60/80) により分析し、菌体外ァ—リノレン酸生産量 を検討した。一方、菌体中のアーリノレン酸量を測定するため、菌体にマ一ガリ ン酸 5 mgと 0.5N 水酸化ナトリゥム /メ夕ノール溶液 1 mlを加え、 80°Cで 1時間 加熱した。放冷後、 7%三フッ化ホウ素/メタノール溶液を l ml添加し、 80°Cで 1 0分間加熱した。放冷後、 2 mlのへキサンと 4 mlの蒸留水を添加して撹拌した後、 上層のへキサン層をガスクロマトグラフィーにより分析し、菌体内のアーリノレ ン酸蓄積量を検討した。その結果、培養上清からは 25 mg/Lのァ一リノレン酸が 確認された。また、菌体中にはァ一リノレン酸の蓄積は認められなかった。

比較例 1 Δ 6デサチユラーゼ c D N A非発現条件下における形質転換株による アーリノレン酸の生産の検討

前記培地(b ) の代わりに、同培地からガラクトースを除いた培地を用いた以 外は実施例 3と同様に SFS- 2株を培養し、培養上清及び菌体中内のァ—リノレン

酸を測定した。その結果、培養上清及び菌体内のいずれからもアーリノレン酸は 確認されなかった。このことから、アーリソレン酸の生成及び菌体外分泌には、 △ 6デサチユラ一ゼの発現が必須であることが確認された。

実施例 4 SFS- 2株の休止菌体を用いたアーリノレン酸の牛産

培地( c ) 300mlに SFS-2株を接種し、 30°C、 72時間培養後、 3000 rpmの遠心処 理により、生育した菌体を集菌した。菌体ペレットを 100mlの 0.1M リン酸カリゥ ム緩衝液(pH 7.0) を用いて洗浄(菌体を懸濁後、遠心処理により集菌)した。 この菌体ペレットの一部を用い、組成の培地(d) に乾燥菌体で 5g/Lになるよう に接種し、 30°C、 144時間培養を行った。培養終了後、実施例 3と同様に方法に より、培養上清および菌体内のアーリノレン酸を測定した。その結果、培養上清 には 70 mg/Lのァ—リノレン酸が確認された。また、菌体内には、 1 Lの培養液 に相当する菌体当たり、 58 mgのリノール酸の取り込みと、 3mgのアーリノレン 酸の蓄積が認められた。

実施例 5 厶 6デサチユラーゼ c D N A発現条件下における SFS- 2株による cis-6, 9, 12, 15-ォク夕デカテトラエン酸の生産の検討

培地(e) 100mlに SFS- 2株を接種し、実施例 3と同様にして脂肪酸の測定を行 つた。その結果、培養上清には 22 mg/Lの cis- 6, 9, 12,15-ォクタデカテトラェン 酸が確認された。一方、菌体内には cis- 6,9,12,15-ォクタデカテトラェン酸の蓄 積は認められなかった。

比較例 2 A 6デサチユラーゼ c D N A非発現条件下における SFS- 2株による cis -6,9,12,15-ォクタデカテトラエン酸の生産の検討

前記培地(e ) の代わりに、同培地からガラクトースを除いた培地を用いた以 外は実施例 5と同様に形質転換体 SFS- 2株を培養し、培養上清及び菌体中内の cis - 6,9,12,15-ォク夕デカテトラェン酸を測定した。その結果、培養上清および菌 体内にいずれからも、 cis_6,9,12,15-ォクタデカテトラエン酸は確認されなかつ た。このことから、 cis_6, 9, 12,15-才クタデカテトラェン酸の生成及び菌体外分 泌には、△ 6デサチユラーゼの発現が必須であることが確認された。

産業上の利用可能性

本発明により、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、脂質、特にアーリノレ ン酸、 cis- 6,9,12,15-ォクタデカテトラェン酸等の不飽和脂肪酸を分泌する微生 物、及び同微生物を用いて脂質を製造する方法が提供される。