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1. WO2001074753 - DERIVES SYNTHETIQUES D'ACIDE LUNULARIQUE, MEDICAMENTS CONTENANT CES COMPOSES, PROCEDE DE PRODUCTION DESDITS DERIVES D'ACIDE LUNULARIQUE ET LEUR UTILISATION

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[ DE ]

Synthetische Derivate von Lunularsäure, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, Verfahren zur Herstellung der Lunularsäurederivate sowie deren Verwendung

Die Erfindung betrifft synthetische Derivate von Lunularsäure, Arzneimittel enthaltend diese Verbindungen, Verfahren zur Herstellung der Lunularsäurederivate sowie deren Verwendung als chemopräventive Agentien gegen Krebserkrankungen.

Da Krebs eine Erkrankung ist, die heute aus verschiedensten Gründen (z.B. Älterwerden der Bevölkerung, negative
Umwelteinflüsse usw.) schon ein Drittel der Bevölkerung von Industriestaaten betrifft und noch mit einer weiteren Zunahme der Erkrankungen zu rechnen ist, gibt es Bemühungen Stoffe herauszufinden, welche frühzeitig angewendet, einen Schutz vor dem Entstehen von Krebs geben (Krebsprophylaxe) . Es gibt deshalb eine ausgedehnte Forschungsrichtung, die sich mit der Identifikation neuer chemopräventiver Agentien beschäftigt, um den dringenden Bedarf der Krebsverhütung zu decken.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der
Identifikation neuer chemopräventiver Agentien, die einfach und nebenwirkungsfrei anzuwenden sind.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der
Patentansprüche .

Von den Erfindern wurde bereits früher gefunden, daß
Lunularsäure (2-Hydroxy-6- [2- (4-hydroxy-phenyl) ] ethylbenzoesäure) und Lunularin, die aus
Leberblümchen, welche zur Kategorie der Moose gehören, isoliert werden können, eine chemopräventive Wirkung haben.

Lunularsäure: R = COOH
Lunularin: R = H

Jetzt wurde weiter herausgefunden, daß bestimmte Derivate der Lunularsäure eine noch weit über Lunularsäure und Lunularin hinausgehende positive Wirkung haben und selbst in geringen Dosen noch gegen Stoffwechselprozesse schützen, die für eine Krebsentstehung verantwortlich gemacht werden können.
Gegenstand der Erfindung sind daher Verbindungen der
allgemeinen Formel (I), (II), (III) oder (IV)



worin X ein beliebiger mono- oder polycyclischer
(Hetero) Arylrest, der ggf. substituiert ist, ist. Beispiele hierfür sind ein carbocyclischer, monocyclischer Rest, beispielsweise die Phenylgruppe, ein heterocyclischer , monocyclischer Rest, beispielsweise die Gruppen Thienyl, Thiophenyl, Furyl , Furanyl , Pyranyl , Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyridinyl, Pyrrolidinyl , Pyrazinyl, Pyrimidinyl , Pyrazolonyl, Pyridazinyl, Purinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Indolyl, Furazannyl, Pyrrolinyl, Imidazolinyl , Pyrazolinyl, Thiazolinyl, Triazolyl, Tetrazolyl, sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können, ein Rest bestehend aus carbocyclischen kondensierten Ringen, beispielsweise die Naphthylgruppe oder die Phenanthrenylgruppe, ein Rest bestehend aus kondensierten heterocyclischen Ringen, beispielsweise Benzofuranyl ,
Benzothienyl , Benzimidazolyl, Benzothiazolyl , Naphtho[2,3-b] thienyl, Thianthrenyl , Isobenzofuranyl , Chromenyl ,
Xanthenyl , Phenoxathiinyl , Indolizinyl, Isoindolyl, 3H-Indolyl, Indolyl, Indazolyl, Purinyl, Chinolizinyl ,
Isochinolyl, Chinolyl, Phthalzinyl, Naphthyridinyl ,
Chinoxalinyl, Chinazolinyl , Chinolinyl, Pteridinyl,
Carbazolyl, ß-Carbolinyl, Cinnolinyl, Acridinyl, Phenazinyl, Phenothiazinyl , Phenoxazinyl , Indolinyl, Isoindolinyl ,
Imidazopyridyl , Imidazopyridmidinyl oder auch die
kondensierten polycyclischen Systeme bestehend aus
heterocyclischen Monozyklen, wie beispielsweise vorstehend definiert, wie beispielsweise Thionaphthenyl , Furo[2,3-b]pyrrol oder Thieno [2 , 3-b] furan, und insbesondere die
Phenyl-, Furylgruppen, wie 2-Furyl, Imidazolyl, wie 2-Imidazolyl, Pyridyl, wie 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Pyrimidinyl, wie Pyridmid-2-yl , Thiazolyl, wie Thiazol-2-yl , Thiazolinyl, wie Thiazolin-2-yl, Triazolyl, wie Triazolyl-2-yl, Tetrazolyl, wie Tetrazol-2-yl , Benzimidazolyl, wie
Benzimidazol-2-yl, Benzothiazolyl", Benzothiazol-2-yl ,
Purinyl, wie Purin-7-yl, oder Chinolyl, wie 4-Chinolyl.

In den obigen Formeln können Rx und R2 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, einen geraden oder verzweigten Alkylrest mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, einen geraden oder verzweigten Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlensto fatomen, einen mono- oder polyzyklischen Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen, einen mono- oder polyzyklischen Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen, oder einen mono- oder polyzyklischen aromatischen Rest bedeuten, wobei diese Reste gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten substituiert sein können. R und R2 können gleich oder verschieden sein.

Es kann für R± und/oder R2 jeder beliebige gerade oder verzweigte C1.30-Alkylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert . -Butyl- , n-Butyl-, n-Hexyl-, 2-Methylpentyl- , 2,3-Dimethylbutyl- , n-Heptyl-, 2-Methylhexyl- , 2 , 2-Dimethylpentyl- 3 , 3-Dιmethylpentyl- , 3 -Ethylpentyl- , n-Octyl-, 2,2-D ime t hy 1 hexy 1 - , 3 , 3 - D ime t hy 1 hexy 1 - , 3-Methyl-3-ethylpentylgruppen. Bevorzugt sind wegen der besseren Loslichkeit kurze Alkylketten, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl-und Isopropyl- . Bevorzugt sind Rx und R2 gerade C1_14-Alkylreste oder C3 l4-Cycloalkylreste . Besonders bevorzugt stehen Rλ und R2 für H, CH3 oder CH3CH2.

Es kann für Rλ und/oder R2 jeder beliebige gerade oder verzweigte C2_30-Alkenylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Vinyl-, Propenyl-, Isopropenyl-, Allyl-, 2-Methylallyl- , Butenyl- oder Isobutenyl-, Hexenyl- oder Isohexenyl-, heptenyl- oder Isoheptenyl- , Octenyl- oder Isooctenylgruppen. Bevorzugt sind Vinyl-, Propenyl- und Isopropenyl-.

So kann R1 und/oder R2 jeder beliebige Cycloalkylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclopropyl- , Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexyl-, Cycloheptyl- , Cxclooctyl-, Cyclononyl- oder Cyc lodecylgruppen . Bevorzugt sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexyl-.

Der für Rλ und/oder R2 verwendbare Cycloalkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstof fatomen kann jeder beliebige Cycloalkenylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyc lobut eny 1 - , Cyclopentenyl - oder Cyc lohexeny 1 - , Cyc lohept enyl - , Cxclooctenyl-, Cyclononenyl- oder Cyclodecenylgruppen. Bevorzugt sind Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl- oder Cyclohexenyl . Beispiele für polyzyklische Alkyl- bzw. Alkenylreste umfassen Norbornan, Adamantan oder Benzvalen.

Vorzugsweise vorhandene Substituenten der verschiedenen vorstehend angegebenen Reste X, R1 und/oder R2 sowie des Grundgerüsts als Substituent R3 können aus der folgenden Gruppe ausgewählt werden:
Halogen: Fluor, Chlor, Brom, Iod,
Amino, Alkylamino, Dimethylamino oder Ethylamino, Dialkylamino , wie Dimethylamino, Diethylamino , Methylethylamino, wobei jeder dieser Dialkylaminoreste gegebenenfalls in Oxidform vorliegt,
Aminoalkyl, wie Aminomethyl oder A inoethyl,
Dialkylaminoalkyl , wie Dimethylaminomethyl oder
ethyl ,
Dialkylaminoalkyloxy, wie Dimethylaminoethyloxy,
Hydroxyl ,
freie, veresterte Carboxylgruppe, wie Alkoxycarbonyl , beispielsweise Methoxycarbonyl oder Ethoxycarbonyl , oder in ein Salz, beispielsweise durch ein Natriumoder Kaliumatom überführt,
Alkyl mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, tert . - Butyl, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogen- atom(e) substituiert, beispielsweise durch Fluor, wie Trifluormethyl ,
Oxo, Cyano, Nitro, Formyl ,
Acyl, wie Acetyl, Propionyl, Butyryl , Benzoyl,
Acyloxy, wie Acetoxy oder ein Rest der Formel:
-0-CO- (CH2)nC02H, worin n = 1 bis 5,
Alkoxy, wie Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, Isopropyloxy, Butyloxy,
Alkylthio, wie Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Isopropylthio, Butylthio,
Carbamoyl ,
Alkenyl, wie Vinyl, Propenyl,
Alkinyl , wie Ethinyl , Propinyl und
Aryl , wie Phenyl , Furyl , Thienyl.

Als Beispiele für derartige substituierte Reste können ein durch ein oder mehrere Halogenatom (e) substituierter Alkyl- rest, wie die Trifluormethyl-, Trifluorbutyl- , Pentafluorpro-pyl-, Pentaf luorbutyl-, Pentafluorpentyl- , Heptafluorbutyl -oder Nonafluorbutylgruppe oder 2-Chlorethyl- genannt werden.

Verbindungen der obigen Formeln (I), (II) , (III) und (IV) werden im weiteren mit dem Begriff "Lunularsäurederivate" beschrieben.

Bevorzugte Verbindungen sind:

Cl, AcO

Cl, AcÖ


In den Tabellen 3 und 4 sind eine Reihe weiterer bevorzugter Verbindungen aufgelistet.

Erfindungsgemäß ganz bevorzugte Verbindungen sind:



Vorzugsweise werden die Verbindungen der obigen Formeln (I) und (II) gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Syntheseschema hergestellt. Verbindungen der obigen Formeln (III) und (IV) sind analog den Vorschriften in Cullmann et al . , Z. Naturforsch. 54c, S. 147-150 (1999) und Cullmann et al . , Phytochemistry, Vol. 45, Nr. 6, S. 1235-1247 (1997) herstellbar.

Die vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Prävention von Krebserkrankungen aller Art, indem sie einerseits bestimmte Stoffwechselprozesse hemmen, bei denen Stoffe entstehen, die die Krebsentstehung fördern, und andererseits bestimmte Stoffwechselprozesse fördern, die beispielsweise karzinogene Substanzen abfangen. Die Modulation von Enzymen, die bei der metabolischen Aktivierung und Freisetzung von Carcinogenen beteiligt sind, ist einer der am besten untersuchten Mechanismen für chemoprotektive Agentien. Phase 1-Enzyme (Cytochrome P450) aktivieren Xenobiotika durch das Einfügen von funktionellen Gruppen, die diese Verbindungen besser wasserlöslich machen. Obwohl diese Funktionalisierung über Phase 1-Enzyme für die komplette Detoxifizierung von Substanzen notwendig ist, kann die Induktion von Phase 1-Enzymen das Risiko erhöhen, Carcinogene zu produzieren, die mit DNA reagieren können und Carcinogenese initiieren. Phase 2-Enzyme konjugieren die aktivierten Verbindungen an endogene Liganden, wie Glutathion oder Glucuron-, Essig- oder Schwefelsäure, wodurch die Freisetzung der Verbindungen in Form dieser Konjugate vermehrt wird. Allgemein stellt die Inhibierung von Phase 1-Enzymen gleichzeitig mit der Induktion von Phase 2 Enzymen eine logische Strategie bei der Chemoprävention dar, was besonders vorteilhaft in frühen Stadien der Carcinogenese ist. Um Modulatoren des Arzneimittel-Metabolismus zu identifizieren und damit eine Aussage über chemopräventive Agentien zu erhalten, werden beispielsweise die inhibitorischen Effekte auf die Phase 1 CyplA Aktivität und auf die Induktion der Phase 2 NAD(P)H:Chinonreduktase (QR) Aktivität bestimmt. Dazu werden beispielsweise ß-Naphthoflavon-induzierte Rattenhepatomzellen als Quelle von CyplA verwendet. Die zeitabhängige Dealkylierung von 3-Cyano-7-ethoxycumarin (CEC) zu 3-Cyano-7-hydroxycumarin kann fluorometrisch in 96-Loch-Platten verfolgt werden (Crespi et al . , Anal. Biochem. (1997), 248 (1): 188-190) . Die Induktion von QR-Aktivität als Modell-Phase 2-Enzym wird beispielsweise colorimetrisch in kultivierten Hepa lclc7-Zellen gemessen. Dazu wird die NADPH-abhängige Menadiol-vermittelte Reduktion von MTT (3- (4, 5-dimethylthiazo-2-yl) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbromid) in blaues Formazan untersucht (Prochaska et al . , Anal. Biochem.- 1988, 169(2): 328-336).

Stoffe mit chemopräventiven Eigenschaften zeichnen sich somit durch manigfaltige Wirkungsmechanismen aus: (1) gewünschter Fremdstoff-Metabolismus (z.B. gemessen als Induktion von NAD (P) H-Chinonreduktase und Hemmung von CyplA), (2) entzündungshemmende Mechanismen (z.B. gemessen als Hemmung der Induktion von iNOS und Hemmung von COX-1), (3) antioxidative Mechanismen verbunden mit Radikalfängereigenschaften (z.B. gemessen mittels Reaktion mit Diphenylpikrylradikalen) und (4) anti-Tumor promovierende und anti-proliferative Eigenschaften (z.B. gemessen als Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithin-Decarboxylase oder gemessen anhand des Maus-Brustdrüsenmodells )

Die Verbindungen der obigen Formeln sind gut verträglich und können im Rahmen eines Arzneimittels zur Prävention von Krebserkrankungen verabreicht werden.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, kutan, subkutan, intravenös, intramuskulär oder rektal. Bevorzugt ist die ni cht - invas ive , d.h. orale, kutane oder rektale, Verabreichung. Das Arzneimittel wird einem Patienten über einen vom Arzt zu bestimmenden Zeitraum oder wird stetig über lange Zeiträume verabreicht. Das Arzneimittel kann sowohl Menschen als auch Säugern verabreicht werden. Das Arzneimittel bietet sich auch an als Unterstützungsmedikation vor, während oder nach einer Tumortherapie (Operation, Bestrahlung und/oder Chemotherapie) an.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindung wird vom Arzt anhand der patientenspezifischen Parameter wie z.B. Alter, Gewicht, Geschlecht, Schwere der Erkrankung, etc. bestimmt.

Entsprechend der Art der Verabreichung wird das Arzneimittel in geeigneter Weise formuliert, z.B. in Form von einfachen oder dragierten Tabletten, Hart- oder Weichgelatinekapseln, Pulver zur Rekons ti tution vor Gebrauch, Granulaten, Suppositorien, Ovula, Injektionspräparaten, Infusionslösungen, Pomaden, Cremes, Gels, Mikrosphären, Implantaten, die nach üblichen galenischen Verfahren hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können gegebenenfalls zusammen mit weiteren Wirkstoffen und mit in pharmazeutischen Zusammensetzungen üblichen Exzipientien formuliert werden, z.B. je nach herzustellendem Präparat Talk, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat , Kakaobutter, wäßrige und nichtwaßπge Trager, Fettkorper mit tierischem oder pflanzlichem Ursprung, Paraffinderivate, Glykole (insbesondere Polyet ylenglykol) , verschiedene Weichmacher, Dispergiermittel oder Emulgatoren, Konservierungsstoffe.

Zur Herstellung flussiger Präparate können Additive wie Natri-umchloridlosung, Ethanol, Sorbit, Glycerin, Olivenöl, Mandelöl, Propylenglycol oder Ethylenglycol verwendet werden.

Es können auch Infusions- oder Injektionslosungen hergestellt werden. Diese sind bevorzugt wäßrige Losungen oder Suspensionen, wobei es möglich ist, diese vor Gebrauch herzustellen, beispielsweise aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff alleme oder zusammen mit einem Trager, wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen, enthalten. Die gebrauchsfertigen Losungen werden sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsmitteln vermischt, beispielsweise mit Konservierungsstoffen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermitt-lern, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisierung kann durch Sterilfiltration durch Filter mit einer kleinen Porengröße erzielt werden, wonach die Zusammensetzung gegebenenfalls lyophilisiert werden kann. Geringe Mengen an Antibiotika können auch zugesetzt werden, um die Beibehaltung der Sterilität zu unterstutzen.

Vorteilhaft ist die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Arzneimittels in einer Dosis-Einheits-Form zur Verabreichung an einen Sauger.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel bzw. pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Inhaltsstoffs (erfindungsgemäße Verbindung der obigen Formeln) zusammen mit organischen oder anorganischen inerten festen oder flüssigen pharmazeutisch vertraglichen Tragern bzw. Verdünnungsmitteln, die für die beabsichtigte Verabreichung geeignet sind, und die mit den aktiven Inhaltsstoffen nicht nachteilig wechselwirken, enthalten.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die erfindungsgemäße Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt wird.

Unter den erfindungsgemäßen Medikamenten können insbesondere die im experimentellen Teil beschriebenen Verbindungen und ganz besonders die Verbindungen, bei denen in der obigen Formel (I) oder (II) Rl und/oder R2 , die gleich oder verschieden sein können, eine Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isoproylgruppe ist, genannt werden.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel bzw. pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen als Wirkstoff mindestens einen wie vorstehend definierten Wirkstoff. Gegebenenfalls können noch weitere pharmazeutische Wirkstoffe in die Zusammensetzung aufgenommen werden, wie z.B.
An t i ox i dan t i en [z.B. red. Gluthathion, N- Acetylcystein, natürliche Polyphenole wie Grüntee- (Epigallcate-chingallat und andere Catechine) oder

Rotweinbestandteile (Resveratrol ) , Anthocyanidine,

Flavonoide, Procyanidine] ,
Vitamine [z.B. hochdosiertes Vitamin C, Vitamin E,

Vitamin A, Vitamin D] ,
Mineralstoffe [z.B. Magnesium, Zink, Calcium] ,
Spurenelemente [z.B. Selen],
Entzündungshemmer [z.B. Cyclooxygenase 1 oder 2 Hemmer

(Nichtsteroidale Entzündungshemmer NSAIDs , wie ASS etc . ) , Lipoxygenasehemmer oder Hemmstoffe der induzierbaren Stickstoffoxidsynthese] ,
Hormonmodulatoren [z.B. Antiöstrogene (z.B. Tamoxifen,

Genistein) oder Aromatasehemmer] ,
Angiogenesehemmer [z.B. Genistein],
Modulatoren der Signalübertragung [z.B. Proteinkinase- hemmer (z.B. Curcumin oder Ras-Farnesylierungshemmer , wie Perillylalkohol oder Limonen) ] ,
Proliferationshemmer ,
Ornithin-Decarboxylase-Hemmer [z.B. DFMO] Apoptose-Induktoren
Ballaststoffe (auch als Vorstufen von kurzkettigen

Fettsäuren)
Induktoren von Zellproliferationsprozessen [z.B.

Natriumbutyrat]

Die Erfindung wird weiter anhand der Figur erläutert:

Fig. 1: Syntheseschema

Fig. 2: Dosis-abhängige Inhibierung der präneoplastischen Läsionsbildung in einem MMOC-Modell durch EC-252

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert .

Beispiel 1

V e r f a h r e n z u r H e r s t e l l u n g v o n E - 6 - ( ω -Styryl ) salicylsäuremethylester (EC-9 )

Zu einer Lösung von Natriummethanolat in Methanol (bereitet durch Auflösen von 9,20 g (400 mMol) Natrium in 300 ml wasserfreiem Methanol) gibt man 56,3 g (100 mMol) (3-Acetoxy-2-methoxycarbonyl)benzyl-triphenyl-phosphoniumbromid (Eicher et al., Synthesis 1988, S. 525) und rührt 30 Min. bei +20°C. Danach fügt man 10,6 g (100 mMol) Benzaldehyd (käufliches Produkt frisch destilliert) zu und erhitzt das Reaktionsgemisch 4 Std. unter Rückfluß. Danach kühlt man auf Raumtemperatur ab, neutralsiert durch Zugabe von Eisessig und entfernt das Solvens im Vakuum. Man nimmt den Rückstand in 300 ml Chloroform auf, wäscht zweimal mit je 100 ml Wasser, trocknet die organische Phase über MgS04 , filtriert sie über 200 g Kieselgel (Nachelution mit wenig CHC13) und entfernt das Solvens im Vakuum. Man erhält ein farbloses Öl, das in ca. 150 ml Petrolether (40-60°C) aufgenommen und bei -30°C (15 h) zur Kristallisation gebracht wird. Man erhält 23,6 g (93%) farblose Nadeln, E/Z-Gemisch, Smp. 51-52°C. Aus dem E/Z-Gemisch kann durch Erhitzen in Toluol (30 Std. unter Rückfluß) in Gegenwart von Iod (einige mg) das reine E-konfigurierte Produkt quantitativ erhalten werden (Smp. : 56-57°C) .


Beispiel 2

V e r f a h r e n z u r H e r s t e l l u n g v o n 6 ( 2 -Phenylethyl) salicylsäuremethyleεter (EC-1)

22,0 g (86,3 mMol) des Produkts aus Beispiel 1 werden in 300 ml Essigester gelöst. Man fügt 2,0 g Palladium auf Aktivkohle (5%) als Katalysator zu und hydriert in einer konventionellen Hydrierapparatur (Fa. Parr) bei 5 bar Wasserstoff-Überdruck. Nach ca. 4 Std. ist die Wasserstoff-Aufnähme beendet. Man filtriert vom Katalysator ab, entfernt das Solvens im Vakuum, nimmt den Rückstand in Chloroform auf und filtriert die CHC13 -Lösung über 300 g Kieselgel (Nachelution mit wenig CHC13 ) . Das Filtrat wird im Vakuum vom Solvens befreit und der Rückstand aus Petrolether (40-60°C) umkristallisiert. Man erhält 19,9 g (90%) des Produkts, farblose Prismen, Smp. 55-56°C.


Beispiel 3

Verfahren zur Herstellung von E-l- (5-Bromthienyl) -2- [ (2-ethoxycarbonyl-3-methoxy)phenyl]ethen (EC-252)

Zu einer Lösung von Natriummethanolat in Methanol (bereitet durch Auflösen von 0,30 g (13,0 mMol) Natrium in 50 ml wasserfreiem Methanol) gibt man 5,63 g (10,0 mMol) (2-Ethoxycarbonyl-3-methoxy) benzyl-triphenyl-phosphoniumbromid (Eicher et al . , Synthesis 1988, S. 525) und rührt 30 Min. bei +20°C. Danach fügt man 1,91g (10,0 mMol) 5-Bromthiophen-2-carbaldehyd (Fa. Acros Organics, Geel, Belgien) zu und rührt das Reaktionsgemisch 24 Std. bei +20°C. Das auskristallisierte Produkt wird abgesaugt und in 50 ml Chloroform gelöst. Die Lösung wird über 50 g Kieselgel filtriert (Nachelution mit wenig CHC13) . Das Solvens wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand [2,90 g (79%) E/Z-Gemisch] zweimal aus Ethanol umkristallsiert . Man erhält 1,84 g (50%) des Produkts, gelbliche Nadeln, Smp. 93-94°C.


Beispiel 4

Bestimmung der chemopräventiven Aktivität ausgewählter Lunularsäurederivate

Hepalclc7-Zellen (ATCC American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) sät man in einer 96-Lochplatte in einer Dichte von 2 x 104 Zellen/ml (200 μl pro Loch) in α-MEM enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B (Gibco BRL, Grand Island, NY) ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum aus und kultiviert bei 37°C in einer 5%igen C02 -Atmosphäre. Nach einer Präinkubationszeit von 24 Stunden wurde das Medium erneuert, die Testverbindungen gelöst in 10% DMSO (10 μ l , Endkonzentration 0,5%) zugegeben und die Platten für weitere 48 Stunden inkubiert. Die QR-Aktivität wurde durch Messen der NADPH-abhängigen Menadiol-vermittelten Reduktion von MTT (3-( 4 , 5-dimethylthiazo-2-yl ) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbromid) zu blauem Formazan gemessen (Prochaska et al . , Anal. Biochem. 1988, 169(2) : 328-336) . Die Proteine wurden durch Kristallviolett-Färbung eines identischen Satzes von Platten bestimmt. Die Induktion der QR-Aktivität wurde aus dem Verhältnis der spezifischen Enzymaktiviäten der mit den Verbindungen behandelten Zellen zu einer Lösungsmittelkontrolle berechnet. Die CD-Werte (benötigte Konzentration in μM, um die spezifische Enzymaktivität zu verdoppeln) wurden erzeugt. Die CD-Werte wurden mit den IC50-Werten (halbmaximale inhibitorische Konzentration der Zeil-Lebensfähigkeit in μM) ins Verhältnis gesetzt, um den chemopräventiven Index Cl zu erhalten. Zusätzliche Tests wurden in einer von Hepa Iclc7-Zellen abgeleiteten Mutanten-Zelllinie (BPrcl) unternommen, welche unfähig ist, den Ah Rezeptor-Ligandenkomplex in den Kern zu translocieren.

Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist eine Induktion von QR bei kleinen Konzentrationen wünschenswert.

Tabelle 1: Induktion von NAD(P)H : Chinonoxidoreduktase
(QR) durch ausgewählte Bibenzyle (alle Daten in
μM)

Hepalclc7 BPrcl

CD/CQ IC50 Cl CD

A 51,4/n.d > 93,5 > 1, n.I
B 20,4/n.d. > 50 2,5 n.I
EC-1 0,22/6,8 31,3 171 n.I
EC-252 0,06/0,24 7,8 129 n.I
EC-9 0,03/0,16 7,2 223 n.I

CD/CQ = Konzentration, um die spezifische Aktiviät von QR zu verdoppeln/zu vervierfachen
IC50 = halbmaximale inhibitorische Konzentration
Cl = Chemopräventiver Index ; Verhältnis von IC50 und CD n.d. = nicht bestimmt
n.I. keine Induktion
A = Lunularin (Kontrolle)
B = Lunularsäure (Kontrolle)

Nachfolgend wurde die Dosis-abhängige Induktion von CyplA-Aktivität in kultivierten Hepalclc7 bestimmt. Die Hepalclc7-Zellen wurden analog wie oben beschrieben für 24 Stunden mit 0,5 μM ß-Naphthoflavon, einem klassischen bifunktionellen Induktor von Arzneimi ttel-metabolisierenden Enzymen, behandelt. Zum Vergleich des induzierenden Potentials wurden die für die 10-fache Anhebung der CyplA-Aktivi tat erforderlichen Konzentrationen ermittelt. Da die Induktion von CyplA zu der Aktivierung von Procarcinogenen führen kann, wurde weiter das Potential, um CyplA-Aktivität zu inhibieren, getestet. Diese Untersuchungen wurden an Lysaten von ß-Naphthoflavon-induzierten H4IIE Rattenhepatoma-Zellen und CEC als Substrat gemacht. H4IIE-Zellen (ATCC American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) werden dazu in 10 cm Zellkulturplatten mit einer Dichte von lxlO6 Zellen in 10 ml MEME-Medium mit den gleichen Zusätzen, wie vorstehend für das α-MEM-Medium angegeben, ausgesät und für 24 Stunden bei 37°C, 5% C02 Atmosphäre kultiviert. Danach wird das Medium erneuert und die Zellen für 38 Std. mit 10 μM ß-Naphthoflavon zur Induktion von CyplA induziert. Anschließend werden die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, durch Abschaben in 1 ml 200 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 mit 10 mM MgCl2 (Puffer 1) geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Zur Aktivitätsbestimmung wird das Zellhomogenat bei Raumtemperatur aufgetaut, zur Lyse durch eine Kanüle Nr. 20 gedrückt und mit Puffer 1 auf 10 ml verdünnt. 90 μl dieser Lösung (ca. 5-25 μg Protein) werden in 96-Lochplatten zu einer Mischung aus lOμl der Testsubstanz in DMSO und 100 μl Reaktionsgemisch (2-fach konzentriert) enthaltend 2,6 mM NADP, 6,6 mM Glucose-6-Phospaht, 10 μM 3-Cyano-7-Ethoxycumarin (CEC) und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphatdehydrogenase gegeben. Der Ansatz wird kurz gemischt. Die Kinetik der zeitabhängigen Dealkylierung von CEC wird 45 Min. lang bei 37°C im Mikrotiterplattenfluorimeter mit einer Anregungswellenlänge von 409 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm aufgenommen (vgl. Crespi et al . , Anal. Biochem. (1997), 248 (1) , S. 188-190) .

Die Induktion der CyplA-Aktivität ist als negativ zu bewerten, da diese Aktivität zu einer Aktivierung von Karzinogenen führen kann. Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist deshalb eine geringe Induktion von CyplA wünschenswert (am besten gar keine CyplA-Induktion) sowie eine Hemmung von CyplA bei kleinen Konzentrationen.

Tabelle 2 : Modulation von Cyp 1 A- Ak t i vi t ä t durch
ausgewählte Bibenzyle (alle Daten in μM)

CyplA- Induktion CyplA- Inhibierunα

lO-fach IC50

A > 93,5 3,7
B 8, 0 8,3
EC-1 2,1 0,99
EC-252 0,225 0,11
EC-9 < 0,13 0,08

Cio-fach : Konzentration resultierend in einer 10-fachen

Induktion der CyplA-Aktivität
IC50: Halbmaximale inhibitorische Konzentration
A : Lunularin (Kontrolle)
B : Lunularsäure (Kontrolle)

Desweiteren wurden alle Verbindungen der Tabelle 3 analog wie vorstehend beschrieben hinsichtlich der QR- und CyplA-Aktivität getestet. Die Auswertung ergab, daß einige der getesteten Verbindungen bessere Eigenschaften haben als andere. Verbindungen mit Werten, die diese als gute Chemopr ävent iva qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt .

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 hinsichtlich der Hemmung der Lipopolysaccharid-induzierten Expression der iNOS in Maus-Makrophagen getestet (N02) . Die Inhibition der Lipopolysaccharid (LPS) -vermittelten iNOS-Induktion in Maus Raw 246.7-Makrophagen wurde mittels der Griess-Reaktion (Ding et al., J. Im unol. (1988), 141(7), S. 2407-2412) bestimmt. Dazu wurden Maus-Makrophagen in DMEM-Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% C02 -Atmosphäre kultiviert. Die Zellen wurden mit einer Dichte von lx 105 Zellen/Loch in DMEM in 96-Lochplatten kultiviert. Nach einer Präinkubationszeit von 24 Stunden wurde das Medium durch 170 μl serumfreies DMEM ersetzt. Die Testverbindungen (10 μl in 10% DMSO, 8 serielle 2-fach Verdünnungen, Endkonzentrations-bereich 0,8 bis 50 μM) wurden hinzugefügt. iNOS wurde durch Zusatz von 20 μl LPS-Lösung (500 ng/ml in serumfreiem DMEM) induziert. Nach 24 Stunden wurde die iNOS-Aktivität über die Quantitierung der Nitritlevel in 100 μl Zellkulturüberständen gemäß der Griess-Reaktion bestimmt und mit einer Nitrit-Standardkurve verglichen. Um die zytotoxischen Effekte der Testverbindungen zu bestimmen, wurde das restliche Zellkulturmedium entfernt und die Zellen wurden bei 4°C für 30 Minuten mit 50 μl eiskalter 10%-iger wässriger Trichloressigsäure-Lösung fixiert, fünfmal mit Wasser gewaschen und kurz getrocknet. Die Zellzahlen wurden durch Sulforhodamin B-Färbung bestimmt (Skehan et al . , J. Natl . Cancer Inst. (1990), 82(13), S. 1107-1112). Im allgemeinen wurden die Verbindungen in nicht-toxischen Konzentrationen getestet ( Zel lanf ärbung > 50% der LPS-behandel ten Kontrollzellen) .
Für chemopräventiv wirkende Verbindungen ist eine Hemmung der Induktion der iNOS bei kleinen Konzentrationen wünschenswert. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 zusammengef ßt.

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 auf ihre antioxidativen Eigenschaften hin getestet. Dafür wurde das vermeintliche Potential der erfindungsgemäßen Verbindungen zum Abfangen von Diphenyl-picryl-hydrazyl-Radikalen (DPPH) ausgewählt. Dies erfolgte durch photometrisches Verfolgen der Reaktion mit 1 , l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) freien Radikalen in einem Mikroplatten-Format bei 515 nm (van Amsterdam et al . , Free Radical Biol . Med. (1992), 12, S. 183-187). Dazu wurden die in DMSO gelösten Testverbindungen mit einer Lösung von 100 μM DPPH in Ethanol für 30 Minuten bei 37°C behandelt. Das Radikalfänger-Potential wurde mit einer Lösungsmittel-Kontrolle (0% Radikalfängereigenschaften) und A s c o r b i n s äu r e (250 μM E n d k o n z e n t r a t i o n , 100% Radikalfängereigenschaften) verglichen. Die halbmaximale Radikalfängerkonzentration SC50 wurde generiert, die in einem Endkonzentrationsbereich von 2-250 μM gewonnen wurden. Hier ist eine Hemmung von DPPH bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Ein weiterer Parameter, um die antioxidativen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen zu ermitteln, ist die Ermittlung der Hemmung des Phorboles ter-vermittel ten Superoxidbursts in differenzierten HL-60 Zellen. Die Inhibierung der Tetradecanoylphorbolacetat (TPA) -induzierten S u e r ox i d - Radi ka 1 b i 1 düng in menschlichen HL-60 promyelocytischen Leukämiezellen, die zu Granulocyten differenziert waren, wurde durch photometrische Bestimmung der Cytochrom c-Reduktion bestimmt (Takeuchi et al . , Cancer Res . (1994), 54(22), S. 5837-5840, Pick und Mizel, J. Immuno1. Meth. (1981), 46(2), S. 211-226). Dazu wurden HL-60 Zellen bei einer Dichte von 2 x 105 Zellen/ml mit 1,3% DMSO in RPMI 1640 Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na und 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% C02 Atmosphäre für vier Tage behandelt, um die terminale Differenzierung zu Granulocyten zu induzieren. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit "Hanks balanced salt solution" enthaltend 30 mM HEPES, pH 7,8 gewaschen und auf eine Dichte von 2 x 106 / ml eingestellt. 2 x 105 Zellen/Loch (100 μl) werden mit den Testverbindungen (25 μl, in 10% DMSO) für 5 Minuten vor der Zugabe von 75 μl Cytochrom c-Lösung in HHBSS (5 mg/ml, 1,25 mg/ml Endkonzentration) präinkubiert . 25 μl Superoxid-Dismutase (600 U/ml in HHBS, 12 U/Loch Endkonzentration) wurden als Positivkontrolle verwendet, alle anderen Löcher erhielten 25 μl HHBSS. Die Superoxidanion-Radikal-Bildung wurde durch Zugabe von 25 μl TPA (0,55 mg/ml in HHBSS, 55 ng/ml Endkonzentration) gestartet. Die Platten wurden leicht geschüttelt. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37°C wurde die Reaktion durch Kaltstellen der Platten auf Eis für 15 Minuten gestoppt. Danach wurden die Platten zentrifugiert und die Cytochrom c Reduktion im Überstand wurde bei 550 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegerätes (Spectramax 340, Molecular Devices) bestimmt. Das Zellpellet wurde zweimal mit PBS gewaschen und die Zellwachstumsfähigkeit wurde fluorometrisch durch enzymatische Hydrolyse des fluorogenen Esterase-Substrats Calcein AM (250 nM in PBS, 100 μl/Loch) bei 37°C in einem Cytofluor 4000 Mikroplattenfluoreszenzlesegeräts (PE Applied Biosystems, Anregung 485 nm, Emission 620 nm) bestimmt. Unter Verwendung dieser Methode konnten unspezifische Effekte von reduzierenden Testverbindungen vermieden werden. Die Reaktion war linear für mindestens 30 Minuten. IC50 - Werte (halbmaximale inhibi torische Konzentration von TPA-induzierter Superoxid-Entstehung) wurden generiert. Hier ist eine Inhibierung der Entstehung von Superoxid-Radikalen bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Desweiteren wurden die Verbindungen der Tabelle 3 auf die TPA-induzierte ODC (Ornit in-Decarboxylase) -Aktivität in kultivierten Maus 308-Zellen untersucht. Die Kultivierung der Maus 308-Zellen, die Behandlung der Zellen mit den in seriellen Verdünnungen in DMSO (0,5% DMSO-Endkonzentration) zugefügten Testverbindungen und die Bestimmung der ODC-Aktivität wurde durchgeführt wie in Gerhäuser et al . , Nat . Med. (1995), 1(3), S. 260-266 beschrieben. Der Proteingehalt der Zellysate unter Verwendung von Rinderserumalbumin as Standard wurde gemäß Bradford (Analyt. Biochem. (1976), 72(1-2), S. 248-254) gemessen und verwendet, um die ODC-spezifische Aktivität (pmol 14C02/mg Protein/Std. ) zu berechnen. IC50 -Werte (halbmaximale inhibitorische Konzentration von TPA-induzierter ODC-Aktivität in μg/ml) wurden berechnet. Hier ist eine Inhibierung der Induktion von ODC bei kleinen Konzentrationen der Testverbindungen erwünscht. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt.

Die Verbindungen der Tabelle 3 wurden auch auf eine inhibitorische Wirkung auf die Cyclooxygenase (COX) -Aktivität getestet (Jang et al . , Science (1997), 275, S. 218-220; Van der Ouderaa et al . , Meth. Enzymol . (1982), 86, S. 60-68). Die COX-Aktivität wurde bei 37°C unter Aufzeichnen des Sauerstoff-Verbrauchs während der Umwandlung von Arachidonsäure in Prostaglandine in einer 1,0 ml Inkubationszelle einer Sauerstoff-Elektroden-Einheit (Hansatec DW, basierend auf einer 02 - Elektrode vom Clark-Typ) gemessen. Das R e a k t i o n s g e m i s c h e n t h a l t e n d 0 , 1 M Natrium/Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, 1 mM Hydrochinon, 0,01 mM Hemin und ungefähr 0,2 U COX-1 in 100 μl Mikrosomen-Fraktion erhalten aus Hammelsamenblasen als Ausgangsquelle für COX-1 (spezifische Aktivität 0,2 - 1 U/mg Protein) wurde mit 10 μl DMSO (Negativkontrolle) oder Testsubstanzlösung (10 mM in DMSO) für 90 Sek. inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl 50 mM Arachidonsäure in Ethanol (100 μM Endkonzentration) gestartet und der Sauerstoffverbrauch wurde für 20 Sek. aufgezeichnet. Für die Berechnung wurde die Rate des 02 - Verbrauchs mit der DMSO-Kontrolle (100 % Aktivität) verglichen. Die Ergebnisse der Tests sind in Tabelle 4 gezeigt .

Beispiel 5:

Nachweis der chemopräventiven Aktivität erfindungsgemäßer Verbindungen im Maus-Brustdrüsenmodell (MMOC)

Mit diesem Modell können Testverbindungen daraufhin getestet werden, ob sie die Entstehung Carcinogen-induzierter präneoplastischer Läsionen in Maus-Brustdrüsen-Organkultur hemmen. Dies ist ein wichtiger Hinweis auf eine chemopräventive Wirkung im Tiermodell.

Ein Nachteil von in-vitro Untersuchungen ist, daß die glatte Übertragbarkeit auf die in-vivo Situation oft nicht gegeben ist. Es wurde jedoch jetzt ein Organkulturmodell entwickelt, das als Klammer zwischen Kurzzeit-in vitro-Versuchen und Langzeit-in vivo-Carcinogenesemodellen dienen kann. Dies ist das Maus-Brustdrüsenmodell (mouse mammary glands, MMOC; Mehta et al . , Carcinogenesis 1995, 16(2), S. 399-404). Dieses System kombiniert die Vorteile eines in-vitro-Modells (Einfachheit, Handhabbarkeit, Dauer) mit den komplexen zellulären, metabolischen und Entwicklungsbedingungen in einem Organismus.

3 bis 4 Wochen alte jungfräuliche weibliche BALB/c Mäuse wurden durch tägliche subkutane Injektionen mit 1 μg Östradiol 17ß und 1 mg Progesteron für 9 Tage vorbereitet. Am Tag 10 werden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet und das thorikale Brustdrüsenpaar entnommen, das auf ein Seidengewebe gelegt wird. Diese Gewebepräparationen wurden 10 Tage in serumfreiem Waymouth MB752 / I-Medium (5 Drüsen/5 ml Medium/Platte) inkubiert. Das Medium ist ergänzt mit 2 mM Glutamin, Antibiotika (Penicillin und Streptomycin, jeweils 100 Einheiten/ml Lösung) und Wachstumsfördernden Hormonen, 5 μg Insulin, 5 μg Prolaktin, 1 μg Aldosteron und 1 μg Hydrocortison pro ml Medium. Das Carcinogen DMBA (2 μg/ml) wird dem Medium für 24 Stunden zwischen den Tagen 3 und 4 zugesetzt. Dieses Zeitinterval stellt den Zeitraum der DNA-Synthese dar. Kontrollplatten wurden mit DMSO (DMBA-Lösungsmittel) behandelt. Nach 10 Tagen Inkubation wurden die Drüsen für weitere 14 in einem Medium gehalten, das nur Insulin (5 μg/ml) enthielt. Während der gesamten Kulturdauer wurden die Drüsen bei 37°C in einer 5% C02 Atmosphäre gehalten.

Die erfindungsgemäße Verbindungen EC-252 (Testagenz) wurde in verschiedenen Konzentration zu dem Medium für die Tage 0-10 gegeben (10-15 Drüsen pro Konzentration). Carcinogen-behandelte Drüsen ohne Testagenz dienten als Positivkontrolle. Am Ende des Experiments nach 24 Tagen wurden die Drüsen in 10% Formalin fixiert, mit Alauncarmin gefärbt und morphokologisch das Vorhandensein von Drüsenläsionen untersucht. Das Auftreten (Inzidenz) von gebildeten Läsionen (Prozentsatz der Drüsen mit Läsionen bezüglich der Gesamtanzahl der Drüsen pro Gruppe) in der mit EC-252 behandelten Gruppe wird mit den Läsionen in der nur mit DMBA-behandelten Gruppe (unbehandelte Gruppe = DMBA-Kontrolle) verglichen und daraus der Prozentsatz der Inhibierung berechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt.

Desweiteren wurden ausgewählte Verbindungen der Tabelle 3 analog wie vorstehend beschrieben im Maus-Brustdrüsenmodell getestet. Die Auswertung ergab, daß einige der getesteten Verbindungen bessere Eigenschaften haben als andere. Verbindungen mit Werten, die diese als gute Chemopräventiva qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Weitere Ergebnisse der getesteten Verbindungen sind Tabelle 5 zu entnehmen.

Beispiel 6:

Nachweis der östrogenen bzw. antiöstrogenen Effekte der erfindungsgemäßen Verbindungen in der Ishikawa humanen Endometriumkrebs-Zelllinie

Die Messung der Förderung von alkalischer Phosphatase (AP)-Aktivität in der Ishikawa humanen Endometrium-Adenocarcinoma-Zellinie (Department of Biochemistry, University of Montreal) erlaubt die Abschätzung der instrinsischen östrogenen Aktivität der Testverbindungen gemäß Tabelle 3. Anti-östrogene Effekte wurden durch Co-Behandlung mit ß-Östradiol und Inhibitoren bestimmt. Die Zellkulturbedingungen waren gemäß Littlefield et al . , Endocrinology (1990), 127(6), S. 2757-2762.

Die Ishikawa-Zellen wurden routinemäßig in α-MEM Medium enthaltend 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B ergänzt mit 10% Aktivkohle-gereinigtem fötalem Kälberserum bei 37°C in einer 5% C02 - Atmosphäre gehalten. Einen Tag vor Start des Experiments wurde das Medium in ein Östrogen- und Phenolrotfreies D-MEM/F-12-Gemisch (1:1) enthaltend L-Glutamat und Pyridoxin-HCl (Fa. Gibco BRL) ergänzt mit 100 Einheiten/ml Penicillin G-Na, 100 Einheiten/ml Streptomycinsulfat und 250 ng/ml Amphotericin B und 5% Aktivkohle-gereinigtem fötalem Kälberserum gewechselt. Für die Bestimmung der östrogenen/anti-östrogenen Aktivität wurden die Zellen mit 0,25% Phenolrot-freiem Trypsin/EDTA trypsiniert und durch eine Injektionsnadel Nr. 18 gepreßt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Diese wurde in einer 96-Loch Mikroplatte in einer Dichte von 2 x 104/Loch in 200 μl EFM plattiert. Nach einer Vorinkubationsphase von 24 Stunden wurde das Medium durch 170 μl frisches EFM ersetzt. Die Testverbindungen gemäß Tabelle 3 (10 μl in 10% DMSO, Endkonzentrationsbereich 0,8-50 μM) , 10 μl 10% DMSO (als Negativkontrolle, Endkonzentration 0,5%) oder 10 μl Tamoxifen (in 10% DMSO, Endkonzentration 0,5 μM, als positives Antiöstrogen) und entweder 20 μl EFM (für östrogene Aktivität) oder 20 μl 50 nM ß-Östradiol in EFM (für anti-östrogene Aktivität) wurden auf ein Endvolumen von 200 μl zu den Platten hinzugefügt. Die Platten wurden bei 37°C in einer feuchten 5% C02-Atmosphäre für 72 Stunden inkubiert. Um die Wirkungen der Testverbindungen auf die Zeilproliferation zu bestimmen, wurde die Zellwachstumsfähigkeit durch Calcein AM Hydrolyse fluorometrisch bestimmt. Dazu wurden die Platten dreimal mit PBS (vorgewärmt auf 37°C) gewaschen und 100 μl 250 nM Calcein AM in vorgewärmtem PBS wurde zu jedem Loch hinzugefügt. Die Fluoreszenz wurde für 10 Minuten bei 37°C in einem Cytofluor 4000 Mikroplatten-Fluoreszenzlesegerät (PE Applied Biosystems, Anregung 485 nm, Emission 620 nm) gemessen. Die Calceinlösung wurde sofort entfernt und 50 μl/Loch 0,5% Triton X in PBS wurde hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht bei -80°C aufbewahrt. Um die AP-Aktivität zu bestimmen, wurden die Platten bei 37°C innerhalb von 2 Minuten aufgetaut und 100 μl/Loch 15 μM 4-Methyl-Umbelliferylphosphat (MUP) in 1 M Diethanolaminpuffer , pH 9,8 enthaltend 0,24 mM MgCl2 wurden hinzugefügt . Die Platten wurden 5 Minuten auf einem M i k r o p 1 a t t e n s c hü t t 1 e r geschüttelt. Die Dephosphorylierung von MUP zu dem fluorescenten 4-Methyl-7- Zb

hydroxy-coumarin ( 4-Methylumbellif eron) wurden für 45 Minuten bei 37°C (Anregung 360 nm, Emission 460 nm) beobachtet. Die AP-Aktivität und das Zellwachstum wurden aus den Raten der Produktbildung (in Fluoreszenzeinheiten/min) bestimmt. Das Verhältnis beider Raten wurde als ein Maß der relativen spezifischen AP-Aktivität berechnet. Die relative Vergrößerung der AP-Aktivität, die indikativ für eine östrogene Aktivität is t , wurde durch Vergleich mit einer DMSO-Lösungsmittelkontrolle berechnet. Für die Kalkulation der anti-östrogenen Wirkung wurden die Ergebnisse als Prozentsätze im Vergleich zu einer mit DMSO und ß-Östradiol behandelten Kon t r o 1 lpr obe ausgedrückt. Tamoxifen wurden als Positivkontrollsubstanz verwendet und produzierte eine Inhibition von > 50% bei einer Testkonzentration von 0,5 μM.

Tes t Verbindungen mit Werten, die diese als gute Chemoprävent i va qualifizieren, sind in Tabelle 4 zusammengestellt .

Tabelle 3
Tabelle 3 (Forts.)













Tabelle 4
40a
Tabelle 4 (Forts, quer)


41
Tabelle 4 (Forts, quer)


Tabelle 4 (Forts . quer)
42
Zur Tabelle 4 (Alle Angaben in μM bzw. %):

FREMDSTOFF-METABOLISMUS
Gewünscht:
Induktion von QR bei kleinen Konzentrationen,
Hemmung von CyplA bei kleinen Konzentrationen,
keine Induktion von CyplA.
QR steht für Induktion der NAD(P)H Chinon Reduktase in Hepelclc7 Maus Hepatomzellen

CD = Konzentration die eine Verdopplung der spezifischen Aktivität der QR bewirkt
IC5o = halbmaximale Hemmkonzentration der Zellviabihtat
Cl = chemopräventiver Index (IC50/CD)
n I no Induction Keine Induktion
n d not determined nicht bestimmt
st Hinweis auf Cytostatische Wirkung
CyplA = Hemmung der CyplA Enzvmaktivitat unter Verwendung von 3-Cyano-7-ethoxycoumaπn Als Enzymquelle wurden ß-Naphthoflavon induzierte H4IIE Ratten Hepatomzellen verwendet IC5o= halbmaximale Hemmkonzentration
CyplA Ind. = Induktion der CyplA Enzvmaktivitat in Hepelclc7 Maus Hepatomzellen
Dieser Effekt ist negativ zu bewerten, kann zu einer Aktivierung von Karzinogenen fuhren' Wird aus mechanistischen Gründen mitbestimmt
Fünffache Induktion = Konzentration die eine Verfunffachung der spezifischen Aktivität von CyplA bewirkt
IC50= halbmaximale Hemmkonzentration der Zellviabihtat

ENTZÜNDUNGSHEMMENDE MECHANISMEN
Gewünscht:
Hemmung der Induktion der iNOS bei kleinen Konzentrationen,
Hemmung von Cox-1 bei kleinen Konzentrationen
N02 Hemmung der LPS-induzierten Expression der iNOS in Maus Makrophagen
IC50 Hern = halbmaximale Hemmung der Nitrit (NO) Produktion
IC50 Tox = Halbmaximale Hemmung des Zellwachstums
CI s o
n d not determined nicht bestimmt
Cox-1 Hemmung der Cyclooxygenase 1 Aktivität
% Hemm Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von lOOμM
IC50 = halbmaximale Hemmkonzentration

ANTI-OXIDATIVE MECHANISMEN UND RADIKALFÄNGEREIGENSCHAFTEN
Gewünscht:
Hemmung bei kleinen Konzentrationen
DPPH: Reaktion mit Dιphen>lpιkrylradιkalen
halbmaximale Hemmkonzentration 43
NXO: Abfangen von Superoxidradikal Anionen im Xanthin/Xanthinoxidase System
IC50 = halbmaximale Hemmkonzentration
Antiox: Hemmung des Phorbolester-vermittelten Superoxidbursts in differenzierten HL-60 Zellen

Nachweis über Reduktion von Cytochrom c
% Hemm.: Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von lOOμM
IC5o = halbmaximale Hemmkonzentration

ANTI-TUMOR PROMOVIERENDE UND ANTI-PROLIFERATIΛΕ EIGENSCHAFTEN:
Gewünscht:
Hemmung der Induktion von ODC bei kleinen Konzentrationen,
Hemmung der DNA Polymerase α bei kleinen Konzentrationen,
anti-östrogene Eigenschaften bei kleinen Konzentrationen,
keine östrogenen Eigenschaften,
Hemmung der Entstehung von Läsionen im MMOC bei kleinen Konzentrationen
ODC: Hemmung der Phorbolester-vermittelten Induktion der Ornithin Decarboxylase in Maus

Keratinozyten (Zellinie Nr 308)
IC5o= halbmaximale Hemmkonzentration
α-Poly: Hemmung der humanen DNA Polymerase α
% Hemm.: Prozentuale Hemmung bei einer Testkonzentration von 500 bzw l OOμM
IC50 = halbmaximale Hemmkonzentration
Ishikawa: östrogene (-E) bzw. antiostrogene (+E) Effekte in der Ishikawa humanen

Endometriumkrebs Zellinie
(+E) IC50 = halbmaximale Hemmkonzentration für ant-i östrogene Effekte
(-E) C5 = Konzentration die eine Verfunffachung der spezifischen Aktivität der alkalischen

Phosphatase bewirkt (Maß für östrogene Aktivität)
tox IC5o: Halbmaximale Hemmung des Zellwachstums
n.I. no Induction: keine Induktion
Nur für eine Auswahl bestimmt (siehe Tabelle Auswahl)
MMOC: Maus mammary organ culture
Hemmung der Entstehung Carcinogen-induzierter pra-neoplastischer Lasionen in Maus Brustdrusen

Organkultur
Wichtiger Hinweis auf chemopräventive Wirkung im Tiermodell
Konz.: Testkonzentration in μM
% Inh.: Prozentuale Hemmung im Vergleich zur DMBA-Kontrolle

44
TABELLE 5

Inhibierung von DMBA-induzierten präneoplastischen Läsionen in Maus-Brustdrüsen- Organkultur



n d nicht bestimmt
Resveratrol diente als interne Positivkontrolle in allen Experimenten Bei einer Konzentration von 5μM inhibierte Resveratrol 52,4 + 7,4 % der DMBA-indzierten präneoplastischen Lasionen