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1. WO1997043315 - NOUVEL ANTICORPS MONOCLONAL ET PROCEDE D'ANALYSE IMMUNOLOGIQUE D'UN e-D DIMERE ET D'UN COMPLEXE e-DD/E

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[ JA ]
明 細書

新規なモノクロ一ナル抗体並びに e— Dダイマー

及び e— DDZE複合体の免疫学的分析方法

技術分野

本発明は、新規なモノクローナル抗体、並びにヒト安定化フイブリンの顆粒球 エラスタ一ゼ分解 Dダイマ一(以下、 e—Dダイマーと称することがある)及び ヒト安定化フイブリンの顆粒球エラスターゼ分解 DDZE複合体(以下、 e— D D/E複合体と称することがある)の免疫学的分析方法に関する。

本発明による前記モノクローナル抗体は、顆粒球ェラスタ一ゼがヒト安定化フィ ブリンを分解することによって、血漿中又は血清中に生じた e—Dダイマ一及び e-DD/E複合体の免疫学的分析方法のための試薬として有用である。また、 前記 e— Dダイマ—及び e— DD/E複合体は、外科手術後の多臓器障害及び肺 気腫の予知マ一カーとして有用である。

背景技術

ヒト安定化フイブリンの各種プロテア一ゼによる分解物は、臨床的診断法にお ける診断マーカーとして有用である。

例えば、ヒト安定化フイブリンのプラスミン分解 Dダイマー(以下、 p—Dダ イマ一と称することがある)及びプラスミン分解 DD/E複合体(以下、 p— D DZE複合体と称することがある)は、汎発性血管内凝固症候群(D I C) の診 断マ一カーとして広汎に使用されている。生体試料中の p—Dダイマ一及び p — DDZE複合体の測定においては、 p—Dダイマーに特異的なモノクローナル 抗体を用いた感作ラテックスによる凝集反応が一般的に使用されている。

また、ヒト安定化フィプリンの e—Dダイマー及び e— DDZE複合体は、外 科手術後の多臓器障害及び肺気腫の予知マ—カーとして有用である。しかし、前 記の p—Dダイマーに特異的なモノクローナル抗体を用いた感作ラテックスによ る凝集反応では、プラスミンの作用によって生成した p—Dダイマ一及び p— D D / E複合体を測定することはできる力顆粒球ェラスタ一ゼの作用によって生 成した e— Dダイマー及び e— DD/E複合体を測定することは不可能である。 このため、既にヒト安定化フィブリンの e— Dダイマ一及び e— DDZE複合体 を測定しょうとする試みがいくつかなされている。

顆粒球ェラスタ一ゼがフィプリノーゲンに作用した際にフイブリノ一ゲンの A «鎖上に新たに生ずる N末端部位(A« 22〜)に反応するモノクローナル抗体 力 s報告されている(B l o o d C o a g u l a t i o n a n d F i b r i n o l y s i s,第 6卷, 259頁, 1995年)。このモノクロ一ナル抗体の 抗原結合部位は、 Eドメインにあり、本発明のモノクローナル抗体とは異なる。 更に、弱いながらもフイブリノ一ゲンと反応するので、この抗体を使用した E I A法では、血漿中のフィブリノ一ゲンの顆粒球エラスタ一ゼ分解物又はフィプリ ンの顆粒球ェラスターゼ分解物を測定することはできない。

また、フィプリノーゲンの顆粒球エラスターゼ D分画を免疫して得たポリクロ ーナル抗体より、プラスミン分解 Dモノマー、プラスミン分解 Dダイマ一、及び プラスミン分解 D D E複合体、並びにフィブリノ一ゲンに反応する抗体を吸収 除去したポリクロ一ナル抗体 ( J . L a b. C I i n. Me d. ,第 102巻, 858頁, 1 983年)も使用される場合がある力操作が煩雑である。

発明の開示

本発明の目的は、血漿などの生体試料中の e— Dダイマ—及び e— DD/E複 合体の量を、その生体試料中に同時に含まれると考えられるフイブリノ一ゲン、 フィブリノーゲンのプラスミン分解物、又はヒト安定化フィプリンのプラスミン 分解物 (特には p— Dダイマー又は p— DD/E複合体)の量に影響を受けるこ となく、分析する方法を提供することにある。

その他の目的及び効果は、以下の記載から明らかになろう。

本発明によれば、ヒトフィブリノ一ゲンの顆粒球ェラスタ一ゼ分解 Dモノマー 及びヒト安定化フィプリンの顆粒球エラスタ一ゼ分解 Dドメィン含有分解物と特 異的に反応するが、フイブリノ一ゲン、並びにフイブリノ一ゲンの顆粒球エラス タ一ゼ分解フラグメント X、顆粒球エラスターゼ分解フラグメント Y、及び顆粒 球エラスタ一ゼ分解フラグメント Eと反応しないことを特徴とする、モノクロ一 ナル抗体が提供される。

また、本発明によれば、配列表の配列番号 1の配列

S e r u 1 u A s p L e u A r g S e r

で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドと反応することを特徴とする、モノク ローナル抗体が提供される。

更には、本発明によれば、生体試料において、ヒト安定化フイブリンの顆粒球 エラスターゼ分解 Dダイマー及び顆粒球ェラスタ一ゼ分解 D Dノ E複合体を分析 する方法であって、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを感作し た支持体を前記試料と接触させ、前記 Dダイマ—又は D D / E複合体と前記感作 支持体との凝集物の形成を検出することを特徴とする、免疫学的分析方法が提供 される。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明のモノクローナル抗体 I F— 1 0 1を感作したラテックスと、 各種抗原とを接触させた場合に生じる凝集反応における、抗原の濃度と凝集反応 速度との相関を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

本明細書において、「顆粒球エラス夕一ゼ」とは、顆粒球のァズ一ル顆粒に含 まれ、局所の炎症などで活性化された顆粒球より放出されるエラスタ一ゼであつ て、その生理的な基質である、細胞マトリックスに含まれるエラスチン、コラー ゲン、フイブロネクチン、若しくはプロテオグリカン、又は血液中タンパク質の フイブリノ一ゲン、フイブリン、プラスミノーゲン、若しくはアンチトロンビン IIIなどを、疎水的ァミノ酸であるバリン又はァラニンのカルボキシル基側で加 水分解するエステラーゼを意味する。

本明細書において、顆粒球エラスターゼに分解されることによって生成する分 解物を、その分解物名の前に「e―」を付与することによって表すことがある。 例えば、ヒトフイブリノ一ゲンの顆粒球エラスタ一ゼ分解 Dモノマー、顆粒球ェ ラスターゼ分解フラグメント X、顆粒球エラスタ一ゼ分解フラグメント Y、及び 顆粒球エラスターゼ分解フラグメント Εを、ヒトフイブリノ一ゲンの e—Dモノ マ一、 e—フラグメント X、 e—フラグメント Y、及び e—フラグメント Eとそ れぞれ表すことがある。

同様に、本明細書において、プラスミンに分解されることによって生成する分 解物を、その分解物の名称の前に「p—」を付与することによって表すことがあ る

本発明のモノクローナル抗体は、近年各方面で行われている細胞融合法により 作製されたハイプリドーマによるモノクローナル抗体産生法で得られたモノク口 ーナル抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒトフイブリノ一ゲンの顆粒球ェラスタ一ゼ 分解 Dモノマー(e— Dモノマー)、及びヒト安定化フイブリンの顆粒球エラス タ一ゼ分解 D ドメイン含有分解物と特異的に反応する力 ?、フイブリノ一ゲン、並 びにフィプリノ一ゲンの顆粒球エラスタ一ゼ分解フラグメント X、顆粒球エラス タ一ゼ分解フラグメント Y、及び顆粒球エラスタ一ゼ分解フラグメント Εとは反 応しない。ヒト安定化フィプリンの顆粒球エラスターゼ分解 Dドメィン含有分解 物とは、ヒト安定化フィプリンを顆粒球エラスターゼで処理することにより生成 する分解物の内、ヒト安定化フィプリンの e— Dドメィンを有する分解物を意味 し、例えば、 e— D D Z Eを基本単位とした e—D DZ Eのポリマー様物質、 e _ Dダイマ一、又は e—D DZ E複合体などを挙げることができ、特には e _ D ダイマー及び e— D D/ E複合体を意味する。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、更に、ヒトフイブリノ一ゲンのブラ スミン分解物及びヒト安定化フイブリンのプラスミン分解物とも反応しない。 本発明は、配列表の配列番号 1の配列:

S e r G 1 u A s p L e u A r g S e r

で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドと反応するモノクローナル抗体にも関 する。

配列表の配列番号 1の配列で表されるアミノ酸配列は、ヒトフイブリノ一ゲン を構成する 3種類のポリペプチド(Α α鎖、 Β /3鎖、及びァ鎖)の 1つである A «鎖の N末端から第 1 12番目〜第 1 1 7番目のアミノ酸配列と一致し、しかも ヒトフィプリノーゲンの顆粒球エラスタ一ゼ分解 Dモノマーを構成するポリぺプ チドの 1つである A «鎖の部分断片(前記鎖から、第 1番目〜第 1 1 1番目 のアミノ酸配列からなるポリべプチドを除いた、残りのポリべプチド:以下、 「Ζα鎖」と称する)のァミノ基末端から第 1番〜第 6番目のアミノ酸配列と 一致する。

本発明の好ましいモノクローナル抗体は、配列表の配列番号 1の配列で表され るアミノ酸配列を有するペプチドと反応し、ヒトフイブリノ一ゲンの e—Dモノ マ一及びヒト安定化フィプリンの顆粒球エラスターゼ分解 Dドメィン含有分解物 と特異的に反応する力、フイブリノ一ゲン、並びにフイブリノ一ゲンの顆粒球ェ ラスターゼ分解フラグメント X、顆粒球エラス夕一ゼ分解フラグメント Υ、及び 顆粒球エラスタ一ゼ分解フラグメント Εとは反応しない。更に、より好ましいモ ノクロ一ナル抗体は、ヒトフィプリノーゲンのプラスミン分解物及びヒト安定化 フイブリンのプラスミン分解物とも反応しない。

本発明のモノクロ一ナル抗体は、そのモノクローナル抗体を産生することので きるハイプリドーマ(例えば、マウスハイプリドーマ)を、例えば、適当な培地 又は哺乳動物(例えば、マウス)の腹腔内で培養することによって製造すること ができる。前記ハイプリドーマは、一般的には、例えば、抗原として e— Dダイ マ—を使用して免疫した哺乳動物又は鳥類(例えば、マウス)の脾臓細胞と哺乳 動物 (例えば、マウス)骨髄腫細胞とを、 K0h 1 e r及び M i 1 s t e i 1 1 の細胞融合の基本方法 [n a t u r e第 256卷 495頁(1975年)参照〕 により細胞融合して製造することが可能である。詳細には、下記実施例の記載の 方法によって製造することができる。

また、前記のハイプリドーマを培養することのできる培地としては、ハイプリ ドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏 最小必須培地 (Du l b e c c o s mo d i f i e d E e a g Γ s m i n i mum e s s e n t i a l me d i um :以下、 D M Eと称する) にゥ シ胎児血清、 L—グルタミン、 L—ピルビン酸、及び抗生物質(ベニシリン Gと ストレプトマイシン)を含む培地が用いられる。

前記のハイプリドーマの培養は、培地中で行う場合には、例えば、 5 % C 0 2 濃度、 3 7でで約 3日間行う。あるいは、マウスの复腔内で培養する場合には、 例えば、約 1 4日間行う。

このようにして製造された培養液又は哺乳動物の月复水から、例えば、タンパク 質の単離■精製に一般的に用いられる方法により、本発明のモノクローナル抗体 を分離 ·精製することが可能である。

そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いる イオン交換カラムクロマトグラフィ一、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマ トグラフィー、プロティン A結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィ 一、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。

本発明の抗体フラグメント、すなわち、本発明のモノクローナル抗体のフラグ メントであって、ヒトフィブリノ一ゲンの顆粒球エラスタ一ゼ分解 Dモノマ一及 びヒト安定化フィプリンの顆粒球エラスタ一ゼ分解 D ドメイン含有分解物と特異 的に反応する抗原結合部位を含む抗体フラグメントには、例えば、 F a b、 F a b,、 F ( a b,) 2 、又は F v等が含まれる。これらのフラグメントは、例え ば、本発明のモノクローナル抗体を定法によりタンパク質分解酵素によって消化 し、続いてタンパク質の分離 ·精製の定法に従って得ることができる。

本発明の分析方法は、本発明のモノクローナル抗体及び Z又は抗体フラグメン トを用いることを除けば、それ以外の点では従来公知の凝集法、例えば、ラテツ クス凝集法などに適用することができる。本発明の分析方法は、スライドグラス 上での肉眼による凝集検査だけでなく、自動分析機による分光学的自動分析にも 適用することができる。すなわち、本発明の分析方法により、ヒト安定化フイブ リンの顆粒球ェラスターゼ分解 Dダイマー及び顆粒球ェラスターゼ分解 D D / E 複合体の存在の検出、半定量的測定、又は定量的測定を行うことができる。 本発明の分析方法に用いることのできる、モノクローナル抗体及び/又は抗体 フラグメント感作支持体は、従来公知の方法を用いて調製することができる。例 えば、支持体(例えば、水不溶性担体、特にポリスチレンラテックス)と抗体含 有緩衝液とを、攪拌下に混合し、遠心分離して得られる沈渣を適当な緩衝液に懸 濁する。

前記感作支持体は、 e— Dダイマー及び e—DD/Ε複合体、並びに e— Dモ ノマ一とそれぞれ反応することができ、それ以外の成分とは反応しない。前記感 作支持体と e— Dダイマー又は e— DDZE複合体とを接触させると、 e— Dダ イマ一及び e— DDZE複合体は複数の抗原決定基を有するので、前記感作支持 体の凝集反応が生じる。それに対して、 e— Dモノマ一は抗原決定基を 1つしか もたないので、前記感作支持体と e— Dモノマ一とを接触させても、前記感作支 持体の凝集反応は生じない。従って、 e— Dダイマ—、 e— DDZE複合体、及 び e— Dモノマーを含む生体試料と、前記感作支持体とを接触させた場合に生じ る前記感作支持体の凝集反応は、 e— Dダイマー及び Z又は e— DDZE複合体 との反応によるものであり、このような凝集反応における差異に基づいて、 e 一 Dモノマーの影響を受けることなく、生体試料中の e— Dダイマ一及び e— D D/E複合体の量を測定することができる。

例えば、前記感作ラテックスの一定量と生体試料の一定量とをスライド板又は マイクロタイタ一プレート上で一定時間混和した後、凝集像の有無又は強弱を観 察して生体試料中の e— Dダイマ一及び e— DD/E複合体の立体構造を保持す る分画の量を判定することができる。あるいは、感作ラテックスの一定量と生体 試料の一定量とを混合し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長で分光学的に 測定することによって生体試料中の e— Dダイマ一及び e— DDZE複合体の立 体構造を保持する分画の量を判定することができる。

また、本発明の分析方法では、生体試料中にヒトフィプリノ一ゲン、ヒトフィ ブリノ一ゲンのプラスミン分解物、又はヒト安定化フィプリンのプラスミン分解 物が存在した場合であつても、それらの化合物と前記感作支持体とは反応しない ので、それらの化合物の影響を受けることなく、前記生体試料中の e—Dダイマ —及び e— DD/E複合体の量を測定することができる。

なお、本発明により分析することのできる生体試料としては、例えば、血漿、 血清、又は尿などを挙げることができる。

実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を 限定するものではない。

実施例 1 : e— Dダイマ—及び e— DDZE複合体の調製

e—Dダイマ一の調製は、主に S t e p h a n i e A. O l e x aと An d r e i Z. B u d z y n s k iの方法(1978) 、 C i r c u l a t i o n, S u p p l . 58, 1 19, O l e x a e t a 1. の方法( 1 979) 、及 び B i o c h i m. B i o p h y s. Ac t a 576, 39〜50に準じて行つ た。フイブリノ一ゲン(カビ社、スウェーデン) 20mg ( 1 Omg/m 1 ) に、 ヒトトロンビン及び塩化力ルシゥムをそれぞれ終濃度 1 0単位 Zm 1及び 1 0 m Mとなるよう加え、 37°Cで 2時間反応させ、フイブリノ一ゲンをフイブリンに 変換させた。 1 8000 X gで 30分間遠心し、フイブリンを非凝固性物質から 分離した。フイブリンを、 0. 1 5Mトリス—塩酸緩衝液(pH7. 8) -5m M塩化力ルシゥム一 0. 02 %N a N 3 液 20 m 1に浮遊させた。浮遊液にヒト 顆粒球エラスタ一ゼ(25単位ノ111 1、エラスチンプロダクト社、米国) 0. 5 m lを添加した。攪拌しながら 37でで 8時間反応させた後、ジイソプロピルフ ルォロリン酸(DF P) (Mo b a y C h em i c a l C o r p. ) を最終 濃渡 2 mMになるように加えて分解反応を停止させた。 DFPを添加してから 1 時間処理後の分解物を D D Z E複合体—安定化フイブリンの顆粒球エラスタ一ゼ 分解物と称する。この分画は、 DDZEを基本単位とした DDZEのポリマー様 物質と、 DD/Eとの混合物である。

次に、前もって 5 OmMトリス塩酸緩衝液(pH 7. 5) -0. 15 M塩化ナ トリウム一 5 mM塩化カルシウム溶液(以下、溶液 Aと称する)で平衡化したセ ファロース CL 6B (フアルマシア社、スウェーデン)のカラム(直径 2. 6 c m, 長さ 90 cm) に、先に得られた DDZE複合体一安定化フイブリンの顆粒 球ェラスタ一ゼ分解物を充填し、溶液 Aで展開する分子ふるいクロマトグラフィ —を行った。分子量マーカ—、並びに抗 D抗血清及び抗 E抗血清(へキスト社、 ドイツ)を用いるォクテロ二一法により e—DD/E複合体の分画を同定、分離 した。このようにして得られた e— DDZE複合体を 3M尿素一 5 OmMクェン 酸(pH5. 5) の溶液中にて 37でで 4時間保温した。次に、 50mMトリス 一塩酸緩衝液(pH 7. 4) — 28mMクェン酸ナトリウム一 0. 1 M塩化ナト

リウム(以下、溶液 Bと称する)で平衡化したセファロース CL— 6 Bのカラム (直径 2. 6 cm, 長さ 9 O cm) に、上記の尿素処理した e— D DZE複合体 を充填し、溶液 Bで展開した。分子量マーカー並びに抗 D抗血清及び抗 E抗血清 を用いたォクテロニー法により、 e— Dダイマー(DD) 分画と e—E (E) 分 画を同定、分離した。特定の吸光度(A 280 nm=2. 0) を示す e— Dダイ マー 10m lを得た。このようにして調製した e—Dダイマ一を、 e— Dダイマ ―に特異的に反応するモノクロ一ナル抗体を産生することのできるハイプリドー マを製造するための免疫原として、またそのハイプリドーマを選別するためのェ ンザィムィムノアッセィ(EL I S A) 用抗原として使用した。

実施例 2 :ハイプリドーマの作製

(a) 免疫化した脾臓細胞の調製

前記実施例 1で得た e— Dダイマー免疫原溶液(A 280 nm=2. 0) を等 量のフロインド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、その混合液 100 1をマウス腹腔内に投与することにより免疫を行った(第 1回免疫)。 30日経 過後、そのマウスに前記と同様の方法で腹腔内に投与した(第 2回免疫)。第 2 回免疫から 2 1日経過後、 e— Dダイマ—免疫原溶液(A 280 nm=2. 0) を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液 100 1を、そのマウスの静脈内に 投与した(最終免疫)。最終免疫から 3日経過後、マウスから脾臓を無菌的に摘 出し、以下の工程に使用した。

(b) 細胞融合

無菌的に摘出した前記の脾臓を、 1 0〜 1 5%ゥシ胎児血清を含む DME培地 5m 1を入れたシャーレ一に入れた。次に、脾臓を 10〜 1 5%ゥシ胎児血清を 含む DME培地約 15m lで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液 をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を 50 m 1遠心チューブに集めて 50 0 X gで 10分間遠心した。こうして得たペレットにへモライジング溶液( 1 5 5mM-NH4 C 1 , 10mM— KHC03 , 1 mM-N a 2 EDTA, p H 7. 0) 3〜5m lを加え、懸濁した。 0でで 5〜 10分間放置し、懸濁液中の赤血 球を破壊した。 10〜 1 5。/0ゥシ胎児血清を含む DME培地 10〜2 Om 1を加 えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレツトを DME培地で遠心法 によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。

一方、予め培養しておいたマウス骨髄脈細胞(ミエローマ細胞) S P 2/0 —Ag 14約 2 X 1 07個に 1 X 1 08個の前記脾臓細胞を加え、 DME培地中 でよく混合し、遠心分離を行った(500X g、 1 0分間)。その上清を吸引し、 ペレツトをよく解きほぐし、 37でに保温しておいた 40%ポリエチレングリコ ール 4000溶液 0. 5m lを滴下し、遠心チューブを手で、 1分間穏やかに回 転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞べレットを混合させた。 次に、 37でに保温しておいた DME培地を 30秒毎に 1 m 1ずつ加えてチュー ブを穏やかに回転させた。この操作を 1 0回繰り返した後、 1 0〜 1 5%ゥシ胎 児血清を含む DME培地 20〜 30m 1を加えて、遠心分離(500 X g、 10 分間)を行った。上清を除去した後、細胞ペレツトを 1 0〜 1 50/0ゥシ胎児血清 を含む HAT培地(DME培地にァミノブリテン 4 X 1 0— 7、チミジン 1. 6 X 1 0— 5M、ヒポキサンチン 1 X 1 0— 4Mになるように添加したもの)で、遠心法 によって 2回洗浄した後、前記 HAT培地 4 Om 1に懸濁した。その細胞懸濁液 を 96ゥエル細胞培養プレートの各ゥエルに 200 ^ 1ずつ分注し、 37 にて 5%炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、 2〜3日間隔で 各ゥエルの培地を約 1 00 1除き、新たに前記の HAT培地を 100 1加え ることにより HAT培地中で増殖するハイプリドーマを選択した。 8闩目頃から 10〜 1 5%ゥシ胎児血清を含む HT培地(CME培地にチミジン 1. 6 X 1 0 一5 M、ヒポキサンチン 1 X 10— 4Mになるように添加したもの)に交換し、ハイ プリドーマの増殖を観察するとともに、約 1 0日目に、以下に示す EL I SA法 により、 e— Dモノマーと反応し、しかも e—Dダイマ一とも反応する抗体(以 下、抗 e—Dモノマ一/ e—Dダイマ一抗体と称する)を産生するハイプリド一 マをスクリ一二ングした。

(c) ハイプリドーマの樹立

ハイプリドーマ培養上清中の産生抗体の有無は、 EL I S A法により測定した。 96ゥエル EL I S A用プレート(Immu l o n II、日本ダイナテック株式 会社)の各ゥエルに、前記実施例 1で得た精製 e— Dダイマ—溶液(A 280 n m=0. 05、生理食塩水で希釈した)を 5 O 1ずつ分注し、 25でで 2時問

放置した。次に、 0. 0 5%Tw e e n 2 0 _生理食塩水で 3回洗浄した後、各 ゥエルにハイプリドーマ培養上清 5 0 μ 1 を加え、 2 5 °Cで 1時間反応させた。 次に、 0. 0 5%Tw e e n 2 0—生理食塩水で 2 0 0倍希釈したペルォキシ ターゼ結合抗マウス抗体(ダコ社、デンマーク) 5 0 1 を各ゥヱルに加えた。 反応終了後、 0. 0 5%Tw e e n 2 0—生理食塩水で各ゥヱルを 3回洗浄し、 0. 5mMァミノアンチピリン、 1 OmMフエノール及び 0. 0 0 5 %過酸化水 素水を含む溶液 2 5 Ομ 1 を各ゥヱルに加え、 2 5でで 3 0分間反応させ、各ゥェ ルの 4 9 0 nmにおける吸光度を測定した。その結果、 1 9 2ゥエル中 1 2ゥェ ルに抗体産生が認められた。

前記の E L I S A法によつて認められた培養上清中の抗 e— Dダイマ—抗体が、 e— Dモノマー、 e—フラグメント X、 e—フラグメント Y、 e—フラグメント E、及びフィブリノ一ゲンと反応するか否かを前記の各抗原を感作した 9 6ゥェ ル E L I S A用プレートを用いて前記と同様の方法で測定した。その結果、 e —Dダイマーと反応した 1 2ゥヱルの培養上清中、 1ゥエルの培養上清が e—D モノマーと反応し、 e—フラグメント X、 e—フラグメント Y、 e—フラグメン E、及びフイブリノ一ゲンとは反応しなかった。他の 1 1ゥヱルの培養上清は、 e—フラグメント Eとは反応しなかった力^ e— Dモノマー、 e—フラグメント X、 e—フラグメント Y、及びフイブリノ一ゲンのすべてと反応した。

e—Dダイマ一及び e—Dモノマーに特異的に反応するゥエル中のハイプリド —マを 2 4ゥエルプレ一トに移し、 1 0〜 1 5%ゥシ胎児血清を含む HT培地で 4〜5日間培養した。その後、 E L I S A法によってフイブリノ一ゲンのプフス ミン分解物(p—フラグメント X、 p—フラグメント Y、 ρ—フラグメント D、 及び p—フラグメント Eの混合物)及び安定化フィプリンのプラスミン分解物

(p— DDZE複合体)との交差反応性を確認した。前記のプラスミン分解物の いずれとも全く反応しなかった。更に、 E L I S A法によって抗 e—Dモノマー Ze— Dダイマ一抗体の産生の有無を確認してから限界希釈法によりクロ一ニン グした。限界希釈法は、 HT培地でハイプリドーマが 5個ノ m l となるように希 釈した細胞浮遊液を、予め正常 BALBZC系マウスの腹腔細胞がゥヱルぁたり 2 X 1 04個分注してある 9 6ゥエルプレ一トの各ゥエルに 1 0 0 /^ 1ずつ分注 した。約 10日後、 EL I S A法によって抗 e— Dダイマ一及び抗 e—Dモノマ —抗体を産生するハイプリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、 20個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖が良好 で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前記と同様の方法で再ク ローン化を行い、抗 e—Dモノマー Ze—Dダイマー抗体産生ハイプリドーマ I F— 1 01を樹立した。このハイプリドーマは、工業技術院生命工学工業技術研 究所(宛名:〒 305日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号)に 1996年 4 月 24日から国内寄託(微ェ研菌寄第 P— 1 5599号)され、 1997年 3月 3 1日から国際寄託に移管されており、国際受託番号は FERM BP-589 0である。

実施例 3 :モノクローナル抗体の製造

(a) イン · ビトロ法

マウスハイプリドーマ I F— 1 0 1を 1 5%ゥシ胎児血清を含む DME培地に て 37でで 5%二酸化炭素雰囲気中、 72〜96時間培養した。培養物を遠心分 離 (10, O O OXg, 1 0分間)した後、上清に固形の硫酸アンモニゥムを 5

0 %最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で 30分間撹拌した後、 60分間放置し、遠心分離(1 0, 000 Xg, 1 0分間)した後、得られた沈 渣を少量の 1 OmMリン酸緩衝液(pH8. 0) に溶解し、 1000倍量の 10 mMリン酸緩衝液に対して透析した。得られた透析内液を、 1 OmMリン酸緩衝 液ですでに平衡化した DEAE—セルロースのカラムに充填した。モノクロ一ナ ル抗体の溶出は 1 OmMリン酸緩衝液(p H 8. 0) と 0. 2M— NaC l含有 1 OmMリン酸緩衝液(pH8. 0) との間で濃度勾配法により行った。溶出さ れたモノクローナル抗体を限外濾過法でし、 0. 1Mリン酸緩衝液(pH8. 0) に対して透析した。ゥシ血清 I gGを除くために、透析物をャギ抗ゥシ血清

1 gG—セファロ一ス 4 Bのカラムに通した。次に、通過液を、 0. 1Mリン酸 緩衝液 (pHO. 8) で平衡化したプロテイン A—セファロ一ス 4 Bのカラムに 充填した。カラムを pH3. 5の緩衝液で溶出して、精製した本発明の抗 e—D モノマー Ze— Dダイマ一モノクローナル抗体 I F— 1 01を得た。

(b) イン ' ビボ法

ブリスタン(2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン) 0. 5m lを 10〜 12週齢の B A LBZC系マウスの腹腔内に投与してから 14〜20日目 のマウス腹腔内に、イン ' ビト口で増殖させたハイプリドーマ I F— 101をマ ウス一匹あたり 2 X 106 細胞となるように接種した。

一匹のマウスから約 10〜 15 m 1の腹水が得られた。その抗体濃度は、 5〜 1 Omg/m lであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製(但し、ャギ抗ゥ シ血清 I gG—セファロース 4 Bのカラムを通す操作を除く)は、前記のイン · ビト口精製法と同様の方法で行った。

実施例 4 :モノクロ一ナル抗体の免疫グロブリンクラス及び特異性の同定

本発明の抗 e— Dモノマー Ze— Dダイマ一モノクローナル抗体 I F— 101 の免疫グロブリンクラスを、ォクテロ二一免疫拡散法により同定した。モノクロ —ナル抗体 I F— 101の免疫グロプリンクラスは I g G , κであった。

実施例 5 :モノクロ—ナル抗体の認識部位の同定

モノクローナル抗体 I F— 101の認識部位の同定はウェスターンプロッティ ング法によって行った。実験操作は主に、 Ze t a—P r o b e B l o t t i n g ewb r ane s I n s t r uc t i o n M a n n u a 1 (ハイオ ラッド社、アメリカ)により行った。実験操作の概要は次のようである。

フイブリノ一ゲンを顆粒球エラスターゼで処理し、 30分間、 60分間、及び 24時間反応後のフイブリノ一ゲンの分解物を、ジチオスレイト一ル(DTT) の存在下及び非存在下で S D Sポリアクリルアミド電気泳動を行った。前記の方 法でプロッティング及びェンザィムィムノアッセィを行い、この結果と S D Sポ リアクリルアミドゲルのクマジ一 · ブリリアント · ブルー G— 250によるタン パク質染色の結果から、モノクローナル抗体 I F- 101の認識部位の同定を行つ た。フイブリノ—ゲン、精製 e— Dダイマ—、及び e_DDZE複合体(安定化 フイブリンの顆粒球エラスタ一ゼ分解物)に対しても前記と同様の方法で行った。 本発明のモノクローナル抗体 I F— 101の各抗原に対する結合反応性を表 1に 示す。表中、 +は結合反応性が有ることを示し、一は結合反応性がないことを示 す。

表 1

抗原 結合反応性

フイブリノ一ゲン

e -X

e一 Y

e— D +

e - E 1

e -E 2

e -E 3

e— Dダイマー +

e— DDZE複合体 +

Αα

Β/?

7

e一 Dモノマ一/ a +

e— Dモノマー/; S

e— Dモノマ一

更に、フイブリノ一ゲンのプラスミン分解フラグメント X、 Y、 D、及び E、 p— Dダイマ一、並びに p— DDZE複合体(安定化フイブリンのプラスミン分 解物)に対しても前記と同様の方法で行った。結果を表 2に示す。

表 2

抗原 結合反応性

フイブリノ一ゲン 一

P-X 一

P-Y 一

P-D 一

p -E 1 一

p -E 2 一

p - E 3

p— Dダイマ—

p— D DZ E複合体

A a

7

p— Dモノマ一/ a

p— Dモノマ一 Ζ /?

_ Β一 Dモノマ一/ _

以上、表 1及び表 2の結果から、本発明のモノクローナル抗体 I F— 1 0 1は、 e— Dモノマーの 鎖を認識することが明らかになつた。

実施例 6 :モノクロ一ナル抗体 I F— 1 0 1のェピト一プの同定

実施例 5の結果からモノクローナル抗体 I F— 1 0 1は e—Dモノマーの/ ひ 鎖を認識することが明らかとなった。そこで、モノクローナル抗体 I F— 1 0 1 のェピト一プをより詳細に解析するため、 e—Dモノマーの/ α鎖のアミノ酸配 列を決定し、それと同じアミノ酸配列をもつペプチドを合成し、それを用いて、 e— Dモノマー、 e— Dモノマ一鎖、 e— Dダイマ一、又は e— D D/ E複 合体と、モノクローナル抗体 I F— 1 0 1との結合阻害実験を行うことによって、 ェピトープのァミノ酸配列を決定した。具体的な実験操作を以下に示す。

e— Dモノマーの /。鎖の N末端側のァミノ酸配列をプロティンシーケンサ 〔アプライドシステムズジャパン(株)〕で解析したところ、配列表の配列番号 2の配列:

S e r G 1 u A s p L e u A r g S e r A r g l i e で表されることが明らかになった。

このアミノ酸配列と、ヒトフィプリノーゲンの A ひ鎖の配列とを比較すること により、 e— Dモノマーの鎖は、 A a鎖の第 1 1 2番目のアミノ酸残基から 始まることが明らかになった。すなわち、 e— Dモノマーの/ ひ鎖の N末端アミ ノ酸を含む N末端側のアミノ酸配列は、ヒトフイブリノ一ゲンの A α鎖の

S e r ! 12 一 G 1 u 113 — A s p 114 — L e u】15 — A r g1 ! 6 一 S e r 117 — A r g】18 - I l e 119 — . . .

に対応することが判明した。

ヒトフイブリノ一ゲンの A α鎖の第 1 1 2番目のアミノ酸残基以降のアミノ酸 配列を有するペプチド 3種類を合成し、それらのペプチドによる、モノクローナ ル抗体 I F— 1 01と、 e— Dモノマ一、 e— Dモノマー/ひ鎖、 e—Dダイマ 一、又は e— DDZE複合体(安定化フイブリンの顆粒球エラスタ一ゼ分解物) との結合阻害実験を行った。

前記結合阻害実験は、実施例 5の「モノクローナル抗体の認識部位の同定」と 同様にウェスターンブロッテイング法によって行った。すなわち、フイブリノ一 ゲンを顆粒球エラスターゼで 24時間反応させた後に得られるフイブリノ一ゲン の分解物(e— Dモノマ一を含む)と、精製 e—Dダイマ一及び e—DDZE複 合体 (安定化フイブリンの顆粒球エラスタ一ゼ分解物)とを、ジチオスレイト一 ル (DTT) の存在下及び非存在下で SDSポリアクリルアミド電気泳動を行つ た。次に Z e t a— P r o b e B l o t t i n Memb r a n e I n s t r u c t i o n Ma n n u a 1 (バイォ · ラッド社、アメリカ)に従い、ブ ロッテイングを行った。このブロッテイング操作の中で、モノクローナル抗体 I F- 101を反応させるときに、各べプチドの存在下(100 //M) 及び非存在 下で実験を行い、 I F— 1 01の反応にる各べプチドの阻害の有無を調べた。 結果を表 3に示す。ぺプチド Aは、ヒトフィブリノ一ゲンの A «鎖の第 1 12 番目〜第 1 17番目のアミノ酸配列:

e r G l u A s L e u A r g S e r

(配列表の配列番号 1の配列)で表されるペプチドであり、ペプチド Bは、ヒト フイブ"ノーゲンの鎖の第 1 1 7番目〜第 1 22番目のアミノ酸配列: S e r A r g I 1 e G l u V a 1 L e u

(配列表の配列番号 3の配列)で表されるペプチドであり、そして、ペプチド C は、ヒトフィプリノーゲンの Aひ鎖の第 122番目〜第 127番目のァミノ酸配 列:

L e u L y s A r g L y s V a 1 l i e

(配列表の配列番号 4の配列)で表されるペプチドである。 +は、加えたぺプチ ドカ、顆粒球ェラスタ一ゼ分解物とモノクロ一ナル抗体 I F— 1 0 1との結合を 阻害したことを示し、一は、加えたペプチドが、前記結合を阻害しないことを示 す。

表 3に示す結果から、モノクローナル抗体 I F— 1 0 1のェピトープは、ヒト フィプリノ一ゲンの Aひ鎖の

S e r J 12 -G 1 u 1 13 - A s p 1 14— L e u 1 15 - A r g 1 16— S e r 1 17 に相当する、 e— Dモノマーの Ζα鎖の N末端ァミノ酸を含む Ν末端側のアミノ 酸配列

¾ e r— G 1 u— A s p— L e u— A r — S e r

を含む部位であることがわかった。

表 3

e一 Dモノマー e一 Dモノマーひ e— Dダイマ— e— DDZE複合体 ペプチド A + + + + ペプチド B — 一

ペプチド C 一 一

実施例 7 :モノクローナル抗体 I F— 1 0 1結合ラテックスの調製とそのラテツ クスによる e—Dダイマー及び e— DDZE複合体(安定化フィプリンの顆粒球 エラスタ一ゼ分解物)の測定

ポリスチレンラテックス〔セラダイン社製,米国, 1 0% (w/v) 懸濁液, 粒径 =0. 4 8 9 m〕 0. 2 m 1を、実施例 3で作製した本発明の抗 e—Dモ ノマ一 Ze— DD/E複合体モノクローナル抗体 I F— 1 0 1を含む 50 mMト リス塩酸緩衝液(p H 8. 0) 1. 8m l (抗体濃度 0. 9 m gノ m l ) に混合 し、マグネチックスターラーで撹拌した。

混合液を遠心分離(2 0, O O O g X l O分間)し、 0. 0 5%N a N3 を含 む蒸留水で 4回洗浄し、 1 mgZm 1の B S Aを含む 0. 1 Mトリス塩酸緩衝液

(p H 8. 0) に懸濁させ(l wZv%) 、保存した。この感作ラテックスと、 種々の濃度の e—Dダイマー、 e—DDZE複合体、フイブリノ一ゲンの顆粒球

エラスタ一ゼ分解物、フイブリノ一ゲンのプラスミン分解物、又は安定化フイブ リンのプラスミン分解物とを混合し、全自動免疫血清検査システム(三菱化学株 式会社製 LP I A— 200) を用いて、凝集の反応速度を測定することにより定 量した。

結果を図 1に示す。直線 aは、 e _Dダイマーを抗原として使用した場合の結 果を示し、以下同様に、直線 bは e—DD/E複合体を、直線 cは e— DD/E 複合体及び p— DD/E複合体の等量混合物を、直線 dはフイブリノ—ゲンのプ ラスミン分解物を、直線 eは p— DD/E複合体を、そして直線 ίはフイブリノ ―ゲンの顆粒球ェラスターゼ分解物を、抗原として使用した場合の結果を示す。 V値とは、凝集反応速度である。

図 1から明らかなように、モノクロ一ナル抗体 I F— 101感作ラテックスに より、 e— Dダイマー、又は e— DD/E複合体を定量的に測定できること力 ?判 明した。

産業上の利用可能性

以上から明らかなように、本発明のモノクローナル抗体によれば、生体試料中 の e— Dダイマ—又は e— DDZE複合体の量を、前記生体試料中に存在すると 考えられるフイブリノ一ゲン、フイブリノ一ゲンのプラスミン分解物、安定化フィ ブリンのプラスミン分解物(特には p—Dダイマ一、 p— DDZE複合体)の干 渉を受けることなく、特異的に定量することのできる免疫学的分析方法を提供す ることができる。

以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

配列表

配列番号: 1

配列の長さ: 6

配列の型:アミノ酸

トポロジー:直鎖状

配列の種類:ペプチド

配列

Ser Glu Asp Leu Arg Ser

1 5

配列番号: 2

配列の長さ: 8

配列の型:アミノ酸

トポロジー:直鎖状

配列の種類:ペプチド

配列

Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg lie 1 5

配列番号: 3

配列の長さ: 6

配列の型:アミノ酸

トポロジー:直鎖状

配列の種類:ペプチド

配列

Ser Ara lie Glu Val Leu

配列番号: 4

配列の長さ: 6

配列の型:アミノ酸

トポロジー:直鎖状

配列の種類:ぺプチド 配列

Leu Lys Ara Lys Val lie