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1. WO1997043299 - NUCLEOSIDE-3'-PHOSPHATES ALKYLES, LEUR PROCEDE DE PRODUCTION ET LEUR UTILISATION

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[ DE ]

ALKYLIERTER NUCLEOSID-3' -PHOSPHATE, VERFAHREN ZU lHRER HERSTELLUNG UND lHRER VERWENDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung alkylierter Nucleosid-3'-Phosphate, diese und deren Verwendung.

Bei der Therapie von Tumoren werden oft Tumortherapeutika eingesetzt, deren Wirkung auf der Alkylierung von DNA beruht. Die Wirkung dieser Tumortherapeutika wird jedoch durch zelluläre Reparaturmechanismen, z.B. der O6-Alkyl-Guanosin-Transferase, vermindert oder sogar ganz verhindert. Um diesem entgegen treten zu können, könnte es nützlich sein, alkylierte Nucleosid-3'-Phosphate ergänzend zu den angesprochenen Tumortherapeutika zu verwenden. Alkylierte Nucleosid-3'-Phosphate stellen das Substrat für die O6-Alkyl-Guanosin-Transferase dar, wodurch diese in den Tumoren gebunden und von ihrer DNA-Reparatur-Aktivität abgehalten würde. Die Herstellung von alkylierten Nucleosid-3'-Phosphaten stellt sich allerdings als äußerst schwierig heraus.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem alkylierte Nucleosid-3 ' -Phosphate hergestellt werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines alkylierten Nucleosid-3 '-Phosphats, das eine Nucleobase, eine Pentose und eine Phosphat-Gruppe aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
(a) Umsetzen eines Schutzgruppen aufweisenden Nucleosid-3 '-Phosphats mit einem Alkylierungsmittel, und
(b) Abspalten der Schutzgruppen.

Der Ausdruck "Nucleobasen" umfaßt jeden basisch reagierenden Heterocyclus, z.B. Purin, Pyrimidin oder Derivate von diesen, wie Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil oder Thymidin.

Der Ausdruck "Pentose" umfaßt jedes Saccharid, das 5 Kohlenstoffatome aufweist, wie D-Ribofuranose und 2-Desoxy-D-ribofuranose. Die Pentose kann über ihr Kohlenstoff-atom 1 β -glykosidisch an ein Stickstoffatom der Nucleobase gebunden sein.

Der Ausdruck "Phosphat-Gruppe" umfaßt organische und anorganische Phosphate jeglicher Art, z.B. Mono-, Di- oder Triphosphate. Die Phosphat-Gruppe kann an das Kohlenstoffatom 3 und ggf. 5 der Pentose gebunden sein.

Bevorzugte Nucleosid-3 '-Phosphate sind Adenosin-, Guanosin-, Cytidin-, Uridin-, 2 ' -Desoxyadenosin-, 2 '-Desoxyguanosin-, 2 '-Desoxycytosin- und Thymidin-3 '-Phosphat, wobei deren Monophosphate von ganz besonders bevorzugt sind.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden in Schritt (a) Schutzgruppen aufweisende Nucleosid-3 '-Phosphate mit einem Alkylierungsmittel umgesetzt. Das Nucleosid-3 '-Phosphat kann die Schutzgruppen an OH-Gruppen der Pentose, an OH-Gruppen der Phosphat-Gruppe(n) und ggf. an der Nucleobase aufweisen. Dabei ist es günstig, wenn alle OH-Gruppen der Pentose und der Phosphat-Gruppe(n) mit Schutzgruppen versehen sind. Beispiele von Schutzgruppen an OH-Gruppen der Pentose sind Dimethoxytrityl-, Silyl- und/oder Acylgruppen, wie Phenylacetyl- und Acetylgruppen. Beispiele von Schutzgruppen an OH-Gruppen der Phosphat-Gruppe(n) sind Cyanoethyl-Gruppen und Derivate davon. Beispiele von Schutzgruppen an der Nucleobase sind vorstehende Acylgruppen. Die Schutzgruppen an der Nucleobase können sich an jeder geeigneten Position der Nucleobase befinden, die nicht alkyliert werden soll, z.B. an einer Aminogruppe.

Die Herstellung von Schutzgruppen aufweisenden Nucleosid-3 '-Phosphaten sowie dazu notwendige Materialien sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können diese von käuflichen Vorläufern erhalten werden (vgl. Umsetzung von 7 zu 8 in Fig. 2) . Sie können auch aus den Nucleosiden (Pentose und Nucleobase) selbst hergestellt werden (vgl. Fig. 1 ) .

Als Alkylierungsmittel in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist jedes Mittel geeignet, das vorstehende Nucleoside, insbesondere die Nucleobasen vorstehender Nucleoside alkylieren kann, z.B. an einem O- und/oder N-Atom. Ein Beispiel hierfür sind Carbokationen liefernde Alkylierungsmittel, z.B. Diazoalkane, wie Diazomethan, Diazoethan und/oder Diazo-n-butan.

In Schritt (a) können durch die Alkylierung auch mehrere Alkylgruppen eingeführt werden, z.B. an verschiedenen Positionen. Die Alkylgruppen können gleich oder verschieden voneinander sein.

Durch Schritt (a) werden alkylierte, Schutzgruppen aufweisende Nucleosid-3 '-Phosphate erhalten.

In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Abspalten der Schutzgruppen. Günstigerweise geschieht dies unter milden Bedingungen, so daß die in Schritt (a) eingeführten Alkylgruppen nicht beeinflußt werden. Die Abspaltung von Dimethoxytritylgruppen kann z.B. mittels eines Ionenaustauschers in der H +-Form durchgeführt weden. Die Abspaltung von Silylgruppen kann mit Fluorid erfolgen. Acylgruppen können durch Behandlung mit Basen, z.B. Ammoniak oder OH- , abgespalten werden. Die Abspaltung von Cyanoethylgruppen oder deren Derivaten kann durch Inkubation mit Ammoniak geschehen. Die Schutzgruppen können nacheinander oder in einer "Eintopfreaktion" abgespalten werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungemäßen Verfahrens kann vor und/oder nach Schritt (b) ein Reinigungs- und/oder Trennschritt erfolgen. Wird z.B. in Schritt (a) ein Isomerengemisch von alkylierten, Schutzgruppen aufweisenden Nucleosid-3 ' -Phosphaten erhalten, so ist es günstig, dieses in die Isomeren zu trennen, bevor die Schutzgruppen abgespalten werden. Der Reini- gungs- und/oder Trennschritt kann z.B. mit chromatographischen Methoden, wie präparativer HPLC, erfolgen.

Beispiele des erfindungegemäßen Verfahrens sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß alkylierte Nucleosid-3 '-Phosphate in großen Mengen und hoher Reinheit erhalten werden. Ferner ist das Verfahren leicht durchführbar und kostengünstig.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind alkylierte Nucleosid-3 ' -Phosphate, umfassend eine Nucleobase, eine Pentose und eine Phosphatgruppe, wie sie vorstehend definiert sind, wobei sich an der Nucleobase eine Alkylgruppe befindet. Diese sind durch das vorstehende Verfahren erhältlich.

Alkylierte Nucleosid-3 ' -Phosphate können bei der Behandlung von Tumoren mit Tumortherapeutika, die z.B. die DNA alkylieren, verwendet werden. Damit kann erreicht werden, daß diese Tumortherapeutika ihre volle Wirkung entfalten. Ferner können alkylierte Nucleosid-3'-Phosphate alleine zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden.

Desweiteren können alkylierte Nucleosid-3 ' -Phosphate zur Analyse von DNA-Alkyl-Addukten eingesetzt werden, z.B. im 32P-Postlabeling-Verfahren. Alkylierende Verbindungen können Krebs verursachen, in dem sie Basen zellulärer DNA alkylieren, wodurch DNA-Alkyl-Addukte entstehen. Solche Addukte können mit dem 32P-Postlabeling-Verfahren nachgewiesen werden. Hierzu wird vorstehende DNA enzymatisch zu Nucleosid-3 '-Phosphaten abgebaut, wodurch ein Gemisch von üblichen Nucleosid-3 '-Phosphaten und alkylierten Nucleosid-3 '-Phosphaten entsteht. Anschließend wird unter Verwendung von y-32P-ATP enzymatisch an der 5 '-Position eine radioaktive Phosphatgruppe eingeführt. Dabei ist es notwendig, daß die Nucleoside an der 3'-Position eine Phosphat-Gruppe tragen, da nur diese auf vorstehende Art markiert werden können. Das Gemisch der radio aktiv markierten Nucleoside wird dann in üblicher weise getrennt und die radio-activ markierten Nucleoside werden nachgewiesen. Mit diesem Verfahren könne DNA-Alkyl-Addukte in sehr kleinen Mengen nachgewiesen werden (ca. 1 Addukt auf 109 normale Nucleoside) . Wegen dieser geringen Menge ist ein Strukturbeweis der DNA-Alkyl-Addukte jedoch nicht möglich. Um die Struktur eines DNA-Addukts zu beweisen, ist die Bereitstellung von Substanzen notwendig, die als Vergleichssubstanzen im 32-Postlabeling-Verfahren eingesetzt weden können. Derartige Substanzen sind alkylierte Nucleosid-3 ' -Phosphate.

Neben dem 32P-Postlabeling-Verfahren werden DNA-Alkyl-Addukte auch mit monoklonalen Antikörpern nachgewiesen. Hierzu wird, wie vorstehend beschrieben, vorgegangen, wobei die alkylierten Nucleosid-3 '-Phosphate mittels gegen sie gerichteter monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden. Zur Gewinnung der monoklonalen Antikörper können alkylierte Nucleosid-3 '-Phosphate verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 : zeigt die Herstellung von O6-n-Butyl-2 '-desoxyguanosin-3 ' -mono- phosphat, und

Fig. 2: zeigt die Herstellung von 3 isomeren alkylierten 2 ' -Desoxythymidin-3 ' -monophosphaten.
Die Verbindung 8 wird aus der käuflichen Verbindung 7 in einer zweistufigen Eintopf reaktion ( 1 . Tetrazol-katalysierte Kopplung mit Hydroxypropionnitril; 2. Oxidation mit Cumolhydroperoxid) hergestellt. Verbindung 8 wird dann direkt mit einem beliebigen Diazoalkan, z.B. Diazomethan, Diazoethan oder Diazo-n-Butan, umgesetzt.
Bei dieser Reaktion entstehen gleichzeitig die 3 isomeren Verbindungen 9a-c. Die Verbindungen 9a-c werden mittels präparativer HPLC getrennt. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt für jedes Isomer getrennt. Die Dimethoxytrityl-Gruppen werden mit einem lonenaustauscher in der H +-Form abgespalten. Die Abspaltung der Cyanoethylgruppen erfolgt durch Inkubation mit Ammoniak. Es werden die alkylierten Nucleosid-3 ' -monophosphate 10a-c erhalten, die mittels präperativer HPLC gereinigt werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel: Herstellung von O6-n-Butyl-2 ' -desoxyguanosin-3 ' -monophosphat

Die Struktur und die Herstellung von O6-n-Butyl-desoxyguanosin-3 ' -monophosphat ist in Figur 1 gezeigt.

(a) Herstellung von N2-Phenylacetyl-2'-desoxyguanosin 2 nach Synthesis, 1 986( 1 ), 45-46

Lösung 1 10 mmol (2,67 g) 2'-Desoxyguanosin 1 wurden in 2 x 30 ml Pyridin eingeengt und in 50 ml Pyridin suspendiert. Zu der Suspension wurden 50 mmol (6,5 ml) Trimethylchlorsilan langsam zugetropft. Nach 30 Minuten wurde das Gemisch mit Eis gekühlt.

Lösung 2 1 6,0 mmol (2,7 g) Hydroxybenzotriazol wurden mit Acetonitril (4 x 30 ml) eingeengt und in 5 ml Acetonitril suspendiert. Unter Luft- und Feuchtigkeitsausschluß wurden 15 mmol (2 ml) Phenylessigsäurechlorid zugetropft. Nach 30 Minuten wurde soviel Pyridin zugegeben, daß sich der Niederschlag löste (ca. 0,3 ml).

Lösung 2 wurde dann in die gekühlte Lösung 1 unter Luft- und Feuchtigkeitsauschluß getropft. Nach beendeter Zugabe wurde über Nacht ( 1 5 Stunden) auf Raumtemperatur erwärmt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Eis gekühlt. Dann wurden 10 ml Wasser und nach 5 Minuten 20 ml konzentrierter Amoniak zugegeben. Nach weiteren 1 5 Minuten wurde im Vakuum zur Trockne eingeengt (Wasserbadtemperatur: 30 °C). Der erhaltene Rückstand wurde in soviel Wasser (ca. 20 ml) aufgenommen, wie zum Lösen nötig war. Dann wurde mit 50 ml Diethylether ausgeschüttelt und die organische Phase dekantiert. Die wäßrige Phase wurde bei 4° C kristallisiert. Der kristallisierte Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Es wurden 3,0 g (78 %) 2 erhalten.

(b) Herstellungvon5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-N2-phenylacetyl-2'-desoxygua- nosin 3 nach Nucleic Acid Research 1 987 ( 1 5/2) 397-41 6)

Es wurden 5,7 mmol (2, 1 8 g) 2 mit Pyridin (3 x 1 0 ml) eingeengt, in Pyridin (30 ml) suspendiert und auf 0° C abgekühlt. In diese Suspension wurden 6,3 mmol (2, 1 3 g) Dimethoxytritylchlorid eingetragen. Es wurde über Nacht (ca. 1 5 Stunden) gerührt. Dann wurden 4 ml Methanol zugegeben. Nach 1 5 Minuten wurde im Vakuum eingeengt (Wassertemperatur 30° C) . Der Rückstand wurde in Dichlormethan (100 ml) aufgenommen und mit 5 %-iger wäßriger Natriumcarbonat-Lösung (3 x 75 ml) und Wasser ( 1 x 75 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde dekantiert, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel mit Chloroform/Ethanol = 95/5 chromatographiert. Es wurden 2,9 g (74 %) 3 erhalten.

(c) Herstellungvon5'-O-(4,4-Dimethoxytrityl)-N2-phenylacetyl-2'-desoxygua- nosin-3'-bis(cyanoethyl)phosphat 4

Es wurden 1 mmol (0,68 g) 3 mit THF (2 x 10 ml) eingeengt und in THF (10 ml) gelöst. Unter Argonatmosphäre wurden 4 Äquvalente Hünigbase und danach 2 Äquivalente Cyanoethyl-(bis-isopropyl)amido-chlorphosphit zugetropft und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1 Stunde wurden zu dem Reaktionsgemisch 30 ml Essigester und 1 ,5 ml Triethylamin zugegeben. Die organische Lösung wurde mit 10 %-iger Natriumcarbonat-Lösung (2 x 10 ml) und gesättigter Natriumchlorid-Lösung ( 10 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Die Reinigung des Rohprodukts erfolgte mittels Kieselgelsäuienchromatographie; Dichlormethan/Essigester/Triethylamin/Methanol = 45/45/10/2,5. Es wurden 0,6 g (67 %) eines Zwischenprodukts erhalten.

0, 1 1 mmol ( 100 mg) dieses Zwischenprodukts wurden in ca. 1 0 ml Acetonitril gelöst, mit 0,25 mmol (18 mg) Hydroxypropionsäurenitril und mit 0,5 mmol (35 mg) Tetrazol versetzt. Nach 1 Stunde wurde 1 Äquivalent 3 %-iger Cumolhydroperoxid-Lösung in Acetonitril zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt (DC-Kontrolle, Kieselgel Chlorofrom/Methanol = 9/1 ) . Nach ca. 1 Stunde wurde mit wenigen Tropfen Ethanol versetzt und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Chloroform (30 ml) aufgenommen und mit 2 %-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Die Reinigung erfolgte über Säulenchromatographie an Kieselgel mit Chloroform/Methanol = 95/5). Es wurden 300 mg (61 %) 4 erhalten.

(d) Herstellung von O6-n-Butyl-5'-O-(4,4-dimethoxytrityl)N2phenylacetyl-2'- desoxyguanosin-3'-bis(cyanoethyl)phosphat 5

1 1 5 μmol ( 100 mg) 4 wurden in 5 ml Methanol gelöst und mit 3 ml etherischer Diazo-n-butan-Lösung versetzt. Nach 30 Minuten wurde unter Vakuum eingeengt und anschließend an Kieselgel chromatorgaphiert (Chloroform/Ethanol = 98/2). Es wurden 40 mg (37 %) 5 erhalten.

(e) Herstellung von O6-n-Butyl-2'desoxyguanosin-3'-bis(cyanoethyl)phosphat 6

32 μmol (30 mg) des vollständig geschützten 5 wurden in 3 ml Nitromethan gelöst und mit einer an Zink(ll)bromid gesättigten Lösung in 3 ml Nitromethan versetzt. Nach 1 5 Minuten wurde mit 50 ml Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit 30 ml 1 M AmmoniumacetatLösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit Wasser und gesättigter Kochsalz-Lösung (je 10 ml) gewaschen und unter Vakuum eingeengt. Das Rohprodukt wurde in 5 ml Wasser gelöst und mit konzentriertem wäßrigen Ammoniak ( 10 ml) 1 5 Stunden bei Raumtemperatur grührt. Es wurde anschließend lyophilisiert, der Rückstand in wenig Wasser aufgenommen, mit 3 x 1 0 ml Chloroform ausgeschüttelt und die wäßrige Lösung erneut lyophilisiert.

Es wurden 4 mg von 6 erhalten.

Spektroskopische Daten von 6

ESI: -Q1MS LMR UP LR; Infusion 5 μl/min, MeOH
M (C14H22N5O7P) = 403; [M-H] 402.0 (100%)

1H-NMR (D2O, 250 Mhz) δ = 8,08 (s, 1 H, NH); 6,37 (dd, 1H, 1'-H); 4,92 (m, 1H, 3'-H); 4,48 (m, 2H, O5-CH2); 4,33 (m, 1 H, 4'-H); 3,84 (m, 2H, 5'-H); 2,70 (m, 2H, 2'-Ha); 1,80 (m, 2H, O6-C-CH2); 1,50 (m, 2H, O6-C-C-CH2); 0,95 (t,3H, O6-C-C-C-CH3)