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1. (WO1995034214) PROCEDE DE FABRICATION D'UN LEVAIN DE PANIFICATION DESHYDRATE ET LEVAIN OBTENU
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PROCEDE DE FABRICATION D'UN LEVAIN DE PANIFICATION
DESHYDRATE ET LEVAIN OBTENU

La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un levain de panification déshydraté, dans lequel la flore microbienne présente une viabilité élevée de la levure, et levain ainsi obtenu.
Dans toute la suite, l'expression "levain" désigne une pâte essentiellement à base de farine, d'eau potable, de sel et d'une flore ou biomasse microbienne, biomasse de panification, capable de déclencher la fermentation du pain.
Ce terme s'applique également aux produits obtenus par déshydratation du levain tel que défini précédemment, sous réserve qu' ils contiennent une flore microbienne vivante en nombre suffisant pour obtenir la levée du pain. Pour produire un levain sec, il est donc nécessaire que la biomasse microbienne déshydratée survive dans un état de dormance pendant le stockage et soit ensuite réactivée par la réhydratation. Cette biomasse est constituée de bactéries acidifiantes lactiques et acétiques ainsi que de levures spécifiques du levain.
Pour maintenir une viabilité relativement élevée des cellules dans le levain sec, il est connu d'ajouter un adjuvant de séchage tel que polysaccharides, émulsifiants. Toutefois, ces adjuvants de séchage présentent un inconvénient majeur car ils sont nuisibles à la qualité de la pâte obtenue.
La présente invention vise à remédier à ces inconvénients en procurant un procédé de déshydratation d'un levain de panification qui conserve après la déshydratation, une viabilité relativement élevée des cellules de la biomasse utilisée, et ce, sans faire appel à un quelconque adjuvant.
A cet effet, ce procédé de fabrication d'un levain de panification déshydraté dans lequel on mélange de façon homogène une biomasse de panification avec un milieu de déshydratation à base de farine et d'eau, pour donner un levain humide, est caractérisé en ce qu'on déshydrate le levain humide à température réduite, c'est-à-dire inférieure à 40°C et en tous cas suffisamment basse pour ne pas détruire la biomasse entrant dans le mélange, en deux étapes successives. La première étape qui correspond à l'enlèvement de l'eau extracellulaire se fait à une vitesse de déshydratation quelconque, tant que l'activité de l'eau aw est supérieure ou égale à 0,990, c'est-à-dire tant que l' aw du milieu externe est supérieure à l ' aw intracellulaire des levures, et ensuite, dès que l'activité de l'eau aw tombe à une valeur inférieure à 0,990 (correspondant à un potentiel hydrique de -1,38 MPa) on déshydrate le levain avec un gradient de potentiel hydrique contrôlé, correspondant à des vitesses de déshydratation comprises entre -0,5kPa/s et -5,0kPa/s jusqu'à ce que l'activité de l'eau aw atteigne une valeur correspondant à une viabilité cellulaire satisfaisante, cette valeur pouvant tomber jusqu'à environ 0,15 (correspondant à un potentiel hydrique de -261 MPa). Il est à noter que l'intensité de la vitesse de déshydratation est donnée par la valeur absolue de ce paramètre (une vitesse de -5,0kPa/s est donc considérée comme plus élevée qu'une vitesse de -0,5kPa/s).
On rappelle que l'activité de l'eau aw est donnée par la formule de Norrish extraite du "Journal of Food Technology" :
h^ = 1 -(Xs) e (—KX s ' 2 où K est une constante dépendant du soluté (1,16 pour le glycérol) et Xs, la fraction molaire du soluté.
Cette technique permet de produire un levain déshydraté complet, au sens boulanger du terme, c'est-à-dire
- contenant suffisamment de levures pouvant être revivifiées, pour provoquer une levée correcte de la pâte ;
- contenant une flore de levures lactiques pouvant être revivifiées, capable d'assurer la production des acides organiques (lactique et acétique principalement) responsables de la saveur du pain au levain.

Afin d'obtenir des taux de survie de la flore microbienne élevés, plus spécialement d'au moins 50 % environ, et même de 60 %, voire de 70 %, on applique une cinétique lente de variation de la pression osmotique au cours de la deuxième déshydratation jusq ' à l ' obtention de la pression osmotique finale qui doit être obtenue en fonction de l'aw recherchée.
L'utilisation de rampes osmotiques permet avantageusement le contrôle d'une telle cinétique comme illustré par les exemples.
De manière avantageuse, au moins la deuxième étape de déshydratation est réalisée à l'intérieur d'une étuve dont on fait varier l'humidité relative par paliers réguliers depuis une valeur d'environ 95 % jusqu'à une valeur finale de 15% au plus lorsque a^^ tombe à 0,15. On notera que dans les dernières phases de séchage, on utilise avec avantage un dessiccateur produisant un air dont l'humidité relative est proche de 0%.
La température réduite de déshydratation est choisie inférieure à 40°C et, de préférence, sensiblement de l'ordre de 20 à 25°C.
L'évaluation de l'activité de l'eau aw du levain est déduite de l'évaluation de la température de rosée mesurée par l'apparition de buée sur un miroir, ou, en variante, par pesées régulières du mélange levure/farine déterminant la teneur en eau et donc l ' activité de l'eau aw déduite de l'isotherme de sorption, établie pour le produit à la température de l'opération.
On réalise de préférence la culture de biomasse dans un milieu hyperosmotique afin de favoriser la synthèse intracellulaire de solutés protecteurs ou encore dans un milieu enrichi en sucre pour favoriser l'accumulation de solutés protecteurs.
La biomasse mise en oeuvre dans le procédé de l'invention est essentiellement à base de levures et/ou de bactéries capables d'assurer la fermentation du pain dans des conditions satisfaisantes.

De manière classique, les levures appartiennent au genre Saccharomyces, l'espèce S.cerevisiae étant le plus largement utilisée, et les bactéries du genre Lactobacillus, comme par exemple L. plantarum, étant entendu que d' autres souches de levures et de bactéries sont utilisables.
L' invention vise également les levains déshydratés tels qu'obtenus par le procédé défini ci-dessus. Ces levains déshydratés sont caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus d'adjuvants de séchage et que le taux de viabilité cellulaire est d'au moins 50 % environ, et même de 60 %, voire de l'ordre de 70 %, pouvant atteindre et dépasser 100%, compte tenu du développement éventuel de la flore bactérienne pendant la première étape de déshydratation.
D' autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent concernant la déshydratation d'un levain humide et de bactéries et en se reportant aux figures 1 à 3, qui représentent respectivement :
- la figure 1, un diagramme donnant, en fonction du temps, la variation de l'activité de l'eau aw d'un levain de panification ( représentée par des croix sur le dessin) et l'humidité relative HRE (représentée en traits continus sur le dessin) de l'ambiance dans l'étuve industrielle,
- la figure 2, une représentation de la vitesse de déshydratation du levain en fonction du temps, et,
- la figure 3, l'isotherme de sorption du levain.
I - Procédé de déshydratation d'un levain de panification.
On utilise un levain humide élaboré à partir de 70 g d'eau, 30 g de farine et 0,5 g d'une levure Saccharomyces cerevisiae (souche CBS 1171).
On a avantageusement procédé, avant la déshydratation, à une culture comme indiqué plus haut de la levure dans un milieu hyperosmotique.
Les expérimentations ont été effectuées dans une étuve industrielle Hereauss à humidité relative contrôlée dans la gamme 40% - 95 %, à une température constante de 25°C.
Au cours de la première étape de déshydratation du levain, on a maintenu, à l'intérieur de l'étuve, une humidité relative de 40 %, par exemple pendant une heure, jusqu'à ce que l'activité de l'eau aw tombe à la valeur 0,990. Au cours de cette première étape de déshydratation le gradient de potentiel hydrique est très élevé et provoque un départ d'eau très important et la vitesse de déshydratation, exprimée en kPa/s augmente progressivement.
Aussitôt que l'activité de l'eau du levain tombe à la valeur de 0,990, on augmente brutalement et fortement l'humidité relative dans l'ambiance, pour la porter à 95%, puis on la fait décroître par paliers réguliers, par exemple de 5% toutes les deux heures, jusqu'à la valeur de 60% au bout d'une période de temps variable déterminant la vitesse de déshydratation. On arrête l'opération de déshydratation lorsque la valeur de l'activité de l'eau a^^ tombe à 0,60. On obtient ainsi, au cours de la deuxième étape du procédé de déshydratation, une vitesse de déshydratation relativement lente qui est comprise entre -0,5kPa/s et -5kPa/s.
Au cours des essais, l'évaluation de l'activité de l'eau a^ du levain pendant la phase de déshydratation a été effectuée par deux méthodes différentes menées parallèlement :
- Par mesure directe de l'activité de l'eau aw,
pour chaque relevé permettant d'établir la figure 1, il a été prélevé dans l'étuve un échantillon représentatif du produit dont on peut facilement déduire une évaluation de la température de rosée mesurée par l ' apparition de buée sur un miroir ; on a eu recours pour cette évaluation à un appareil du type CS-2, DECAGON-USA. A noter que le temps nécessaire pour effectuer une telle mesure est de l'ordre de 3 à 5 minutes par échantillon.
- Par mesure indirecte à partir de l ' isotherme de sorption du mélange que l'on étudie.

On rappelle que l ' isotherme de sorption est une courbe reliant les deux paramètres teneur en eau/activité de l'eau ; cet isotherme est bien entendu spécifique à chaque produit.
On a représenté en figure 3 l ' isotherme de sorption du mélange ("activité de l'eau" a^. en fonction de la "teneur en eau" exprimée en grammes d'eau pour 100 grammes de matière sèche) dont on a décrit ci-dessus les phases de déshydratation. A partir de l'isotherme de sorption du mélange considéré (0,5 gr de levure, 30 gr de farine) et connaissant la teneur en eau initiale dudit mélange, il est évidement possible de suivre très simplement les variations de l'activité de l'eau par mesure régulière de la masse du mélange. On observera qu'une telle pesée est relativement aisée, dans la mesure où l'on travaille à

25°C, c'est-à-dire sensiblement à la température ambiante.

Enfin, il est à noter que le suivi de l'activité de

1' eau par l'une ou 1* autre des méthodes qui viennent d'être décrites, conduit naturellement à la connaissance du potentiel hydrique qui lui correspond selon la formule connue :

potentiel hydrique (Pa) = RT/Vw.lnaw

dans laquelle R est la constante des gaz parfaits (8,314 J.mol-i.K-1) et T la température (°K) et Vw est le volume molaire partiel de l'eau (à savoir 1,8.10~5 rn^.mol"1).
Comme il a été indiqué précédemment, aucun adjuvant de déshydratation n'est incorporé pendant les deux phases de déshydratation à l ' intérieur de l ' étuve. On procède ensuite à une mesure du pourcentage de viabilité et les résultats obtenus par le procédé suivant l'invention, mis en oeuvre avec une vitesse de déshydratation lente correspondant à -IkPa/s, une vitesse de déshydratation intermédiaire correspondant à -3,75kPa/s et une vitesse de déshydratation élevée correspondant à -4,17 kPa/s sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. Les résultats indiqués dans le tableau 1 confirment l'influence de la vitesse de déshydratation de la dernière étape sur la viabilité cellulaire, à savoir : plus la déshydratation est lente, meilleure est la conservation de la viabilité.
Tableau 1

Type Vitesse % viabilité % viabilité % perte d'essai c e déshydratation avant après viabilité
traitement traitement
Essai rapide -4,17 kPa/s 97,54 48,08 49,46

Essai interméd. Etuvage
-3,75 kPa/s 97,54 56,96 40,58

Essai lent Etuvage
-1 kPa/s 97,54 68,55 29,00

II - Procédé de déshydratation de bactéries de levain.
- déshydratation des bactéries jusqu'à l'obtention de a^ = 0,29
a) Microorganisme et conditions de culture
L.plantarum L-73 est cultivée en milieu MRS (De Man et al, 1960, Journal of Applied Bacteriology 23(1), p. 130 - 135)) à 30°C, sous atmosphère d'azote.
La pression osmotique de ce milieu est ajustée à - 1,38 MPa à l'aide de glycérol (aw = 0,990).

b) Choc osmotique
Après une pré-culture de 12 h, suivie d'une culture de 24 h, en milieu MRS, 9 ml de suspension bactérienne sont centrifugés (5 min ; 2860 g).
Le culot cellulaire est alors remis en suspension à l'aide d'une solution eau-glycérol de pression osmotique connue ( π = 171 MPa ; aw = 0,290).

c) Rampes osmotiques
Après une pré-culture de 12 h, suivie d'une culture de 24 h, en milieu MRS (a^, = 0,990), 9 ml de suspension bactérienne sont centrifugés. Le culot cellulaire est alors remis en suspension dans 9 ml d'une solution eau- glycérol, à une pression osmotique de -1,38 MPa. 1 ml de cette suspension est mélangé à 3 ml d'un mélange eau-glycérol (aw = 0,990). 43 ml de glycérol pur sont ajoutés à différentes cinétiques par l'intermédiaire d'un pousse-seringue (Melsungen, Allemagne ; Razel, Etat-unis), afin d'atteindre une pression osmotique finale de 171 MPa (ε^ = 0,29).
Quatre cinétiques de variation de la pression osmotique sont testées :
0,0209 MPa/s (135 min)
0,0565 MPa/s (50 min)
0,1178 MPa/s (24 min)
0,2570 MPa/s (11 min)

d) Mesure de la viabilité cellulaire
La viabilité cellulaire est déterminée selon la méthode U.F.C. (unité formant colonie). Les dilutions sont réalisées dans une solution eau-glycérol de pression osmotique identique à la pression osmotique finale (171 MPa).
Pour chaque dilution, 100 μl sont inoculés sur milieu MRS agar (π = -1,38 MPa ; aw = 0,990) (3 boîtes par dilution) .
Les boîtes sont incubées 48 h à 30°C sous atmosphère d'azote.
Le taux de viabilité de chaque traitement est comparé à un contrôle, maintenu à la même pression osmotique (π = -1,38 MPa), mais également dilué.
Les résultats obtenus sont donnés dans le tableau suivant :

Rampes (Mpa/s)
Choc 0,2570 0,1178 0,0565 0,0209
(11 min) (24 mie) (50 min) (135 min
43% 73% 86% 88% 83%

% de 40% 78% 87% 90% 85% viabilité 40% 78% 91% 93% 88% L' examen de ces résultats montre que l ' augmentation de la pression osmotique du milieu externe par rampes permet d'augmenter significativement le taux de survie des bactéries obtenu lors du choc.
- déshydratation des bactéries jusqu'à l'obtention de aw = 0,17.
On opère comme indiqué ci-dessus, mais on effectue le choc osmotique en appliquant une pression de -245 MPa, l'a^ étant de 0,170. En outre, dans l'étape c), on mélange 1 ml de la suspension cellulaire avec 54 ml de glycérol pur, afin d'atteindre une pression osmotique finale de -245 Mpa (aw = 0,170).
Les résultats donnés dans le tableau suivant correspondent aux 2 cinétiques de variation de la pression osmotique indiquées ci-après :
- 0,0255 MPa/s (160 min)
- 0,0864 MPa/s (47 min).
Lors de la mesure de la viabilité cellulaire, selon l'étape d) , on réalise des dilutions dans une solution eau-glyrérol de pression osmotique identique à la pression finale (- 245 MPa).

Rampes (Mpa/s)
Choc 0,0864 MPa/s 0.0255 MPa/s
(47 min) (260 min)
17% 39% 52%%

% de 13% 40% 56% viabilité 16% Non effectué 46%

Ainsi, comme dans l'exemple précédent, on constate que l'application d'une cinétique lente de variation de la pression osmotique permet d'augmenter le taux de viabilité des cellules, par rapport à celui obtenu avec des cinétiques plus rapides ou en soumettant les cellules à un choc osmotique.