Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

Aller à Demande

1. WO1993018403 - PROCEDE D'IDENTIFICATION D'ANTICORPS NEUTRALISANT DES VIRUS DE MALADIES INFECTIEUSES

Note: Texte fondé sur des processus automatiques de reconnaissance optique de caractères. Seule la version PDF a une valeur juridique

[ RU ]

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ИНФЕКЦИОННОГО

ЗАБОЛЕВАНИЯ

Область техники

Предлагаемое изобретение относится к прикладной иммуно-логии и предназначено для диагностики инфекционных заболева-ний.

Предшествующий уровень техники

Существуют различные способы выявления антител к вирусу инфекционных заболеваний. Рассмотрим их на примере инфекци-онного вирусного заболевания под названием "Алеутская болезнь норок" (АБ) , которое наносит основной ущерб пушному зверовод-ству. Существующие в мире способы диагностики АБ технологич-ны, но обладают не очень высокой чувствительностью. Извест-ные высокочувствительные способы трудоемки, дороги, требуют для своего исполнения много времени, которое резко увеличивав ется при обследовании большого количества особей.

Известен радиоиммунный способ выявления антител к виру-су АБ, включающий сорбцию предварительно очищенных антител на пластиковом планшете, внесение вирусного антигена, внесение меченных 1?^ противовирусных антител исследуемого образца, проведение конкурентной реакции взаимодействия, и счет ради-оактивности. Чувствительность способа составляет 0,01мкг/мл. , длительность- для первой стадии от 12часов до недели, для следующих стадий 3-4часа (см. Aasted В. and Bloom М.Е.: Sen-setlve radlolmmune assay for measuring aleutlan disease virus antigen and antibody. J. Clin. Mlkroblol. 18. 637-644. 1983).

Недостатками известного способа являются его длитель-ность, трудоемкость, необходимость использования дорогого оборудования, специальных условий и навыков работы с радио-активной меткой.

Известен способ выявления антител к вирусу АБ методом встречного иммуноосмоэлектрофореза, включающий подготовку стеклянных пластин, покрытых гелем 0,7% агарозы, выбивание лунок в геле и заполнение лунок вирусным антигеном с катод- ной стороны, исследуемыми сыворотками - с анодной стороны, проведение реакции взаимодействия путем просмотра образугощих- ся линий преципитации (см. Cho H.J. , Ingram D.G. Antigen and antibody in Aleutian dlseas In mink. The reaction of antibody with the Aleutian desease agent using immunodiffusion and lmmunoelektroosmophoresls. Can. J. Сотр. Met 37, 217-223,1973).

Недостатками известного способа являются его недостаточ-но высокая чувствительность, составляющая Ι-Ю мкг/мл. , необ-ходимость использования специального оборудования, длитель-ность при массовом обследовании особей.

Наиболее близким к предлагаемому способу является имму-ноферментный способ выявления антител к вирусу АБ, включающий сорбцию предварительно очищенного вирусного антигена на твер-дофазный носитель (пластиковый планшет) в течение 12 часов при температуре 4°С, внесение сыворотки крови особей и прове-дение реакции взаимодействия антител исследуемой сыворотки крови и сорбированного антигена в течение 2 часов при темпе-ратуре 25°С, внесение фосфатазного коньюгата кроличьих анти-тел против иммуноглобулина особей, проведение реакции взаимо-действия в течение 2 часов при температуре 25°С, внесение субстратного раствора и регистрацию результатов реакции взаи-модействия по .фермент-субстратному окрашиванию, при этом пос-ле проведения каждой из реакций взаимодействия проводят от-мывку планшета буфером. Чувствительность способа составляет 0,1-1,0 мкг/мл. , длительность - 17 часов (см. Wright P.F..

Wllkie B.N. Detection of antibody in Aleutian disease of mink: Comparison of emzyme-1 inked immunosorbent assay and counter-immunoelectrophoresis, American Journal of Vet. Reterch, 43, 5, 865-868, 1982).

Недостатками известного способа являются его недостаточ- но высокая чувствительность, большая длительность, возмох-ность использования только сыворотки крови в качестве иссле-дуемого образца в объеме не менее 100 мкл., большая трудоем- кость при массовом исследовании.

Раскрытие изобретения

В основу настоящего изобретения положена задача упроще- ния известного способа, повышения его чувствительности, а так же расширения его функциональных возможностей.

Поставленная задача решается тем, что в способе выявле- ния антител к вирусу инфекционного заболевания, включающем нанесение исследуемых образцов на твердофазный носитель, про- ведение реакции взаимодействия антител исследуемых образцов с вирусным антигеном, и регистрацию результатов реакции взаимо-действия по субстрат-ферментному окрашиванию, в качестве твер-дофазного носителя используют твердофазный пористый носители способный связывать белки, вирусный антиген метят ферментом, исследуемые образцы в виде микрокапель точками наносят на по-верхность носителя, и высушивают, а реакцию взаимодействия ан-тител исследуемых образцов с вирусным антигеном осуществляют прямым взаимодействием меченного ферментом вирусного антигена с антителами исследуемых образцов.

Решению поставленной задачи способствует то, что твердо-фазный пористый носитель, способный связывать белки, исполь-зуют в форме листа или ленты предварительно разлинованных прямоугольной сеткой с цифровыми или буквенными обозначения-ми ее квадратов, каждый исследуемый образец помещают в квадрат сетки для образования матрицы пространственно разобщенных ми-кроточек исследуемых образцов, а в качестве твердофазного по-ристого носителя, способного связывать белки, используют пре-имущественно нитроцеллюлозу, а также то, что в качестве иссле-дуемых образцов используют любые биологические жидкости, по-тенциально содержащие антитела к вирусу инфекционного заболе-вания, а в качестве фермента используют непосредственно свя-занную с вирусным антигеном или опосредованно через различные лиганды в виде комплексов с антителами пероксидазу или фосфа-тазу или галактозидазу , и то, что вирусный антиген использу-ют преимущественно в виде антиген-биотин-стрептавидин-перок-сидазного комплекса. Причем в случае использования в качестве биологической жидкости, потенциально содержащей антитела к вирусу инфекционного заболевания, крови её предварительно разбавляют в 2-=-20 раз, например, фосфато-солевым буфером.

Лучший вариант осуществления изобретения

Исследуемые образцы любых биологических жидкостей инфи-цированных особей (норок) наносят в виде матрицы микроточек на твердофазный носитель, способный связывать белки, и высуши-вают при комнатной температуре. Носитель инкубируют в течение 30-60 минут при температуре 37 °С , либо при комнатной темпера-ратуре в блокирующем растворе, насыщающем свободную активную поверхность носителя. В качестве блокирующего раствора испо- льзуют любые биологические жидкости, не содержащие исследуе-мых компонентов (противовирусных антител) , способные качест-венно насытиь активную поверхность носителя. Преимущественно используют растворы 0,25-1,0 # желатина, либо растворы жела-.тина с сывортками крови животных. Реакцию взаимодействия свя-занных сносителем. антител исследуемых образцов с вирусным ан-тигеном проводят при покачивании в течении 30-60 минут при 37 °С в блокирующем растворе, содержащем вирусный антиген, ме-ченный ферментом. В качестве антигена в конкретном примере используют вирус алеутской болезни норок, выделенный из орга-нов и тканей инфицированных норок или из культуры клеток ин-фицир.ованной вирусом, адаптированным к росту на данной культу-ре клеток. После инкубации с антигеном т .ательно отмывают но-ситель в буфере, содержащем неионный детергент и проводят ре-гистрацию результатов взаимодействия в фермент-субстратном растворе. Результаты реакции оценивают по появлению окрашенных пятен на месте образцов, содержащих антитела к вирусу алеутс-кой болезни норок. В качестве исследуемого образца использу-гот любые биологические жидкости, потенциально содержащие анти-тела к вирусу - кровь, сыворотку крови, слюну, мочу, гомоге-наты органов и тканей норок, преимущественно используют кровь, разбавленную в 2-20 раз. В качестве твердофазного носителя используют твердофазные пористые носители, способные связывать белки - лавсан, поливинилендифторид , преимущественно испо-льзуют носители на основе нитроцеллюлозы. Носитель использу-ют в форме листа (ленты) , разлинованного (ой) в виде сетки. Нанесение индивидуальных образцов осуществляют в квадраты сет-ки, получая при этом матрицу пространственно разобщенных мик-роточек. В качестве фермента используют пероксидазу, фосфата-зу, галактозидазу , которые либо непосредственно связаны с ви-русным антигеном, либо опосредованно через различные лиганды в виде комплексов с антителами, биотин-стрептавидиновых ком-плексов. Преимущественно используют вирусный антиген в виде антиген-биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса. Чувст-вительность способа составляет 0,01-0,07 мкг/мл. Длительность способа для 100 образцов - 2 часа 15 минут. Длительность спо- соба для 1000 образцов - 2 часа 15 минут плюс время нанесения 1000 образцов. Например, носитель размером 45x45 мм имеет маркированную сетку для исследования 100 образцов. Нанесение образцов осуществляют точками в квадраты сетки. Обработка но-сителя предложенным способом выявила положительные пробы под 43, 53, 78. Использование 10 таких носителей позволяет од-новременно исследовать 1000 образцов, при этом, если на один носитель необходимо 1-2 мл рабочего раствора, то для 10 та-ких носителей нужно по 10-20 мл.

Существенными отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются следующие.

Исследуемые образцы непосредственно наносят на твердофаз-ный носитель, способный связывать белки. Нанесение осуществ-лягот точками по 0,2-0,5- мкл в квадраты сетки на поверхности носителя;' При этом возможно нанесение большого количества проб на небольшой по размерам носитель. Одновременная обработка не-скольких таких носителей позволяет упростить способ за счет возможности одновременного исследования от 50 до 5000 и более проб.

Прямое нанесение исследуемых образцов по 0,2-0,5 мкл на поверхность носителя позволяет расширить функциональные воз-можности способа за счет использования любых биологических жидкостей, потенциально содержащих антитела к вирусу.

Использование в качестве носителя любого твердофазного пористого носителя, способного связывать белки, позволяет ра-сширить функциональные возможности способа. Использование именно пористых носителей оправдано в связи с большой актив-ной поверхностью твердофазных пористых носителей по сравнению с просто твердофазными. Носители на основе нитроцеллюлозы или её смеси с другими целлюлозными эфирами удобны в использова-нии за счет достаточно высокой ёмкости и простоты обращения с ними.

Преимущественное использование крови, разбавленной в 2-20 раз, позволяет получить дополнительный положительный эф-фект за счет сокращения' расхода исследуемой пробы, а также увеличить разрешающую способность способа. Причем этот эффект тем значительнее, чем меньше свободных антител в исследуемом образце крови. При нанесении разбавленной крови разрешающая способность способа выше, пятна положительной реакции ярче и чётче очерчены.

Проведение реакции прямым взаимодействием сорбированных на носителе антител исследуемого образца с вирусным антигеном, меченным ферментом, что позволяет упростить известный способ за счет сокращения количества специфических стадий, необходи-мых для его осуществления.

Мечение вируса ферментом опосредованно через различные лиганды позволяет получить дополнительный положительный эффект за счёт повышения чувствительности способа, так как при этом на конечной стадии анализа образуется иммунохимический комп-лекс, в котором на одну молекулу антитела приходится несколь-ко десятков молекул фермента.

Использование в качестве вирусного антигена, меченного ферментом, антигена в виде биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса позволяет повысить чувствительность способа с 0,1 мкг/мл (прямое мечение пероксидазой) до 0,01 мкг/мл (мечение биотином и образование комплекса антиген-биотин-стрептавидин-фермент). Мечение вируса биотином позволяет расширить функци-ональные возможности способа за счёт универсальности данного вещества, так как в качестве коньюгата можно использовать лю-бой авидин- или стрептавидин-ферментный коньюгат. Для получе-ния антиген-биотин-стрептавидин-ферментного комплекса на ста-дии взаимодействия антиген-антитело в рабочий раствор добав-ляют биотинилированный антиген в концентрации, равной или пре-вышающей концентрацию коньюгата. Оптимально использовать стре-птавидин-ферментный коньюгат в концентрации 0,002-0,004 мг-мл. В качестве лиганда можно также использовать моноклинальные антитела, что позволяет дополнительно повысить чувствитель-ность способа, во-первых, за счёт увеличения количества фер-ментной метки, во-вторых, за счёт снижения не специфической о связывания (по сравнению с использованием поликлональных ан-тител) .

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными приме-рами.

Пример I. Сыворотку крови 100 особей норок по 0,5 мкл наносят апиляром точками на поверхность разлинованного на квадраты листа 50x50 мм нитроцеллюлозы. Квадраты имеют поряд-ковые обозначения для удобства нахождения нужной пробы.

Лист с нанесенными образцами высушивают при комнатно темпе-ратуре, а затем инкубируют в течение 45 минут в 2 мл 0,5 % раствора желатина, содержащего 20 % сыворотки крови барана. Реакцию взаимодействия проводят в 2 мл блокировочного раство-ра, содержащего биотинилированный вирусный антиген в концент-рации 0,005 мг/мл .и стрептавидин-пероксидазу в концентрации 0,0025 мг/мл, тритон Х-ЮО до 0,05 %. Лист инкубируют в дан-ном растворе 60 минут при 37 °С . Затем носитель отмывают 5 раз по 4 минуты раствором 0,1 М бикарбоната натрия, содержащем

0,1 % тритон Х-ЮО. После 2 минут инкубации в субстратном ра-створе, содержащем 0,01 % Н20г, 0,05 % ДАБ в 0,05 М трис-0,05 М имидазольном буфере рН 7,4, пробы, содержащие антитела к ви-русу АБ, окрашиваются в коричневый цвет и проявляются в виде пятна в определенном квадрате. Чувствительность способа -0,07 мкг/мл, продолжительность - 2 часа 15 минут.

Пример 2. Способ осуществляют аналогично примеру I за исключением того, что в исследование берут 1000 образцов кро-ви особей норок. На 10 листов размером 50x50 мм по 0,5 мкл наносят исследуемую кровь. Далее одновременно в одних и тех же емкостях проводят необходимые для осуществления споба опе-рации. Концентрации реагентов остаются как в примере I, а объ-ём увеличивается пропорционально числу носителей. Так, для 10 носителей необходимо по 20 мл блокировочного раствора и раст-вора для проведения реакции взаимодействия. Чувствительность способа - 0,07 мкг/мл, длительность - 3 часа.

Пример 3. Способ осуществляют аналогично примеру I, за исключением того, что в качестве твердофазного носителя ис-пользуют пористые мембраны на основе поливинилендифторида.

Перед нанесением мембрану смачивают метанолом. В качестве бло-кировочного раствора используют 0,5 % желатин. Реакцию взаи-модействия проводят в 0,25 % желатина. Чувствительность спо- соба - 0,01 мкг/мл, продолжительность для 100 образцов - 2 ча- са 15 минут.

Пример 4. Способ осуществляют аналогично примеру I, за исключением того, что в качестве исследуемой жидкости исполь- зуют 100 образцов слюны особей норок. Чувствительность спосо- ба - 0,07 мкг/мл, но пятна окрашены слабее, продолжительность - 2 часа 15 минут.

Пример 5.- Способ осуществляют аналогично примеру I, за исключением того, что в качестве коньгогата используют стреп-тавидин, меченный В-галактозидазой. В блокировочный раствор на стадии взаимодействия антиген-антитело добавляют стрепта-видин, меченный В-галактозидазой, в концентрации 0,006 мкг/мл. Чувствительность способа - 0,01 мкг/мл, продолжительность для 100 образцов - 4 часа. Время увеличилось за счёт более длите-льного проявления в субстратном растворе.

Пример 6. Способ осуществляют аналогично примеру I, за исключением того, что реакцию взаимодействия проводят в раст-воре содержащем неочищенный вирусный антиген и противовирус-ные моноклональные антитела в концентрации 10 мкг/мл, мечен-ные пероксидазой. Чувствительность способа - 0,07 мкг/мл, продолжительность - 2 часа 15 минут.

Пример 7. Способ осуществляют аналогично примеру 2, за исключением того, что в качестве исследуемой жидкости исполь-зуют кровь особей норок, разбавленную водой в 20 раз. Разре-шающая способность способа в этом случае выше, пятна чётче очерчены и ярче. Чувствительность способа - 0,07 мкг/мл, про-должительность для 1000 образцов - 3 часа.

Промышленная применимость

Предлагаемый способ предназначен для диагностики инфек-ционных заболеваний, характеризуется высокой чувствительнос-тыо и технологичностью, позволяет проводить массовые обследо-вания в том числе в труднодоступных районах. Для осуществле-ния способа не требуется дорогостоящее сложное оборудование. Достоинством предлагаемого способа является возможность ис-пользования любых биологических жидкостей, потенциально со-держащих антитела к вирусу инфекционного заболевания. Для ре-ализации способа не требуется персонал высокой квалификации. Предполагается освоение промышленного выпуска специальных на-боров на различные количества исследуемых образцов.