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1. WO1992018532 - ARN, ADN ET PROTEINE ANTIGENIQUE VIRALE DU VIRUS DE L'HEPATITE NON-A, NON-B

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[ JA ]
明 細 書

非 A非 B型肝炎ウィルスの RNA、 DNA及びウィルス抗原蛋白質 〔産業上の利用分野〕

本発明は非 A非 B型肝炎ウィルスに関連する抗原ポリべプチドおよびそれ をコードする DNA断片並びに抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗体に関する。さら には、抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗体、非 A非 B型肝炎ウィルス抗原および 非 A非 B型肝炎ウィルス遺伝子の検出方法に関する。

〔従来の技術〕

非 A非 B型肝炎は、現在、輸血後肝炎の約 95%を占めると考えられており 、該ウィルス感染者を検出して輪血用血液から除外ずることや、予防用ワク チンの開発が強く望まれている。近年、 Houghtonらは、該ウィルス遺伝子を 分離したと発表し(特開平 2— 500880号)、該ウィルス抗原を用いた E I A による抗体検出試薬を販売するに至っている。この抗体検出試薬の適用によ り、輸血後非 A非 B型肝炎予防に対する期待が寄せられているが、陽性の供 血者血液を除外しても、その肝炎発症率は 5〜7 %であり、未だ消滅を見る に至っていない。

その原因として考えられることは、該ゥィルス感染と抗体産生の関係がま だ明らかになっていないということもさることながら、該ウィルスゲノムの 核酸配列にかなりの異質性があるらしいということがある。この点について は、 Houghtonらの発表した核酸配列を元に、 P C R法やブライマーェクステ ンション法などにより該ウィルスゲノム c-DNA をクローニングした多数の実 験の結果 (Kubo et. al. , Nucleic Acid Research 17, 10367 一 10372, 1989 、 Kato et. al. . Proc. Japan Acad. , 65B, 219-223, 1989、 Maeno et. al. , Nuc leic Acid Research, 18, 2685-2689, 1990、 Kato et. al. , Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 87. 9524-9528, 1990) から明らかである。このように、非 A非 B型肝炎の診断、並びに輪血による非 A非 B型肝炎発症の予防は未だ完全と 言えず、遺伝子診断を含めた新しレ、診断法の開発が望まれている。

また、本発明者のひとりである有馬暉勝は、 Houghtonらとは独立して同時 期に、ヒト患者血清を RNAソースおよび抗体ソースとして、ィムノスクリ一 ニング法で HCV (肝炎 C型ウィルス)の core領域のェピトーブのひとつをク ローン化している(Arima et al. , Gastroenterologia Japonica, 25, 218-22 2, 1990)。

〔本発明の開示〕

本発明は、新規な非 A非 B型肝炎ウィルスの抗原ポリペプチドおよびそれ をコードする DNA の提拱と、さらにこれらを用いる非 A非 B型肝炎の診断方 法、診断試薬の提供を目的とする。

本発明者らは、上記の現状を鑑み、非 A非 B型肝炎ウィルスの研究を開始 した。 s-GPT高値を示す日本国内の供血者血漿を原料として鋭意研究の結果 、これまで報告されたウィルスとは異なる新しい夕イブの非 A非 B型肝炎ゥ ィルス由来の DNA の単離、構造確認に成功した。さらに、これら DNA および それがコードするボリペプチドを用いて非 A非 B型肝炎の診断、予防、治療 を行ない得ることを見い出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は非 A非 B型肝炎ウィルス遺伝子 RNA に相同的な部分 DNA (配列番号 1 , 2および 3 ) 、それらがコードする非 A非 B型肝炎ウィルス抗原ボリべ プチド(配列番号 1 , 2および 3 ) およびこれら抗原ポリペプチドを抗原と するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を提供するものである。

即ち、本発明は、下記の配列 1 , 2および 3の非 A非 B型肝炎ウィルス抗 原ポリべプチドの、全部または一部を含有してなるポリべプチドである。 配列 1

GG GTT ATC TGC TGC TCC ATG TCA TAC TCC TGG ACG GGG GCC CTC ATA 47

Val l ie Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu l ie

1 5 10 15

ACA CCA TGT GGG CCT GAG GAG GAG AAG TTA CCG ATC AAC CCT CTG AGC 95

Thr Pro Cys Gly Pro Glu Glu Glu Lys Leu Pro l ie Asn Pro Leu Ser

20 25 30

AAC TCG CTC ATG CGA TTC CAT AAC AAG GTG TAC TCC ACA ACC TCG AGG 143

Asn Ser Leu Met Arg Phe His Asn Lys Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg

35 40 45

AGT GCT TCT CTG AGG GCG AAG AAG GTG ACC TTT GAC CC 181

Ser Ala Ser Leu Arg Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp

50 55

配列 2

ACA ACT CTT ACC ATG ATC CTC GCC TAT GCT GCT CGT GTT CCT GAG CTG 48

Thr Thr Leu Thr Met l ie Leu Ala Tyr Ala Ala Arg Val Pro Glu Leu

1 5 10 15

GTC CTT GAA GTC ATC TTC GGC GGT CAT TGG GGT GTG GTG TTC GGC TTG 96 Val Leu Glu Val lie Phe Gly Gly His Trp Gly Val Val Phe Gly Leu

20 25 30

GCC TAC TTC TCC ATG CAG GGA GCG TGG GCC AAG GTC ATC GCC ATC CTC 144 Ala Tyr Phe Ser Met Gin Gly Ala Trp Ala Lys Val lie Ala He Leu

35 40 45

CTC CTT GTC GCA GGA GTA GAT GCA GAC ACC TAT ACC ACC GGC GGA CGA 192 Leu Leu Val Ala Gly Val Asp Ala Asp Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Arg 50 55 60

GCG GGT TCT GAC ATG TAC TCG CTT GCT AGC CTT TTC AGC TCT GGT CCC 240 Ala Gly Ser Asp Met Tyr Ser Leu Ala Ser Leu Phe Ser Ser Gly Pro 65 70 75 80

CGG CAG CAC ATT GAC CTA ATC 261 Arg Gin His lie Asp Leu lie

85

配列 3

CC GAG GAG GAG AAG TTG CCA ATC AAT CCT TTG AGT AAT TCG CTC GTG 47 Glu Glu Glu Lys Leu Pro lie Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Val 1 5 10 15

AGG TTT CAC AAC AAG GTG TAC TCC ACA ACC TCA AAG AGC GC 88 Arg Phe His Asn Lys Val Tyr Ser Thr T r Ser Lys Ser

20 25

さらに本発明は、上記のポリペプチドをコードする、上記配列 1, 2およ び 3の DNA の全部または一部を含有してなる DNA、上記ポリペプチドを抗原 とするボリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、試薬の構成成分とし て、上記の DNA をブライマーとして用い、非 A非 B型肝炎ウィルス由来の DN A を増幅させ検出することを特徴とする非 A非 B型肝炎ウィルス ¾伝子の検 出方法、上記の抗原ポリペプチドを用い、免疫学的手法により、試料中の抗 非 A非 B型肝炎ウィルス抗体の存在を確認する抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗 体検出方法、上記の抗体を用い、免疫学的手法により、試料中の非 A非 B型 肝炎ウィルス抗原の存在を確認する非 A非 B型肝炎ウィルス抗原検出方法及 び上記の抗原ポリべプチドを用いて製造された非 A非 B型肝炎ワクチンをも 提供する。

従って、本発明には、本発明の DNA の部分オリゴヌクレオチドをプライマ 一として用い、非 A非 B型肝炎ウィルス由来の DNA を増幅させ検出すること による非 A非 B型肝炎ウィルス遺伝子の検出方法も含まれる。

また、本発明には、本発明の DNA に相同的な RNA も含まれる。

なお、本発明オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドは、少なくとも 10個 の塩基またはアミノ酸(長さ)を含む。

本発明の構成は以下の通りである。

(1) 非 A非 B型肝炎ウィルスの RNA の調製

非 A非 B型肝炎ウィルス RNA の抽出原料としては、 S- GTP値が高値を示す 供血者の血漿を用いることができる。ウィルス面分は、公知の方法に従い、 ボリエチレングリコール添加後遠心分離操作により採取する。このウィルス 面分からの RNA の抽出、精製は、例えばグァニジンチオシァネート、界面活 性剤、キレート剤および還元剤の混合溶液にてウィルス面分からの抽出を行 つた後、フエノール抽出、有機溶媒分面 (Chamezynski et al, Anal, Bioc hem. , 162^ 156, 1987) 、次いで密度勾配超遠心操作により精製 RNA を得る 方法で行うことができる。

(2) 2本鎖 DNA の調製とクローニング

得られた RNA を铸型として用い、ランダムブライマー、逆転写酵素、 DNA ボリメラ一ゼ等を用いる cDNA合成法 (Gubler, ϋ. et al. Gene, 25. 263, 19 83) などの常法により、 2本鏆 DNA を調製することができる。

このようにして得られた 2本鎖 DNA を、常法に従い、パクテリオファージ 、例えば A zap 、 A gtllなどに組み込んだ後、大腸菌を支持菌として培養、 スクリーニングすることにより、目的とするクローンを得ることができる。

2本鏆 DNA をファージベクターに組み込む方法としては、例えば Hyunh, T. V . らの DNA Cloning, a practical approach, _ 1, 49 (1985) に記載の方法な どが挙げられる。

目的とするクローンのスクリーニング法は、公知の方法に準ずればよく、 例えば λ gt 11ファージベクターに 2本鎖を組み込んだ場合、そのベクターを B. coliY1090 に感染させ、形成されたプラーク中に含まれるポリペプチドを ニトロセルロース膜に転写し、次いで、該転写膜を、非 A非 B型ウィルス肝 炎患者血清を該ウイルスの抗体源として用レ、る免疫学的手法によるスクリー

二ングに供する方法が挙げられる。

ただし、この方法では、非 A非 B型肝炎ウィルスの全 DNA を解析すること は難しい。それゆえに、以下の方法を適用することもできる。

すなわち、まず、前記の方法で非 A非 B型肝炎ウィルスに感染しているこ とが確認された患者の新しい血漿から RNA を調製する。次に、これを铸型と して作成した 1本鎖 DNA と既知の構造を有する適切なブライマーを用い、常 法の PCR 法により DNA を増幅させ、サブクローニングすることにより、非 A 非 B型肝炎ウィルス由来の DNA を得ることができる。プライマーは、既知の 非 A非 B型肝炎ウィルス DNA配列をもとにして、よく保存されている部分を 適宜選択してォリゴヌクレオチドを合成し、プライマーとして用いることが でき、通常は 10〜30個の塩基配列からなる断片がプライマーとして用いられ る。

塩基配列の構造は、マキサム,ギルバート法 (Maxam, A. M. and Gilbert , W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560. 1977)あるいはジデォキシ法 (Messing, J. et al, Nucl. Acids Res. , _9, 309, 1981) によって決められ る。

本発明の非 A非 B型肝炎ウィルス DNA の部分塩基配列は、配列番号 1およ び 2に示されるが、それらにホモロジ一のある配列について、 SDC GENETYX (SDCソフトウェア開発株式会社、東京)を用いて検索した。その結果、 GenB ank データベースで、それらに 60%以上のホモロジ一のある配列は見つから なかった。既に報告されている非 A非 B型肝炎ウィルス DNA の塩基配列との 比較では、 Houghtonらの報告した配列(HCV-US) (特開平 2— 500880号)と 塩基レベルで 69.5%、アミノ酸レベルで 79. 7%、加藤らの報告した配列(HC V-J) (Kato et. al. , Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524— 9528, 1990) とは 核酸レベルで 71.8%、ァミノ酸レベルで 83. 1%のホモロジ一があった。

(4) 抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗体の検出

本発明の非 A非 B型肝炎ウィルス抗原ポリべプチドまたはその一部を用い て、生体試料、例えば患者血清中の抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗体の有無を 免疫学的手法により検定することができ、該ウィルス感染診断が可能である。 免疫学的手法としては、公知の方法が適用でき、公知の方法として、例えば 酵素免疫法、放射性免疫法、ウェスタンプロット法、能動凝集法、ラテック ス凝集法、化学発光免疫法などが挙げられる。

(5) 抗非 A非 B型肝炎ウィルスボリペプチド抗体の作成

本発明の非 A非 B型肝炎ウィルスポリべプチド、またはその一部を抗原と して抗体を作製することができる。抗非 A非 B型肝炎ウィルスボリぺプチド のボリクローナル抗体は、常法に従い、マウス、モルモット、ゥサギなどの 動物の皮下、筋肉内、腹腔内、静脈に抗原を複数回接種し、十分に免疫した 後、該動物から採血、血清を分雜することにより得ることができる。モノク ローナル抗体についても公知の方法により作製することができる。例えば、 該ボリべプチドまたはべプチド断片で免疫したマウスの脾細胞と市販のマウ スミエローマ細胞との細胞融合により得られるハイプリドーマを作製後、こ のハイプリドーマ培養上清またはこのバイプリドーマを腹腔内投与したマウ スの腹水から、非 A非 B型肝炎ウィルスポリペプチドのモノクローナル抗体 を調製することができる。なお、動物に免疫する際には、市販のアジュバン トも使用できる。

これら抗体は、公知の免疫学的手法による生体試料中の非 A非 B型肝炎ゥ

ィルス抗原の同定、定量を可能とする。すなわち、これら抗体は、非 A非 B 型肝炎ウィルス抗原の診断試薬として利用できる。

(6) 非 A非 B型肝炎ウィルスの遺伝子解析

これまでに、非 A非 B型肝炎ウィルスに関する報告として、前記の Hought onらの報告 (HCV-US) 、加藤らの報告 (HCV-J ) 、岡本らの報告 (HCV-J6) 、さらに本発明のウイルスを含めて 4種類の報告があることからも明らかな ように、非 A非 B型肝炎ウィルスには、幾つかのサブタイプが存在すること が知られている。

前記した如く、生体試料中の本発明のウィルスに対する抗体または該ゥィ ルス抗原ボリべプチドの免疫学的検定法は、該ウィルス感染診断方法として 有用ではあるが、各ウィルスサブタイプを同定、判定することは難しい。 配列番号 1の DNA は、ウィルスの非構造蛋白質をコードする領域の一部に 相当し、配列番号 2の DNA は、構造蛋白質をコードする領域の一部に相当す る。非 A非 B型肝炎ウィルスの各サブタイプの DNA塩基配列を本発明の DNA の塩基配列と比較すると、ホモロジ一は 60〜70%とかなり低い。この事は、 非 A非 B型肝炎ウィルスのこの部分の DNA塩基配列をもとにして、適切なォ リゴヌクレオチドをブライマーとして用いる遺伝子解析法を行うことにより 、非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイプの型別判定が可能であることを示す。 具体的には、常法に従い、生体試料例えば検体血漿より調製した RNA を畴 型として用い、適切なアンチセンスプライマー、センスプライマ一および逆 転写酵素を用いる RT— PCR 法により DNA を増幅させ、その DNA を解析するこ とにより、非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイプの型別判定ができる。プライ マ—は、各サブタイプウィルスの DNA塩基配列に基づいて適宜選択すればよ

く、所定のサイズの DNAが増幅されたかどうかをポリアクリルアミドゲルま たはァガロースゲル電気泳動で調べることにより、該ウィルスの型別判定が できる。また、ブライマーの中間に位置する各サブ夕イブウィルスの標識合 成オリゴヌクレオチドをプローブとして使用することにより、その確認をす ることもできる。

また、増幅させた DNA の構造を解析する際は、必要に応じて適切なベクタ —に該 DNA を組み込み、それを適切な宿主に導入、複製させるとよい。これ により、塩基配列の解析が可能である。

さらに、本発明の非 A非 B型肝炎ゥィルスボリぺブチドを用いることで、 ワクチンの作製が可能であり、該ワクチンは、非 A非 B型肝炎治療剤として 使用できる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を詳細に且つ具体的に説明するが、本発明はこ れらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

血漿からの非 A非 B型肝炎ウィルス RNA の調製

S-GPT高値を示す日本国内の供血者血漿 9. 85リットルを用い、終濃度 4 % となるように PEG4000 を加え、室温で 30分〜 40分撹拌溶解した。 4てで 1夜 静置した後、 3, 300rpmで 30分間遠心し、沈渣としてウィルスを濃縮した。 次いで、 AGPC法 (Chamezynski and Sacci, Anal. Biochem. , 162, 156 - 15 9, 1987)及び、 Cs-TFA超遠心法 (Okayama et. al. , Method Enz. , 154E, 3 -28, 1987) に従い、 RNA を調製した。即ち、得られた沈渣に対して 2容 の 6 M D溶液(6 M Guanidine isothiocyanate, 0. 75% Sarcosy 1, 37. 5πΛί クェン酸ナトリウム(PH7.0)) と終濃度 0.7%となるように 2—メルカプト エタノールを加え、よく混和した。これに 0.1 容の 2Μ酢酸ナトリウム(ρΗ4 ) . 1容の水飽和フエノール、 0.2容のクロ口ホルム一イソアミルアルコー ル (49 : 1 ) を加えて混和し、氷上に 15分間静置した後、 4でで 8000rpm、 20分間の遠心をし、水層を別の容器に移すというフエノール抽出操作を 3度 行った。この水層に 1容のイソブロバノールを加え、一 20°Cに数時間以上放 置した後、 4でで 8000rpm、 20分間の遠心をし、沈澱を回収するというイソ プロパノール沈澱を行った。沈殿を少量の 4 M D溶液一 0.7 % 2—メルカプ トエタノールに溶解し、それを 1.02gZmlトリフルォロ醉酸セシウム一 0.1 M EDTA溶液に重層し、 25でで 35, OOOrpm、 12時間の遠心をして沈澱を得た。 この沈澱を少量の 4M D溶液一 0.7 %2—メルカブトエタノールに溶解し、 イソプロパノール沈藪を行い、 RNAを調製した。

実施例 2

c-DNA ライブラリーの作

BRし社 (Bethesda Research Laboratories Life Technologies Inc. Gait her-sbuog)の c-DNA Synthesis System (8267SA)を用い、そのマニュアルに 従って c-DNA合成を行い、同じく BRL社の c-DNA Cloning System AgtlO a nd ;igtll(8285SA)を用い、そのマニュアルに従って; I gtllベクタ一に 2本 鎖 c-DNA を組み込んだ。 In Vitro Packagingは、 Stratagene社 (Stratagene .La Jolla)の GigapackTM Gold II Packaging Extractを用いて行った。具体 的には、まず、铸型 RNA にランダムプライマーを加え、逆転写酵素を用いて 1本鎖 c-DNA を合成した。次に、 RNase H、大腸菌 DNA Polymerase I、大 腸菌 DNA Ligase を用いて 2本鎖 c-DNA を合成した。得られた 2本鎖 c-DNA を EcoRI Methylaseで処理して、 c-DNA内部の EcoRI 切断部位をメチル化し た後、 T4 DNA Polymerase を用いて末端を平滑化した。この平滑末端に、 T4 DNA Ligase を用いてリン酸化された EcoRI リンカーを接続した。 EcoRI で 余分なリンカ一を切断した後、ゲルろ過で EcoRI リンカ一を除去した。得ら れた EcoRi切断末端を持つ 2本鎖 c-DNAを、 T4 DNA Ligase を用いて; I gtll ファージのアーム DNA に接続した。得られた組換えファージ DNA を、 In Vit ro Packaging Extract と室温で混合することにより、組換え体ファージを 得た。

実施例 3

ィムノスクリーニング

支持菌として E. coli Y1090を用い、常法に従い、;i gtll組換えファージの ブラ一クを形成させた。 lOmM IPTG (Sigma社)に浸しておいたニトロセル口 ースフィルタ一(Schleicher & SchueIL BA85) をプラークの上にのせ、 37°C でさらに 3時間培養した。ニトロセルロースフィルターを TBS(pH7. 5 ) (10 mM Tris-HCl. 150mM NaCl)で 4回洗浄した後、 5 %スキムミルク溶液( 5 % スキムミルク, 0. 05% Tweenを含む TBS)に浸して 4 eCで 1夜弱く振gした。 非 A非 B型肝炎患者 10名の血清を等量ずつ混合し、そこにその総量と等量の 大腸菌 Y1090溶菌液を加えて室温で 60分間振盪した後、 3, 000rpm. 30分間遠 心して得た上清を 5 %スキムミルク溶液で 10倍希釈したものを 1次抗体液と して用いた。プラークを転写したニトロセルロースフィルタ一に 1次抗体液 を加え、 4。Cで 1夜弱く振盪した。このニトロセルロースフィルターを、 TB S-0. 05% Tweenを用いて室温で 5分間洗浄する操作を 2回繰り返した後、酵 素標識した 2次抗体液として、 Anti human IgG(Fc) (Goat)-Peroxidase conj ugateCCappel社)を TBS-0. 05% Tweenで 500 倍希釈したものを用意し、ここ にニトロセルロースフィルターを入れ、室温で 2時間弱く振盪した。この二 トロセルロースフィルターを TBS-0.05% Tweenを用レ、て室温で 5分間洗浄す る操作を 2回繰り返した後、基質液(TBS(pH6.5)を 10^、 3呢 ^ 4—クロ ロー 1一ナフトールノメタノール液を 2 、 3 %過酸化水素水溶液(過酸化 水素水)を 40 _βの比率で混合したもの)にニトロセルロースフィルターを 入れ、室温で振盪した。発色の停止は、フィルターを蒸留水で洗浄すること によって行い、陽性クローンを 10個選択した。

塩基配列の決定

塩基配列の決定は、常法通り、 M13ファージを用いた Dideoxy Terminatio n 法で行った。実際には、 USB社 (Uni ted States Biochemical Corporatio n, Cleve-land) ©Sequenase version 2. 0 Labeled dCTP Editionを用い、同 マニュアルに従って行った。

その結果、配列番号 1に示す通り、新規な非 A非 B型肝炎ウィルスの非構 造蛋白質をコードする塩基の部分 DNA であることを確認した。また、この塩 基配列からコードされたァミノ酸配列も、同配列番号に記載した如く演繹さ れた。

なお、該 c-DNA を組み込んだファージ λ ΕίΙΙを E. col i Y1088株に導入した Escherichia coli 2-22- i gtllは、通商産業省工業技術院微生物工業技術研 究所特許微生物寄託センタ—(〶 3 0 5日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号)に、受託番号:微ェ研菌寄第 12899号(FERM P-12899) として、平成 4年 3月 24日付で寄託されている。

実施例 4

ブライマーを用いる非 A非 B型肝炎ウィルス DNA のクローニング

実施例 3により該ウィルスゲノ厶を有することが明らかになつた血漿検体 より RNA を調製した。ブライマーは、加藤らの報告(Kato et al, Proc, Na tl. Acad. Sci. USA, 87, 9524, 1990) の HCV-J の塩基配列から、センスブ ライマーとして 1289— 1309位、アンチセンスプライマーとして 1572— 1592位 を選択し、各々の合成オリゴヌクレオチドを用いて常法により PCR を行なつ た。この際、各ブライマーの 5 ' 端には、 M13mpl8および M13mpl9にクロー 二ング可能な制限酵素認識配列、すなわちセンスブライマーには Smalおよび BainHi の認識配列、アンチセンスブライマーには Pstlおよび Sai lの認識配列 を付加して使用した。

PCR で増幅した DNA を各制限酵素で切断した後、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動にかけ、当該バンドを切り出し、 DNAを抽出した。抽出した DNA を 、常法に従い、 M13mpl8および M13mpl9にサブクローニングし、塩基配列を 解析した結果、核飄は、配列番号 2に示す如く、新しい非 A非 B型肝炎ゥ ィルスの構造蛋白質をコードする領域の部分 DNAであった。また、この塩基 配列からコードされるアミノ酸配列も、同配列番号に記載した如く演繹され た。

該 c-DNA を含む M13mpl8を制限酵素 Sma〖および BaraHI にて処理し、該 c-DN A部分を切り出し、ブラスミド pUEX3 に組み込んだ。このブラスミドで E. co l i 皿 5 α株を形質転換させた形質転換体 Escherichia col i env-pUEX3は、通 商産業省工業技術院微生物工業技術研究所特許微生物寄託センター(〶3 0 5日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号)に、受託番号:微ェ研菌寄第 12 900号 (FERM P-12900) として、平成 4年 3月 24日付で寄託されている。

実施例 5

非 A非 B型肝炎ウィルス抗原に対する抗体検出による該ウィルス感染の診断 本発明で得られた C-DNA を組み込んだ; I gtl lファージ(2— 22) と野生型 の λ 8ΐ11ファージを約 1 : 2の比率で混ぜ、支持菌としては E. col i Y1090を 用い、常法に従いプラークを形成させた。 lOmM IPTG (Sigma社)に浸してお いたニトロセルロースフィルター(Schleicher & Schuel l, BA85) をブラーク の上にのせ、 37ででさらに 3時間培養した。ニトロセルロースフィルターを

TBS (pH7. 5)で 4回洗浄した後、それを 5 %スキムミルク溶液に浸して 4 eC で 1夜弱く振盪した。非 A非 B型肝炎患者、 B型肝炎患者、健常人の各々の 血清検体に各々等量の大腸菌 Y1090溶菌液を加え、室温で 60分間振盪し、 3, OOOrpm, 30分間遠心して得た上清を 5 %スキムミルク溶液で 10倍希釈したも のを 1次抗体液として用いた。プラークを転写したニトロセルロースフィル ターを 3麵幅のストリップにしたものに 1次抗体液を加え、 4でで 1夜弱く 振盪した。このニトロセルロースフィルターを TBS-0. 05% Tweenを用いて室 温で 5分間洗浄する操作を 2回繰り返した後、 2次抗体液として、 Anti hu man IgG(Fc) (Goat)-Peroxidase conjugate (Cappel 社)を TBS-0. 05% Twe enで 500 倍希釈したものを調製し、ここにニトロセルロースフィルタ一を入 れ、室温で 2時間弱く振盪した。ニトロセルロースフィルターを TBS- 0. 05%

Tweenを用いて室温で 5分間洗浄する操作を 2回繰り返した後、基質液(TB S(pH6. 5)を 10 、 3 mg/ 4—クロロー 1一ナフトール/メタノール溶液を 2 m£、 3 %過酸化水素を 40〃 ^の比率で混合したもの)にニトロセルロース フィル夕一を入れ、室温で振盪した。発色の停止は、フィルターを精製水で 洗净することによって行った。

野生型 A gtllファージのプラーク部位と組換え; I gtllファージ(2— 22) のプラーク部位の発色に差がある場合を陽性、差のない場合を陰性と判定し た。その結果を表 1に示した。表中 2— 22が本発明による方法であり、 C100 -3が Houghtonら(特開平 2— 500880号)の方法による結果である。 C100-3は 、非 A非 B型肝炎患者血清 12検体中 8検体が陽性を示しているが、 B型肝炎 患者血清に対しても 5検体中 3検体が陽性を示し、特異性が明確でない。一 方、本発明の方法 2 - 22では、非 A非 B型肝炎患者血清 12検体中 7検体が陽 性を示し、 B型肝炎患者血清には陰性を示し、特異性の点で本発明による方 法がはるかに優れている。


実施例 6

合成ぺブチドによる抗非 A非 B型肝炎ウィルス抗体の検出

実施例 5は配列番号 1の DNA を組み込んだ; I gtllを使用しているので、配 列番号 1の全構造を含むポリべプチドを抗原とする抗ウィルス抗体の測定で ある。しかし、全構造を含むポリペプチドを使用するより、その構造の中で 抗原性の高いぺプチド部分を選択し、その部分の合成べプチドを抗原とする ELISA法によって抗体を検出する方法の方が、簡便かつ実用的であるので、 ェピトーブの決定を行なつた。

配列番号 1のポリペプチドアミノ酸配列をもとに、 1一 20位、 11一 30位、 21— 40位、 31— 50位および 41一 59位に相当するペプチドを合成し、ェピトー ブ部位決定に供した。抗ウィルス抗体の検出は、常法の ELISA法にて行なつ た。すなわち、各合成ペプチドでコートしたゥエルに、実施例 5で陽性と判 定された検体血清を加えて反応(37で、 1時間)、洗浄後、アルカリフォス ファターゼ標識抗ヒト IgG抗体を反応(37で、 1時間)、洗浄、次いで酵素 基質 P-二トロフヱニルフォスフヱートを加えて 37で 30分間反応させた後、波 長 405nm における吸光度を測定した。

その結果、表 2に示すごとく、 11一 30位合成ペプチドが最も高い抗原活性 を示した。このことから、 11一 30位またはそれを含む合成ペプチドを抗原と して用いることにより、抗非 A非 B型肝炎ゥィルス抗体の検定が可能である。

表 2


実施例 7

非 A非 B型肝炎ウィルスゲノムの検出

プライマーとして配列番号 1記載の塩基配列 39〜60位のセンスコドン部と 149 -172位のアンチセンスコドン部の合成オリゴヌクレオチドを用いた。 非 A非 B型肝炎ウィルス感染高危険群のヒト血漿 1; ^より、実施例 1の方 法により RNA を調製した。得られた RNA の 1/6量を用い、常法に従い RT-PCR を行った。 c-DNA合成は、 lOmM Tris-HW (pH8.3) 、 50mM KC£, 2mM MgC 、 200mM dNTPs、 0.01% gelatin^ 20 units Placental RNase inhibitor, lOOmMアンチセンスブライマ一、 100 units Murine逆転写酵素という反応組 成で、 37°Cにて、 30分間行った。 c-DNA合成後、それを 95°C、 5分間の保温 で熱変性させ、続いて PCR を行った。 PCR の反応組成は、 lOra Tris-HC ( pH8.3)、 50m KC、 1.5mM MgC£2 、 200ra dNTPs、 0.01% gelatin, lOOraM センスプライマ一、 lOOraM アンチセンスプライマ一、 1 unit Taq Iポリメラ —ゼであり、 94° ( 、 1分間熱変性、 55°C、 2分間アニーリング、 72°C、 1分 30秒間 DNA 伸長反応というサイクルを 60サイクル行った。 PCR 反応後、その 1/10量を 6 %ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、臭化工チジゥムで染 色し、紫外線照射下で写真をとつた。日本国内の C100- 3抗体陽性血漿 30検 体のうち、 14検体が陽性であった。

実施例 8

非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイブの識別

非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイプのうち、 Houghtonらの HCV-US, Katoら の HCV-J および本発明の 2— 22ウィルスの識別検定を行なった。

各サブタイプウィルスの塩基配列に基づいて、実施例 6で使用した配列番 号 1の塩基配列中のォリゴヌクレオチドプライマ一と同じ位置に相当するォ リゴヌクレオチドをそれぞれ合成し、ブライマーとして使用した。それぞれ の塩基配列と位置番号は表 3に示した。

C100-3抗体強陽性 (2. 000≥) 、いわゆる Houghtonらのウィルス抗原を用い た抗体検出試薬で強陽性と判定された供血者血漿及び各種肝疾患患者血漿最 低 300 ^より実施例 1の方法に従って調製した非 A非 B型肝炎ウィルス RN A のうち、得られた RNA の血漿 100 ^相当量を铸型とし、上述の各ブライ マー各々 200nMを添加し、通常の RT-PCR法を 40〜60サイクル行うことにより 、ゲノムを増幅して検出した。

PCR反応においてのァニーリング温度はブライマーの塩基配列より算出さ れた Tm値をもとに(Tni値一 5で)に設定した。

また、この他、反応条件、増幅産物の検出方法等は、実施例 7に記載した 通り、またはこれに準じたものとした。

表 3 サブタイプ l Sij用プライマー

ウィルスタイプ 驢删

2 -22

sense primer +5' -GCCCTCATAACACCATGTGGGC-3' 2 -22; 39nt- 60nt anti-sense primer -5' -GTCACCnCTTCGCCCTCAGAGAA-3' 2 -22; 149nt- 172nt

HCV-J

sense primer +5' -GCCTTGATCACGCCATGCGCTG-3' HCV-J ; 7611nt-7632nt anti-sense primer -5' -GTGACCTTCTTCTGCCGCAGACTT-3' HCV-J ; 7721nt-7744nt

HCV-US

sense primer +5" -GCACTCGTCACCCCGTGCGCCG-3' HCV-US; 7626nt-7647nt anti-sense primer - 5' -GTGACnTCTTCTGCCTrTGGCAA-3' HCV-US; 7736nt-7759nt

次いで、増幅させた DNA をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた後、 プライマー設定領域内中央付近に設定されたアンチセンス3 2 P 標識合成オリ ゴヌクレオチドをプローブとして反応させる、いわゆるサザンハイブリダイ ゼーションを行なうことにより識別した。使用したプローブは表 4に示した c この方法による非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイプの検出結果は以下の通 りであった。すなわち、表 5に示す如く、 C100- 3抗体強陽性(2. 000 ≥) で ある供血者血漿 30例においては、各サブタイプの検出は、該ウィルスゲノム ( 2 - 22) 型、 HCV-J 型、 HCV-US型の順に 13例 (43. 0% ) , 21例 (70. 0%) , 13例(43. 0%) であった。また各種肝疾患患者血漿においては、同順に C

型急性肝炎 3例中 0例(0 %) , 2例(66.7%) , 0例(0 %) 、 C型慢性 肝炎 26例中 11例(42. 3%) , 15例(57. 7%)、 0例(0 %)、 C型肝硬変 10 例中 4例(40. 0%) , 3例(30, 0%), 0例(0 %)、 Β型慢性肝炎 14例中 5例 (35. 1%)、 2例(14.3%) , 0例( 0 9 であった。この他に自己免 疫性肝炎においても 2例中 1例に該ウィルスゲノム型の非 Α非 Β型肝炎ウイ ルスサブタイプが検出された。

さらに 2— 22型として識別された DNA のうち 4個を選択し、常法に従い M 13mpl8および M13mpl9に組み込み、次いで大腸菌 E. col i DH5 a F'または JM 107 を支持菌として増殖させて組み換えファージ DNA を調製し、両方向から それぞれの塩基配列を解析した結果、その中の 1個では、配列番号 3に示し た如く、配列番号 1記載の 2— 22型と比較して一部に変異が認められた。

表 4 サブタイ 佣プローブ

ウィルスタイプ 塩基 S^ll 塩 Sfi置

2 -22 5' -GAGGTTGTGGAGTACACCT GTTATGGAATCGCATGAGCG-3' 2 -22; 100nt-139nt HCV-J 5' -GATGTTGTGGAGTAGACCATAGTGTGGTGACGCAGCAMG-3' HCV-J ; 7672nt-7711nt

HCV-US 5' -GAGGTGG GGAATACACCAAAnGTGGTGACGTAGCAACG-3* HCV-US; 7687nt-7726nt

表 5 臨床検体中非 A非 B型肝炎ウィルスサブタイプの検出結果


本発明の DNA、 RNA または抗原ポリペプチドを用いることにより、非 A非 B型肝炎の診断が可能となり、輸血等による該肝炎ゥィルスの感染の予防、 ワクチン、抗ウィルス剤の開発が可能となる。

〔配列表〕

配列番号: 1

配列の長さ: 181

配列の型:核酸

鎖の数: 2本鎖

トポロジー:直鎖状

配列の種類: c DNA to genomic RNA

フラグメント型:中間部フラグメント

起源:非 A非 B型肝炎ウィルス

配列の特徴

特徴を表す記号: CDS

存在位置: 1 . . 181

特徵を決定した方法: E

配列の特徵

特徴を表す記号: peptide

存在位置: 3 . . 179

特徵を決定した方法: S

配列

GG GTT ATC TGC TGC TCC ATG TCA TAC TCC TGG ACG GGG GCC CTC ATA 47 Val lie Cys Cys Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu lie 1 5 10 15

ACA CCA TGT GGG CCT GAG GAG GAG AAG TTA CCG ATC AAC CCT CTG AGC 95 Thr Pro Cys Gly Pro Glu Glu Glu Lys Leu Pro lie Asn Pro Leu Ser AAC TCG CTC ATG CGA TTC CAT AAC AAG GTG TAC TCC ACA ACC TCG AGG 143 Asn Ser Leu Met Arg Phe His Asn Lys Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg

35 40 45

AGT GCT TCT CTG AGG GCG AAG AAG GTG ACC TTT GAC CC 181 Ser Ala Ser Leu Arg Ala Lys Lys Val Thr Phe Asp

50 55

配列番号: 2

配列の長さ: 261

配列の型:核酸

鎖の数: 2本鎖

トポロジー:直鎖状

配列の種類: c DNA to genomic RNA

フラグメント型:中間部フラグメント

起源

生物名:非 A非 B型肝炎ウィルス

配列の特徵

特徴を表す記号: CDS

存在位置: 1 . . 261

特徴を決定した方法: E

配列の特徴

特徴を表す記号: peptide

存在位置: 1 . . 261

特徵を決定した方法: S

配列

ACA ACT CTT ACC ATG ATC CTC GCC TAT GCT GCT CGT GTT CCT GAG CTG 48

Thr Thr Leu Thr Met lie Leu Ala Tyr Ala Ala Arg Val Pro Glu Leu 1 5 10 15

GTC CTT GAA GTC ATC TTC GGC GGT CAT TGG GGT GTG GTG TTC GGC TTG 96 Val Leu Glu Val He Phe Gly Gly His Trp Gly Val Val Phe Gly Leu

20 25 30

GCC TAC TTC TCC ATG CAG GGA GCG TGG GCC AAG GTC ATC GCC ATC CTC 144 Ala Tyr Phe Ser Met Gin Gly Ala Trp Ala Lys Val lie Ala lie Leu

35 40 45

CTC CTT GTC GCA GGA GTA GAT GCA GAG ACC TAT ACC ACC GGC GGA CGA 192 Leu Leu Val Ala Gly Val Asp Ala Asp Thr Tyr Thr Thr Gly Gly Arg

50 55 60

GCG GGT TCT GAC ATG TAC TCG CTT GCT AGC CTT TTC AGC TCT GGT CCC 240 Ala Gly Ser Asp Met Tyr Ser Leu Ala Ser Leu Phe Ser Ser Gly Pro 65 70 75 80

CGG CAG CAC ATT GAC CTA ATC 261 Arg Gin His He Asp Leu lie

85

配列番号: 3

配列の長さ: 88

配列の型:核酸

鎖の数: 2本鎖

トポロジー:直鎖状

配列の種類: c DNA to genomic RNA

フラグメント型:中間部フラグメント

起源

生物名:非 A非 B型肝炎ウィルス

配列の特徵

特徴を表す記号: CDS

存在位置: 1 . . 88

特徴を決定した方法: E

配列の特徴

特徴を表す記号: peptide

存在位置: 3 . . 86

特徴を決定した方法: S

配列

CC GAG GAG GAG AAG TTG CCA ATC AAT CCT TTG AGT AAT TCG CTC GTG 47 Glu Glu Glu Lys Leu Pro l ie Asn Pro Leu Ser Asn Ser Leu Val 1 5 10 15

AGG TTT CAC AAC AAG GTG TAC TCC ACA ACC TCA AAG AGC GC 88 Arg Phe His Asn Lys Val Tyr Ser Thr Thr Ser Lys Ser

20 25