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1. WO1990004649 - PROCEDE POUR LE SEQUENÇAGE DIRECT DE CHAINES D'ACIDES NUCLEIQUES AU MOYEN DE LA REACTION EN CHAINE DE POLYMERASE ET DE THIOTRIPHOSPHATES DE DESOXYNUCLEOSIDES

Numéro de publication WO/1990/004649
Date de publication 03.05.1990
N° de la demande internationale PCT/EP1989/001269
Date du dépôt international 24.10.1989
Demande présentée en vertu du Chapitre 2 10.04.1990
CIB
C12Q 1/68 2006.01
CCHIMIE; MÉTALLURGIE
12BIOCHIMIE; BIÈRE; SPIRITUEUX; VIN; VINAIGRE; MICROBIOLOGIE; ENZYMOLOGIE; TECHNIQUES DE MUTATION OU DE GÉNÉTIQUE
QPROCÉDÉS DE MESURE OU DE TEST FAISANT INTERVENIR DES ENZYMES, DES ACIDES NUCLÉIQUES OU DES MICRO-ORGANISMES; COMPOSITIONS OU PAPIERS RÉACTIFS À CET EFFET; PROCÉDÉS POUR PRÉPARER CES COMPOSITIONS; PROCÉDÉS DE COMMANDE SENSIBLES AUX CONDITIONS DU MILIEU DANS LES PROCÉDÉS MICROBIOLOGIQUES OU ENZYMOLOGIQUES
1Procédés de mesure ou de test faisant intervenir des enzymes, des acides nucléiques ou des micro-organismes; Compositions à cet effet; Procédés pour préparer ces compositions
68faisant intervenir des acides nucléiques
CPC
C12Q 1/686
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms
68involving nucleic acids
6844Nucleic acid amplification reactions
686Polymerase chain reaction [PCR]
C12Q 1/6869
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms
68involving nucleic acids
6869Methods for sequencing
Déposants
  • MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FÖRDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V. [DE]/[DE] (AllExceptUS)
  • ECKSTEIN, Fritz [DE]/[DE] (UsOnly)
  • VOSBERG, Hans-Peter [DE]/[DE] (UsOnly)
  • GISH, Gerald [US]/[DE] (UsOnly)
  • NAKAMAYE, Kay [US]/[US] (UsOnly)
  • OLSEN, David, B. [US]/[DE] (UsOnly)
Inventeurs
  • ECKSTEIN, Fritz
  • VOSBERG, Hans-Peter
  • GISH, Gerald
  • NAKAMAYE, Kay
  • OLSEN, David, B.
Mandataires
  • WEICKMANN, H.
Données relatives à la priorité
P 38 36 201.524.10.1988DE
P 39 30 312.811.09.1989DE
Langue de publication allemand (DE)
Langue de dépôt allemand (DE)
États désignés
Titre
(DE) VERFAHREN ZUR DIREKTEN SEQUENZIERUNG VON NUKLEINSÄUREKETTEN MIT VERWENDUNG VON DER POLYMERASEKETTENREAKTION UND DEOXYNUKLEOSID-THIO-TRIPHOSPHATEN
(EN) METHOD FOR DIRECT SEQUENCING OF NUCLEIC ACID CHAINS USING THE POLYMERASE CHAIN REACTION AND DEOXYNUCLEOSIDE THIOTRIPHOSPHATES
(FR) PROCEDE POUR LE SEQUENÇAGE DIRECT DE CHAINES D'ACIDES NUCLEIQUES AU MOYEN DE LA REACTION EN CHAINE DE POLYMERASE ET DE THIOTRIPHOSPHATES DE DESOXYNUCLEOSIDES
Abrégé
(DE)
Die Erfindung betrifft eine direkte Sequenzierung von Nukleinsäureketten durch Denaturierung und dann Amplifizierung der zu sequenzierenden Bereiche durch mehrmaliges Durchlaufen eines Zyklus, umfassend a) einen Nukleinsäure-Syntheseschritt, bei dem die zu sequenzierende Nukleinsäure als Matrizenstrang in Anwesenheit der vier Deoxynukleosidtriphosphate von einer Polymerase, ausgehend von Oligonukleotid-Primern, die zu den 3'-Enden der antiparallelen Stränge der zu sequenzierenden Nukleinsäuren komplementär sind, repliziert wird, gefolgt von b) einem Denaturierungsschritt, wobei die entstandenen Nukleinsäuren während oder nach der Amplifizierung an ihrem einen Ende markiert werden. Die Sequenzierung der markierten Nukleinsäuren geschieht durch Einbau modifizierter Nukleotide an jeweils für eine Base spezifischen Positionen, Verkürzung der amplifizierten Nukleinsäuren jeweils bis zu diesen Positionen und elektrophoretische Auftrennung der entstandenen Nukleinsäurefragmente. Zum Einbau modifizierter Nukleotide bei der Amplifizierung in vier verschiedenen Ansätzen werden anstelle der vier Deoxynukleosidtriphosphate je ein Deoxynukleosid-$g(a)-thio-triphosphat zusammen mit den jeweils drei anderen unmodifizierten Deoxynukleosidtriphosphaten eingesetzt.
(EN)
A method for direct sequencing of nucleic acid chains by denaturation followed by amplification of the regions to be sequenced by repetition of a cycle includes a) a nucleic acid synthesis step in which the nucleic acid to be sequenced is replicated, as a matrix strand in the presence of the four deoxynucleoside triphosphates, by a polymerase, starting from oligonucleotide primers which are complementary to the 3' ends of the antiparallel strands of the nucleic acids to be sequenced; followed by b) a denaturation step. The ends of the resulting nucleic acids are marked during or after amplification. Sequencing of the marked nucleic acids is carried out by incorporating modified nucleotides at positions speicific for a particular base, shortening the amplified nucleic acids to these respective positions and separating the resultant nucleic acid fragments by electrophoresis. The modified nucleotides are incorporated during amplification in four different cycles by using a deoxynucleoside-$g(a)-thiotriphosphate together with each of the three other unmodified deoxynucleoside triphosphates instead of the four deoxynucleoside triphosphates.
(FR)
Un procédé pour le séquençage direct de chaînes d'acides nucléiqus par dénaturation suivie de l'amplification des régions à séquencer par répétion d'un cycle comporte a) une étape de synthèse d'acides nucléiques, dans laquelle l'acide nucléique à séquencer est répliqué sous forme d'un brin matriciel, en présence des quatre triphosphates de désoxynucléosides, par une polymérase, à partir d'oligonucléotides amorces qui sont complémentaires des terminaisons 3' des brins anti-parallèles des acides nucléiques à séquencer; suivie b) d'une étape de dénaturation. Les terminaisons des acides nucléiques obtenus sont marquées pendant ou après l'amplification. Le séquençage des acides nucléiques marqués s'effectue par incorporation, à des positions spécifiques d'une base, de nucléotides modifiés, raccourcissement, jusqu'à ces positions, des acides nucléiques amplifiés et séparation par électrophorèse des fragments d'acides nucléiques résultants. Les nucléotides modifiés sont incorporés, lors de l'amplification en quatre cycles différents, grâce à l'emploi d'un thiotriphosphate $g(a) de désoxynucléoside conjointement avec les trois autres triphosphates de désoxynucléosides non modifiés, à la place des quatre triphosphates de désoxynucléosides.
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