Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

Aller à Demande

1. KR1020200064891 - 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법

Note: Texte fondé sur des processus automatiques de reconnaissance optique de caractères. Seule la version PDF a une valeur juridique

[ KO ]
조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법{Method of providing the information for predicting of hematologic malignancy prognosis after peripheral blood stem cell transplantation}
기 술 분 야
 본 발명은 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
배경기술
 혈액 악성종양 또는 혈액암은 다양하지만, 골수 또는 림프 조직으로부터 기원하여 혈액 기능에 영향을 미치는 연관된 암이다. 매년, 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종 및 골수종의 새로운 사례가, 미국에서 진단되는 모든 새로운 암 사례의 거의 10%를 차지한다. 항체 및 키나제 억제제(예: 이마티니브 - BCR-ABL 억제제)를 사용하는 표적 치료요법이 개발되었지만, 혈액암을 다루는데 있어서 여전히 화학 치료요법 및 방사선 치료요법에 많이 의존한다. 이들은 통상적으로 상당한 부작용을 나타내며, 낮은 효능을 생성한다. 골수형성이상 증후군(Myelodysplastic syndromes, MDS)은 클론성 줄기세포 장애에 의한 골수성 종양으로, 비효율적인 조혈 작용을 일으키고 급성 골수성 백혈병(Acute myeloid leukemia, AML)의 진행 위험성을 증가시킨다. 이 증후군은 무기력증부터 AML의 진행 또는 심각한 혈구 감소증과 같이 생명을 위협하는 다양한 임상적 증상을 나타낸다. 아자시티딘(Azacitidine) 또는 데시타빈(Decitabine)과 같은 저메틸화 억제제(Hypomethylating agents, HMA)를 이용한 치료는 고위험 MDS 환자 또는 혈구 감소증 증상을 가지는 저위험 MDS 환자에게 첫 번째 치료 방법이다. 그러나, 임상 시험자의 HMT에 따른 생존율 및 저메틸화 치료(Hypomethylating therapy, HMT)에 대한 응답을 예측하는 것은 여전히 해결해야 할 문제로 남아있다.
 치료법 선택을 돕기 위하여 현재까지 다양한 예후 점수 시스템이 개발되어 왔다. 그 중에서도, 가장 최근 시스템인 개정된 국제 예후 점수 시스템(Revised International Prognostic Scoring System, IPSS-R)은 환자의 생존율을 예측하는데 유용하나, HMT에 대한 치료 반응성을 예측하기에는 효과적이지 않았다. 따라서, 신뢰할 수 있는 분자유전학적 마커를 확인한다면, 이를 통해 MDS에 대한 추가적 예후 정보를 제공할 수 있을 것이다. 대상자가 골수에서 5% 미만의 모구를 보이고 분자적으로 검출 가능한 암을 나타내는 경우 대상자는 최소 잔류 질병(MRD: minimum residual disease)을 나타낸다고 일컬어진다. 어떤 MRD도 검출되지 않을 때 (<10 -4, 즉 10 4 골수 세포 당 하나의 백혈병 세포 미만이 검출가능할 때) 완전한 분자적 완화가 달성된다. 지난 몇 년간 일련의 후향적 연구들은, 소아 백혈병에서 이미 밝혀진 바와 같이 성인 급성 림프구성 백혈병에서 MRD가 독립적인 예후인자임을 보였다 (Bruggemann et al. Blood 107 (2006), 1116-1123; Raff et al. Blood 109 (2007), 910-915).
 한편,  혈액암  환자에서  강력한  항암  화학  요법  단독  혹은  방사선  요법과  함께  암세포와  환자  자신의  조혈모세포를  제거한  다음  새로운  조혈모세포를  이식해  주는  치료법인  조혈모세포이식(hematopoietic  stem  cell  transplantation,  HSCT)은  과거  골수를  활용하던  골수이식(bone  marrow  transplantation,  BMT)의  영역을  넘어서  현재는  말초혈액(peripheral  blood,  PB)과  제대혈(cord  blood,  CB)  내에  존재하는  모든  형태의  조혈모세포를  이식원으로  활용하여  이식하는  것을  말한다.  동종  조혈모세포  공여자(조혈모세포  기증자)는  환자와  성별,  혈액형이  달라도  상관  없으나,  인백혈구항원(HLA,  human  leukocyte  antigen)  형(type)이  전부  또는  일부가  맞아야  하며,  이후  전처치  요법으로  인한  골수억제  기간을  지나  타인의  조혈모세포가  환자의  골수에  자리를  잡고  새로운  혈액세포를  만들어낼  때까지  (이를  생착이라  함)  감염  등의  부작용을  유의하며  보전적  치료를  유지한다.  조혈모세포  이식  후  추적  관찰을  위해  골수의  세포  형태  관찰,  세포유전검사,  분자유전검사와  적혈구  표현형  검사  등을  시행하고  있으나,  골수  검사나  적혈구  표현형  검사는  예민도가  낮고  조기에  임상  양상의  변화를  예측하기  어려운  단점이  있다.  세포유전검사는  진단  당시  특이한  염색체  이상이  없었던  정상  핵형인  경우  또는  같은  성별의  조혈모세포이식을  받은  경우에는  유용한  정보를  얻기  어렵다.  또한,  분자유전학검사도  예민도는  높지만  진단  당시  특이한  재배열이  없었던  경우  추적  관찰의  지표로  사용할  수  없는  문제점이  있어왔다.    조혈모세포  이식은  주로  혈연  관계에서  이루어지므로  대립인자의  양상이  유사한  경우가  많아  정보  제공에  유용한  표지자를  선택하기  위해서는  되도록  여러  표지자에  대한  검사를  동시에  시행할  필요가  있다.  공여자와  환자의  유전학적  다형성  부위의  변화  양상을  비교하는  키메리즘(chimerism)  검사는  현재  환자  조혈세포의  구성  상태를  파악할  수  있으므로  추적  관찰시  유용한  지표가  될  수  있다.  혼합  키메리즘(mixed  chimerism)은  조혈모세포  이식후  환자의  골수세포가  공여자의  골수  세포로  완전히  치환되지  않고  남아  공여자와  환자의  세포가  함께  존재하는  상태를  의미한다.  완전  키메리즘(complete  chimerism)은  환자의  골수가  완전히  공여자의  세포로만  구성된  상태를  의미하며,  성공적인  이식이란  완전  키메리즘  상태가  되는  것을  목표로  한다.  
발명의 상세한 설명
   해결하려는 과제
 본 발명에서는 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 개발하는 것을 목적으로 한다.
   과제의 해결 수단
 상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 NGS 패널을 제공한다.
 또한, 본 발명은 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 조성물을 제공한다.
 또한, 본 발명은 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 키트를 제공한다.
 또한, 본 발명은 NGS 기반 조혈모세포 이식 후 미세잔존질환 및 키메리즘 분석방법을 제공한다.
 아울러, 본 발명은 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
   발명의 효과
 본 발명에 따르면, 본 발명의 NGS 패널은 조혈모세포 이식된 개체의 미세잔존질환 (Minimal Residual Disease; MRD) 및 조혈모세포 이식된 개체와 공여 개체의 키메리즘을 동시에 분석 가능하므로, 정확하고 빠르게 백혈병 및 림프종 등을 포함하는 혈액암의 예후 예측할 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도면의 간단한 설명
 도 1은 미세잔존질환 평가를 위한 질병 연관 유전자 돌연변이 분석 알고리즘을 모식화한 도이다.
도 2는 미세잔존질환 평가를 위하여, 혈액종양질환의 진단 및 예후와 연관된 유전자의 돌연변이를 선별하기 위한 차세대염기서열분석 패널을 나타낸 도이다.
도 3은 키메리즘 분석을 위한 NGS 분석용 SNP를 이용한 키메리즘 분석 알고리즘을 모식화한 도이다.
도 4는 Korean Genome Database (KRGDB)의 한국인 대립 유전자 빈도 자료(allele frequency data)를 나타낸 도이다.
도 5는 키메리즘 분석에 유용한 것으로 선정한 SNP의 크로모좀(chromosome, chr), coordinate, DB SNP ID, KRGDB 정보를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 개발된 알고리즘을 이용한 질병 연관 유전자 돌연변이 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 조혈모세포 이식 후 질병 연관 돌연변이 정량 분석을 통한 미세잔존질환 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 NGS 및 STR 분석 방법으로 키메리즘을 비교한 도이다:
A: NGS 및 STR 분석으로 얻은 공여자 키메리즘 값의 상관 관계;
B: 두 키메리즘 분석의 Blant-Altman 플롯;
C 내지 F: 환자 11(C), 12(D), 13(E) 및 14(F)의 조혈모세포 이식 전 후 NGS, STR 및 MAB(mutant allele burden)을 이용한 생착 모니터링; 및
G: 환자 1의 HSCT 전/후의 SETBP1 영역의 통합 지놈 뷰어.
도 9는 본 발명의 키메리즘 분석 알고리즘을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
 일 측면에서, 본 발명은 ABCA12, ABL1, ASXL1, ATM, ATRX, ATXN7L1, BCOR, BRAF, BRCC3, CALR, CBL, CBLB, CD101, CEBPA, CREBBP, CSF1R, CSF3R, CTCF, CUX1, DNMT1, DNMT3A, EGFR, EP300, ERG, ETV6, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HIPK2, IDH1, IDH2, INVS, IRF1, JAK2, KDM2B, KDM6A, KIT, KMT2A, KMT2D, KRAS, LAMB4, MECOM, MET, MLL3, MLL5, MN1, MPL, NCOR2, NF1, NLRP1, NOTCH1, NPM1, NRAS, NRD1, NUP98, OCA2, PDGFRA, PHF12, PHF6, PRPF40B, PRPF8, PTPN11, RAD21, RAD50, RINT1, ROBO1, ROBO2, RUNX1, RUNX1T1, SETBP1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET1, TET2, TP53, TP53BP1, U2AF1, U2AF2, WT1 및 ZRSR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자, 및 rs3736908, rs2304429, rs2289195, rs2276599, rs4685, rs16865262, rs788017, rs788018, rs788023, rs10498027, rs4673925, rs10498030, rs17501837, rs1523721, rs3821735, rs6795556, rs2271151, rs967454, rs2304503, rs11713094, rs2305037, rs2305036, rs2335052, rs12498609, rs2647243, rs2454206, rs10033601, rs2070731, rs2070730, rs9282762, rs9282761, rs216136, rs3829987, rs2228422, rs3830035, rs3830036, rs2072454, rs4947986, rs2227983, rs2227984, rs2293347, rs2240455, rs10953468, rs11976329, rs2074748, rs420753, rs2072407, rs10274535, rs2240819, rs74483926, rs6464211, rs10252263, rs2230722, rs2274649, rs34001282, rs35445683, rs1056171, rs2229971, rs10823229, rs12773594, rs12221107, rs11195199, rs1875, rs1799937, rs16754, rs664982, rs17210957, rs11168830, rs3741622, rs10849885, rs2293514, rs747443, rs4073630, rs17086226, rs2491223, rs2491227, rs2491231, rs1933437, rs1800414, rs1800404, rs550239, rs2602141, rs690367, rs689647, rs560191, rs2439831, rs60147683, rs11651270, rs884367, rs1642785, rs2952976, rs1801052, rs2905876, rs2285892, rs9894648, rs964288, rs663651, rs3744825, rs2290684, rs2114724, rs2228611, rs2241531, rs11672909, rs2228612, rs1049481, rs664684, rs2295454, rs2295765, rs4911231, rs7121, rs9608885, rs20552, rs2076577, rs2076578, rs5936062, rs6520618, rs2230018, rs20539, rs1264011, rs3088074 및 rs35268552로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 특이적으로 검출하는 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 NGS(next generation sequencing) 패널에 관한 것이다.
 일 구현예에서, 본 발명의 NGS 패널은 미세잔존질환(Minimal Residual Disease; MRD) 및 키메리즘(chimerism)을 동시에 분석할 수 있다.
 일 구현예에서, 키메리즘 분석에 가장 유용한 유전자 좌는 ABCA12 유전자 염색체 2번의 215928972 위치의 rs1523721일 수 있다.
 일 구현예에서, 본 발명의 NGS 패널은 상기 유전자들을 특이적으로 검출하기 위한 표적 영역(target regions)에 대한 위치 정보를 포함할 수 있다.
 일 구현예에서, 상기 유전자들의 표 2에 표시된 영역에 특이적인 프로브들을 포함할 수 있다.
 일 구현예에서, 표적 캡쳐 방법을 이용한 NGS 분석 방법용 NGS 패널일 수 있다.
 일 구현예에서, 혈액암은 만성 골수단구성 백혈병(CMMoL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 호지킨 병(HD), 비-호지킨 림프종(NHL), 급성 림프성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 전골수성 백혈병(APL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 호중구성 백혈병(CNL), 급성 미분화 백혈병(AUL), 역성형 대세포림프종(ALCL), 전림프성 백혈병(PML), 청소년 골수단구성 백혈병(JMML), 성인 T-세포 ALL, 삼계열 골수 이형성증을 지니는 AML(AML/TMDS), 혼합된 계통백혈병(MLL), 골수이형성 증후군(MDS), 골수증식성 장애(MPD) 및 다발성 골수종(MM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군인 것이 더욱 바람직하다.
 본 발명에서 용어, "NGS(Next-generation sequencing, 차세대 염기서열 시퀀싱)"은 Massive parallel sequencing, 대용량 염기서열 분석법, 또는 대규모 병렬형 염기서열 분석법이라고 한다. 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 얻은 데이터를 생물 정보학적 기법을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 분석법을 의미한다. 기존의 Sanger 방식과 달리 대량의 병렬 데이터 생산이 가능하고, DNA 서열에 대한 증폭을 하고 그 후 형광 표식 등을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기를 읽어내는 분석법이다. 상기 차세대 염기서열 시퀀싱의 분석 장비는 사용하는 화학 반응 및 염기서열 검출 원리 등 세부 기술에 따라 고유의 특성 및 장단점에 따라 다양한 플랫폼이 출시되었다.
 본 발명에서 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
 본 발명에서 "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망을 말한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 재발 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 특히 초기 암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 암 치료의 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다. 예후 예측은 질환 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함된다.
 본 발명에서 용어, "프로브"란 DNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 표 2의 유전자의 특정 영역에 상보적인 RNA 프로브를 이용하여 표적 캡쳐 방법으로 NGS를 수행할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 통상의 기술분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있으므로 본 발명에서는 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
 본 발명에서 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 NGS 패널을 포함하는 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 조성물 및 이를 포함하는 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 진단용 키트에 관한 것이다.
 일 측면에서, 본 발명은 (1) 대상으로부터 분리된 시료로부터 DNA를 분리하고; (2) 제 1항의 NGS 패널을 이용하여 ABCA12, ABL1, ASXL1, ATM, ATRX, ATXN7L1, BCOR, BRAF, BRCC3, CALR, CBL, CBLB, CD101, CEBPA, CREBBP, CSF1R, CSF3R, CTCF, CUX1, DNMT1, DNMT3A, EGFR, EP300, ERG, ETV6, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HIPK2, IDH1, IDH2, INVS, IRF1, JAK2, KDM2B, KDM6A, KIT, KMT2A, KMT2D, KRAS, LAMB4, MECOM, MET, MLL3, MLL5, MN1, MPL, NCOR2, NF1, NLRP1, NOTCH1, NPM1, NRAS, NRD1, NUP98, OCA2, PDGFRA, PHF12, PHF6, PRPF40B, PRPF8, PTPN11, RAD21, RAD50, RINT1, ROBO1, ROBO2, RUNX1, RUNX1T1, SETBP1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET1, TET2, TP53, TP53BP1, U2AF1, U2AF2, WT1 및 ZRSR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 및 rs3736908, rs2304429, rs2289195, rs2276599, rs4685, rs16865262, rs788017, rs788018, rs788023, rs10498027, rs4673925, rs10498030, rs17501837, rs1523721, rs3821735, rs6795556, rs2271151, rs967454, rs2304503, rs11713094, rs2305037, rs2305036, rs2335052, rs12498609, rs2647243, rs2454206, rs10033601, rs2070731, rs2070730, rs9282762, rs9282761, rs216136, rs3829987, rs2228422, rs3830035, rs3830036, rs2072454, rs4947986, rs2227983, rs2227984, rs2293347, rs2240455, rs10953468, rs11976329, rs2074748, rs420753, rs2072407, rs10274535, rs2240819, rs74483926, rs6464211, rs10252263, rs2230722, rs2274649, rs34001282, rs35445683, rs1056171, rs2229971, rs10823229, rs12773594, rs12221107, rs11195199, rs1875, rs1799937, rs16754, rs664982, rs17210957, rs11168830, rs3741622, rs10849885, rs2293514, rs747443, rs4073630, rs17086226, rs2491223, rs2491227, rs2491231, rs1933437, rs1800414, rs1800404, rs550239, rs2602141, rs690367, rs689647, rs560191, rs2439831, rs60147683, rs11651270, rs884367, rs1642785, rs2952976, rs1801052, rs2905876, rs2285892, rs9894648, rs964288, rs663651, rs3744825, rs2290684, rs2114724, rs2228611, rs2241531, rs11672909, rs2228612, rs1049481, rs664684, rs2295454, rs2295765, rs4911231, rs7121, rs9608885, rs20552, rs2076577, rs2076578, rs5936062, rs6520618, rs2230018, rs20539, rs1264011, rs3088074 및 rs35268552로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 NGS로 분석하며; (3) 대상의 조혈모세포 이식 후 미세잔존질환 및 키메리즘을 확인하는 것을 포함하는 NGS 기반 조혈모세포 이식 후 미세잔존질환 및 키메리즘 분석방법에 관한 것이다.
 일 구현예에서, 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 정액, 질 세포, 모발, 타액, 객담, 뇌척수액, 골수 및 뇨로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 말초 혈액 또는 골수인 것이 더욱 바람직하다.
 일 측면에서, 본 발명은 (1) 조혈모세포 이식된 대상으로부터 분리한 시료로부터 DNA를 분리하고; (2) ABCA12, ABL1, ASXL1, ATM, ATRX, ATXN7L1, BCOR, BRAF, BRCC3, CALR, CBL, CBLB, CD101, CEBPA, CREBBP, CSF1R, CSF3R, CTCF, CUX1, DNMT1, DNMT3A, EGFR, EP300, ERG, ETV6, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HIPK2, IDH1, IDH2, INVS, IRF1, JAK2, KDM2B, KDM6A, KIT, KMT2A, KMT2D, KRAS, LAMB4, MECOM, MET, MLL3, MLL5, MN1, MPL, NCOR2, NF1, NLRP1, NOTCH1, NPM1, NRAS, NRD1, NUP98, OCA2, PDGFRA, PHF12, PHF6, PRPF40B, PRPF8, PTPN11, RAD21, RAD50, RINT1, ROBO1, ROBO2, RUNX1, RUNX1T1, SETBP1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET1, TET2, TP53, TP53BP1, U2AF1, U2AF2, WT1 및 ZRSR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 돌연변이, 및 rs3736908, rs2304429, rs2289195, rs2276599, rs4685, rs16865262, rs788017, rs788018, rs788023, rs10498027, rs4673925, rs10498030, rs17501837, rs1523721, rs3821735, rs6795556, rs2271151, rs967454, rs2304503, rs11713094, rs2305037, rs2305036, rs2335052, rs12498609, rs2647243, rs2454206, rs10033601, rs2070731, rs2070730, rs9282762, rs9282761, rs216136, rs3829987, rs2228422, rs3830035, rs3830036, rs2072454, rs4947986, rs2227983, rs2227984, rs2293347, rs2240455, rs10953468, rs11976329, rs2074748, rs420753, rs2072407, rs10274535, rs2240819, rs74483926, rs6464211, rs10252263, rs2230722, rs2274649, rs34001282, rs35445683, rs1056171, rs2229971, rs10823229, rs12773594, rs12221107, rs11195199, rs1875, rs1799937, rs16754, rs664982, rs17210957, rs11168830, rs3741622, rs10849885, rs2293514, rs747443, rs4073630, rs17086226, rs2491223, rs2491227, rs2491231, rs1933437, rs1800414, rs1800404, rs550239, rs2602141, rs690367, rs689647, rs560191, rs2439831, rs60147683, rs11651270, rs884367, rs1642785, rs2952976, rs1801052, rs2905876, rs2285892, rs9894648, rs964288, rs663651, rs3744825, rs2290684, rs2114724, rs2228611, rs2241531, rs11672909, rs2228612, rs1049481, rs664684, rs2295454, rs2295765, rs4911231, rs7121, rs9608885, rs20552, rs2076577, rs2076578, rs5936062, rs6520618, rs2230018, rs20539, rs1264011, rs3088074 및 rs35268552로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 SNP를 분석하며; (3) 대상의 조혈모세포 이식 후 미세잔존질환 및 키메리즘을 확인하는 것을 포함하는 조혈모세포 이식 후 혈액암 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
 일 구현예에서, 상기 (2) 단계에서, 유전자 및 SNP 분석은 차세대 염기서열 시퀀싱(Next-generation sequencing, NGS), 생어 시퀀싱(Sanger sequencing), 단일-분자 실시간 분석법(Single-molecule real-time sequencing), 이온 반도체 분석(Ion semiconductor), 파이로 시퀀싱(Pyrosequencing), SBS(Sequencing by synthesis), SBL(Sequencing by ligation) 및 연쇄 정지반응(Chain termination)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 본 발명의 NGS 패널을 이용하여 차세대 염기서열 시퀀싱(Next-generation sequencing) 방법으로 분석하는 것이 더욱 바람직하다.
 일 실시예에서, 키메리즘 분석은 이식 전 SNP가 동형접합(homozygous; aa)이고, 이식 후 이형접합(heterozygous; Aa)으로 변화했을 때, wild type 염기는 공여자 세포에서 기원한 염기를 의미하는 것으로 확인하였다. 반면, 이식 전 SNP가 이형접합(heterozygous; Aa)이고, 이식 후 동형접합(homozygous; aa)으로 변화했을 때, 치환된 염기는 공여자 또는 환자의 세포에서 기원하였을 것이고, 검출되는(%가 낮더라도) wild type 염기는 환자의 남아있는 세포에서 기원한 염기를 의미하는 것으로 확인하였다.
 본 발명에서 용어, "SNP (single nucleotide polymorphism)"는 단일 뉴클레오티드에서의 다형성 (polymorphism)이다. 즉, 어느 집단에 있어 전체 게놈 (genomome)에 있는 하나의 염기가 염색체 마다 다른 경우가 존재하는데, 통상적으로 SNP는 300 내지 1000개의 염기에 하나 정도 존재하기 때문에 인간 게놈 DNA 전 체에는 적어도 300만개의 SNP가 존재하게 된다.
 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
  실시예 1. 차세대염기서열분석 패널 구성
  1-1. 혈액종양질환 질병 연관 유전자 선발 및 NGS 패널 구성
 미세잔존질환 평가를 위해, MDS 및 골수 증식성 종양 형성(myeloproliferative neoplasia)을 가진 환자들에서 자주 돌연변이되는 유전자를 함유하는 차세대염기서열분석 패널을 구성하였다. 구체적으로, 도 1의 알고리즘에 따라 MDS 및 골수 증식성 종양 형성과 연관된 87개의 ABCA12, ABL1, ASXL1, ATM, ATRX, ATXN7L1, BCOR, BRAF, BRCC3, CALR, CBL, CBLB, CD101, CEBPA, CREBBP, CSF1R, CSF3R, CTCF, CUX1, DNMT1, DNMT3A, EGFR, EP300, ERG, ETV6, EZH2, FBXW7, FLT3, GATA1, GATA2, GNAS, HIPK2, IDH1, IDH2, INVS, IRF1, JAK2, KDM2B, KDM6A, KIT, KMT2A, KMT2D, KRAS, LAMB4, MECOM, MET, MLL3, MLL5, MN1, MPL, NCOR2, NF1, NLRP1, NOTCH1, NPM1, NRAS, NRD1, NUP98, OCA2, PDGFRA, PHF12, PHF6, PRPF40B, PRPF8, PTPN11, RAD21, RAD50, RINT1, ROBO1, ROBO2, RUNX1, RUNX1T1, SETBP1, SF3A1, SF3B1, SMC1A, SMC3, SRSF2, STAG2, TET1, TET2, TP53, TP53BP1, U2AF1, U2AF2, WT1 및 ZRSR2 유전자 (도 2, 표 1 및 2)를 선별하여 차세대염기서열분석(next-generation sequencing, NGS) 패널을 구성하였다.
 
표 1
 
  JPEG pat00003.jpg 187 83
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  1-2. 조혈모세포 이식 후 키메리즘 분석을 위한 SNP 선발 및 NGS 패널 구성
 상기 실시예 1-1의 질병연관 돌연변이 유전자와 연관이 없는 SNP(single nucleotide polymorphism)의 접합성(heterozygosity) 정보를 이용하여 조혈모세포 이식 후 키메리즘을 분석하기 위하여, 키메리즘 분석에 유용한 SNP 마커를 도 3의 알고리즘으로 선정하였다. 이를 위해, SNP은 인종별 차이를 보이므로 한국인에 적합한 SNP 조합을 구성하고, 해당 유전자가 질병과 연관된 후천적 돌연변이 (예, LOH)를 보일 수 있으므로, 다양한 유전자를 포함한 키메리즘 분석 SNP 조합을 구성하였다. 구체적으로, 밝혀진 모든 SNP들을 일반 한국인의 이형접합체 빈도 (the Korean reference genome database investigated 1722 Korean individuals)로 검토하였다 (도 4). 동형 접합체와 이형 접합체 대립 유전자는 각각 90~100 % 및 45 ~ 60 %의 염기수 빈도에 의해 결정되었고, 한국인 데이터베이스에서 0.2 내지 0.8의 이형접합 빈도를 가지는 153개의 SNP (도 5)를 조사하고 NGS 키메리즘 분석에 최적인 SNP들을 하기 기준에 따라 선택하였다: 1) > 500 mean read depth; 2) ≤ 0.2% background error (BE); 및 3) < 10% 이형 접합 대립유전자의 measurement error (ME, 참조 대립형질 및 대체 대립형질 사이의 판독수의 차).
 그 결과, 121개의 SNP들이 NGS 키메리즘 분석용으로 선택되었으며, 선택된 SNP들의 판독 깊이, %BE 및 %ME는 각각 1398.3 ± 538.9, 0.082% ± 0.035% 및 3.31% ± 2.27%로 나타났다 (표 3).
  JPEG pat00030.jpg 188 155
 
  실시예 2. 미세잔존질환 및 키메리즘 분석
  2-1. 환자 선발 및 시료 준비
 골수이형성증후군(Myelodysplastic syndrome, MDS)로 진단받고 서울 성모 병원에서 allo-HSCT를 받은 14명의 환자들을 본 연구에 등록하였으며, 본 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되고 서울 성모 병원의 기관 검토위원회로부터 승인을 받았다 (KC16SISI0395). 환자들로부터 말초 혈액 또는 골수(bone marrow, BM) 흡인(aspirates)을 수집하고 (N = 53) 이로부터 DNA를 추출하였다.
  2-2. STR 분석
 STR 분석은 AmpFlSTR Identifier PCR Amplification (Applied Biosystems, Warrington, UK)를 이용하여 종래의 16개의 마커 (염색체 8의 D8S1179, 21q11.2-q21의 D21S11, 7q11.2-22의 D7S820 , 5q33.3-34의 CSF1PO, 3p의 D3S1358, 11p15.5의 TH01, 13q22-31의 D13S317, 16q24-qter의 D16S539, 2q35-37.1의 D2S1338, 19q12-13.1의 D19S433, 12p12-pter의 vWA, 2p23-2per의 TPOX, 18q21.3의 D18S51, 5q21-31의 D5S818, 4q28의 FGA, 및 X (p22.1-22.3) 및 Y (p11.2) 염색체의 아멜로제닌(amelogenin) 유전자좌)로 수행되었다.
  2-3. NGS 수행을 통한 미세잔존질환 및 키메리즘 평가
  2-3-1. NGS를 이용한 MDS 관련 유전자 변이 확인
 NGS 분석은 상기 실시예에서 도 1의 알고리즘에 따라 선별한 MDS 및 골수 증식성 종양 형성(myeloproliferative neoplasia)을 가진 환자들에서 자주 돌연변이되는 87개의 유전자 (도 2 및 표 1)를 함유하는 차세대염기서열분석 패널을 이용하여 수행되었다. 표적 캡쳐 시퀀싱(Target capture sequencing)은 맞춤형 표적 키트 (3039061, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다 DNA 라이브러리는 SureSelct Target Enrichment System Kit (G7530-90000) (Agilent, CA)를 이용하여 제작되었다. Covaris S2 (Covaris, MA) 장비를 이용해 각 샘플 당 500ng genomic DNA를 250bp 정도의 조각으로 shearing하고 target-specific Capture Library (Bait ID : 3039061)에 혼성결합시킨다. 준비된 라이브러리의 양은 KAPA Library Quantification Kit (KK4824, Kapa Biosystems)을 이용해 계량하였고, 아답터가 결합된 라이브러리의 품질과 사이즈 분포는 electrophoresis on Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA microfluidic chips (Agilent, CA)을 이용해 측정하였다. Illumina HiSeq2500로 라이브러리의 서열판독을 진행하였는데, 장비 내에서 클러스터 생성이 진행되었으며, 이미지 분석은 HiSeq control Software version 1.8.4.을 이용해 수행되었다. 또한, 아답터 서열과 저품질 서열 판독을 제거하기 위해 cutadapt (https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200) 및 sickle ( https://github.com/najoshi/sickle)를 이용하였다. 서열 fead를 인간 참조 지놈 (hg19)에 얼라인하기 위해 Burrows-Wheeler aligner ( https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp324)를 이용했다. local realignment, 점수 재조정 및 서열 데이터의 필터링을 위해 Genome Analysis ToolKit (GATK) ( http://genome.cshlp.org/content/20/9/1297)를 이용하였다. 또한, Picard ( https://github.com/broadinstitute/picard) 및 Samtools ( https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp352)를 기본 프로세스, 서열 데이터의 관리 및 mpileup 생성을 위해 사용하였다. VarScan v.2.3.9 ( http://varscan.sourceforge.net/)를 변이를 확인하는데 사용하였다.
 그 결과, 환자에 동종이계의 조혈모세포 이식(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)을 수행하기 전(pre-allo-HSCT) 및 수행 후(post-allo-HSCT)의 ASXL1EZH2 돌연변이에 대한 대립유전자 깊이(allele depth)를 분석함으로써 조혈모세포 이식 후 질병 연관 돌연변이 정량 분석을 통한 미세잔존질환을 평가하였다(도 6). 그 결과, 조혈모세포 이식 전의 환자에서는 ASXL1EZH2 돌연변이가 존재하나, 조혈모세포 이식 후의 환자에서는 ASXL1 EZH2 돌연변이가 낮음을 확인하였다 (도 7).
  2-3-2. NGS를 이용한 조혈모세포 이식 후 키메리즘 확인
 121개의 SNP를 포함하는 NGS 패널을 이용하여 상기 실시예에서와 같이 NGS로 분석하고, 각 SNP의 공여자 allele burden은 하기 수학식 1 내지 4로 계산하였다.
 
수학식 1
 
수학식 2
 
수학식 3
 
수학식 4
 *공여자 키메리즘은 평균 공여자 allele burden으로 정의되었다.
 그 결과, 유용한 SNP들의 수는 가변적이었으며 (중앙값 25.5, 범위 8-41) STR (중앙값 10.5, 범위 5-14)보다 더 높게 나타났다. NGS 분석에서 공여자 키메리즘은 STR 분석 결과와 매우 높은 상관관계를 나타냈으며 ( r 2 = 0.988 ( P < 0.0001)) (도 8A), 모든 데이터 포인트는 Blant-Altman plot에서 평균 % 차이의 3 표준 편차(SD) 이내였다 (도 8B). MRD 역치는 표 3의 각 유전자좌에서 평균 %BE + 3SDs로 결정되었다 (표 4). 9명의 환자 (1-9)는 0.03 ± 0.05% 돌연변이 allele burden을 가지는 완전히 공여자 키메리즘 (STR 99.29 ± 0.76, NGS 99.60 ± 0.58)을 나타냈다 (표 5). 환자 10은 정상적인 혈액 소견과 혼합된 키메리즘을 나타냈다. 14 환자 중, 세 명의 환자 (11-13)가 allo-HSCT 후에 재발하였다. 재발에서 돌연변이 allele burden의 감소 및 공여자 키메리즘 감소를 검출하였다 (환자 11, 도 8C). 환자 12는 추적 관찰 첫 1년에 혼합된 키메리즘을 보였고 SF3B1 돌연변이가 낮은 수준 (0.44 ± 0.16)으로 지속되었다 (도 8D). 환자 13은 allo-HSCT 후 7개월까지 혼합된 키메리즘을 나타냈고, NRAS 돌연변이가 진단시 관찰되었으나 allo-HSCT 후 사라졌다. 상기 환자는 공여자 키메리즘이 감소된 allo-HSCT 후 9개월차에 AML이 재발하였다. 특히, 새로운 세포유전적 이상이 NRAS 돌연변이 재발생 없이 얻어졌다 (도 8E). 이를 통해 개체별 질병 진행이 동시 분석을 통해 효과적으로 입증될 수 있음을 나타냈다. 또한, 환자 14는 분석 알고리즘의 효과를 확인했다. 상기 AML 환자는 allo-HSCT를 11년 전에 받았다. 정기적인 추적 관찰 동안 범혈구감소증(pancytopenia)이 발생했으며, 혈청학적 측정 및 키메리즘 분석을 위한 BM 검사를 수행하여, 3-계통 이형성증 및 증가된 blast (5%)를 나타냈다. 특히, 완전한 공여자 키메리즘 (99.8%)과 PHF6 돌연변이가 NGS로 발혀졌으며, 이는 돌연변이가 공여자 세포로부터 유래된 것임을 나타냈다. 이는 1q 획득 및 7q 상실을 동반한 공여자-세포 유래된 MDS를 입증하는 세포유전학적 분석 //46,XY,+1,der(1;7)(q10;q10)[5]/46,XY[5]으로 뒷받침되었다.
 즉, 상기 실시예에서 선발된 SNP 중 조혈모세포를 이식받은 공여자와 환자 개체별로 실제 차이를 나타내는 유용한 수여자 대립유전자 (Informative recipient alleles, IRA)는 하기의 기준으로 선정되었다:
 1) 환자 (수여자) (Recipient, Rw, Rv)의 SNP이 이형접합인 경우, 공여자(Donor, Dw)의 SNP는 동형접합이어야 한다; 및
 2) 환자와 공여자의 SNP이 동형접합인 경우, 환자와 공여자는 서로 다른 염기의 동형접합이어야 한다.
  JPEG pat00036.jpg 73 170
  JPEG pat00037.jpg 102 174
 아울러, 키메리즘 계산을 위하여, (1) 환자(Recipient, Rw, Rv)의 SNP이 이형접합인 경우, 공여자(Donor, Dw)의 SNP는 동형접합이어야 하며, 이때 환자 키메리즘(Recipient Chimerism)(%)은 하기의 수학식 5로 계산된다.
 
수학식 5
 또한, (2) 환자(Recipient, Rw)와 공여자(Donor, Dv)의 SNP가 서로 다른 염기의 동형접합인 경우 하기의 수학식 6으로 계산된다.
 
수학식 6
 이를 이용하여 환자(Recipient, Rw, Rv)에 조혈모세포 이식(PBSCT)을 수행하기 전(pre-PBSCT) 및 수행 후(post-PBSCT)와 공여자(Donor, Dv)의 키메리즘을 분석한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 환자의 키메리즘(Recipient Chimerism)은 7.21%인 것으로 확인되었다.
 상기 결과를 통해, 조혈모세포 이식 전 환자의 검체에서 시행한 SNP의 접합성(heterozygosity)가 이식 후 검체에서 변화했을 때 이를 이용하여 공여자 세포에서 기원한 염기인지 또는 남아있는 또는 재발한 세포에서 기원한 염기임을 예상할 수 있음을 확인하였다. 이는, 이식 전 SNP가 동형접합(homozygous; aa)이고, 이식 후 이형접합(heterozygous; Aa)으로 변화했을 때, wild type 염기는 공여자 세포에서 기원한 염기를 의미하는 것이며, 반면, 이식 전 SNP가 이형접합(heterozygous; Aa)이고, 이식 후 동형접합(homozygous; aa)으로 변화했을 때, 치환된 염기는 공여자 또는 환자의 세포에서 기원하였을 것이고, 검출되는(%가 낮더라도) wild type 염기는 환자의 남아있는 세포에서 기원한 염기를 의미하는 것임을 확인하였다. 이를 통해, 대립유전자 빈도 데이터(Allele frequency data)를 이식 전과 이식 후에 비교함으로써 키메리즘 분석에 이용할 수 있음을 확인하였다.