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1. FR2766059 - PROCEDE POUR LA STIMULATION DES DEFENSES NATURELLES DE PLANTES AGRONOMIQUEMENT UTILES ET COMPOSITION POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCEDE

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PROCÉDÉ POUR LÀ STIMULATION DES DÉFENSES NATURELLES DE PLANTES AGRONOMIQUEMENT UTILES ET COMPOSITION POUR LA MISE EN OEUVRE DE CE PROCÉDÉ L'invention a pour objet un procédé pour la stimulation des défenses naturelles de plantes agronomiquement utiles.
Il s'agit en particulier - de la vigne et des arbres fruitiers du groupe comprenant le pommier, le poirier, - des céréales du groupe comprenant le blé, le maïs et le riz, - des oléagineux du groupe comprenant le soja, le tournesol et le colza et - des plantes légumières du groupe comprenant les carottes, le chou-fleur, les tomates et les pommes de terre.
Elle vise également une composition pour la mise en oeuvre du susdit procédé.
La stimulation des défenses naturelles se traduit, dans le cas d'une plante ayant eu un premier contact avec un agent pathogène tel qu'un virus, une bactérie, un champignon ou un insecte, par le développement d'un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante une présensibilisation grâce à laquelle elle devient capable de réagir plus efficacement à une nouvelle attaque.
Cette présensibilisation est désignée par l'expression "résistance systémique acquise".
On connaît des produits appelés éliciteurs ou sensibilisateurs qui, mis au contact de la plante, sont capables de provoquer préventivement dans celle-ci la présensibilisation ou résistance systémique acquise dont il vient d'être question.
Celle-ci peut, lors de la reconnaissance d'un agent pathogène donné, provoquer une stimulation très rapide de métabolismes secondaires qui conduisent par exemple à la production de molécules antibiotiques, à un renforcement de la paroi cellulaire et à la production de protéines à activité antifongique.
La nécessité d'abaisser les coûts étant une préoccupation permanente des exploitants agricoles, l'effort de recherches en vue de la découverte de nouveaux éliciteurs est constant.
Et la Société Demanderesse, dont l'un des axes de recherches a précisément pour but de trouver de tels éliciteurs, a eu le mérite d'établir que les oligo β 1-3 glucanes, dont seulement certains avaient déjà été utilisés dans l'agriculture, constituent des éliciteurs de choix à 1'égard des plantes agronomiques énumérées plus haut.
Il s'ensuit que le procédé de stimulation des défenses naturelles de plantes agronomiquement utiles est caractérisé par le fait qu'il comprend l'application, notamment foliaire, auxdites plantes, notamment celles du groupe défini plus haut, d'une quantité efficace d'au moins un oligo β 1-3 glucane.
Les oligo β 1-3 glucanes mis en oeuvre dans le cadre du susdit procédé sont composés de 3 à 250, de préférence de 3 à 50 et, plus préférentiellement encore, de 3 à 30 unités saccharidiques, leur masse moléculaire allant par conséquent de 540 à 45000 Daltons.
On définit la "quantité efficace" par la quantité d'au moins un oligo β 1-3 glucane qu'il convient d'appliquer par hectare de culture à traiter pour conférer aux plantes de cette culture la résistance systémique acquise dont il vient d'être question.
Elle est, dans le cas de l'invention, de 5 à 500 g, de préférence de 10 à 100 g.
Elle est mise en oeuvre par application, notamment foliaire, en une ou deux fois, aux stades végétatifs précoces, notamment au stade 2 feuilles.
On traite les plantes identifiées ci-dessus et dont il s'agit de stimuler les défenses naturelles, à l'aide d'une composition généralement aqueuse pour application foliaire qui contient non seulement la substance active constituée par le ou les oligo β 1-3 glucanes, mais également les constituants classiques de ce genre de composition, la concentration en substance active de la composition étant de 0,05 à 0,2 g/1.
Pour constituer la susdite composition, on peut utiliser, à la place de l'eau, un véhicule choisi dans le groupe comprenant les huiles minérales et végétales, les corps gras liquides et les alcools, notamment le propylène- glycol et le glycérol.
Les constituants classiques des susdites compositions sont choisis, en fonction des plantes à traiter, dans le groupe comprenant les solvants, les agents tensio-actifs, les agents dispersants et les charges solides.
Le volume de composition mise en oeuvre par hectare est de 10 à 1000 litres et généralement de l'ordre de 500 litres.
Pour préparer les susdits oligo β 1-3 glucanes, on peut hydrolyser des β 1-3 glucanes qui sont des polysaccharides de poids moléculaire variable de 60000 à plus de 1 million de Daltons; ces polysaccharides consistent essentiellement en des unités de D-glucose reliées spécifiquement par des liaisons 3-glucosidiques entre le carbone 1 du premier groupe glucose et le carbone 3 du deuxième groupe glucose; ces liaisons sont, par conséquent, des liaisons β(1-3); il s'agit de polysaccharides linéaires pouvant porter des ramifications β 1-6 et ayant jusqu'à 10000 unités saccharidiques par molécule.
Les β 1-3 glucanes sont d'origines diverses.
Ils peuvent être extraits - de bactéries, notamment d'Alcaligen.es faecalis, l'extrait en question étant dénommé curdlan, - de champignons, notamment de Schizophyllum commune (l'extrait étant le Schizophyllan) , de Sclerotium glucanium (l'extrait étant le Scleroglucan), d'autres extraits fongiques étant le pachyman, le lichenan (extrait de Cetraria islandica) et le paramylon, - de levures, notamment de Saccharomyces cerevisae, les extraits ainsi obtenus étant le "Yeast glucan" et le zymosan, et - de différentes plantes, notamment d'algues et de céréales, les extraits correspondant étant désignés par "β-glucan des algues marines" et "β-glucan des céréales", d'autres extraits étant la callose (extrait par exemple de grains de pollen de graminées) et le lentinan (extrait de Lentinus edodes). L'hydrolyse des β 1-3 glucanes peut être effectuée par voie enzymatique ou par voie acide.
La dégradation enzymatique des β 1-3 glucanes peut être effectuée par mise en oeuvre de β-glucanases extraites de levures du type Saccharomyces cerevisiae ou de mollusques.
Parmi ces β-glucanases, on peut citer EC 3.2.1.21 ou EC 3.2.1.6. A partir de l'hydrolysat ainsi obtenu, on isole par ultrafiltration la fraction oligosaccharidique recherchée.
Il est signalé que les oligo β 1-3 glucanes visés dans le cadre de 1'invention peuvent également être préparés par synthèse chimique par mise en oeuvre de la réaction de Koenig et Knorr.
Une première étape de cette réaction consiste en l'acétylation du β D-glucose à chaud dans l'acétate de sodium (CH^COONa).
Dans une deuxième étape, le β D-glucopentacétate ainsi obtenu est soumis à la réaction de Koenig et Knorr. EXEMPLE 1
Préparation d'un oligo β 1-3 glucane constitué par un hydrolysat appelé H13.
La matière première est constituée par le curdlan qui est un β(1~3) glucane extrait d'une bactérie, à savoir Alcaligenes faecalis; le curdlan est commercialisé par la Société SIGMA Chimie sous la référence C 7821.
On dissout 20 g de curdlan dans 2 litres d'eau déminéralisée.
Cette solution est thermostatée à 40°C; on y ajoute 80 unités de la susdite enzyme.
On maintient l'ensemble à 40°C pendant 2 heures et 45 minutes.
On ultrafiltre ensuite la solution obtenue dans un dispositif d'ultrafiltration tangentielle commercialisé par la Société MILLIPORE sous la marque Pellicon, équipé d'une cassette de porosité 5000 Daltons.
La pression d'entrée est de 3 bars.
Pendant cette ultrafiltration, le volume à ultrafiltrer est maintenu constant à 2 litres par addition d'un complément de 3 litres d'eau déminéralisée. L'ultrafiltrat de 4 litres obtenu à l'issue de cette opération d'ultrafiltration contient les oligo β 1-3 glucanes de masse moléculaire inférieure à 5000 Daltons; sachant que la masse moléculaire de l'unité saccharidique est d'environ 180, les oligo β 1-3 glucanes contenues dans l'ultrafiltrat sont constituées d'au plus 30 unités saccharidiques. La solution est ensuite concentrée à un volume de 50 ml par évaporation à 80°C à l'aide d'un dispositif de marque Rotovapor, puis lyophilisé.
On obtient 16 g d'une poudre couleur crème qui constitue l'hydrolysat H13 .
Une analyse par chromatographie ionique couplée à 1'ampérométrie et utilisant la résine échangeuse d'ions commercialisée par la Société DIONEX Chemical Corp. sous la marque Dionex, montre que les oligo 3 1-3 glucanes constitutifs de la susdite poudre ont en fait 2 à 30 unités saccharidiques, le degré de polymérisation moyen étant de 3 à 15. EXEMPLE 2
Préparation d'un oligo 3 1-3 glucane constitué par un hydrolysat appelé Hll.
La matière première est une algue marine dénommée Laminaria digitata. A 300 g d'algues fraîches de type Laminaria digitata récoltées au mois d'août sous forme fraîche ou sèche, on ajoute progressivement 1 1 d'acide sulfurique 0,3%. L'opération est réalisée au bain-marie à une température d'environ 70°C pendant 2 heures et 30 minutes sous agitation.
Cette opération est renouvelée deux fois. L'extrait obtenu est clarifié par filtration sur un filtre de porosité 1,2 pm.
Le liquide résultant de cette filtration est soumis à une ultrafiltration tangentielle sur une membrane de porosité 50000 Daltons. L'ultrafiltration est réalisée en maintenant une pression de 1 bar.
On obtient ainsi un ultrafiltrat de pH 5,5 présentant un volume d'environ 0,8 litre. Cet ultrafiltrat est soumis à une dialyse sur une membrane en ester de cellulose de porosité égale à 500 Daltons.
On obtient un dialysat qui est concentré à un volume de 100 ml par évaporation à 80°C à l'aide d'un dispositif de type ROTOVAPOR, puis lyophilisé.
On obtient 7 g d'une poudre couleur crème constituant l'extrait Hll.
Une analyse par chromatographie ionique couplée à 1'ampérornétrie et utilisant une résine échangeuse d'ions commercialisée par la Société DIONEX, montre que les oligo 3 1-3 glucanes constitutifs de la susdite poudre ont en fait 3 à 30 unités saccharidiques, le degré de polymérisation moyen étant de 20 à 30. EXEMPLE 3
Préparation d'un oligo β 1-3 glucane constitué par un hydrolysat appelé H14.
La matière première est le zymosan.
On dissout dans 2 litres d'eau déminéralisée, une quantité de 20 g de Zymosan qui est un 3 1-3 glucane extrait de Saccharomyces cerevisiae et qui est commercialisé par la Société SIGMA Chimie sous la référence Z 4250. A cette solution, on ajoute 20,4 g d'une solution concentrée d'acide sulfurique à 96% de manière à avoir une concentration finale en S04H2 de 0,1 M.
On maintient le mélange à 75-80°C pendant 6 heures.
On neutralise ensuite le milieu jusqu'à pH 6 par addition d'une solution de soude à 50%.
On effectue une ultrafiltration tangentielle à l'aide du dispositif utilisé à l'exemple 1 et équipé d'une cassette de porosité de 5000 Daltons; la pression d'entrée est de 3 bars, cette pression étant maintenue pendant l'ultrafiltration, ce qui permet le passage des molécules de poids moléculaire légèrement supérieur au seuil de coupure théorique imposé par la cassette de porosité de 5000
Daltons; 1'ultrafiltrat obtenu est soumis à une ultrafiltration supplémentaire à l'aide du même dispositif d'ultrafiltration mais équipé d'une cassette de porosité de 500 Daltons, ce grâce à quoi la solution est dessalée.
Le résultat de cette opération est concentré par évaporation à 80°C à l'aide du dispositif de type ROTOVAPOR utilisé à l'exemple 1 jusqu'à un volume de 50 ml, puis lyophilisé.
On obtient ainsi 15 g d'une poudre de couleur crème constituée d'oligo β 1-3 glucanes ayant une masse moléculaire de 500 à 5400 Daltons, c'est-à-dire de 3 à 30 unités saccharidiques; cette poudre constitue l'hydrolysat H14.
Le rendement est de 60 à 75% par rapport à la matière première.
Une analyse par chromatographie ionique couplée à 1'ampérométrie et utilisant la résine échangeuse d'ions commercialisée par la Société DIONEX Chemical Corp. sous la marque Dionex, montre que les oligo β 1-3 glucanes constitutifs de la susdite poudre ont effectivement de 3 à 30 unités saccharidiques, le degré de polymérisation moyen étant de 4 à 10. EXEMPLE 4
Préparation d'un oligo β 1-3 glucane constitué par un hydrolysat appelé H30.
La matière première est constituée par le Lichenan qui est un β 1-3 glucane extrait d'un champignon, le Cetraria islandica, commercialisé par la Société SIGMA Chimie sous la référence L6133.
On utilise comme enzyme, le CEREFLO qui est une préparation de β-glucanase produite par fermentation d'une souche bactérienne de type Bacillus subtilis et commercialisée par la Société NOVO.
On dissout 10 g de Lichenan dans 2 litres d'eau déminéralisée. A cette solution, qui est thermostatée à 30°C, on ajoue 100 unités de la susdite enzyme.
On maintient l'ensemble à 30°C pendant 2 heures.
On ultrafiltre ensuite la solution dans un système d'ultrafiltration tangentielle commercialisé par la Société MILLIPORE sous la marque Pellicon, équipé d'une cassette de porosité 10000 Daltons. le volume à
Pendant cette ultrafiltration, ultrafiltrer est rincé par un complément de 2 litres d'eau déminéralisée. L'ultrafiltrat de 4 litres obtenu à l'issue de cette opération d'ultrafiltration contient les oligo β 1-3 glucanes de masse moléculaire inférieure à 10000 Daltons; sachant que la masse moléculaire de l'unité saccharidique est d'environ 180, les oligo β 1-3 glucanes contenus dans 1'ultrafiltrat sont constitués d'au plus 50 unités saccharidiques.
La solution est ensuite concentrée à un volume de 50 ml par évaporation à 80°C à l'aide d'un dispositif de marque ROTOVAPOR, puis lyophilisé.
On obtient 8 g d'une poudre couleur crème constituant l'hydrolysat H30.
Une analyse par chromatographie ionique couplée à 1'ampérométrie et utilisant la résine échangeuse d'ions commercialisée par la Société DIONEX Chemical Corp. sous la marque Dionex, montre que les oligo β 1-3 glucanes constitutifs de la susdite poudre ont effectivement de 3 à 50 unités saccharidiques, le degré de polymérisation moyen étant de 10 à 40. EXEMPLE 5
Composition concentrée aqueuse à base de l'hydrolysat H13.
Cette composition concentrée comporte les constituants suivants:
Hydrolysat H13 200 g
Agent tensio-actif Tween 80 5g
Agent conservateur (méthylparaben sodé) 5 g
Eau 790 g 1 000 g
Pour sa mise en oeuvre, cette composition concentrée à 2 0% en poids de substance active est diluée avec une quantité d'eau suffisante pour amener la concentration en matière active dans le mélange final à la valeur de 0,05 g/1.
La composition ainsi obtenue, prête à l'emploi, peut être mise en oeuvre par pulvérisation sur les feuilles des plantes à traiter. EXEMPLE 6
Composition sous forme de poudre à base de 1 ' hydrolysat H13.
Il s'agit d'une composition soluble dans l'eau qui se présente sous la forme d'une poudre contenant la matière active et les constituants classiques.
Sa constitution est comme indiqué ci-après:
Hydrolysat H13 200 g
Kaolin en tant que charge minérale 500 g
Agent conservateur (méthylparaben sodé) 5 g Amidon purifié en tant qu'antimottant 295 g 1000 g
Pour sa mise en oeuvre par pulvérisation, cette poudre à 20% en poids de substance active est dissoute à raison de 10 g de H13 dans 1000 ml d'eau. * * * L'efficacité des oligo 3 1-3 glucanes constituant l'hydrolysat H13 a été mise en évidence sur des plants de blé infectés par la septoriose ainsi que sur des plants de vigne infectés par le champignon Botrytis cinerea.
Les expériences correspondantes sont décrites dans les exemples 7 et 8. EXEMPLE 7
Etude de l'efficacité de 1'hydrolysat H13 dans le cas du blé infecté par Septoria tritici.
Pour cette étude, on utilise 160 plantules de blé tendre d'hiver de type "Tendrai" connu pour sa sensibilité à l'égard de Septoria tritici.
On cultive ces plantules dans 16 bacs contenant chacun un lot de 10 plantules.
On forme 4 ensembles, respectivement dénommés A, B, C et D et constitués chacun de 4 bacs, autrement dit de 4 lots de 10 plantules. 5 Dans chaque ensemble - les premier et deuxième lots de plantules, qui sont des lots témoin, sont traités par pulvérisation foliaire au stade végétatif 2 feuilles (GS 12 selon l'échelle de Zadocks) par de l'eau distillée en présence de 0,1% de 10 TWEEN 20, - les troisième et cinquième lots sont traités par pulvérisation foliaire au stade végétatif 2 feuilles (GS 12 selon l'échelle de Zadocks) avec 5 ml d'une première composition conforme à l'invention comprenant, en tant que 15 substance active, l'hydrolysat H13.
La susdite composition contient dans l'eau distillée en présence de TWEEN 20: - dans 1'expérience sur 1'ensemble A, 1 mg/1 d'hydrolysat H13, 20 - dans 1'expérience sur 1'ensemble B, 2 mg/1 d'hydrolysat H13 , - dans 1'expérience sur 1'ensemble C, 10 mg/1 d'hydrolysat H13 , - dans 1'expérience sur 1'ensemble D, 100 mg/1 25 d'hydrolysat H13.
Après les susdits traitements par pulvérisation, les plantules des quatre lots de chaque ensemble sont maintenues à la température ambiante pendant 4 heures afin de laisser sécher les gouttelettes de produits à la surface des 30 feuilles. Elles sont ensuite placées en chambre climatique à 19°C le jour et 17°C la nuit, avec une photopériode de 12 heures de lumière suivie de 12 heures d'obscurité et une humidité relative de 65%. 48 heures après ce traitement, on inocule par pulvérisation aux premier et troisième lots de chaque ensemble une suspension dans l'eau en présence de 0,1% de TWEEN 20 contenant 10^ pycnospores par ml d'une souche de Septoria tritici.
Les deuxième et quatrième lots de chaque ensemble sont soumis à la même inoculation d'agent pathogène 72 heures après le traitement par l'hydrolysat H13.
Les plantules des lots témoin et celles des lots ayant été inoculés avec Septoria tritici sont placées en enceinte climatisée à 19°C le jour et 17°C la nuit, avec une photopériode de 12 heures de lumière suivie de 12 heures d'obscurité et une humidité relative de 100% durant les 96 premières heures et de 85% ensuite. 21 jours après respectivement les premier et deuxième séries d'inoculation avec Septoria tritici, on inspecte les plantules de blé des quatre ensembles de quatre lots.
On détermine - d'une part, le pourcentage de protection PP et - d'autre part, l'intensité d'infection II, tous deux exprimés en pourcent.
Les deux grandeurs sont définies par rapport aux lots témoin.
Le "pourcentage de protection" est calculé par la formule suivante: le nombre de plantes témoin le nombre de plantes traitées présentant des nécroses foliaires " présentant des nécroses foliaires le nombre de plantes témoin présentant des nécroses foliaires L'"intensité d'infection" représente le pourcentage de surface foliaire nécrosée par rapport à la surface totale de la première feuille.
Les résultats de l'ensemble de ces déterminations sont réunis dans le tableau I.
TABLEAU I
Hydrolysat mis en oeuvre Ensemble (concentration en hydrolysat de la composition de traitement) Résultats enregistrés 21 jours après Inoculation des spores 48 heures après traitement Inoculation des spores 72 heures après traitement PP% 11% PP% Il % A 1 mg/l 6,4 4,6 12,3 16,8 H 13 B 2 mg/l 34,5 30,4 58,4 85,4 C 10 mg/l 27,5 20,0 39,7 65,6 D 100 mg/I 3,3 4,5 21,9 28,8
De l'examen des résultats réunis dans le tableau I, il résulte que la pulvérisation de H13 entraîne une diminution de l'infection par Sepzoria tritici, - que le traitement doit être effectué le plus tôt possible avant une éventuelle infection par un agent pathogène, les résultats enregistrés pour une inoculation à 72 heures après le traitement étant meilleurs que ceux enregistrés pour une inoculation à 48 heures après le traitement, - que les concentrations des compositions appliquées sont avantageusement d'environ 2 à environ 10 mg/1. EXEMPLE 8
Etude de l'efficacité de l'hydrolysat K13 dans le cas de la vigne infectée par Botrytia cinerea.
Le champignon responsable de la maladie sur vigne est Botrytis cinerea Pers.
Le volume de la récolte peut être réduit de même que les qualités organoleptiques.
La lutte chimique contre l'agent responsable ne permet pas d'obtenir une protection parfaite et, de plus, certains des produits utilisés dans cette lutte entraînenent l'apparition de souches de champignon résistantes à certaines familles chimiques.
Depuis peu, des travaux montrent l'existence de mécanismes d'action entraînant la stimulation des défenses naturelles des plantes.
Pour cette étude, on prélève des feuilles sur de jeunes plants de vigne de pépinières. On pulvérise sur les faces supérieure et inférieure des feuilles l'hydrolysat H13 sous la forme de six compositions à base de cet hydrolysat H13 dans l'eau distillée et en présence de TWEEN 20, ces compositions ayant six concentrations différentes.
On installe ensuite chaque feuille sur un buvard humide dans une boîte de Pétri et, 48 heures après le traitement, on contamine en déposant 4 gouttes d'inoculum (105 conidies par ml) sur chaque feuille.
Pour caractériser la progression du champignon à la surface de la feuille, on note la fréquence, l'intensité et la formation de conidies.
Les résultats réunis sont exprimés dans le tableau II suivant en terme d'efficacité de protection par rapport au témoin.
TABLEAU II
Concentration Produit H13 0,002 mg/ml 95% 0,005 mg/ml 95 % 0,01 mg/ml 95 % 0,05 mg/ml 82 % 0,1 mg/ml 82 % 0,5 mg/ml 95 %
De l'examen des résultats réunis dans le tableau II, il résulte que la mise en oeuvre par pulvérisation de l'hydrolysat H13 entraîne une diminution de l'infection par le champignon et une protection pouvant atteindre 95% dès lors que la concentration à laquelle l'hydrolysat H13 est mis en oeuvre est de 0,002 mg/ml à 0,5 mg/ml.