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1. WO2020159063 - COMPOSITION DE MYCÉLIUM DE CHAMPIGNONS COMPLEXE AYANT UNE ACTIVITÉ AMÉLIORANT LA FONCTION DU FOIE ET SON PROCÉDÉ DE PRÉPARATION

Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2  

배경기술

3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

15   16  

과제 해결 수단

17   18   19   20   21   22  

발명의 효과

23   24   25  

도면의 간단한 설명

26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38  

발명의 실시를 위한 형태

39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91  

청구범위

1   2   3   4   5  

도면

1a   1b   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

명세서

발명의 명칭 : 간기능 개선활성을 갖는 버섯 복합균사체 조성물 및 이의 제조방법

기술분야

[1]
본 발명은 버섯균사체를 이용한 간기능 개선용 조성물에 관한 것으로, 자세하게는 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 3종류의 균사체를 쌀보리 배지에 혼합 접종하여 복합 버섯균사체를 제조하고, 이 혼합 버섯균사체의 추출물을 통해 간기능 개선에 효과를 얻도록 한 간기능 개선활성을 갖는 버섯 복합균사체 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
[2]

배경기술

[3]
생체의 기능은 산화작용과 항산화 작용의 균형에 의해 유지되며. 각종 장기의 세포는 물론, 피부 세포와 혈관의 내피세포 등도 이 산화작용의 영향을 받아 활성화되거나, 기능저하 혹은 노화작용을 일으키게 된다. 또한, 면역작용을 비롯하여 암의 발생과 암세포에 대한 항암활성 및 미생물 감염에 대한 생체 방어 작용도 산화/항산화 작용에 의해 영향을 받게 된다.
[4]
최근 환경오염과 식생활 패턴의 변화와 비만 및 사회생활 속에서 심리적 스트레스의 증가 등이 원인이 되어 심혈관계 질환과 대사성 질환과 같은 이른바 성인병이라 불리우는 질병에 걸리는 환자가 급격히 증가하고 있으며, 특히 간(liver) 관련 질환인 지방간, 간경화, 간경변, 간암 혹은 간염 등에 걸리는 환자도 갈수록 증가하는 추세이다.
[5]
간은 지방의 대사와 영양성분의 처리, 에너지원의 공급 등 생체에 있어 실로 다양한 기능을 담당하고 있는 조직으로, 간에 바이러스 감염이나 암이 발생하여 간 기능이 저하될 경우 심혈관계는 물론 영양대사에 있어 중대한 이상이 생겨 생체기능에 지장을 초래한다
[6]
하지만, 국내·외에서 간기능과 관련된 많은 연구가 진행되고 있음에도 여전히 획기적인 방안이 소개되지 않고 있으며, 그 이유들 중에는 개발된 후보물질 자체가 간조직 등에 세포독성을 나타내고, 특히 in vitro 및 in vivo 결과 간 차이가 크다는 점이 지적되고 있다.
[7]
따라서 관련분야 연구에서는 간기능 조절용 약제보다 부작용이 없는 천연소재를 기능성 식품 재형으로 개발하는 기술이 효과적일 것으로 기대되고 있으나, 지금까지 국외에서 보고된 약 10여 종의 활성성분 및 물질들은 모두 간독성 및 부작용이 심하며 용도가 의문시되고 있다.
[8]
간의 기능이 저하되는 원인의 하나로서 간조직에서 산화작용이 극심하게 발생할 경우 간세포(hepatocyte)의 기능이 감소하여 생체기능에 총체적인 저하가 일어나게 된다. 예로서 알코올을 대량으로 섭취할 경우, 알코올에 대한 분해능이 저하되어 숙취에 걸리게 되며, 간기능 저하로 인해 바이러스 감염과 같은 미생물 감염에 취약하게 되어 감염에 걸리기 쉽게 되며, 또한 간기능이 약화되면 혈중 콜레스테롤의 수치가 증가하여 고지혈증 등을 유발하게 된다.
[9]
특히 성인에 있어서 신체의 기능이 전반적으로 저하된 상태여서 간의 기능이 저하될 경우, 각종 감염증은 물론 심장병, 고지혈, 고혈압과 같은 심혈관계 질환 혹은 당뇨와 같은 대사성 질환에 걸리기 쉬우므로 간기능 개선은 성인의 건강유지에 대단히 중요하므로 부작용이 없는 천영소재를 활용한 간기능 개선식품의 요구가 증대되고 있었다.
[10]
[11]
[선행기술문헌]
[12]
[특허문헌]
[13]
대한민국 공개특허 제10-2007-0005950호(2007.01.11)
[14]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[15]
본 발명은 상기와 같은 필요에 의해 창출된 것으로, 본 발명의 목적은 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 3종류의 균사체를 쌀보리 배지에 혼합 접종하여 복합 버섯균사체를 제조하고, 이 혼합 버섯균사체의 추출물을 통해 제조된 간기능 개선활성을 갖는 버섯 복합균사체 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
[16]

과제 해결 수단

[17]
상기와 같은 목적을 위해 본 발명 간기능 개선식품의 제조방법은 a) 쌀보리를 수침 및 탈수하여 배지를 형성하는 단계; b) 상기 배지의 pH 조건을 맞추는 단계; c) 상기 배지를 멸균하는 단계; d) 상기 배지에 복합 버섯종균을 접종하는 단계; e) 접종된 배지를 배양하는 단계; f) 배양된 복합 버섯균사체를 건조 후 분쇄하는 단계; g) 분쇄된 버섯균사체를 열수 추출 및 농축하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
[18]
이때 상기 버섯종균은, d-1) 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종 후 각 버섯의 균사체를 별도로 배양하는 단계; d-2) 상기 d-1) 단계에서 배양된 3종의 균사체를 POB(Potato Dextrose Broth)에 복합접종하는 단계; d-3) 3종의 균사체가 접종된 POB를 4~6주간 배양하는 단계; 를 통해 제조되는 것이 바람직하다.
[19]
또한, 상기 c)단계는, 배지를 110 내지 130℃에서 30분 내지 1시간 30분 멸균 후 냉각시키는 것이 바람직하다.
[20]
또한, 상기 d) 단계는 쌀보리 배지 1㎏ 당 0.03 ~ 0.3% 중량의 복합버섯종균을 접종하는 것이 바람직하다.
[21]
또한, 본 발명 간기능 개선식품은 앞서 서술된 제조방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 한다.
[22]

발명의 효과

[23]
본 발명은 천연소재인 3종 혼합 버섯균사체는 재배하여 생산하는 방식으로 공간의 절약과 위생적인 제품생산이 가능하다.
[24]
특히 차가, 영지, 상황 등 3종류의 버섯 균사체를 복합하여 제조한 3종 혼합 버섯균사체는 알콜에 의해 유도되는 간독성에 대해 우수한 억제효과를 나타내며, 항산화 활성은 물론 높은 항염증 활성을 나타낸다.
[25]

도면의 간단한 설명

[26]
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 간기능 개선식품의 제조방법을 나타낸 공정도로서, 도 1a의 (A)와 도 1b의 (A')가 연결되어 순차적으로 공정이 진행된다.
[27]
도 2는 3종 버섯균사체의 알콜성 간독성 억제효과를 나타낸 그래프이다.
[28]
도 3은 3종 버섯균사체의 혈중 LDH 감소효과를 나타낸 그래프이다.
[29]
도 4는 알콜 유도 체중감소에 대한 3종 버섯균사체의 억제효과를 나타낸 그래프이다.
[30]
도 5는 알콜 유도 간 중량 감소에 대한 3종 버섯균사체의 억제효과를 나타낸 그래프,
[31]
도 6은 버섯균사체의 간조직 내 항산화 효소 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프,
[32]
도 7은 버섯균사체의 항산화 활성 비교를 나타낸 그래프,
[33]
도 8은 버섯균사체 시료의 세포독성을 나타낸 그래프,
[34]
도 9는 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 NO 생성억제를 나타낸 그래프,
[35]
도 10은 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 TNF-a 생성억제를 나타낸 그래프,
[36]
도 11은 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 IL-6 생성억제를 나타낸 그래프,
[37]
도 12는 각 버섯균사체의 폴리페놀 함량 비교를 나타낸 그래프이다.
[38]

발명의 실시를 위한 형태

[39]
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명 간기능 개선활성을 갖는 버섯 복합균사체 조성물 및 이의 제조방법을 구체적으로 설명한다.
[40]
본 발명에서 개선하고자 하는 간기능은 간세포의 항산화 작용을 높여줌으로 상당부분 개선할 수 있으며, 항산화 물질은 flavonoid계의 물질을 다량으로 포함하는 식물체 추출물에 많이 함유되어 있다. 즉 항산화 물질을 다량으로 포함하는 식물 추출물을 이용하여 간기능 개선 식품을 개발하여 성인병을 예방하는데 도움이 될 수 있다.
[41]
간기능 개선에 유효한 물질로는 밀크씨슬 추출물에 함유되어있는 실리마린이 효과가 있는 것으로 알려져있다. 비 간염 바이러스성 만성 간질환을 치료하는 약제로는 ursodeoxycholic acid(UDCA)와 간은 담즙산 조절약제, 간 추출물, 비타민 복합제, 아르긴 등의 간대사 촉진제, citioxo 등의 독성제거 활성물질 등이 주로 사용되어 왔으나, 이들 대부분은 합성화합물이므로 부작용이 문제되고 있으며 아직 그 효과가 만족스럽지 못한 상태이다.
[42]
본 발명에서 사용되는 버섯은 일반적으로 다양한 생리활성을 갖는 성분인 β-Glucan을 다량 함유하고 있으며, 이 β-Glucan이은 신약개발의 소재로서 뿐만 아니라 기능성 식품소재로 주목을 받고 있다.
[43]
이에 버섯의 인공배양을 통해 버섯균사체를 생산, 가공한 제품 역시 다양하게 개발되고 있지만, 몇 기능성 물질로 인정받은 버섯균사체 등이 신약으로 제품화된 것 외에는 다양한 시도와 달리 단순 가공식품 외에 뚜렷한 식품 소재화를 찾기가 어려운 실정이다.
[44]
이에 본 발명에서는 단순히 하나의 버섯이 아닌, 차가, 영지 및 상황버섯 등 3종류의 약용버섯을 농산물 배지에서 복합 배양하여 얻은 혼합형 버섯균사체를 소재로 한 간기능 개선 식품소재를 제공하고자 하며, 과학적 분석과 효능 입증을 통해 다양한 형태의 제품 개발과 시장에서의 경쟁력을 확보할 수 있다.
[45]
[46]
1. 실시예
[47]
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 간기능 개선식품의 제조방법을 나타낸 공정도로서, 본 발명 간기능 개선식품은 서술된 제조방법을 통해 제조된다.
[48]
a) 쌀보리를 수침 및 탈수하여 배지를 형성하는 단계에서는 배지용 쌀보리를 세척 후 4 ~ 8시간 수침하여 복합배양을 위한 수분조건으로 수분함량이 전체 중량 10 ~ 20%, 바람직하게는 15% 수준으로 맞추게 된다.
[49]
b) 상기 배지의 pH 조건을 맞추는 단계에서는 적정량의 탄산칼슘을 첨가하여 배지의 pH를 7.0 ~ 7.2로 맞추게 된다.
[50]
c) 상기 배지를 멸균하는 단계에서는 수분와 pH 조건을 맞춘 쌀보리 배지를 1㎏단위로 포장 후 110 내지 130℃에서 30분 내지 1시간 30분 멸균 후 냉각하게 된다. 바람직하게는 121℃에서 1시간 멸균 후 22 ~ 24℃로 맞추게 된다.
[51]
d) 상기 배지에 복합 버섯종균을 접종하는 단계에서는 쌀보리 배지 1㎏당 0.03 ~ 0.3% 중량의 복합버섯종균을 접종하게 된다.
[52]
이때 접종되는 복합 버섯종균은 d-1) 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종 후 각 버섯의 균사체를 별도로 배양하는 단계, d-2) 상기 d-1) 단계에서 배양된 3종의 균사체를 POB(Potato Dextrose Broth)에 복합접종하는 단계, d-3) 3종의 균사체가 접종된 POB를 4~6주간 배양하는 단계를 통해 제조된다.
[53]
이때 배지 100중량 대비 자실체 조직을 30중량부 접종하게 된다.
[54]
e) 접종된 배지를 배양하는 단계에서는 배지를 30 ~ 40일 암배양한다.
[55]
f) 배양된 복합 버섯균사체를 건조 후 분쇄하는 단계에서는 배양된 복합 버섯균사체를 57 ~ 60℃에서 건조 후 분쇄한다.
[56]
g) 분쇄된 버섯균사체를 열수 추출 및 농축하는 단계에서는 분쇄된 버섯균사체 중량 대비 10배의 증류수로 혼합하여 70 ~ 72℃에서 10 ~ 12시간 추출하게 된다. 이후 추출된 총 부피의 1/5 수준으로 농축시키게 된다. 이 단계에서 농출된 추출물을 기능식품 재료로 사용할 수도 있으나, 이를 분말화시킴으로 더욱 활용범위를 다양화할 수 있다.
[57]
h) 이후 농축된 추출물을 건조 후 열풍 건조(HD; Heat dry)에 의해 분말화하게 되며, HD 조건은 80℃에서 6 ~ 8시간 건조하게 된다.
[58]
[59]
2. 실험방법
[60]
1) 세포독성 시험: RAW 264.7세포에 각 시료를 여러 농도로 희석하여 24시간 배양 후, MTT법에 의해 세포독성을 측정하였다.
[61]
2) 마우스 알콜성 간질환 모델: 5주령의 수컷 Balb/c 마우스에 25% ethanol을 5g/kg의 투여량으로 1일 1회 총 7일간 경구투여하여 알콜성 간질환을 유발하였다.
[62]
3) 시료의 투여: 양성대조군을 비롯하여 두 종류의 공시시료는, 에탄올 투여개시 2일전부터 각각 2mg/mouse의 양으로 1일 1회 총 9일간 경구투여하였다.
[63]
4) 생화학적 분석: 에탄올 투여 종료 후 1일째의 혈청시료를 이용하여 혈중 GTP(ALT), GOT(AST) 및 LDH를 정량하고, 에탄올 투여 종료 후 1일째의 간 조직을 lysis하여 간 조직 중의 SOD 및 catalase를 정량하였다.
[64]
5) 시료의 안전성(in vivo 테스트): 마우스의 체중 측정과 혈청학적 분석을 통한 간독성 테스트를 통해 시료에 의한 독성유도 유무를 판정하였다.
[65]
6) 항염증 활성측정: 항염증 실험은 RAW 264.7 대식세포에 LPS(100 ng/ml)로 자극하여 염증을 유발시키는 모델을 이용함. 각 시료를 여러 농도로 LPS 자극 12시간 전에 처리하고, LPS 자극 후 24시간 배양하였다. 배양 후 세포배양액 중의 염증성 인자(NO, TNF-a, IL-6)를 ELISA에 의해 정량하였다.
[66]
7) 항산화 활성측정 시험: 각 시료의 항산화 활성은 1.1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl을 이용한 DPPH법을 이용하여 측정함. 양성대조군으로는 50 ug/ml 농도의 BHT를 처리하였다.
[67]
8) 통계학적 유의성은 에탄올만을 처리한 그룹에 대해 Student’s two tailed t-test를 통해 검토하였다.
[68]
[69]
3. 실험결과
[70]
1) 알콜성 간독성 억제효과
[71]
도 2는 3종 버섯균사체의 알콜성 간독성 억제효과를 나타낸 그래프로서, 혈청 중의 GOT 및 GPT를 정량하여 시료의 간질환 억제활성을 판정한 결과, 에탄올 투여에 의해 상승한 혈중 GOT/GPT의 수치가 모든 버섯균사체 투여에 의해 감소하였다. 특히 3종 혼합균사체는 각각을 버섯균사체를 단독으로 처리한 경우보다 높은 억제효과를 나타내었다.
[72]
도 3은 3종 버섯균사체의 혈중 LDH 감소효과를 나타낸 그래프로서, 질환 발생 시 간세포의 손상에 의해 간세포 내에 있던 LDH효소의 혈중 농도가 높아지는 것으로 알려졌다. 알콜 투여에 의해 유도된 간질환에서 혈중 LDH 농도 상승에 대한 버섯 균사체 시료의 억제효과를 관찰한 결과, 에탄올 투여에 의한 LDH 혈중농도 상승의 억제효과는 3종 혼합 버섯균사체에서 가장 감소하는 것으로 나타났다.
[73]
도 4는 알콜 유도 체중감소에 대한 3종 버섯균사체의 억제효과를 나타낸 그래프, 도 5는 알콜 유도 간 중량 감소에 대한 3종 버섯균사체의 억제효과를 나타낸 그래프로서, 알콜성 간질환에 의해 유도되는 체중과 간 중량의 감소에 대한 억제효과에서도 3종 혼합 버섯균사체가 가장 높은 효과를 나타내었다.
[74]
도 6은 버섯균사체의 간조직 내 항산화 효소 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프로서, 한편 간조직 내 항산화 효소인 SOD와 catalase의 발현을 측정한 결과, 3종 혼합 버섯균사체 투여는 SOD의 발현만을 약간 상승시키는 것으로 나타났다.
[75]
2) 버섯균사체의 항산화 효과
[76]
도 7은 버섯균사체의 항산화 활성 비교를 나타낸 그래프로서, DPPH법에 의해 각 시료의 항산화 활성을 측정한 결과, 3종 혼합균사체가 가장 높은 활성을 보임. 양성대조군인 BHT은 50 ug/ml에서 저해율 10%를 나타났다.
[77]
3) 버섯균사체의 항염증 효과
[78]
도 8은 버섯균사체 시료의 세포독성을 나타낸 그래프로서, RAW 264.7세포를 이용하여 항염증 활성을 측정하였다. 우선 이 세포에 대한 각 시료의 세포독성을 측정한 결과, 모든 버섯균사체 시료가 500 ug/ml의 농도까지는 안전한 것으로 확인되었다.
[79]
도 9는 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 NO 생성억제를 나타낸 그래프, 도 10은 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 TNF-a 생성억제를 나타낸 그래프, 도 11은 염증세포에 대한 버섯균사체 시료의 IL-6 생성억제를 나타낸 그래프로서, 세포독성이 없음을 확인한 후, 염증인자인 NO에 대한 생성억제를 조사한 결과, 3종 혼합 버섯균사체가 가장 높은 항염증 효과를 나타내었다. 또한, TNF-a와 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 분비에서도 3종 혼합 버섯균사체가 가장 높은 억제효과를 보였다.
[80]
4) 버섯균사체 폴리페놀의 정량
[81]
도 16은 각 버섯균사체의 폴리페놀 함량 비교를 나타낸 그래프로서, 각 버섯균사체의 폴리페놀 함량을 정량한 결과, 3종 혼합 버섯균사체가 가장 많은 함량의 폴리페놀을 함유하는 것으로 확인되었다.
[82]
[83]
4. 결과 요약
[84]
1) 3종 버섯균사체는 알콜에 의해 유도되는 간독성을 억제하는 효과가 있으며, 이 효과는 각 버섯균사체 단독 처리군에 비해 높은 것으로 확인되었다.
[85]
2) 3종 혼합 버섯균사체에 의한 간독성 억제효과는 간조직 내 항산화 효소인 SOD 발현의 상승과 관련있는 것으로 추정되었다.
[86]
3) 3종 혼합 버섯균사체는 다른 단독의 버섯균사체에 비해 높은 항산화 활성을 지니는 것으로 나타났다.
[87]
4) 간독성에 대한 억제효과와 더불어, 3종 혼합 버섯균사체는 높은 항염증 활성을 나타내었다.
[88]
5) 3종 혼합 버섯균사체의 열수 추출물은 높은 항염증 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
[89]
6) 3종 혼합 버섯추출물은 각각의 단독 버섯추출물에 비해 많은 폴리페놀을 함유하고 있는 것으로 확인되었다.
[90]
[91]
본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

청구범위

[청구항 1]
a) 쌀보리를 수침 및 탈수하여 배지를 형성하는 단계; b) 상기 배지의 pH 조건을 맞추는 단계; c) 상기 배지를 멸균하는 단계; d) 상기 배지에 복합 버섯종균을 접종하는 단계; e) 접종된 배지를 배양하는 단계; f) 배양된 복합 버섯균사체를 건조 후 분쇄하는 단계; g) 분쇄된 버섯균사체를 열수 추출 및 농축하는 단계; 를 포함하는 것을 것을 특징으로 하는 간기능 개선식품의 제조방법.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 버섯종균은, d-1) 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종 후 각 버섯의 균사체를 별도로 배양하는 단계; d-2) 상기 d-1) 단계에서 배양된 3종의 균사체를 POB(Potato Dextrose Broth)에 복합접종하는 단계; d-3) 3종의 균사체가 접종된 POB를 4~6주간 배양하는 단계; 를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 간기능 개선식품의 제조방법.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 c)단계는, 배지를 110 내지 130℃에서 30분 내지 1시간 30분 멸균 후 냉각시키는 것을 특징으로 하는 간기능 개선식품의 제조방법.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 d) 단계는 쌀보리 배지 1㎏ 당 0.03 ~ 0.3% 중량의 복합버섯종균을 접종하는 것을 특징으로 하는 간기능 개선식품의 제조방법.
[청구항 5]
제1항의 제조방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 간기능 개선식품.

도면

[도1a]

[도1b]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]

[도11]

[도12]