Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

Aller à Demande

1. WO2020156593 - PROTÉINE ANTI-DERMATITE ATOPIQUE

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9  

附图

1A   1B   2A   2B   3   4A   4B   5  

说明书

发明名称 : 抗特应性皮炎的蛋白

技术领域

[0001]
本发明属于生物技术领域。

背景技术

[0002]
特应性皮炎(atopic dermatitis,简称AD)是一种慢性皮肤疾病,其特征在于干燥,瘙痒和红斑湿疹以及炎性细胞的选择性积累。AD病情易反复,不易治愈,导致患者的身体健康和生活质量都受到严重影响。AD的发病是基因遗传、环境因素、皮肤屏障功能缺陷及免疫异常等多个方面共同作用的结果,到目前为止对其发病机制尚未完全阐明。近些年,AD的发病率逐年升高,AD的治疗成为备受关注的重要课题。当前AD的治疗多使用抗组胺和类固醇激素等激素类药物,长期使用会产生耐药性和皮肤萎缩等副作用。
[0003]
幽门螺杆菌的毒力因子有幽门螺杆菌-中性粒细胞激活蛋白(Helicobacter pylori neutrophil-activating protein,Hp-NAP)、CagA、CagPAI、VacA、OipA、BabA等,均可引起炎症反应。本实验室提交了Hp-NAP的编码基因序列(Genebank登录号AY366361),还利用基因工程技术将其克隆表达得到幽门螺杆菌-中性粒细胞激活蛋白(Hp-NAP),还利用基因工程技术将麦芽糖结合蛋白(MBP)与Hp-NAP进行融合得到rMBP-NAP融合蛋白,对该蛋白的研究有:Wang,T.,et al.International Immunopharmacology 29.2(2015):876-883。
[0004]
发明内容
[0005]
本发明公开了Hp-NAP(幽门螺杆菌-中性粒细胞激活蛋白)抗特 应性皮炎的用途,其编码基因可在Genebank查询登录号AY366361得到;本发明还公开了Hp-NAP与MBP的融合蛋白rMBP-NAP抗特应性皮炎的用途。本发明的Hp-NAP、rMBP-NAP亦可联用用于抗特应性皮炎。
[0006]
本发明还对应公开了含上述活性蛋白的抗特应性皮炎药物组合物,该药物组合物含有药学上可接受的载体,剂型可为注射剂,如粉针剂或注射液,给药方式可为腹腔注射。
[0007]
本申请人通过恶唑酮诱导的AD模型发现,Hp-NAP、rMBP-NAP均可有效治疗AD,为AD治疗提供了全新的药物。

附图说明

[0008]
图1A为Hp-NAP抗AD试验的各实验组对AD小鼠耳厚影响的分析;
[0009]
图1B为Hp-NAP抗AD试验的各实验组对AD小鼠全身及耳部拍照的分析,箭头表示对耳部局部的放大;
[0010]
图2A为Hp-NAP抗AD试验的各实验组小鼠耳部组织表皮层厚度的统计分析;
[0011]
图2B为Hp-NAP抗AD试验的各实验组小鼠耳部肥大细胞数的统计分析;
[0012]
图3为rMBP-NAP抗AD试验的各实验组对AD小鼠耳厚影响的分析;
[0013]
图4A为rMBP-NAP抗AD试验的各实验组小鼠耳部组织表皮层厚度的统计分析;
[0014]
图4B为rMBP-NAP抗AD试验的各实验组小鼠耳部肥大细胞数的统计分析;
[0015]
图5为rMBP-NAP抗AD试验的各实验组给药后小鼠肝脏重量的统计分 析;
[0016]
以上各图可能涉及的图示的统一含义:*表示p<0.05,**表示p<0.01,***表示P<0.001。

具体实施方式

[0017]
一、Hp-NAP蛋白对OXA诱导的特应性皮炎模型小鼠的治疗作用
[0018]
实验方法:
[0019]
AD小鼠模型给药:
[0020]
a.购买7周龄雌性的BALB/C小鼠,在实验室饲养一周后,将小鼠随机分为4组—空白对照组、致敏组、HP-NAP蛋白给药组、地塞米松给药组(每组各6只),放在独立通风笼盒中饲养,并做好标记。
[0021]
b.将8周龄的BALB/C小鼠背部剃毛约2cm X 2cm面积,24小时后用5%恶唑酮(Oxazolone)致敏液20μL于BALB/c小鼠背部涂抹致敏,空白对照组小鼠背部涂抹20μL丙酮橄榄油溶液。
[0022]
c.一周后,将0.3%的恶唑酮溶液20μL涂于小鼠耳部内侧,用于耳部激发(空白对照组用丙酮:橄榄油4:1代替),每周三次。
[0023]
d.HP-NAP蛋白给药方案:在建模后第0天起开始腹腔给药,每周3次,共7次,每次给药200ug/0.2ml。在0-14天,每次耳部激发一小时后,对各组小鼠分别给药:致敏组于腹腔注射200μL PBS溶液;HP-NAP蛋白给药组于腹腔注射200μg/0.2mL HP-NAP蛋白溶液;地塞米松给药组于腹腔注射200μg/0.2mL地塞米松 (DEX)溶液。每周三次给药,第16天牺牲小鼠。
[0024]
AD小鼠皮损严重程度检测:
[0025]
在-7-16天,每天用测厚规测量小鼠耳廓部位厚度,测量在致敏或激发之前完成,观察AD模型各实验组小鼠皮损情况并拍照。
[0026]
AD小鼠的病理组织学检测:
[0027]
a.在AD模型的小鼠发病第16天时,麻醉剂牺牲小鼠,剪下BALB/c小鼠发病的耳部组织,并将其置于4%多聚甲醛固定液中固定24h以上。
[0028]
b.对小鼠耳部组织进行石蜡包埋处理后,将其切割制成6μm切片,耳部组织均进行H&E染色,H&E切片拍照后,并使用ImageJ软件分析照片,统计耳部表皮厚度。
[0029]
c.对小鼠耳部组织进行石蜡包埋处理后,将其切割制成6μm切片,耳部组织均进行甲苯胺蓝染色,切片拍照后,并使用ImageJ软件分析照片,统计耳部组织中炎症细胞的浸润情况。
[0030]
实验结果:
[0031]
1、HP-NAP蛋白对特应性皮炎小鼠症状的改善
[0032]
致敏组:从第7天开始,小鼠耳朵肿胀程度明显增加,耳部红肿程度严重,直至第14-16天,逐渐形成结痂,发生苔藓样硬化。
[0033]
HP-NAP治疗组:在14-16天时,与致敏组相比,小鼠的特应性皮炎耳部未出现结痂且红胀现象明显得到抑制,耳厚减轻。
[0034]
其中,耳厚数据统计见图1A,牺牲小鼠前耳朵照片如图1B所示,显然,HP-NAP蛋白组与致敏组相比有明显差异。
[0035]
2、AD小鼠的病理组织学检测
[0036]
H&E染色分析表明,致敏组出现皮肤角质层遭到破坏,真皮层增厚,大量炎症细胞浸润,血管扩张的现象;而在HP-NAP给药组中没有明显的炎症细胞的渗出,表皮呈轻微增厚,角质层完整,血管无明显扩张,即HP-NAP蛋白给药组治疗效果较为显著(见图2A)。
[0037]
对耳部组织进行甲苯胺蓝染色,观察致敏组耳部组织中肥大细胞浸润情况。结果表明,致敏组耳部表皮层附近有大量被染成紫色或紫红色颗粒,即肥大细胞。而HP-NAP给药组耳部甲苯胺蓝染色分析表明,耳部表皮附近肥大细胞数目减少,肥大细胞浸润的现象减轻(见图2B)。
[0038]
二、rMBP-NAP蛋白对OXA诱导的特应性皮炎模型小鼠的治疗作用
[0039]
实验方法:
[0040]
AD小鼠模型给药:
[0041]
a、将7周龄的BALB/C小鼠背部剃毛约2cm 2,12小时后用5%恶唑酮致敏液20μL于BALB/c小鼠背部致敏,空白对照组小鼠背部涂抹20μL丙酮橄榄油溶液。
[0042]
b、一周后,将0.3%的恶唑酮Oxazolone溶液20μL涂于小鼠耳部内侧,用于耳部激发(空白对照组用丙酮:橄榄油4:1代替),每周三次。
[0043]
c、将小鼠随机分为4组——空白对照组、致敏组、rMBP-NAP融合蛋白给药组、地塞米松给药组(每组各6只),放在独立通风笼盒中饲养,并做好标记。
[0044]
d、rMBP-NAP融合蛋白给药方案:在建模后第0天起开始腹腔给药,每周三次,共十次,每次给药200ug/0.2ml。在0-21天时,每次耳部激发一小时后,对各组小鼠分别给药:致敏组于腹腔注射200μL PBS溶液;rMBP-NAP融合蛋白给药组于腹腔注射200μg/0.2mL rMBP-NAP融合蛋白溶液;地塞米松给药组于腹腔注射200μg/0.2mL地塞米松(DEX)溶液。每周三次给药,在实验22天时处死小鼠。
[0045]
AD小鼠皮损严重程度检测:
[0046]
在-7-22天时,每天用测厚规测量小鼠耳廓部位厚度,测量在致敏或激发之前完成,观察AD模型各实验组小鼠皮损情况并拍照。
[0047]
AD小鼠的病理组织学检测:
[0048]
a、在AD模型的小鼠发病高峰期(第16天)时,麻醉剂处死小鼠,剪下BALB/c小鼠发病的耳部组织,并将其置于4%多聚甲醛固定液中固定24h以上。
[0049]
b、对小鼠耳部组织进行石蜡包埋处理后,将其切割制成6μm切片,耳部组织均进行H&E染色,并于显微镜下观察耳部组织的病理学形态。
[0050]
c、耳部H&E切片拍照后,并使用ImageJ软件分析照片,统计耳部组织中炎症细胞的浸润情况。
[0051]
AD小鼠的脏器指数分析:
[0052]
AD模型小鼠给药治疗后,于第22天注射200ul 1%戊巴比妥钠麻醉致死。小鼠腹部解剖,取出脾脏组织和肝脏组织,使用吸水纸吸干 残余液体,称量并记录数据。统计分析AD小鼠给药后各组之间脏器指数差异。
[0053]
实验结果:
[0054]
1、rMBP-NAP蛋白对特应性皮炎小鼠症状的改善
[0055]
致敏组:小鼠耳朵肿胀程度增加,开始逐渐形成结痂,发生苔藓样硬化。在第15-22天时,耳厚增加,耳部红肿程度严重,出现明显结痂现象。
[0056]
rMBP-NAP治疗组:小鼠的特应性皮炎耳部红胀明和结痂现象明显得到抑制,耳厚减轻。在16天发病高峰期时,与致敏组相比,rMBP-NAP组耳部红肿和结痂情况得到显著改善(见图3)。
[0057]
2、AD小鼠的病理组织学检测
[0058]
H&E染色分析表明,致敏组出现皮肤角质层遭到破坏,真皮层增厚,大量炎症细胞浸润,血管扩张的现象;而在rMBP-NAP给药组中没有明显的炎症细胞的渗出,表皮呈轻微增厚,角质层完整,血管无明显扩张,即rMBP-NAP融合蛋白给药组治疗效果较为显著(见图4A)。对耳部组织进行甲苯胺蓝染色,观察致敏组耳部组织中肥大细胞浸润情况。结果表明,致敏组耳部表皮层附近有大量被染成紫色或紫红色颗粒,即肥大细胞。而rMBP-NAP给药组耳部甲苯胺蓝染色分析表明,耳部表皮附近肥大细胞数目减少,肥大细胞浸润的现象减轻(详见图4B)。
[0059]
3、脏器指数分析:
[0060]
如图5所示,肝脏脏器指数分析结果显示,各组之间没有明显差异。

权利要求书

[权利要求 1]
蛋白用于制备抗特应性皮炎药物的用途,所述蛋白为Hp-NAP和/或rMBP-NAP。
[权利要求 2]
抗特应性皮炎的药物组合物,该药物组合物包含蛋白及其药学上可接受的载体,所述蛋白为Hp-NAP和/或rMBP-NAP。
[权利要求 3]
如权利要求2所述的药物组合物,其特征是,所述药物组合物为注射剂。
[权利要求 4]
如权利要求2或3所述的药物组合物,其特征是,所述药物组合物为粉针剂或注射液。
[权利要求 5]
如权利要求4所述的药物组合物,其特征是,所述药物组合物的给药方式为腹腔注射。
[权利要求 6]
用蛋白治疗特应性皮炎的方法,所述蛋白为Hp-NAP和/或rMBP-NAP。
[权利要求 7]
如权利要求6所述的方法,其中,所述蛋白通过注射方式给药。
[权利要求 8]
如权利要求6所述的方法,其中,所述蛋白为粉针剂或注射液形式。
[权利要求 9]
如权利要求6所述的方法,其中,所述蛋白通过腹腔注射方式给药。

附图

[ 图 1A]  
[ 图 1B]  
[ 图 2A]  
[ 图 2B]  
[ 图 3]  
[ 图 4A]  
[ 图 4B]  
[ 图 5]