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1. CN107250147 - Universal methylation profiling methods

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通用甲基化分析方法


技术领域
本申请要求于2015年12月17日提交的美国序列号14/973,637和于2014年12月19日提交的美国临时申请号62/094,850的优先权,其内容在此通过引用以其整体并入本文。
在整个本申请中,引用了多个出版物。这些引用的全部对比文件被直接放置在权利要求书的前面。这些出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本申请中以更充分地描述本发明所涉及的现有技术。
背景技术
DNA甲基化是具有多个调节功能(比如X染色体失活、基因组印迹和反转录转座的抑制)的重要的表观遗传学机制(Goll and Bestor 2005)。这种甲基化方法涉及通过被称为DNA甲基转移酶(Mtases)的酶甲基从S-腺苷L-甲硫氨酸(AdoMet)转移到胞嘧啶(C)的C5碳以产生5-甲基胞嘧啶(5mC)(Goll and Bestor,2005)。人类基因组包含~2800万个CpG位点,其中约70%在胞嘧啶的5位处甲基化(爱德华兹等,2010(Edwards et al.,2010))。异常或反常的DNA甲基化已经与越来越多的人类疾病有关,该人类疾病包括免疫缺陷、着丝粒不稳定(Centromere instability)和面部异常(ICF)综合症、脆性X综合征以及其它的发育疾病、年龄相关的神经变性病症、糖尿病和癌症有关(罗伯森等,2005(Robertson et al.,2005),由Goll和Bestor修订,2005)。因此,越来越多地研究了DNA甲基化状态的表观遗传变化在正常表型改变和疾病相关的表性改变两者中的作用,包括由NIH发起的路标表观基因组项目(Roadmap Epigenomics Project)以建立多种细胞类型的参考表观组。为了完成所述目标,可以以单碱基分辨率和高通量全面地分析DNA甲基化状态的全基因组方法和技术是至关重要的(苏祖基等,2008,莱尔德,2010(Suzuki et al.,2008,Laird,2010))。
已经开发了超过30种甲基化分析技术,但是其都具有缺点(莱尔德,2010(Laird,2010))。认为由苏珊克拉克(Susan Clark)和玛丽安弗罗默(Marianne Frommer)在1994年报道的亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)(克拉克等,1994(Clark et al.,1994))是最有用的方法。然而,BGS具有一些严重缺点:(1)在亚硫酸氢盐转化产生序列时存在严重的序列信息丢失,所述序列不能与基因组对齐;(2)对GC富集序列的强烈偏好(爱德华兹等,2010(Edwardset al.,2010));(3)亚硫酸氢盐转化人工产品(artifacts),以及(4)由于在严苛反应条件下的高速链断裂,需要大量的长起始DNA(瓦内克等,2002,1997(Warnecke et al.,2002,1997))。尽管超过30项技术的发展,实现了鉴定DNA的甲基化状态(甲基化组分析),全基因组甲基化模式的确定依然是麻烦的且昂贵的(Clark et al.,1994)。为进一步促进全基因组DNA甲基化分析,需要克服上述局限性的重大改进或新方法。
发明内容
本发明提供了一种化合物,其具有以下结构:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。
本发明还提供了一种物质组合物,其包含具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
所述化合物与CpG甲基转移酶相连接。
本发明还提供了一种产生双链DNA衍生物的方法,其包含使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触:
其中R是能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化学基团,其是在使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合的条件下进行,从而产生所述双链DNA衍生物,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n是1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。
本发明还提供了一种确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;
b)通过在步骤a)中产生的衍生物的光转化制备U类似物;
c)独立地获得所述双链DNA衍生物的单链;
d)对在步骤c)中获得的所述单链进行测序;以及
e)将在步骤d)中测定的所述单链的序列与没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链的序列进行比对,
其中在衍生物单链的所述单链中存在尿嘧啶类似物,其替代在没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链中的预定位置上的胞嘧啶,表明了在所述双链DNA的所述位置上的所述胞嘧啶是未甲基化的。
本发明还提供了一种衍生的DNA分子,其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R'是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R″、CN、NO 2 、C(O)R″、S(O) 2 NHR″;
其中X是O或NR';
其中R″是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R'是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。
本发明还提供了一种衍生的DNA分子,其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R″是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。
本发明还提供了一种用于衍生双链DNA分子或者用于确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的试剂盒,其包含:
a)具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)使用说明书。
本发明还提供了一种确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)确定在所述双链DNA中的预定位置上的胞嘧啶是否被所述化学基团R所修饰,
其中在所述双链DNA中预定位置上的所述胞嘧啶被所述化学基团修饰表示在所述双链DNA中的所述位置上的所述胞嘧啶为未甲基化的。
附图说明
图1.通过DNA甲基转移酶(MTase)使用AdoMet类似物将C转化为U。MTase将化学转化基团R从AdoMet类似物转移到胞嘧啶的5位上。在转移之后,在R基团与C之间的以光化学方式触发的分子内反应促进4位上的脱氨基化以形成U类似物。DNA MTase能够将多种官能团转移到具有高序列特异性的双链DNA中的胞嘧啶的5位上。
图2. 5-ALL-OMC的合成路线图。
图3.在5-ALL-OMC的光辐照时间过程中的HPLC图谱。在辐照3小时之后,主峰是起始材料5-ALL-OMC(MS-MW实测值298)(左侧)。在12小时光辐照之后,大多数起始材料被消耗产生MS-MW为299的新产物5-ALL-OMU(右侧)。
图4.新的以光化学方式产生的产物(5-ALL-OMU)的UV吸收光谱显示出在265nm处的最大吸收,其为典型的U吸收,而起始材料(5-ALL-OMC)示出λmax=274nm的期望的C吸收。
图5.由5-AOMC以光化学方式产生的产物与合成的5-AOMU的混合物在HPLC分析中表现为单一峰。
图6. 5-ALL-OMC亚磷酰胺的合成。
图7.引物延长的单碱基延伸MS分析表明在光辐照之后在DNA链中的5-ALL-OMC转化为5-ALL-OMU(C到U),产生掺有addA(A)的引物延伸产物(MW3261),而在对应(counterpart)的DNA链中,未修饰的C保持完整,产生掺有ddG的延伸产物(MW 3277)(B)。
图8.含有光反应性部分的AdoMet类似物的实例结构。R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';X是O或NR';R'是H或烷基;并且n=l至8。
图9.含有光反应性基团的AdoMet类似物的实例合成路线图。
图10.合成导致图9中显示的AdoMet类似物的溴化物中间体的实例合成路线图。
图11.基于DNA甲基转移酶辅助的CpG位点特异性C向U转化的DNA甲基化分析方法。优化的AdoMet类似物用于将转化基团递送至未甲基化的CpG上以使得只有修饰的C可通过光触发的分子内反应进一步转化为U。后续测序允许DNA甲基化状态以单碱基分辨率读出。
图12.AdoMet类似物的实例结构,其中光活性烯烃经苯基、二甲氧基苯基(dimethoxyphenyl group)或其它基团修饰。
图13.当C经长波吸收双键(long-wavelength absorbing double bond)(比如苯基修饰的烯烃)修饰时,通过环加成中间体DNA中的利用酶修饰的C向U衍生物的光催化转化。
图14.Ru(bpy) 3 2+的双途径光催化机制,所述Ru(bpy) 3 2+是可进行缺电子烯烃和富电子烯烃两者的[2+2]环加成的多功能光催化剂。
图15.A.当C用缺电子双键修饰时,通过环加成中间体进行的Ru(bpy) 3 2+-可见光催化的DNA中的5-位修饰C向U的光转化。B.当C用富电子双键修饰时,通过环加成中间体进行的Ru(bpy) 3 2+-可见光催化的DNA中的5-位修饰的C向U的光转化。
图16.生成、分离、纯化和分析突变体M.SssI的功能活性的方法的概括。
图17.经设计或在生成的过程中的His标记的野生型和突变型变异体。
图18.用Hpall消化1小时的野生型(WT)和突变体pCal7的凝胶照片。具有甲基化非敏感的Mspl的野生型质粒的消化作为对消化的完全控制。M.Sssl的突变型变异体的体内功能试验的凝胶结果。用Hpall消化的分离的质粒的凝胶结果表明了正如预期的,野生型对Hpall消化是完全耐受的,SerSer和AlaSer突变型质粒对Hpall消化是部分耐受的,而SerAla突变体由Hpall完全消化。结果证实了SerSer和AlaSer突变体然而由于其较大的活性位点能够以预期低于野生型的效率甲基转移。
图19.合成含有具有长波吸收的光反应性基团的AdoMet类似物的实例方案。
图20.光转化测定。合成了具有在相同CpG位点的环境中在各链上的可光转化的5-修饰的胞嘧啶(C')的寡核苷酸。在辐照之前,或者在不存在向U类似物(U')的光转化的情况下,可通过限制性内切酶HpaII切割位点,然后进行PCR扩增,其导致C'被正常C替换。在光转化之后,PCR可将所得U'转化为正常U,在这种情况下,可用BfaI切割位点。在DNA中包括其它限制性位点以产生使得凝胶上的条带或者由质谱法获得的峰可容易分辨的片段尺寸。
图21. 5-PhAllOMC合成路线的实例。
图22.A.图24中的化合物4的核磁共振(NMR)图谱。B.图24中的化合物6的核磁共振(NMR)图谱。C.图24中的化合物7的核磁共振(NMR)图谱。
图23. 5-PhAll-OMC的质谱。
图24. 5-DiMePhAll-OMC的实例合成路线。
图25. 5-PhAll-OMC向5-PhAll-OMU的光化学转化。(1.)直接的光解或三重态敏化(triplet sensitization)引发了[2+2]环加成。(2.)C的伯胺基被氧化为羰基。由于C中双键的丢失,该反应在水溶液(pH=7)中自发地发生。(3.)在最后步骤,环裂可生成5-PhAll-OMU。类似的dT衍生物的环裂已经在文献中被报道了(Matsumura,et al.,2008,Fujimoto,et al.,2010)。
图26.上图,在三重态敏化剂噻吨酮(triplet sensitizer thioxanthone)(TX;如右上角顶部的图显示的)存在下光辐照之前的5-PhAll-OMC(如顶部中间的上图所示)的HPLC分析。插图显示了TX和5-PhAll-OMC紫外吸收光谱;注意到,350nm的光不与胞嘧啶相互作用但是由TX强烈吸收。下图:用350nm光光辐照20min之后的分析。虽然敏化剂(TX)的浓度保持不变,5-PhAll-OMC被大部分消耗掉并且新的光产物出现了。主要的光产物被分离并且由MS、1H-NMR和13C-NMR鉴定为U的环丁基衍生物,直的加合物或交叉的加合物(如下图左侧所示的)。
图27. 5-PhAllOMC(上图)和分离的光产物(下图)的13C-NMR分析。碳原子5、6、c和d观察到主要位移。为了简单起见,只有直的[2+2]环加合物被显示了。这些结果(正如红外光谱一样)显示了4位的氧化脱氨基作用,没有对碱基配对位置产生影响。
图28.光敏剂共轭模型化合物(photo-sensitizer conjugated model compound)(TX-Ph-C)的合成。TX光敏剂到光活性基团的并入会增加去氨基反应的专一性和效率。
图29.上图:包含敏化剂的AdoMet类似物,其递送高效的光活性脱氨基基团到双链DNA中的未甲基化的CpG位点的胞嘧啶上。显示了噻吨酮光敏剂。下图:合成包含敏化剂的AdoMet类似物的方案。
图30.包含光敏剂(TX)和可点击部分(clickable moieties)(叠氮基修饰在上面,炔烃在下面,两者都被圈在该图中)的AdoMet类似物的实例结构。
图31.光化学甲基化分析的总体方案的概要。引入修饰以通过点击化学纯化包含未甲基化的CpG位点的DNA片段。这些包含未甲基化的CpG二核苷酸的DNA片段在铜离子的存在下将被收集在包含互补修饰(炔烃或叠氮基)的磁珠上。该珠子在中性水溶液缓冲区中洗涤,结合的适配体和由PCR扩增的DNA在测序文库的构建之前直接从珠子脱离。
图32.化合物肉桂醇(环形)和图21中的模型化合物5-PhAll-OMC在乙腈(ACN)溶液中的荧光光谱(λex=282nm)。该图显示了当共价连接到C时由于单重态能量转移到C和/或[2+2]环加成苯丙烯双键(cinnamyl double bond)为C,苯丙烯醚发色团(苯乙烯发色团)的荧光是高效淬火的。
图33.为了通过激光闪光光解确定从三重态敏化剂噻吨酮向PhAll-OMC的苯乙烯发色团的三重态能量转移的速率常数,使用了包含苯乙烯发色团的模型化合物肉桂醇。噻吨酮的光致激发产生了三重态,其由肉桂醇淬火,具有速率常数k q =7.8x 109M-1S-1,其接近于有可能三重态能量转移的最大速率常数。
图34.在不存在和存在不同浓度的肉桂醇(0到0.25mM)的条件下,在氩气饱和的乙腈溶液中,在脉冲激光器激发(355nm,5ns脉冲宽度)之后在625nm处监测的噻吨酮三重态的瞬态吸收的衰退踪迹。B.确定三重态能量转移速率常数。在不同浓度的肉桂醇的条件下,噻吨酮三重态的衰退的假一级速率常数。
具体实施方式
术语
除非另外规定,否则如本文所使用的,各以下术语将具有如下所列的定义。
A -腺嘌呤;
C -胞嘧啶;
DNA -脱氧核糖核酸;
G -鸟嘌呤
RNA -核糖核酸;
T -胸腺嘧啶;以及
U -尿嘧啶。
“核酸”可意指任何核酸分子,包括,但不限于,DNA、RNA及其杂合体。形成核酸分子的核酸碱基可以是碱基A、C、G、T和U以及其衍生物。这些碱基的衍生物是本领域公知的,并且在《PCR系统、试剂和消耗品》(PCR Systems,Reagents and Consumables)(珀金埃尔默目录1996至1997年,罗氏分子系统公司,布兰奇,新泽西州,美国(Perkin Elmer Catalogue1996-1997,Roche Molecular Systems,Inc.,Branchburg,New Jersey,USA))中举例说明。
核苷酸的“类型”是指A、G、C、T或U。碱基的“类型”是指腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
在本申请中为了简单起见,C和dC可交换地使用,A和dA、U和dU、G和dG和T和dT也是一样。同样地,为简单起见,T和U之间具有中间体的结构类似物/性质在本文被称为U。
“突变型”DNA甲基转移酶是指修饰的DNA甲基转移酶,包括但不限制于修饰的M.SssI、M.Hhal和M.CviJI。
“质量标记物”意指预定尺寸的分子实体,其能够通过可断裂的键连接在其它实体上。
“固体基底”可意指可黏附核酸或试剂的以固相存在的任何合适的介质。非限制性实例包括芯片、颗粒或柱。
“杂交”可意指基于序列互补性使一条单链核酸与另一条核酸退火。在核酸之间的杂交倾向取决于其环境的温度和离子强度、核酸的长度以及互补程度。这些参数对杂交的影响是本领域公知的(参见萨姆布鲁克J,弗里奇EF,马尼亚蒂斯T.1989.分子克隆:实验室手册.冷泉港实验室出版社,纽约(Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.1989.Molecularcloning:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.))。
本发明的实施例
本发明提供了一种化合物,其具有以下结构:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。
在一个或多个实施例中,R是
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是且n为1时,R 1 或R 2 至少一个不为H。
在一个或多个实施例中,R是
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
本发明还提供了一种物质组合物,其包含具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
所述化合物与CpG甲基转移酶相连接。
在一个或多个实施例中,R是:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是
且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。
在一个或多个实施例中,R是:
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
在一个或多个实施例中,所述化合物与所述CpG甲基转移酶的活性位点相连接。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是CviJI甲基转移酶或其突变体。
本发明还提供了一种产生双链DNA衍生物的方法,其包含使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触:
其中R是能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化学基团,其是在使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合的条件下进行,从而产生所述双链DNA衍生物,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n是1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是且n为1时,R 1 或R 2 的至少一种不为H。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是CviJI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时,所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。
在一个或多个实施例中,所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。
本发明还提供了一种确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;
b)通过在步骤a)中产生的衍生物的光转化来制备U类似物;
c)独立地获得所述双链DNA衍生物的单链;
d)对在步骤c)中获得的所述单链进行测序;以及
e)将在步骤d)中测定的所述单链的序列与没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链的序列进行比对,
其中在衍生物单链的所述单链中存在尿嘧啶类似物,其替代在没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链中的预定位置上的胞嘧啶,表明了在所述双链DNA的所述位置上的所述胞嘧啶是未甲基化的。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。
在一个或多个实施例中,当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时,所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。
在一个或多个实施例中,在步骤d)中所述测序是通过合成测序。
在一个或多个实施例中,所述通过合成测序包含使衍生的单链与DNA聚合酶、引物寡核苷酸、dATP、dCTP、dGTP、dTTP以及连接有可检测标记的三磷酸双脱氧核苷酸接触。
在一个或多个实施例中,所述可检测标记是放射性或有荧光的。
在一个或多个实施例中,所述可检测标记是质量标记物。
在一个或多个实施例中,所述可检测标记是具有电性能的分子,该电性能通过例如减小此类电流影响纳米孔中的离子电流。在一个或多个实施例中,所述方法还包含在步骤d)之前将所述单链与固体载体相连接。本发明还提供了一种衍生的DNA分子,其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R'是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R″、CN、NO 2 、C(O)R″、S(O) 2 NHR″;
其中X是O或NR';
其中R″是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R'是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。
在一个或多个实施例中,R'是:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R″、CN、NO 2 、C(O)R″、S(O) 2 NHR″;
其中X是O或NR″;
其中R″是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R'是或当R'是
且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。
在一个或多个实施例中,R'是
在一个或多个实施例中,R″是H或烷基。
本发明还提供了一种衍生的DNA分子,其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R″是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。
在一个或多个实施例中,R″是以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。
在一个或多个实施例中,R″是:
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
本发明还提供了一种用于衍生双链DNA分子或者用于确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的试剂盒,其包含:
a)具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)使用说明书。
在一个或多个实施例中,R是以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。
在一个或多个实施例中,R是
在一个或多个实施例中,R'是H或烷基。
在一个或多个实施例中,所述试剂盒还包含CpG甲基转移酶。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。
本发明还提供了一种确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)确定在所述双链DNA中的预定位置上的胞嘧啶是否被所述化学基团R所修饰,
其中在所述双链DNA中预定位置上的所述胞嘧啶被所述化学基团R修饰表示在所述双链DNA中的所述位置上的所述胞嘧啶为未甲基化的。
在一实施例中,所述方法进一步包括在步骤b)之前的C类似物向U类似物光转化的步骤。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。
在一个或多个实施例中,所述化学基团具有以下结构:
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是CviJI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。
在一个或多个实施例中,确定在所述双链DNA中的预定位置上的胞嘧啶是否被所述化学基团R所修饰包含将所修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶类似物。
在一个或多个实施例中,所述方法还包含通过光催化反应将在DNA衍生物中的修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶类似物。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应使用三(联吡啶)钌(II)氯化物(Ru(bpy) 3 2+)催化剂来进行。
在一个或多个实施例中,所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 Cl 2
在一个或多个实施例中,所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 (PF 6 ) 2
在一个或多个实施例中,用于所述光催化反应的光源是家用灯泡。
在一个或多个实施例中,用于所述光催化反应的光源是激光。
在一个或多个实施例中,所述激光的波长为400nm至600nm。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应是通过采用大于350nm波长的光辐照来进行。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应是通过采用具有长波吸收性能的催化剂来进行。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应是通过采用300nm-700nm波长范围的光辐照来进行。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应进一步是在0℃-90℃温度范围来进行。
在一个或多个实施例中,所述光催化反应进一步是在具有pH在4到10之间的缓冲溶液中来进行。
本发明提供了用于甲基化分析的方法。用于甲基化分析的方法公开于美国专利申请公开号US 2011-0177508 Al中,其在此通过引用并入本文。
本发明提供了DNA甲基转移酶的用途。DNA甲基转移酶的实例包括但不限于M.SssI、M.HhaI和M.CviJI以及经修饰的M.SssI、M.HhaI和M.CviJI。主要将这些酶修饰为具有降低的特异性以使得在AdoMet类似物上的R基团可被更有效地转移到未甲基化的C残基上,包括在DNA中的CpG位点的环境中。这样的经修饰的M.SssI和M.HhaI基因的实例已经描述于文献(刘克纳维卡斯等(2012)改造DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶反应以用于DNA的序列特异性标记《核酸研究》,40(22),11594-602;Kriukiene等(2013)通过CpG位点的共价捕获的DNA未甲基化分析.《自然》第4卷:doi:10.1038/ncomms3190(Lukinavicius et al(2012)Engineering the DNA cytosine-5methyltransferase reaction for sequence-specific labeling of DNA.Nucleic Acids Res 40:11594-11602;Kriukene et al(2013)DNA unmethylome profiling by covalent capture of CpG sites.NatureCommun 4:doi:10.1038/ncomms3190))。
本发明提供了即用的方法和过程,其中通过可裂解的连接子与碱基结合的可检测标记是染料、荧光团、生色团、组合的荧光能量转移标记物、质量标记物、电泳团(electrophore)或能够减小纳米孔中离子电流的分子。组合的荧光能量标记物及其生产方法公开于美国专利号6,627,748中,其在此通过引用并入本文。
可用于本文所述方法的实施例的可检测标记物及其将核酸黏附在表面上的方法公开于美国专利号6,664,079和7,074,597中,其在此通过引用并入本文。
本发明还提供了即用的方法和过程,其中将DNA与固体基底相结合。本发明还提供了即用的方法,其中DNA是通过1,3-偶极叠氮化物-炔的环化加成化学反应与固体基底结合。本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的。本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA炔标记的。本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的,而且所述固体基底是叠氮化物-官能化的。本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA是通过叠氮连接、炔基连接,或者生物素-抗生蛋白链菌素相互作用固定在固体基底上的。核酸的固定化在由克里斯汀维特曼(2005)编著的《DNA在芯片II上的固定化》,斯普林格出版公司,柏林(ImmobilizationofDNA on ChipsII,edited by Christine Wittmann(2005),Springer Verlag,Berlin)中描述,其在此通过引用并入本文。本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA是通过聚乙二醇分子与固体基底结合的,而且所述固体基底是叠氮化物-官能化的,或者DNA是通过叠氮连接、炔基连接或者生物素-抗生蛋白链菌素相互作用固定在固体基底上的。在一个实施例中,DNA或核酸是通过与DNA相容的共价位点-特异偶联化学作用与固体表面连接/结合的。
本发明还提供了即用的方法和过程,其中所述固体基底的形式为芯片、颗粒、孔、毛细管、玻片、薄片、滤纸、纤维、多孔介质或者柱。本发明还提供了即用的方法和过程,其中所述固体基底是金、石英、二氧化硅、塑料、玻璃、尼龙、金刚石、银、金属、聚丙烯,或者石墨烯。本发明还提供了即用的方法,其中所述固体基底是多孔的。芯片或颗粒可用DNA微阵列法常用的材料制作,例如玻璃或尼龙。颗粒/微颗粒可依次固定在芯片上。
本发明还提供了即用的方法和过程,其中将约1000个或更少的DNA拷贝与所述固体基底结合。本发明还提供了即用的方法和过程,其中将2×l07、l×l07、l×l06或l×l04个或更少的DNA拷贝与所述固体基底结合。
本发明还提供了即用的方法和过程,其中核苷酸类似物包含萤光团Cy5、Bodipy-FL-510、ROX和R6G中的一种。
本发明还提供了即用的方法和过程,其中DNA聚合酶是9°N聚合酶或其变体。可以用于本发明的DNA聚合酶包括,例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、噬菌体T4DNA聚合酶、SequenaseTM、Taq DNA聚合酶、9°N聚合酶(外-)A485L/Y409V、Phi29或Bst2.0。可以用于本发明的RNA聚合酶包括,例如,噬菌体SP6,T7和T3RNA聚合酶。
用于生产可裂解地加帽的和/或可裂解地连接的核苷酸类似物的方法公开于美国专利号6,664,079中,其在此通过引用并入本文。
在美国专利申请公开号2003-0232371A1中描述了DNA甲基化,其在此通过引用以其整体并入本文。
本文描述的多种要素的所有组合和附属组合均在本发明的范围之内。
可以通过参考下述的实验细节来更好地理解本发明,但是本领域技术人员将容易地意识到特定的实验细节只是用以说明如在所附权利要求书中更加完整地描述的本发明。
实验细节
特定序列的DNA甲基化首先通过南方印迹技术(Southern blotting)来分析,其是先用对甲基化敏感的限制性核酸内切酶(MSRE),如HpaII来裂解,但当中心CpG二核苷酸为甲基化时,其无法裂解序列5'-CCGG-3'(瓦尔韦克和弗拉维尔,1978(Waalwijk andFlavell,1978))。所述方法很强烈,并且当用于未甲基化的且存在于许多拷贝中的线粒体DNA的印迹被反复探测时,所述方法为完全消化提供了内部的控制。但是,MSRE方法冗长且昂贵,需要相对大量的放射性核苷酸,并且对于每个片段只能检验少量的CpG位点,因为所有CpG位点中仅有~20%落在已知MSRE的识别序列中。如果给定的片段含有许多CpG位点,而只有一个或者几个位点是未甲基化的,则通常将所述序列评分为未甲基化的。MSRE提供了最佳控制的甲基化分析方法,但是其低通量和其它缺点意味着其不能构成全基因组甲基化分析平台的基础。
已经开发出用于单个或少量CpG位点快速甲基化分析的许多其它的基于PCR的方法;例如甲基化敏感的PCR(MSP;施泰格瓦尔德等,1990(Steigerwald et al.,1990))、COBRA(伊兹和莱尔德,2002(Eads and Laird,2002))和甲基-光(郑等,2001(Trinh etal.,2001))。这些方法快速且便宜,但只能检验少量的CpG位点;其不适于无偏好性的全基因组甲基化分析。在发现了特定的甲基化异常与特定的病症有关之后,这些关注的方法或许适用于临床样本的诊断和预后测试。
微阵列分析法的应用已经取得了很大的成功(例如,敬田等,2002(Gitan et al.,2002))。但是,微阵列法不能确定重复序列(其包含基因组中大多数的5-甲基胞嘧啶;罗林斯等,2006(Rollins et al.,2006))的甲基化状态,并且CpG岛由于其高的G+C含量产生高的噪声水平。微阵列法不能检查每个CpG二核苷酸的甲基化状态。再次,尽管所述方法有其优点,但其不适合于全基因组的甲基化分析。
甲基化分析的重要进展来自苏珊克拉克(Susan Clark)和玛丽安弗罗默(Marianne Frommer)在1994年引入了亚硫酸氢盐基因组测序(BGS)(克拉克等,1994(Clarket al.,1994))。BGS依靠亚硫酸氢钠对胞嘧啶4-位上的氧化脱氨基能力,从而将碱基转化为尿嘧啶。在5-位上的甲基防止了亚硫酸氢盐跨5-6双键的加成,其使得5-甲基胞嘧啶抗亚硫酸氢盐转化。PCR扩增,接着DNA测序产生C泳道,其中的每个条带对应于起始DNA中的5-甲基胞嘧啶;所有未甲基化的胞嘧啶被测序为胸腺嘧啶。BGS是一项超越早期的基因组测序方法的重大进展(丘奇&吉尔伯特,1984(Church&Gilbert,1984))。
但是,当用于全基因组甲基化分析时,BGS有严重的缺点。首先,除非一个序列在存在亚硫酸氢盐处理和不存在亚硫酸氢盐处理两种情况下并比较结果,否则BGS不能知道在终序列的胸腺嘧啶是在起始物质中的胸腺嘧啶或胞嘧啶。这就大大降低了DNA的信息含量。结果,就不用新的超高通量的DNA测序方法,由于序列读数短,很大百分比的序列不能在基因组图的单一位置上绘制出来。几乎没有什么重复序列能在图上表示出来。BGS主要限制在基因组预先选择的区域内,在所述区域内可设计引物以选择性地扩增目的区域。通过这种方法不能获得全基因组的甲基化分析,这是因为基因组的许多区域不允许设计独特的成套引物的缘故。CpG岛尤其成问题,因为不含CpG二核苷酸的引物位点不能在大多数的CpG岛中发现。其次,亚硫酸氢盐转化要求DNA是单链的;任何双链DNA将抵抗转化并被评分为甲基化了的。结果,亚硫酸氢盐处理必须在十分苛刻的条件下进行(0.2N氢氧化钠,在升高温度条件下进行数小时)。在这样的条件下,亚硫酸氢盐转化与键断裂是竞争反应,只有当95%以上的DNA被裂解成小于350bp时,亚硫酸氢盐转化才会趋于完全(瓦内克等,2002(Warneckeet al.,2002))。这就意味着必须使用大量的起始DNA,而且DNA—定要长。这就妨碍了使用石蜡切片的DNA,其中DNA几乎都<300bp,并且还妨碍了使用少量DNA,如在早期胚胎、小组织切片检查的情况下以及其他大量的DNA不能获得的情况。第三,在某些序列环境中,CpG二核苷酸固有地抵抗亚硫酸氢盐转化(瓦内克等,2002(Warnecke et al.,2002)),被评分为甲基化的假位点。第四,所有C-G碱基配对的缺失给PCR扩增步骤带来很大的偏好性,其有利于从未转化的或已经甲基化了的起始物质衍生而来的PCR产物(瓦内克等,1997(Warnecke etal.,1997))。每一个这样的人工产品都可能是严重的。
综合来看,亚硫酸氢盐转化时的序列信息缺失、强的PCR偏好性、亚硫酸氢盐转化的人工产品,以及需要大量长的起始DNA使得常规BGS不适于通过超高通量的DNA测序的全基因组甲基化分析。
过去几年中,所述实验室已经开发出新的方法将正常人类基因组分段成甲基化的和未甲基化的区室,并且已经确定了来自分段的基因组的超过3千万个碱基对的CpG二核苷酸的甲基化状态以表征正常人类基因组的甲基化概况(罗林斯等,2006(Rollins et al.,2006))。在那项研究中,开发了新的计算方法将基因组的注解特征绘制在非常大的序列数据的集合上。尽管这个依赖于将DNA用酶分段成甲基化的和未甲基化的区室的方法提供了更多CpG位点的甲基化状态信息,其要比所有其他方法加起来的总数还多,但它还是不能进行全基因组的甲基化分析,因为现有技术尚不能克服它的缺点。
甲基化异常的实例通过罗林斯等,(2006)(Rollins et al.,(2006))的方法来识别。应注意,本文公开的方法可用于任何测序的基因组;乳腺癌被表征了是因为已知在这些细胞的基因组中存在高度异常的甲基化模式,并且这些基因组提供了出色的测试系统。
柯雷马桑斯卡斯(Klimasauskas)和温霍尔德(Weinhold)组先前的研究工作(达尔霍夫等,2006a,2006b(Dalhoff et al.,2006a,2006b))已经表明多种官能团可以通过合成的AdoMet类似物由DNA甲基转移酶有效地转移到DNA中胞嘧啶的5-位上,在AdoMet类似物中甲基已经被多种官能团的任意一种所取代。具体地说,Dalhoff et al.(2006a)用一系列取代甲基的官能团合成了合成的AdoMet变异体,其还实现了DNA甲基转移酶的有效运行。接着Dalhoff et al(2006b)证实了通过使用DNA甲基转移酶具有基本上100%效率,多种官能团向胞嘧啶和鸟嘌呤重复(CPG位点)的DNA位点中Cs的5位转移。
Haga et al.(1993)证实了在丙酮中的2.3-二甲基-2-丁烯存在下胞嘧啶到相应的环丁烷光加合物(通过光引发的增加两种或以上反应物形成的产品)的光转化(在光的影响下的转化)。这种化学过程由Matsumura et al.,(2008)和Fujimoto et al.(2010)应用用于C到U的DNA上的转化。申请人的调查试图应用从这些关于AdoMet、使用甲基转移酶的酶促转移和C到U的光转化的调查研究导出的知识以设计新颖的方法用于单细胞、全基因组甲基化组分析。
对于给定的甲基转移酶,可将诸如生物素那样的庞大基团加成到每个识别位点上。这里,DNA甲基转移酶M.SssI可用于将特定的反应性基团转移到每个未甲基化的CpG二核苷酸中胞嘧啶的5-位上;非CpG的胞嘧啶不会被修饰。如果所述胞嘧啶是甲基化的,则所述反应被阻断—只有未甲基化的CpG二核苷酸被衍生。转移的基团的最重要之处在于其改变了测序过程中或者PCR扩增过程中的碱基配对,以便识别在起始DNA中甲基化的或者未甲基化的CpG二核苷酸。所述方法在概念上与亚硫酸氢盐基因组测序有关,但并不具有使得BGS不能用于全基因组甲基化分析的缺点。
实例1:基于在CPG岛中的胞嘧啶的DNA甲基转移酶辅助的位点特异性转化的全基 因组DNA甲基化分析的方法
开发了基于独特且新颖方法的优越的甲基化分析方法。柯雷马桑斯卡斯(Klimasauskas)和温霍尔德(Weinhold)组(达尔霍夫等,2006a,2006b(Dalhoff et al.,2006a 2006b))合成了S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)类似物,其中甲基已经被多种官能团所替代,并表明DNA甲基转移酶能够特异性地将这些官能团转移到在DNA CpG位点中的胞嘧啶的5位上。效率基本上为100%(达尔霍夫等,2006a,2006b(Dalhoff et al.,2006a,2006b))。因此,DNA甲基转移酶已经用于大量化学基团与DNA的序列特异性、共价连接,为大量天然DNA的精确、靶向官能化和标记提供了新的分子工具。
利用所述能力来使用CpG位点特异性DNA甲基转移酶来用合适的反应性中间体修饰C的5位,所述反应性中间体随后将C转化为尿苷(U)类似物。这样的转化策略满足上述标准并克服了现有方法中的缺点,因此推进了全基因组DNA甲基化分析领域。
开发了基于DNA甲基转移酶辅助的在未甲基化的CpG二核苷酸中的C的位点特异性转化的新全基因组甲基化分析方法。在所述方法中,将用C-反应性官能团衍生的AdoMet类似物用作DNA甲基转移酶的底物以将反应性官能团转移到在未甲基化的CpG二核苷酸中的C的5位上(图1)。例如,CpG位点特异性细菌DNA甲基转移酶M.SssI(其通过使用AdoMet作为供体使得所有的CpG二核苷酸甲基化)可被使用以促使未甲基化的CpG二核苷酸中的C's到U's的化学转化;这通过酶的精确的CpG位点识别和在C的5位的键的形成的高选择性实现(Renbaum et al.,1990)。AdoMet类似物被开发了,实现M.SssI直接转移基团到DNA的未甲基化C's以便于这些经修饰的CpG C's向U's的高效光转化,具有对DNA的最小损伤。在中性水溶液中,这些利用酶连接的反应性基团或官能团引发高效分子内反应,导致C转化为U类似物。在转化之后,转化的DNA的高通量DNA测序提供了单个碱基分辨率甲基化分析;未甲基化的胞嘧啶被测序为胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶被测序为胞嘧啶。
亚硫酸氢盐基因组测序是当前针对甲基化组分析的黄金标准方法(Katja etal.,2013)。该方法需要导致未甲基化C转化为U的亚硫酸氢盐治疗DNA。甲基化C's仍然未受到影响。在亚硫酸氢盐治疗的DNA的测序时这些甲基化C's此后被识别,因为这些是唯一的读为胞嘧啶的C's。在另一方面,未甲基化的胞嘧啶(其已经被转化为U)被读为胸苷。
所述方法具有许多创新方面,相比于BGS表现出多种优势。首先,在所述新方法中,使所有CpG二核苷酸甲基化的CpG位点特异性细菌DNA甲基转移酶M.SssI将转化化学基团转移到每个未甲基化CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位上;由于酶的严格的CpG位点识别和对于C的5位的高区域选择性,非CpG胞嘧啶和5-甲基C's未被修饰。这具有比传统亚硫酸氢盐化学法显著的优势,包括只有未甲基化CpG位点的特异性转化,其代替了当使用亚硫酸氢盐时的所有未甲基化的胞嘧啶。这增加了针对转化的序列信息含量并从而促进基因组读取的对齐。意味着仍然有可能识别基因组中经转化的序列的相应序列。
相反,在BGS时,所有未甲基化C's被转化。这是大量的正在被转化的核苷酸甚至于经转化的DNA通常不再类似于亲本DNA。因此,很难识别在转化的DNA中哪段相当于亲本DNA中的相同区域。因此,BGS引起序列信息的丢失。再者,通过不直接作用于所有C's,在本发明的方法中使用的化学转化有希望不易于受到DNA裂解的影响并且导致远远不及BGS的DNA损伤,其能够对较长DNA片段进行测序。
此外,通过不直接作用于所有胞嘧啶,转化化学法毒性低且导致远远不及BGS的DNA损伤,其能够对较长DNA片段进行测序(目前的亚硫酸氢盐方法通常限于分析<500bp的DNA片段)。
其次,当在胞嘧啶的5位上用反应性基团修饰时,进一步的转化限于修饰的C并且以高效的分子内形式发生。此外,转化化学作用的多功能性允许精细地优化转化以确保最小程度的DNA损伤并保留最大的DNA序列信息。
第三、亚硫酸氢盐转化还面对需要单链DNA的劣势;双链DNA对转化是耐药的并且甚至当未甲基化时被读为甲基化的。因此,亚硫酸氢盐治疗必须在非常严格的条件(在高温下,0.2N NaOH,数小时)下进行,使得使用大量的最初的DNA成为必要(Warnecke et al.,2002)。
第四、BGS的可靠性进一步通过在某些序列环境下的CpG二核苷酸的耐受性被减小到亚硫酸氢盐转化(Warnecke et al.,2002)。
第五、转化步骤之后的PCR(聚合酶链反应即扩增DNA的方式)扩增步骤有利于从未转化或甲基化的原始材料得到的产物,引入较大的偏离(Warnecke et al.,1997)。相反,由于其特异性、高效性和温和的转化条件,DNA甲基转移酶辅助的C的光转化有希望消除BGS的缺陷,比如信息含量的丢失、非CpG胞嘧啶的反应性和大量的长的DNA(作为原始材料)的需要。
上文讨论了亚硫酸氢盐测序及其限制。相反地,由于DNA甲基转移酶辅助的C转化的特异性、高效和温和转化条件,其保留了BGS的主要优点(测试每个CpG二核苷酸的甲基化的能力)同时避免了BGS的缺点如信息含量的缺失、非CpG胞嘧啶的反应性以及对于大量长DNA作为起始材料的需求。因此,新方法比现有方法更简单且更易于自动化和用于高通量新一代测序的DNA样品制备,提供了全面分析基因组DNA甲基化模式的新的且可靠的方法。
在DNA甲基转移酶的化学和生物学研究中的进展已经产生了新的工具试剂盒来化学修饰在未甲基化CpG中的C的5位从而引发在所述特定C上的转化反应。研究了在DNA中的合适的C到U转化的多种化学机制。例如,据报道,光辐照可通过2+2环加成在烯烃与C的5,6位双键之间产生5,6-环丁烷中间体,导致共轭体系的中断,以及在4位上的脱氨基化(芳贺町等,1993(Haga et al.,1993))。值得注意的是,所述化学法已经用于在DNA上的C向U转化(松村等,2008,藤本吉秀等,2010(Matsumura et al.,2008,Fujimoto et al.,2010))。
实例2:5位修饰的脱氧胞苷到脱氧尿苷的光化学转化。
对于酶辅助的位点特异性C向U转化,先决条件是5位连接的化学转化部分应能够触发分子内反应导致C向U的转化。虽然从未报道过这样的实例,但是通过设计和合成脱氧胞苷来开始本研究,其中脱氧胞苷的5位上衍生有光反应性部分。通过连接插入C的双键与5位之间的具有1至5个碳单元的含双键的链来设计5位修饰的C。已经合成了模型化合物之一5-烯丙氧基甲基-dC(5-ALL-OMC),其中双键是来自5位的3碳单元,随后在图2中示出了合成路线。产物通过HR MS和1H NMR进行完全表征。
然后,在水溶液中在约300nm下进行5-ALL-OMC的光辐照长达12小时,并通过HPLC和UV吸收来分离和监测反应产物。MS和HPLC图谱显示5-ALL-OMC(MW 298)以光化学方式高效地转化为新产物5-All-OMU(MW 299)(图3)。
在相同条件下,在光辐照之后C和5-甲基-C两者均保持完整。新的以光化学方式产生的产物(5-All-OMU)的UV吸收光谱显示出在265nm处的最大吸收,其为典型的U吸收,而起始材料(5-ALL-OMC)示出λmax=274nm的期望的C吸收(图4)。结果表明5-ALL-OMC通过光辐照转化为U类似物。为了进一步证明所述转化,合成并表征了5-All-OMU。由5-ALL-OMC以光化学方式产生的产物与合成的5-All-OMU的混合物在HPLC中表现为单一峰(图5),表明新产物与5-All-OMU相同。以光化学方式产生的5-All-OMU也通过1NMR进行表征。
这些数据清楚地证明,使用烯烃部分对C的5位的修饰可导致在温和条件下通过光辐照高效地形成U类似物。
实例3:在DNA中的C向U类似物的位点特异性光化学转化
为了测试光化学方法用于在真正的DNA链上将C转化为U的可行性,合成了完全受保护的5-ALL-OMC亚磷酰胺(图6)并且通过标准寡核苷酸合成法将5-ALL-OMC(C*)掺入16聚体寡核苷酸5'-TACGA(C*)GAGTGCGGCA-3'中。在HPLC纯化之后,通过MALDI-TOF MS来表征修饰的16聚体,产生MW为5001的峰,等于所计算的质量。然后,进行寡核苷酸5'-TACGA(C*)GAGTGCGGCA-3'的光辐照以将C*转化为U类似物。在DNA中的C*转化结果通过使用单碱基延伸MS分析来检测(图7)。在所述分析中,将光辐照的寡核苷酸用引物5'-TGCCGCACTC-3'(MW2964)进行退火,然后用ddNTP和DNA聚合酶孵育。在DNA聚合酶的帮助下,可将4个ddNTP中的一个选择性地掺入引物的3'端。光化学诱导的C向U的转化应能够引导ddA的掺入,产生MW为3261的延长的引物,否则应掺入ddG得到MW 3277的延长的引物。
一个碱基延长的引物(one-base elongated primer)的实际MS测量示出MW为3261,其与掺有单个ddATP的引物的MW相匹配,因此,确认了在模板上存在互补的U,并证明了在DNA上的C*向U类似物的光化学转化(图7上面)。在对照实验中,在相同条件下进行未修饰的对应物5'-TACGACGAGTGCGGCA-3'的光辐照。所得引物延长产物的单碱基延伸MS分析给出MW为3277,其与用单个ddGTP延伸的引物的MW相匹配(图7下面),清楚地表明在DNA片段中只有将C的5位用光反应性部分修饰,才能将其高效地转化为U类似物。还测量了可能的光辐照诱导的DNA损伤。在所使用的条件下(300nm,经过10小时),没有观察到DNA损伤。
上述研究表明使用光反应性部分进行的C的5位修饰提供了C向U的高效转化的新途径,而不存在亚硫酸氢盐转化的缺点。因此,证明了C向U的CpG位点特异性转化的可行性并且所述结果提供了所述DNA甲基转移酶辅助的DNA甲基化分析方法的基础和原理。
实施例4:由5位反应性部分触发的C向U转化化学作用的研究
将5位衍生的脱氧胞苷模型化合物的文库用于系统地筛选和优化最有效地将C转化为U的C反应性官能团。在图8中列出了部分模型化合物。
用作DNA甲基转移酶底物的AdoMet类似物的种类是AdoHcy的锍衍生物,其中光活性基团(R)替代了AdoMet中的甲基(图8)。这样的含有光活性基团(R)的AdoMet类似物用作CpG特异性DNA甲基转移酶如M.SssI的底物并且作为酶反应的结果,可将这些光活性基团(R)转移到DNA中的未甲基化CpG二核苷酸的C的5位上。
(1)光活性基团(R)包括烯烃(图8,a、b、c、d、e),其在光辐照时与C的5,6双键形成了环丁烷中间体,并且进一步导致C向U的转化。光活性基团(R)还包括用R 1 、R 2 和R 3 修饰的烯烃,其促进光反应。R 1 、R 2 和R 3 为氢、烷基、芳基、酰胺、羧酸、酯、硝基、氰基、醛基、酮和磺胺。这样的烯烃或R 1 、R 2 和R 3 修饰的烯烃可通过多个长度的碳链(n=1至8)从AdoMet类似物的硫原子上分离。可将烷基链或可化学断裂的结构(如酯连接子)插入AdoMet类似物中的上述烯烃与硫原子之间。
(2)光活性基团(R)包括上述烯烃共轭丁二烯部分(图8,c)。这样的丁二烯通过多个长度的碳链与AdoMet类似物中的硫原子相连。
(3)光活性基团(R)包括马来酸酐和马来酰亚胺类似物(图8,f、g、h、i),其通过包含多个长度的碳链的饱和键或双键来与AdoMet类似物中的硫原子相连。
(4)光活性基团(R)还包括含N,N双键的官能团,其可用于在光辐照时与C的5,6双键进行光反应。例如,R可以为含四唑的部分(图8,j、k、1),其通过包含多个长度的碳链的饱和键或双键来与AdoMet类似物中的硫原子相连。
实例5:含光反应性基团的AdoMet类似物的合成
通过在温和的酸性条件下使用光反应性部分的相应三氟甲磺酸酯(triflates)或溴化物进行的AdoHcy的区域选择性S-烷基化来进行具有期望的延伸的侧链的AdoMet类似物的合成。在AdoHcy烷基化之后,预期得到锍的立体异构体混合物,进一步进行RP-HPLC(反相高效液相色潽法)纯化以分离酶活性的S-差向异构体以用于后续转移反应。在图9中示出了AdoMet类似物的合成路线的实例。AdoMet类似物合成所需的光反应性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物可使用如图10中所示的可市购起始材料来合成。
实例6:DNA甲基转移酶引导的在含CPG的DNA上的C反应性官能团的转移以及后续 的位点特异性C向U的转化。
基于上述实验结果来设计AdoMet衍生物并且鉴定了所合成的AdoMet衍生物的可能文库。根据报道的方法(达尔霍夫等,2006a,2006b(Dalhoff et al.,2006a,2006b))通过在温和的酸性条件下使用光反应性部分的相应三氟甲磺酸酯或溴化物进行的AdoHcy的区域选择性S-烷基化来进行具有期望的延伸的侧链的AdoMet类似物的合成(图10)。在AdoHcy烷基化之后,预期得到锍的立体异构体混合物,进一步进行RP-HPLC纯化以分离酶活性的S-差向异构体以用于后续转移反应。以AdoMet类似物作为底物,使用CpG位点特异性DNA甲基转移酶(M·SssI)将光反应性基团转移到在合成的DNA和基因组DNA样品两者上的未甲基化胞嘧啶的5位上(图11)。将MALDI-TOF MS用于评估反应性部分转移到DNA上的效率。此外,使用上文所获得的优化反应条件来进行C向U的位点特异性光化学转化。将单碱基延伸实验(图7)用于研究在DNA上的转化效率。
鉴定了理想的AdoMet类似物,并优化了修饰官能团的酶转移和在DNA上的转化两者的条件。通过筛选最佳波长、强度和其他条件(温度、时间、缓冲剂、pH和辅助成分)来进一步优化光辐照条件以使转化产率最大化并使在DNA上的可能副反应最小化。
实例7:将DNA甲基转移酶辅助的转化化学作用与新一代DNA测序组合以达到实际 (real-world)DNA甲基化分析
在C到U类似物的DNA甲基转移酶辅助的CpG位点特异性转化确认之后,由乳房癌细胞系MCF-7(对于其具有非常大量的甲基化数据)可确定在实际基因组DNA制备中的甲基化模式。通过蛋白酶K消化、苯酚提取以及针对10mMTris HCl,pH 7.2的透析来纯化DNA。然后,使DNA与上文所鉴定的最佳AdoMet衍生物和M·SssI(纽英伦生物技术有限公司(NewEngland Biolabs,Inc.))反应。然后,使衍生的DNA经历高通量DNA测序(图11),将在NCBI参考序列中显示为TpG的CpG二核苷酸评分为在起始DNA中的未甲基化CpG二核苷酸。已经开发并验证了所需软件(爱德华兹等,2010(Edwards et al.,2010))。
将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶类似物之后,来自加成的反应基团的惰性“尾部”保留在胞嘧啶的5-位上。所述尾部延伸到DNA螺旋的主槽中,但是公知的是,所述位置的修饰并不干扰聚合酶延伸过程中核苷酸的掺入,并且已经在大量的应用中修饰了所述位置(莒等,2006(Ju,et al.,2006)),包括具有大的加合物如生物素、地高辛配基(digoxigenin)以及大的荧光部分的DNA和RNA的聚合酶催化的标记。这样的修饰并未显著干扰与dNTP结合的效率或特异性。这允许将确定的样品制备方案(乳液PCR或桥接PCR)和高通量DNA测序技术与基因组DNA的酶辅助的CpG位点特异性C向U转化结合起来。
因此,所述新的全基因组DNA甲基化分析方法的工作流程(图11)由以下组成:1)C反应性部分向C的5位的酶转移;2)导致C向U类似物转化的光反应;3)对制备样品进行测序;以及4)整合高通量DNA测序以及使用适于酶辅助的和基于光化学的C向U转化的任何测序平台的数据解释。所述工作流程的确认为方案的进一步自动化建立了基础。
实例8:非CpG甲基化的检测
一些细胞类型包含非CpG甲基化(利斯特等,2009(Lister et al.,2009)),其功能目前尚未知。通过M.SssI方案的简单修饰来取代M.CViJI,可绘制出所有非CpG甲基化的~22%,M.CViJI使GpC二核苷酸中的胞嘧啶甲基化(许等,1998(Xu et al.,1998)),对于M.SssI,其特异于CpG二核苷酸。
实例9:甲基化分析和单个分子测序
所述技术还可用于通过DNA经过纳米孔室时的电子特性来鉴定碱基的单个分子测序技术。开发了AdoHcy衍生物,其允许衍生的胞嘧啶的精确鉴定以便区分胞嘧啶与5甲基胞嘧啶。这表示技术的简单延伸,其允许极快速且经济地绘制基因组甲基化模式。此处建立的甲基-seq方法提供了不仅可通过所有目前方法进行测序而且完全适于正在开发的新的单个分子方法的转化的DNA。
实例10:在对DNA有利的波长下光辐照介导的C向U的转化
在可用来研究DNA中的合适的C向U转化的多种化学机制中,可转化C(其在5位上未甲基化)为U衍生物的最有希望的化学机理是烯烃和C的5,6位双键之间的光辐照介导的[2+2]环加成。光辐照介导的[2+2]环加成导致C中共轭体系的中断且产生了烯烃与5,6位双键之间的5,6-环丁烷中间体。由于共轭体系的中断,在4位上的进一步脱氨基化(芳贺町等,1993(Haga,et al.,1993))可容易地发生,导致U衍生物的形成。值得注意的是,已经将所述化学作用应用于在DNA上的C向U转化(松村等,2008,藤本吉秀等,2010(Matsumura,et al.,2008,Fujimoto,et al.,2010))。甲基化的C不能经历具有烯烃底物的[2+2]环加成并且因此在该方法中不能转化为U。
已证明,可使用模型化合物5-烯丙氧基甲基-dC(5-ALL-OMC)通过300nm光辐照来将5位上被含烯烃的化学基团修饰的C光转化为U类似物。
再者,建议使用针对光辐照(其对DNA没有损伤影响)的光源。鉴于此,在光反应性双键处的进一步化学修饰经建议延长共轭体系使得烯烃反应中心的光吸收性能在光的较长波长处出现,保证在用大于350nm的波长且成为可见光谱的辐照时的光环加成和氧化脱氨基作用。
共轭延长的修饰提供了各种各样的烯烃,其经测试以优化含有可用于设计和合成AdoMet类似物种类的合适的双键。各种各样的修饰有吸电子基团或给电子基团的互补双键种类可被用于衍生AdoMet类似物。在另一方面,针对空间和能量有利的分子内环加成,这些修饰的双键和C的5,6双键之间的距离也被考虑。
图12显示了AdoMet类似物的实例结构,其中光活性的烯烃经苯基、二甲氧基或其它的基团修饰。通过采用DNA甲基转移酶和此类经设计的AdoMet类似物作为底物可进行长波吸收光反应性部分在CpG位点的5位上的连接。如图13所示,通过采用DNA安全的光辐照(大于330nm),实现了随后的C到U的转化。在CpG位点的光反应性部分直接从长波辐照得到光能并且引发了进一步具有C's中5,6双键的环加成。C的环丁烷中间体容易经历羟基化和去氨基,导致了DNA内U类似物的形成并且最终实现了在光辐照条件下CpG位点特定的C到U的转变。
对类似于图13中显示的AdoMet类似物的荧光研究已经证明了光激发的苯乙烯发色团(Ph-=-)通过[2+2]环加成和/或从苯乙烯发色团到C的单重态能量转移(参见图33)快速失活。利用苯乙烯发色团的更高的摩尔吸光系数,能量转移到C发色团还导致[2+2]环加成和随后的转化为U。
对于导致光环加成中间体形成的更有效的光反应,各种类的光敏剂或光催化剂还被用于便于激发,尤其那些具有长波长吸收性能的光敏剂或光催化剂,比如噻吨酮(TX)和其衍生物。在长波长辐照时,TX可被激发以生成三重态(TX)*中间体,其能够转移能量且生成上述提到的(图12和13)包含部分的5位修饰的双键的激发三重态。
此类从TX到类似于图13中显示的AdoMet类似物的doMet类似物中的苯乙烯发色团的三重态能量转移的速率常数由激光闪光光解确定为7.8x 109Ms-1。该高速率常数接近于针对三重态能量转移的理论最大速率常数。生成的包含部分的三重态激发双键很容易与导致环丁烷中间体形成的C的5,6双键反应,其便于C向U的转化。
再者,由于三重激发态较长的寿命,公知[2+2]环加成从三重激发态,相比单重激发态(由直接光解生成),通常更有效地进行。
或者,除了促进C向U光转化的多种5位修饰基团之外,通过使用与光催化剂三(联吡啶)钌(II)氯化物(Ru(bpy) 3 2+)组合使用的可见光将温和且有效的光反应条件应用于在实际DNA中的C向U转化。
用可见光(λmax=452nm)辐照Ru(bpy) 3 2+产生光激发状态Ru*(bpy) 3 2+,其可从相对富电子的胺碱基提取电子。然后,所得Ru(bpy)3+复合物将芳基烯酮还原为参与[2+2]环加成的关键自由基负离子中间体。在另一方面,Ru*(bpy) 3 3+还可将电子传给电子受体,然后,所得Ru(bpy) 3 2+使富电子苯乙烯氧化,提供可经历后续[2+2]环加成的自由基正离子。因此,无论是经过还原淬灭循环(reductive quenching cycle)还是氧化淬灭循环,Ru*(bpy) 3 2+均证明为烯烃的[2+2]光环加成的有力光氧化还原催化剂(艾斯查等,2008;2010;杜等,2009(Ischay et al.,2008;2010;Du et al.,2009))。其双途径光催化机制使Ru(bpy) 3 2+成为可进行缺电子烯烃和富电子烯烃两者的[2+2]环加成的多功能光催化剂(Michael,et al.,2008;2010)(图14)。所述优点提供了广泛的缺电子烯烃和富电子烯烃两者,从其中可筛选和优化可用于设计和合成AdoMet类似物的合适的含双键种类。当通过使用DNA甲基转移酶和这样的AdoMet类似物作为底物将光反应性部分连接在CpG位点的5位上时,通过Ru2+-可见光光催化完成后续的C向U转化。因此,组合作为光催化剂的该Ru2+复合体的使用和具有CpG修饰的DNA的可见光辐照提供了针对位点特定的C向U转化的另一个选项。
图15示出Ru(bpy) 3 2+-可见光催化DNA中的5位修饰的C向U的光转化的两个实例。Ru(bpy) 3 2+复合物的实例可以为Ru(bpy) 3 Cl 2 和Ru(bpy) 3 (PF 6 ) 2 。可见光光催化反应混合物包含Ru(bpy) 3 2+复合物、叔胺(例如,N,N-二异丙基乙胺(i-Pr 2 Net))、季铵阳离子(如MV(PF 6 ) 2 、甲基紫或MV2+)、Mg2+或Li+。光源可以为普通家用灯泡或激光(波长为400nm至600nm)。
因此,光反应介导的C向U的转化的条件包括在从300nm到700nm波长,在具有pH在4到10之间的缓冲溶液中0℃到90℃的温度之间,具有或不具有上述提到的光敏剂或光催化剂连同其它必要的成分的光辐照。
实例11: M.SssI的诱变
针对全基因组、单个CpG甲基化分析(其通过采用新颖的利用酶的活性在单细胞水平处是有效的)和光化学策略(其利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(AdoMet)的合成类似物)的方法正在被开发。该技术的重要成分是CpG特异的胞嘧啶-5DNA甲基转移酶,M.SssI。
来自螺原体物种的细菌限制性甲基转移酶M.SssI正常地转移锍连接的甲基基团从S-腺苷L-甲硫氨酸(AdoMet)到双螺旋DNA的胞嘧啶-磷酸酯-鸟苷(CpG)二核苷酸中的胞嘧啶残基的5位。之前的研究已经表明了M.SssI可转移其它的锍连接的部分从合成的AdoMet衍生物到DNA,正如在Klimauauskas et al.,U.S.Patent ApplicationPublication No.2012/0088238 Al中所描述的。Kriukiene et al.(2013)证明了在替换谷氨酸盐142和天门冬素(Aspargine)370为丙氨酸时M.SssI转移酶活性增加100倍。然而,虽然有利的选择性减小产生了,几乎确定的是,由于AdoMet结合位点增加的疏水性和AdoMet结合位点中氨基酸侧链的尺寸的急剧减小引起了酶活性的有害的下降。进行了类似的M.SssI的诱变并且还生成具有被替换为丝氨酸的谷氨酸盐142和天门冬素(Aspargine)370的突变体。
图16概括了用于生成、分离和分析突变体M.SssI活性的实验设计。
M.Sssl已经经设计以增加来自合成的AdoMet类似物的反应性基团转移的效率。突变Q142和N370均位于M.Sssl的活性位点并且这些残基到非极性的丙氨酸的突变有可能打开活性位点,从而促进更有效的结合到大于甲基基团的底物。这里,在替换上述提到的氨基酸为丝氨酸之后M.Sssl的效率进一步被研究了。假设在DNA和AdoMet存在下通过恢复AdoMet结合位点的亲水性和不严格的特异性同时维持提高的丙氨酸突变体的转移速率,丝氨酸突变体比丙氨酸变异体更稳定。还设计了M.SssI Q142S/N370A和Q142A/N370S变异体以进一步研究在这两个位点不同组合的取代对酶的转移活性的影响。
细菌菌株
下面的菌株被用于表达M.SssI:大肠杆菌K12菌株ER1821F-glnV44el4-(McrA-)rfbDl relAl endAl spoTl thi-1·(mcrC-mrr)114::IS10(Wait-Rees et al 1991)。该菌株是从新英格兰生物实验室得到。
细菌菌株ER1821经选择,因为它具有删除的基因,其为McrBC(特异性地限制通过不同组合的序列特异性的胞嘧啶甲基化酶修饰的DNA的酶)指定遗传密码。
在LB介质中,在37℃,细菌正常地生长[Sambrook,1989]。通过采用标准的CaCl 2 方法在化学上它们被使得有竞争力的(Tu et al.,2008)。有竞争力的细胞具有~107cfu/ugDNA的转化效率。通过采用标准的丙三醇协议,一批细胞也被使得是电转化感受态的[Sambrook,1989]。电转化感受态细胞具有~108cfu/g DNA的转化。
质粒和寡核苷酸
表达载体pCAL7被选择,因为它指导存在于螺原体物种内的DNA M.SssI变异体的表达并且具有与哺乳动物DNA甲基转移酶(CpG)相同的序列特异性,但是更高的转化数(turnover number)以及不需要半甲基化的底物(Renbaum and Razin,1992)。
pCAL7是被用于表达CpG特异性的DNA甲基转移酶M.SssI的7.4kb质粒。定向诱变被用于通过使结合辅因子的袋(cofactor-binding pocket)中的两个保守位置(Q142A/N370A)突变设计野生型M.SssI为His标记的突变的变异体。按照Tu et al.,2013协议进行质粒转化。通过采用来自富酶泰斯(生物技术公司)(Fermentas Life Sciences)的GeneJET质粒小量提取试剂盒(GeneJET Plasmid Miniprep Kit)进行质粒的小规模制备。
用于研究突变体SssI的活性的DNA是Dnmtl基因的460bp PCR扩增的片段。它含有许多位点使得它有用于研究酶转移的效率。
引物经设计用于插入6x His标记物、定向诱变和测序(用于验证序列中的突变)。通过采用Stratagene软件,用于诱变的引物经设计。用于测序的引物经手动地设计以从预期的突变退火~100bp。对于6x his标记物插入。类似于涉及非重叠引物对的使用的Naismith et al.(2008)描述的方法的方法经设计以提高插入较大的18bp片段的可能性。如下表1列举了用于定向诱变的引物。从集成DNA技术公司(Integrated DNATechnologies)订购引物。
表1用于6x His标记物插入(His)的引物对,替换Q142和N370。引物中的His插入被强调并且在His正义引物和反义引物之间的重叠区是斜体的。
使用化学感受态细胞(competent cells)的定向诱变
在7.4kb pCal7质粒上进行定向诱变以插入His标记物和替换突变。采用表1中列举的引物,由安捷伦科技的Quickchangell协议中概述的寡核苷酸定向诱变实施的诱变。简单地说,质粒是用引物集扩增的PCR,转化为ER1821细胞且被覆盖在氨比西林培养皿上。2-4个菌落经挑选用于小规模制备(使用GeneJET质粒小量提取试剂盒)。接着小规模制备菌落连同测序引物被寄到GeneWiz Inc用于测序以确认诱变的成功。
采用电转化感受态细胞(electrocompetent cells)的定向诱变
定向诱变在pCal7质粒上实施以通过采用安捷伦科技的Quickchangell-E协议中概述的协议引入置换突变。简单地说,通过采用诱变引物、提取的氯仿、析出的乙醇PCR扩增的质粒用水稀释到6μl。2μl该溶液经电穿孔到50μl的电转化感受态的大肠杆菌中,然后其通过添加到200μl SOC中稀释。然后50μl的该溶液被覆盖到氨比西林培养皿上,随后紧接着上述提到的小规模制备和测序过程。
野生型和突变型变异体(其被制备或在正在被设计的过程中)连同它们的名称被提供在图17中。由定向诱变生成的置换通过测序被确认,结果被概括在表2中。His标记物的插入同样通过测序被确认(表3)。
表2、生成M.SssI突变型变异体的置换的测序确认。突出该置换的核苷酸。WT显示了在未突变的质粒(没有His插入)中在针对替换的位点处的序列。
表3.N末端6x His标记物插入的测序确认
测序诱变后的质粒确认了置换的存在。对于6x His标记物的插入,通过使用Naismith et al(2008)中描述的PCR条件,设计了一组非重叠性引物使得新合成的DNA在后续的扩增循环中被用作模板。该方法的效率非常低。这使得申请人使用SS质粒,His标记物进入的质粒最初作为模板被插入以生成其它的突变型变异体和His标记的野生型变异体。
为了增加诱变的效率,电穿孔细胞被制备以及针对具有诱变产物的E4102S的转化,化学转化由电穿孔代替。相比它们的化学上感受态的对应物,电穿孔细胞具有高10倍的转化效率。如预期的,这些细胞的使用大幅度地提高每个诱变反应的菌落数目到~50菌落(相比针对具有化学上感受态细胞的诱变仅仅1或2)。然而,测序结果显示了这些菌落中高于50%包含亲本DNA,没有理想的突变。合适的片段的观察(其通过采用NEBCutter可生成)暗示了如在凝胶的带中所观察的,1350bp片段(其包含M.SssI序列、复制起点和Amp抗性序列(resistance sequence))也许在大肠杆菌内正在循环。
M.SssI活性是由限制性保护实验(restriction protection assay)评估。M.SssI表达pCal7质粒通过采用GeneJET质粒小量提取试剂盒分离并且通过采用甲基化敏感的限制性内切酶Hpall针对甲基化测试。用1U Hpall和IX CutSmart Buffer(由新英格兰生物实验室提供)培养200ng质粒并且在37℃培养1小时。10μΙ该溶液与1μΙ6X DNA负载染料混合并且被装载到1.5%琼脂凝胶上。通过采用Bio-Rad Gel Doc,该凝胶被观察。
具有M.SssI突变的变异体的体内功能试验的结果被显示在图18中。来自突变体的质粒被分离且用Hpall被消化。观察到,SerSer(Sssl Q142S/N370S)和AlaSer(M.SssIQ142A/N370S)突变型质粒对Hpall消化是部分耐受的,然而SerAla(M.SssI Q142S/N370A)突变体由Hpall是完全消化的。
假设从细菌分离的突变型质粒对Hpall消化是耐受的,如果它正在表达功能性的甲基转移酶。用Hpall消化的分离的质粒的凝胶结果(参见图18)表明了正如预期的,野生型对Hpall消化是完全耐受的,SerSer和AlaSer突变型质粒对Hpall消化是部分耐受的,然而SerAla突变体完全地由Hpall消化。结果确定了SerSer和AlaSer突变体能够以预期低于野生型的效率(由于其较大的活性位点)甲基转移。
未来的努力将集中于完成诱变以及His标记的野生型和其它的突变型M.SssI蛋白的纯化。随后蛋白进一步针对它们的甲基转移酶活性被测试。同时,通过使用质粒DNA,针对酶转移和光转化的高效率,合成的AdoMet经筛选且经优化以及最后通过采用最佳的AdoMet衍生物进行实验以确定在现实世界基因组DNA制备中的甲基化模式,尤其那些具有大量的甲基化数据(例如,来自乳腺癌细胞株MCF-7的DNA)。随后的高流通量下一代测序以单基对分辨率(single base pair resolution)促进DNA甲基化状态被读出并且验证方法的准确性。
依赖这些实验的成功,这种针对DNA甲基化组的分析的新方法可在单细胞水平上有效且节约地使用。来自单细胞的全基因组测序被认为基因组生物学中需要的下一步并且在许多临床应用中被预期有用;因此,该方法允许仅仅涉及平行的待完成的稍微修饰DNA测序协议的全基因组甲基化分析。
实例12:包含理想的长波长吸收光反应性部分的 AdoMet类似物的合成法
在温和的酸性条件下通过特定选择的具有对应的光反应性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物的AdoHcy的S-烷基化实施具有理想的长波长吸收光反应性部分的AdoMet类似物的合成。在AdoHcy的烷基化之后,预期到锍的非对映的混合物以及进一步RP—HPLC(反相高效液相色谱法)纯化被进行以分离针对后续的转移反应的利用酶的活性S-差向异构体。针对AdoMet类似物的合成路线的实例被显示在图19中。通过使用市售的原始材料可以制备针对此类AdoMet类似物合成所需要的光反应性部分的三氟甲磺酸酯或溴化物。
AdoMet衍生物包含比由AdoMet承载的甲基基团体积更大的连接锍的光活性基因。因此,申请人引入了用丙氨酸或丝氨酸取代体积大的谷氨酸盐(Q)142和天门冬素(N)370的氨基酸置换以扩大M.SssI的AdoMet的结合口袋(参见实施例11)。通过这种修饰,将增加转移大体积的来自AdoMet衍生物的光活性基团的效率。申请人已经得到下述的M.SssI的突变体:Q142S,N370S;Q142S N370A;Q142A,N370S;Q142Q,N370S;Q142Q,N370A;Q142S,N370N;Q142A,N370N。每个酶已经被纯化并且针对DNA中大体积的光活性基团从AdoMet衍生物到未甲基化CpG二核苷酸的转移效率经测试。
实例13:光转化反应的进一步测试
测试合成的单链DNA分子中的5位用光活性基团修饰的C向U类似物转化的可替代方法利用合成的双链DNA分子,其利用简单的基于凝胶的限制性内切核酸酶测定。
将至少50个碱基对的DNA分子的两个链合成为含有在CpG环境中的一个修饰的C的寡核苷酸。使用标准的基于亚磷酰胺的合成化学法将在两个链中的相同CpG部分中的C用之前所述的5位修饰的可光转化类似物中的一个来替代。以这样的方式设计寡核苷酸,在PCR之后,将所得双链DNA分子在不存在光转化的情况下用一种限制性酶裂解,在存在光转化的情况下用不同的限制性酶裂解。光转化事件的确认是通过在琼脂糖凝胶上检测所得限制性片段,或者随后变性,通过MALDI-TOF质谱检测单链片段来进行。另外的限制性位点使得在凝胶上的片段易于辨别,而在合成的DNA分子长度中在别处的另外可修饰CpG位点提供了用于在彼此不同的短距离下测试多个C类似物的光转化的另外选项。示出了这样的测定的实例(图20)。
实例14:用于测试光转化反应的模型化合物的合成
由于用于转化5-All-OMC为5-All-OMU类似物的UVB辐照(300nm)的可能的损伤影响,胞啶的苯丙烯类衍生物(phenylallyl derivative of cytidine)(5-PhAll-OMC),以致较长的有利DNA的波长可被用来引发C向U的转化,反而被合成了。具体地说,模型化合物5-PhAllOMC和5-DiMePhAll-OMC已经被合成了。针对5-PhAll-OMC的合成路线的实例被显示在图21中。图20中的化合物4、6和7的核磁共振(NMR)光谱分别被显示在图22A、B和C中。5-PhAll-OMC的质谱被显示在图23中。针对5-DiMePhAll-OMC的合成路线的实例被显示在图24中。
在三重态光敏剂噻吨酮(TX)的存在下用350nm光辐照5-PhAll-OMC。5-PhAll-OMC转化为U类似物的详细机理被显示在图25中。利用在4位的氧化脱氨基作用,大部分原始材料被转化为环丁基衍生物,如质谱、红外光谱以及1H和13C NMR所确认的。
新产物被发现是高于原始材料5-PhAll-OMC的1个质量单元,表明了可能的U类似物是从5-PhAll-OMC生成的。图26显示了在三重态敏化剂噻吨酮的存在下在光辐照之前5-PhAll-OMC的HPLC分析。插图显示了TX和5-PhAll-OMC的UV吸收光谱;注意到350nm光不与胞嘧啶相互作用但是强烈地由TX吸收。图26(下图)显示了在用350nm光光辐照20分钟之后的分析。虽然敏化剂(TX)的浓度保持不变,5-PhAll-OMC大部分被消耗掉且新的光产物出现了。13C NMR光谱(图27所显示的)明确地确认了在直的或交叉的结构中[2+2]环加合物的形成。
实施例15:模型化合物的合成,其中光敏剂(TX)共价地被连接到光反应性官能团(functionality)用于测试光转化反应
为了增加效率并且减小预料不到的副反应的可能性,TX敏化剂共价地被连接到苯基发色团。分子内三重态能量转移在几纳秒内使得TX三重态无效以在这种苯烯基发色团中引起三重态激发部分(图28),然后其通过[2+2]环加成与C的双键反应(Turro,et al.,2010)。由于从微秒到纳秒TX三重态寿命的数量级减小(由于分子内能量转移),比如电子转移反应的不想要的副反应(其损伤DNA)是高度地不太可能的。图28显示了针对模型化合物(其具有共价连接的光敏剂(TX))的一种合成路线。
实施例16:包含AdoMet类似物的光敏剂的合成
包含敏化剂的AdoMet类似物递送高效的光活性脱氨基基团到双链DNA中未甲基化的CpG位点的胞嘧啶上。一种化合物的结构和合成方案被提供在图29中。
实施例17:包含光敏剂(TX)和用于CPG位点富集和测序的可点击部分的AdoMet类似物的合成
在人类基因组DNA中CpG二核苷酸约5倍未被读出并且在CpG岛中被浓缩(Bestoret al.,2014),结果在读取较短的下一代测序(short-read next-generationsequencing)中,全部DNA序列中约20仅仅%甚至包含单个的CpG二核苷酸。这意味着约80%的测序成本被浪费了。检测非常少量的肿瘤DNA尤其有用且有必要。这可以通过向图30中显示的AdoMet类似物添加叠氮基或炔烃部分来完成以致衍生的DNA(其包含未甲基化的CpG二核苷酸)可被捕获且通过点击化学在炔烃或叠氮基磁珠上纯化(Kolb et al.,2001)。结果是流通量的5倍增加。叠氮基和炔烃修饰的光活性基团被显示图30中。
实施例18:通过采用包含光敏剂(TX)和可点击部分的AdoMet类似物的CpG位点富集的光化学甲基化分析
为了增加光化学甲基化分析的效率,这些DNA片段(其包含未甲基化的CpG二核苷酸)具体地用点击化学抽取,如图31中所显示的。如果经转移的基团具有炔烃部分,修饰有叠氮基的磁珠被用于捕获;具有叠氮基部分的经转移的基团在炔烃衍生的珠子上捕获(Kriukiene et al.,2013)。然后捕获的DNA经处理用于下一代DNA测序。这将保证只有那些DNA片段(其包含一个或多个未甲基化的CpG位点)会经历测序。注意到:该方法具有单个CpG分辨率并且所有甲基化的CpG位点经测序为CpG位点以及所有的未甲基化的CpG位点经测序为TpG's。
再者,图32显示了乙腈溶液中两种化合物的荧光光谱(·ex=282nm)。当脱氧胞苷部分共价地被连接到图21中的5-PhAll-OMC时,苯乙烯发色团的荧光丢失是由快速分子内[2+2]环加成(产生U的第一反应步骤)和/或从苯乙烯发色团到脱氧胞苷部分的单重态能量转移引起的。利用苯乙烯发色团较高的摩尔吸光系数,能量转移到脱氧胞苷发色团还导致[2+2]环加成和后续的向U转化。
公知[2+2]环加成相比从单重激发态,通常从三重激发态更有效地进行。通过激光闪光光解和瞬态吸收光谱,显示了图21中的5-PhAll-OMC的苯乙烯发色团的三重激发态可有效地通过采用噻吨酮由三重态敏化占据。
噻吨酮衍生物在接近UV光谱区直至400nm(对DNA不是有害的光谱区)具有极好的光吸收性能。为了确定通过激光闪光光解的三重态能量转移的速率常数,使用了图21中的模型化合物5-PhAll-OMC,其包含苯乙烯发色团。光致激发噻吨酮生成的三重态(其由苯乙烯发色团(图21中的5-PhAll-OMC淬火,具有速率常数7.8x 109M-1s-1,其是有可能三重态转移的最大速率常数(图33)))。
图34显示了在不存在和存在不同浓度的图21中的5-PhAll-OMC(0到0.25mM)下在氩气饱和的乙腈溶液中在脉冲光激发(355nm,5ns脉冲宽度)之后在625nm监测的噻吨酮三重态的瞬态吸收的衰退踪迹(图34A)和三重态能量转移速率常数的确定(图34B)。
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