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1. CN107250147 - Universal methylation profiling methods

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[ ZH ]

权利要求书

1.一种化合物,其具有以下结构:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。

2.根据权利要求1所述的化合物,其中R是
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。

3.根据权利要求1所述的化合物,其中R是

4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物,其中R'是H或烷基。

5.一种组合物,其包含具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
所述化合物与CpG甲基转移酶相连接。

6.根据权利要求5所述的组合物,其中R是:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是
且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。

7.根据权利要求5所述的组合物,其中R是

8.根据权利要求5至7中任一项所述的组合物,其中R'是H或烷基。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的组合物,其中所述化合物与所述CpG甲基转移酶的活性位点相连接。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物,其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。

11.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物,其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。

12.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物,其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。

13.一种产生双链DNA的衍生物的方法,其包含使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触:
其中R是能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物上转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5-碳上的化学基团,其是在使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合的条件下进行,从而产生所述双链DNA的衍生物,
其中R具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是且n是1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H。

14.根据权利要求13所述的方法,其中R具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R是或当R是且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。

15.根据权利要求13所述的方法,其中R具有以下结构:

16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法,其中R'是H或烷基。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。

18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。

19.根据权利要求13至16中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。

20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法,其中当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时,所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。

21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法,其中所述未甲基化胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的单链中的鸟嘌呤邻接。

22.一种确定存在于已知序列的双链DNA序列的单链中预定位置的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中R具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;
b)通过光转化在步骤a)中产生的衍生物中C类似物来制备U类似物;
c)独立地获得所述双链DNA的所述衍生物的单链;
d)对在步骤c)中获得的所述单链进行测序;以及
e)将在步骤d)中测定的所述单链的序列与没有产生衍生物的所述双链DNA的相应链的序列进行比对,
其中在所述衍生物的所述单链中存在U类似物替代胞嘧啶类似物表明了在所述双链DNA的单链中的预定位置上的胞嘧啶是未甲基化的。

23.根据权利要求22所述的方法,其中R具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。

24.根据权利要求22所述的方法,其中R具有以下结构:

25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法,其中R'是H或烷基。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。

27.根据权利要求22至25中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。

28.根据权利要求22至25中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法,其中所述胞嘧啶在序列中直接与所述双链DNA的所述单链中的鸟嘌呤邻接。

30.根据权利要求22至29中任一项所述的方法,其中当能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳上的所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5-碳共价结合时,所述化学基团允许所述未甲基化胞嘧啶的4-位上的光化学脱氨基化。

31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法,其中在步骤d)中所述测序是通过合成测序。

32.根据权利要求31所述的方法,其中所述通过合成测序包含使衍生的单链与DNA聚合酶、引物寡核苷酸、dATP、dCTP、dGTP、dTTP以及连接有可检测标记的三磷酸双脱氧核苷酸接触。

33.根据权利要求32所述的方法,其中所述可检测标记是放射性的或有荧光的。

34.根据权利要求32所述的方法,其中所述可检测标记是质量标记物。

35.根据权利要求32所述的方法,其中所述可检测标记是能够减小纳米孔中的离子电流的分子。

36.根据权利要求22至35中任一项所述的方法,其还包含在步骤d)之前将所述单链与固体载体相连接。

37.一种衍生的DNA,其中所述衍生的DNA不同于还没有被衍生的DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R'是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R”、CN、NO 2 、C(O)R”、S(O) 2 NHR”;
其中X是O或NR';
其中R”是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R'是且n为1时,R 1 、R 2 或R 3 中的至少一个不为H,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。

38.根据权利要求37所述的衍生的DNA分子,其中R'是:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R”、CN、NO 2 、C(O)R”、S(O) 2 NHR”;
其中X是O或NR”;
其中R”是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
前提条件是,当R'是或当R'是
且n为1时,R 1 或R 2 中的至少一个不为H。

39.根据权利要求37所述的衍生的DNA分子,其中R'是

40.根据权利要求37至39中任一项所述的衍生的DNA分子,其中R”是H或烷基。

41.一种衍生的DNA分子,其中所述衍生的DNA分子不同于DNA之处在于其包含核苷酸残基,所述核苷酸残基包含具有以下结构的碱基:
其中R”是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数,
并且其中所述糖是所述核苷酸残基的糖。

42.根据权利要求41所述的衍生的DNA分子,其中R”是以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。

43.根据权利要求41所述的衍生的DNA分子,其中R”是:

44.根据权利要求41至43中任一项所述的衍生的DNA分子,其中R'是H或烷基。

45.一种用于衍生双链DNA分子或者用于确定存在于已知序列的双链DNA序列中的胞嘧啶是否为未甲基化的试剂盒,其包含:
a)具有以下结构的化合物:
其中R是
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)使用说明书。

46.根据权利要求45所述的试剂盒,其中R是以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。

47.根据权利要求45所述的试剂盒,其中R是

48.根据权利要求45至47中任一项所述的试剂盒,其中R'是H或烷基。

49.根据权利要求39至41中任一项所述的试剂盒,其还包含CpG甲基转移酶。

50.根据权利要求42所述的试剂盒,其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。

51.根据权利要求42所述的试剂盒,其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。

52.根据权利要求42所述的试剂盒,其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。

53.一种确定存在于已知序列的双链DNA序列的单链中的预定位置的胞嘧啶是否为未甲基化的方法,其包含:
a)通过使所述双链DNA与CpG甲基转移酶和具有以下结构的S-腺苷甲硫氨酸类似物接触来产生所述双链DNA的衍生物:
其中R是化学基团,所述化学基团能够通过所述CpG甲基转移酶从所述S-腺苷甲硫氨酸类似物转移到所述双链DNA的未甲基化胞嘧啶的5碳上以使得所述化学基团与所述双链DNA的所述未甲基化胞嘧啶的所述5碳共价结合,从而制备衍生的双链DNA,其中R具有以下结构:
其中R 1 、R 2 和R 3 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数;以及
b)确定在所述双链DNA中的预定位置上的胞嘧啶是否被所述化学基团R所修饰,
其中用所述化学基团R修饰在所述双链DNA中预定位置上的所述胞嘧啶表示在所述双链DNA中的所述位置上的所述胞嘧啶为未甲基化的。

54.根据权利要求53所述的方法,其中所述化学基团具有以下结构:
其中R 1 和R 2 独立地为H、烷基、芳基、C(O)NH 2 、C(O)R'、CN、NO 2 、C(O)R'、S(O) 2 NHR';
其中X是O或NR';
其中R'是H、烷基或芳基;并且
其中n是1至8的整数。

55.根据权利要求53所述的方法,其中所述化学基团具有以下结构:

56.根据权利要求53至55中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.SssI甲基转移酶或其突变体。

57.根据权利要求53至55中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.HhaI甲基转移酶或其突变体。

58.根据权利要求53至55中任一项所述的方法,其中所述CpG甲基转移酶是M.CviJI甲基转移酶或其突变体。

59.根据权利要求53至58中任一项所述的方法,其中确定在所述双链DNA中的预定位置上的胞嘧啶是否被所述化学基团R所修饰包含将所修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶类似物。

60.根据权利要求59所述的方法,其包含通过光催化反应将在所述DNA衍生物中的经修饰的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶类似物。

61.根据权利要求60所述的方法,其中所述光催化反应使用三(联吡啶)钌(II)氯化物(Ru(bpy) 3 2+)催化剂来进行。

62.根据权利要求61所述的方法,其中所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 Cl 2

63.根据权利要求61所述的方法,其中所述(Ru(bpy) 3 2+)催化剂是Ru(bpy) 3 (PF 6 ) 2

64.根据权利要求60至63中任一项所述的方法,其中用于所述光催化反应的光源是家用灯泡。

65.根据权利要求60至63中任一项所述的方法,其中用于所述光催化反应的光源是激光。

66.根据权利要求68所述的方法,其中所述激光的波长为400nm至600nm。

67.根据权利要求60所述的方法,其中所述光催化反应是通过使用大于350nm波长的光辐照进行的。

68.根据权利要求67所述的方法,其中所述光催化反应是通过使用具有长波吸收性能的催化剂进行的。

69.根据权利要求68所述的方法,其中所述催化剂是噻吨酮(TX)或其衍生物。

70.根据权利要求60所述的方法,其中所述光催化反应是通过使用300-700nm波长的光辐照进行的。

71.根据权利要求60-70任一项所述的方法,其中所述光催化反应进一步是在0℃到90℃之间的温度进行的。

72.根据权利要求71所述的方法,其中所述光催化反应进一步是在具有pH在4到10之间的缓冲溶液中进行的。