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1. WO2004054590 - NOUVEAU GINSENOSIDE UTILISE COMME AGENTS ANTITUMORAUX

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[ ZH ]
一种新型抗肿瘤人参皂苷

技术领域- 本发明涉及 20-Ο- β -D-木糖(1→6)- β -D-葡萄糖 -20(s)-原人参二醇 [20-O- β -D -xylopyranosyl(l→6)- β -D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol, 简称 Mx],特别以 Mx和含有 Mx为活性成分的新颖抗肿瘤制剂。 Mx具有诱 导肿瘤细胞分化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转肿瘤多药耐药性、 抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机体免疫力和降低化 疗药物毒副作用等抗肿瘤活性。

背景技术:

人参皂苷具有多种药效功能, 如抗肿瘤和免疫调节、改善微循环、调节 消化机能、安神、抗衰老、抗紧张、预防消化道溃疡、提高生命质量、增强 记忆力和学习能力等。但天然人参皂苷几乎不能被肠道直接吸收入血,并且, 药代动力学行为较差。

近来,先后发现多种由天然人参皂苷经生物转化而来的代谢产物如 20-O-β 葡萄糖 - 20(S)-原人参二醇 [20 -0- β -D-glucopyranosyl

-20(S)-protopanaxadiol, 简称 C-K], 20-O- a -L-阿拉伯糖 (1—6) - β -D-葡萄糖 -20(S)-原人参二醇 [20-O- -L-arabinopyranosyl (1—6)- β -D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol,简称 C-Y] 和 20-O- -L-阿拉伯糖 (1—6) - β -D-葡萄糖 -20(S)-原人参二醇 [20-O- a -L-arabinofuranosyl (1→6)- β -D-glucopyranosyl 20(S)-protopanaxadiol, 简称 Mc]。它们分别被证明是相应天然人参皂苷的口 服吸收形式。 Hasegawa等研究发现 C-K在抗肿瘤方面具有诱导肿瘤细胞分 化、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤诱导的新生血管形成、 抗击肿瘤的浸润和转移等多种生物活性;另外, C-K具有良好的药代动力学

行为且基本无毒或毒性很低, 目前,在韩国已进入 III期临床研究。源于天 然人参皂苷 Rb2和 Rc的代谢产物 C-Y和 Mc具有与 C-K相似的药效活性。

由于天然人参或天然人参皂苷口服后几乎不直接吸收,口服后上述三种 可吸收的代谢产物是通过人体肠道菌的转化而来。 因机体的人参皂苷肠道菌 代谢能力存在个体差异,因此,理论上,直接使用转化物可以避免吸收障碍, 使临床上易于掌握有效剂量,。

Hasegawa将天然人参皂苷与肠道菌一起体外厌氧培养,从培养液中分离 得到 C-K,并申请了美国专利(5,919,770)。由于厌氧培养时, C-K不是唯一 产物、 C-K转化率率低,因此,分离纯化繁琐,后处理不易。此外,厌氧培 养条件苛刻也使成本大大生高。有柚皮苷酶、橙皮苷酶水解制备 C-K的方法, 但该法有下列缺陷:水解时间长、酶的用量大,酶的来源不易,因此,不适 于工业制备。

我们先前的研究开发了在工艺及成本上均有优势的 C-K酶法制备方法 (中国专利,申请号 01133410.X)和微生物发酵方法(中国专利,申请号 02132403. 4)0两项技术发明较之肠道菌和柚皮苷酶、橙皮苷酶的制备技术有 多种优势。利用上述技术,以三七茎叶中富含的人参皂苷 Rb3为原料,本发 明的发明人发现了 Mx这一具有抗肿瘤活性的新化合物, Mx具有与 C-K相 似的生物活性,而较之人参,三七及其茎叶在我国具有更加明显的资源优势, 因此,可以预见本发明具有极大的开发和应用价值。

发明的技术内容:

本发明提供了具有如下结构式 I的 20-O- β -D-木糖 (1— 6)- β 葡萄糖 -20(s)-原人参二醇 [20-O- β -D -xylopyranosyl (1→6)- β

-D-glucopyranosyl-20(S)-proto-panaxadiol], 以下简称 Mx。

Mx的特性如下:

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(8)无臭、无色、针状结晶体(甲醇-水体系中结晶)

(9)易溶于甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇、吡啶、二甲亚砜。 Mx具有诱导肿瘤细胞分化、 诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长、逆转 肿瘤多药耐药性、抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤的浸润和转移、增强机 体免疫力和降低化疗药毒副等抗肿瘤活性,具极大的幵发潜力。

本发明还提供了含有 Mx为活性成分的新颖抗肿瘤制剂。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中, Mx的有效剂量为 l-50 mg/Kg/天。 本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中, Mx可与任何法定药用赋形剂和配合 剂制成各种药用剂型的制剂。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中, 以 Mx为活性成分的制剂可单独使 用,也可与目前市场上的任何化疗药(包括激素类、烷化剂类、铂类、抗代 谢类、拓扑异构酶抑制剂类、抗微丝微管类、诱导分化类及其它)联合使用, 或制成复方制剂使用。

本发明 、所提供的新颖抗肿瘤制剂中,制剂剂型可为口服、注射或局部用 药剂型。

本发明所提供的新抗肿瘤制剂中, 口服剂型可为片剂、粉剂、悬浊液、 乳浊液、胶囊、颗粒剂、糖衣片、药丸、液体、醑剂、糖浆或柠檬水剂等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中, 注射剂型可为水剂、悬浊液或溶液 等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中, 局部用药剂型可为软膏、固体、悬 浊液、水剂、醑剂、粉剂、糊剂、栓剂、气溶胶、泥敷剂、涂抹剂、洗剂、 灌肠剂或乳剂等。

本发明所提供的新颖抗肿瘤制剂中,赋形剂可以是下列中的一种或多 种:(a)、口服剂型的粉状赋形剂如乳糖、结晶纤维素、淀粉、糊精、磷酸 钙、碳酸钙、合成或天然的二氧化铝、干燥的氢氧化铝,硬脂酸镁、碳酸氢 钠等;(b)、局部用药剂型的粉状赋形剂如氧化锌、滑石、淀粉、高陶土、 硼酸盐粉末、硬脂酸锌、硬脂酸镁、碳酸镁、沉淀碳酸钙、碱式没食子酸铋 和硫酸钾铝粉末生等;(c)、液体用赋形剂如水、甘油、丙二醇、甜味糖浆、 乙醇、脂肪油、乙烯甘油、聚乙二醇、山梨醇;软膏用赋形剂,如混合脂肪, 脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜡、日本蜡、石蜡、硫酸石蜡、树脂、高 级醇、塑料、乙二醇、水或表面活性剂(包括脂溶基、水溶基和悬浮基)等。 具体实施方式:

实施例 1: Mx的制备

人参皂苷 Rb3 (500mg)蜗牛酶(84 mg)溶于磷酸-柠檬酸缓冲液(32mL , pH4.5, 离子强度为 O.OOlmol - L-1, 含 10%的乙醇) 中, 40°C水浴中水解 1 天;离心反应液收集沉淀,用水将沉淀物制成悬浊液,用乙酸乙酯萃取(10 mL X 5),合并乙酸乙酯液,减压除乙酸乙酯后获 Mx ( 193mg)。

实施例 2: 片剂配方实例

Mx (30 mg)与乳糖、结晶纤维素和 1 %硬脂酸镁的混合物均匀混合,经 压片机制成每片为 200 mg的片剂。

实施例 3 : 注射剂配方实例

无菌操作下,将 Mx (15mg)和多乙氧基醚的溶液灌入小瓶,除水份后, 获注射用制剂。

实施例 4: 抑制 MCF-7和 K562细胞生长的活性

a)、方法:以人乳腺癌 MCF-7细胞株和人红白血病 K562细胞株为实验 用细胞株,取对数生长期细胞(2.5xl05/mL)接种在 96孔板内,由高至低浓 度加入药物溶液,对照组则加入等体积 RPM 1640培养液。药物作用 48小时 后,按 MTT法求生长抑制率和 IC50:

生长抑制率 (%) =[ 1一实验组 OD值 /对照组 OD值] χ100% IC50是生长抑制率为 50%时的药物浓度。

b), 实验结果:如表 1所示。

表 1. Mx对 MCF-7和 K562细胞生长的 [ P制作用

IC50 ( μ Μ)

MCF-7 562

ADM 1.4±0.1 2.6±0.2

Mx 47±9 32±5

C-K 41±9 27±7

C-Y 90±14 50±8

Mc 97±11 57±6 结果表明 Mx对两种肿瘤细胞株具有生长抑制作用, IC5Q分别为 47μΜ 禾口 32μιη。

实施例 5: Mx对肿瘤细胞浸润渗透能力的影响

a)、方法:采用 transwell浸润渗透方法,依 Cancer Res., 47, 3239, 1987操 作。 transwell是一个插件,可插入标准 24孔板中某一孔的上部。在 transwell 插件培养腔的底部有 8μηι大的孔径,由一滤膜隔断,在滤膜上用 5 g 的 martigel模拟纤维粘连蛋白涂于表面,形成上下两培养腔室的屏障。 HT1080 人腺肉瘤细胞株,经 Mx ( 1-1000 μΜ)处理 30分钟后置于 transwell的培养 腔 (细胞数为每 100 L 1X105) 内,上下均加入 600 含 0.1%小牛 血清的 MEM培养液, 4小时孵育后,取下 24孔板,用乙醇固定孔内细胞, HE染色, 光镜计数,获浸润渗透细胞数。将处理前后的细胞数进行比较, 求渗透抑制率和 ED50

渗透抑制率 (%) = [ 1—实验组渗过的细胞数 I对照组渗过的细胞数] χ100%

ED50 =渗透抑制率为 50%时的药物浓度。

b)、实验结果:如表 2所示。

表 2. Mx对肿瘤细胞基底膜渗透能力的抑制

ED50 ( μ Μ)

对照

RGSD 4000

Mx 7.2

C-K 4.1

C-Y 35

Mc 52

结果表明: Mx较 RGSD (Arg-Gly-Asp-Ser, 已知具有抑制肿瘤转移活性 的多肽)具有更强的抑制活性,在 50%渗透抑制作用时的浓度(ED50)为 7.2

实施例 6: 逆转肿瘤多药耐药性

a)、方法:以人乳腺癌阿霉素耐药株 MCF-7/ADM及其敏感株 MCF-7/S 和人红白血病阿霉素耐药株 K562/A及其敏感株 K562/S为实验用细胞株(以 敏感细胞株的 IC5o为基数,耐药细胞株对阿霉素的耐药倍数 MCF-7为 30倍, K562为 62倍),用 MTT法考察化合物在无毒剂量下化合物对阿霉素 IC5Q (阿 霉素耐药株)影响,根据下列公式计算耐药倍数。

耐药倍数 =耐药细胞 IC5。/敏感细胞 IC5();

b)、实验结果:如表 3所示。

表 3. Mx对肿瘤多药耐药性的逆转作用

ϋ 耐药倍数

(μ Μ) MCF-7/ ~~ K562/A

A

control 30.1 62.5

Verapamil 8 6.6 11.0

Mx 6 13.3 33.7

C-K 6 14.8 36.3

C-Y 6 18.4 39.0

Mc 6 16.4 37.8

PPD 12 26.1 52.2

结果表明: Mx对两种多药耐药性肿瘤细胞株的逆转活性 50 %。