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1. WO2011054960 - PROCÉDÉ D'OBTENTION DE DONNÉES POUR LA DÉTERMINATION DE L'HÉMOGLOBINE TOTALE (THB) D'UN ÊTRE VIVANT OU DE L'ÉTAT MÉTABOLIQUE D'UN ÊTRE VIVANT

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[ DE ]

Bezeichnung

Verfahren zur Datengewinnung für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von für die Ermittlung der Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) eines Lebewesens oder eines Stoffwechselzustands eines Lebewesens geeigneten Daten.

Die mit einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ermittelten Daten sind unter anderem verwendbar für

■ die Beurteilung von Blutbildungsstörungen und Blutverlusten, z.B. bei Dialyse, Operationen und Blutspende,

die Kontrolle einer Blutmanipulation im Sport,

die Ermittlung von Anpassungsprozessen an unterschiedliche Umweltbedingungen,

die Bestimmung des anabolen/katabolen Stoffwechselzustandes des Kör- pers.

Das Blutvolumen des menschlichen Körpers und seine Teilvolumina können indirekt durch Markierung seiner/ihrer zellulären Bestandteile wie Hämoglobin und gesamte Erythrozyten oder seine/ihrer flüssigen Bestandteile, wie Albumine, be-stimmt werden. Von größerem praktischem Interesse ist die zelluläre Markierung, da hiermit alle gängigen Blutbildungsstörungen oder Veränderungen aufgrund von Außeneinflüssen ermittelt werden können, ohne dass Verdünnungseffekte durch Veränderungen des Plasmavolumens die Ergebnisse verfälschen . Bislang wurden als Marker radioaktive Substanzen, die in die Blutbahn injiziert wurden, oder Kohlenmonoxid benutzt, welches über die Atmung zugeführt wurde. Während im medizinisch-klinischen Bereich noch die radioaktiven Marker eingesetzt werden, wird im Bereich des Sports nahezu ausschließlich die CO-Rückatmung verwandt (s. Gore CJ, Hopkins WG, Bürge CM (2005) Errors of measurment for blood volume Parameters: a meta-analysis. J Appl Physiol 99: 1745-1758).

Beide Bestimmungsarten sind sehr genau, stehen aber wegen ihrer möglichen Nebenwirkungen in der Kritik. So können radioaktive Marker nur sehr dosiert und kaum wiederholt eingesetzt werden, bei der Anwendung von CO muss seine Toxizität beachtet werden, die davon herrührt, dass es die Sauerstofftransportka-pazität herabsetzt und damit insbesondere bei anämischen Patienten (Blutarmut) nur bedingt eingesetzt werden kann. Diese beiden Arten der Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens sind daher mit Risiken und legalen Problemen behaftet.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Verfügung zu stellen, das toxikologisch weniger bedenklich oder unbedenklich ist.

Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens nach Patentanspruch 1 ergeben sich durch die Merkmale der Unteransprüche.

Unter einem Marker wird hier und im Folgenden ein Element oder eine chemische Verbindung verstanden, das bzw. die zur Beobachtung von Stoffwechsel prozessen oder zur Bestimmung der Gesamthämoglobinmenge verwendet wird.

Ein Grundgedanke der Erfindung besteht darin, ein Isotop des Stickstoffs, sei es in elementarer Form oder in einer das Isotop enthaltenden Verbindung, einem Lebewesen zuzuführen, um entweder aus der hierdurch bedingten kurzzeitigen Änderung der Konzentration dieses Isotops im Körper, sei es in elementarer Form oder in einer chemischen Verbindung, oder aus der Abweichung des Isotopen-Verhältnisses 15N/14N oder der Abweichung des Isotopologenverhältnisses von Isotopologen wie beispielsweise 15NO und 14NO, die die N-Isotopen enthalten, vom natürlichen Verhältnis (das natürliche Verhältnis der Konzentrationen von 15NO zu 14 NO wird mit 3,67 * 10 3 angegeben), gegebenenfalls auch im Verlauf über eine bestimmte Zeitdauer, Rückschlüsse auf Veränderungen des Stoffwechselzustands oder die Gesamthämoglobinmenge des Lebewesens ziehen zu können. Aus einer festgestellten Änderung eines Stoffwechselzustands kann dann beispielsweise durch Vergleich der gemessenen Änderungen mit anderen Messungen, bei denen vergleichbare Änderungen bei vergleichbaren Probanden festgestellt wurden und bei denen die Messungen einer bestimmten Diagnose zugeordnet wurden, auch eine Diagnose abgeleitet werden.

Das natürliche Isotopenverhältnis von 15N/14N entspricht dem oben angegebenen für 15NO/14NO. Bei einer exogenen Applikation von 15N oder von mit 15N markierten Substanzen (15NO, 15N-markierte Substrate) reicht der Einsatz minimaler absoluter Mengen (beispielsweise 15 μΙ) aus, um eine signifikante Verschiebung des Isotopen- bzw. Isotopologenverhältnisses zu erreichen. Dadurch wird der Proband/Patient wenn überhaupt nur minimal gestört/beeinträchtigt. Daher eignet sich die Quantifizierung der 15N-Konzentration bzw. das Isotopenverhältnis ebenso wie das Isotopologenverhältnis der auf 15N basierenden Stickstoffverbindungen in Proben, insbesondere im Blut, als empfindlicher Indikator zur Bestimmung physiologischer und pathologischer Stoffwechsel prozesse im Blutkreislauf. Für die beiden Isotope bestehen leichte Unterschiede der Reaktionskonstanten, so dass pathologische Prozesse sowie Prozesse unter Belastung zu einer messbaren Veränderung des endogenen Isotopenverhältnisses führen.

Als besonders geeigneter Marker kommt Stickstoffmonoxid (NO) in Betracht. NO ist ein wichtiges Signalmolekül im Blutkreislauf des menschlichen Körpers, welches sich physiologischer Weise im Körper befindet und an das Hämoglobin bindet, ohne wie das CO in Konkurrenz mit Sauerstoff zu treten. Insbesondere das 15NO Isotopolog (aber auch das 14NO-Isotopolog), welches über die Atmung zugeführt werden kann, bindet sich komplett an das Hämoglobin und ist daher insbesondere auch als Marker für die Gesamthämoglobinmenge geeignet.

Die Erfindung ermöglicht somit eine minimalinvasive Bestimmung der totalen Hämoglobinmenge und des Blutvolumens durch ein prinzipiell körpereigenes Tracergas als erstem Marker, welches in sehr geringer Menge als zweiter Marker über die Atmung zugeführt wird. Dadurch ist die Anwendbarkeit der Methode auf alle Patientenkollektive und auf gesunde Probanden ohne gesundheitliches Risiko gewährleistet, was bislang nicht der Fall war.

Ein weiterer Kern der Erfindung besteht darin, dass das Isotopologenverhältnis der 14N160 und/oder 15N160-Mengen in Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin, Speichel, Sperma) oder der exhalierten Luft zu mindestens zwei unterschiedlichen Zeitpunkten - bezogen auf die Probennahme am Lebewesen (Probanden/Patienten/Athleten/Tier) - gemessen werden, und zwar selbst dann, wenn dem Lebewesen kein Marker verabreicht wird . Durch diese Vorgehensweise können Änderungen der jeweiligen NO-Mengen/Konzentrationen ermittelt werden. Selbstverständlich ist dies auch mit allen anderen Isotopologen von Stickstoffmonoxid durchführbar, ebenso wie mit den beiden Stickstoff-Isotopen 14N und 15N als solches.

Gemessene zeitliche Änderungen der Isotopenkonzentration bzw. der Isotopologenkonzentration lassen Rückschlüsse auf den Ablauf von physiologischen und pathologischen Prozessen (Zeit- und Reaktionskonstanten) des gesamten NO-Metabolismus zu. Diese Prozesse werden von Transport- und Verteilungsprozesse innerhalb des Körpers überlagert. Dabei werden alle möglichen Erscheinungsformen bzw. Bindungsmöglichkeiten des NO und seiner Abbauprodukte im Stoffwechsel (NO gebunden an Hämoglobin Hb-NO, gelöstes NO, Nitrosothiole (RSNO), N-Nitroso-Verbindungen (RNNO), nitrosierten/nitrosylierten Spezies (RXNO), Nitrat, Nitrit, etc.) berücksichtigt. Die unterschiedlichen Metaboliten im NO-Stoffwechsel können aus den Körperflüssigkeiten selektiv über chemische Reaktionen, wie sie aus der Literatur bekannt sind, freigesetzt werden.

Die Technik erlaubt somit darüber hinaus neue, bisher nicht bestimmbare Analysen des NO Metabolismus, der NO Bildung, der NO Verteilung und der Wechselwirkung zwischen verschiedenen endogenen und exogenen NO Quellen.

Eine Freisetzung des am Hämoglobin gebundenen NO erfolgt in einer Ferricyanidlösung. Für Nitrit erfolgt die Reduktion zu NO in ei ner Kaliumjodid Lösung (KI + HCl Gemisch). Nitrat und Nitrit werden in einer Vanadiumchloridlösung (V(III)CI3 + HCl Gemisch bei ca. 90°C) freigesetzt. Um z.B. die Nitratmenge einer Probe zu bestimmen, muss demnach die Differenz der freigesetzten NO-Mengen einer Kaliumjodid- sowie einer Vanadiumchlorid-Lösung gemessen werden. NO kann auch aus Thiolen freigesetzt werden.

Der Transport des freigesetzten NO aus der jeweiligen Lösung in eine Nachweiszelle erfolgt durch einen kontinuierlichen Gasstrom. Hier bietet sich als Trägergas Luft oder Edelgas, Fluss 100 ml/min - 2 l/min, an. Je nach Fragestellung kann auch die Ermittlung der freigesetzten NO-Menge nur eines Reaktionskanals ausreichen. Die Bestimmung des Blutvolumens kann z.B. ausschließlich über die Freisetzung des 15NO aus Hb-NO mit einer Ferricyanidlösung erfolgen. Die freigesetzte NO-Menge wird quantifiziert und mit dem Zeitstempel der Probennahme versehen.

Durch in zeitlichen Abständen aufeinander folgende Messungen erhält man Zeitreihen von NO-Konzentrationen in der jeweils untersuchten Körperflüssigkeit bzw. der Atemluft. Wenn die Kinetik des zu untersuchenden Prozesses über Vorversuche ermittelt wurde, reicht die Bestimmung der NO-Mengen oder -Konzentrationen zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten aus, und man kann die Reaktions- und Zeitkonstanten von Entstehungs- oder Abbauprozessen bestimmter Stoffwechsel re-aktionen des NO-Metabolismus quantifizieren. Die charakteristische Kinetik des zu untersuchenden Prozesses wird in Vorversuchen mit hoher zeitlicher Auflösung ermittelt. An den gemessenen zeitlichen Verlauf wird eine Funktion (Exponenti-alfunktion, Logistische Funktion, etc.) angefittet, die den zeitlichen Anstieg bzw. Abfall der gemessenen NO-Mengen geeignet wiedergibt. Hieraus kann die Zeitkonstante bestimmt werden.

Dadurch lässt sich eine Vielzahl physiologischer Informationen ermitteln bzw. lassen sich pathologische Veränderungen (Zeit- und Reaktionskonstanten) des NO-Metabolismus erfassen. Bei der Bestimmung des Blutvolumens sind alleine die Zeitkonstanten des Bindungsvorganges des 15NO Markergases an das Hämoglobin,

die Verteilung des Hb-NO im Körper und der natürliche Abbau des Hb-NO im Blut ausschlaggebend. Der Bindungsvorgang des NO an das Hämoglobin ist nicht l imitierend und erfolgt verglichen mit den beiden anderen Prozessen instantan. Die beiden übrigen Vorgänge überlagern sich und bewirken nach der Einatmung des 15NO - Markergases die Ausbildung eines maximalen Plateauwertes, bevor die Abbauprozesse ein Sinken der Hb-NO-Konzentration im Blut bewirken.

In Vorversuchen können an einer Anzahl von Probanden/Athleten/Patienten Blutproben in einem engen Zeitraster (30-60 Sekunden Abstand zwischen den Entnahmen) entnommen und die zeitliche Kinetik der Hb-15NO-Änderung quantifiziert werden. Die Freisetzung erfolgt wie oben beschrieben durch eine Zugabe der Blutprobe (100 μΙ - 1 ml) in eine Ferricyanidlösung (Glasbehälter mit ca. 10-50 ml Ferricyanidlösung). Die Quantifizierung erfolgt in einem Analysegerät.

Die Messung der N-Isotopenkonzentration in einer Probe erfolgt vorzugsweise, wie schon beim NO-Isotopologennachweis, in gasförmiger Phase. Daher werden die Isotopen bzw. Isotopologen vorzugsweise in einen NO-Isotopolog überführt.

Die Umwandlung, Freisetzung und Messung der 14N und/oder 15N-Komponenten in bzw. als gasförmiges Stickstoffmonoxid bietet wesentliche Vorteile gegenüber der Messung in der flüssigen Phase. Mit Hilfe empfindlicher Molekülnachweisverfahren wie Massenspektroskopie, Laserspektroskopie, etc., kann ein isotopologenselektiver Nachweis erfolgen, der in der flüssigen Phase nicht möglich ist. Im ersten Schritt erfolgt die Umwandlung (Reduktion, Substitution) in der Flüssigkeit bzw. an der Bindungsstelle. Mit Hilfe eines Trägergases, wie Stickstoff, Edelgas, normale Luft, etc., erfolgt die Austreibung aus der Flüssigkeit. Hierbei ist eine große Oberfläche durch fein verteilte Gasblasen vorteilhaft. Einer Schau mbildung aufgrund der Proteine in z.B. Vollblut kann/muss Rechnung getragen werden. Das Molekülnachweisverfahren muss sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Selektivität besitzen.

Um ein 15N/14N Isotopenverhältnis empfindlich ermitteln zu können, sollte ein ausreichend schneller Wechsel zwischen zwei geeigneten Nachweisfrequenzen möglich sein, um sowohl die 14NO- als auch die 15NO-Konzentration abwechselnd innerhalb eines nahezu identischen Gasvolumens bestimmen zu können.

Ein etabliertes Verfahren für den NO-Nachweis in der Wissenschaft und für klinische Anwendungen ist der Chemilumineszenznachweis (Firmen : Siewers, Ecophys). In den letzten Jahren wurden hier die verschiedenen Freisetzungsverfahren etabliert, die für die vorliegende Erfindung eingesetzt werden können. Allerdings ist die Chemilumineszenzmethode nicht isotopologenselektiv.

Andere bekannte Verfahren, mit denen gleichzeitig isotopologenselektiv die 14NO und 15NO-Mengen einer Gasprobe ermittelt werden können, sind beispielsweise mittels Faraday-Modulationsspektroskopie (s. Appl. Physics B (2009) 96, S. 535-544), die Lasermagnetresonanz-(LMR)-Spektroskopie oder auch die Massenspektrometrie. Allerdings stellt ein Isotopologenverhältnis von etwa 1/300 zwischen 15NO und 14NO große Anforderungen an die Massenauflösung eines Massenspektrometers, da die beiden Isotopologe in benachbarten Massenkanälen nachgewiesen werden.

Mit Quantenkaskadenlasern stehen seit einigen Jahren erstmalig Festkörperlaser zur Verfügung, die ausreichende Laserleistung von Halbleiterlasern im mittleren Infrarot verfügbar machen. Die Laser weisen eine Frequenzabstimmbarkeit auf, die einen kombinierten Nachweis der 14NO- und 15NO-Isotopologe mittels Fara-day-Rotations-Spektroskopie gestatten. Die Laser erfordern eine Kühlung der Abwärme mit Flüssigstickstoff. Ein Teil der Laserstrahlung (Strahlteiler) dient der Stabilisierung der Nachweisfrequenz mit einer mit NO gefüllten Referenzzelle. Der Nachweis erfolgt jeweils nur für ein Isotopolog.

Veränderungen des Isotopologenverhältnisses liegen unterschiedliche Reakti-onskonstanten 14N160 zu 15N160 im Körper zugrunde. Bei exogener Gabe ma rkierter Substanzen (15N160 als Gas, 15N-markiertes Substrat, 15N-markierter NO Donor) können die exogenen 15NO-Quellen von den endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopologenverhältnis anhand der Veränderungen des Isotopologenverhältnis 15NO/14NO in der Blutprobe unterschieden werden. Eine Stimulierung oder Inhibierung der endogenen NO-Quellen mit natürlichem Isotopologenverhältnis durch exogene 15NO-Applikation kann ebenfalls durch eine Veränderung des Isotopologenverhältnisses in der Blutprobe ermittelt werden Diese Wechselwirkungen sind insbesondere für die Untersuchung von Wirkstoffen relevant. Eine Markierung kann direkt durch Gabe eines 15NO-Donors, z.B. 15N-Molsidomin, oder über die Gabe eines markierten Substrates bzw. einer Vor- läufersubstanz, z.B. 15L-Arginin erfolgen. Die Quantifizierung des Effektes erfolgt wieder über die Verschiebung des Isotopologenverhältnisses in der z.B. Blutprobe.

Bei exogener Applikation ist der Zeitpunkt der ersten Probennahme in der Regel der Zeitpunkt vor Verabreichung des Markers.

Bei einer Erhöhung der Anzahl der Blutproben pro Zeit bis hin zu einer nahezu kontinuierlichen Entnahme kann die zeitliche Kinetik der beobachteten Prozesse detaillierter aufgelöst und quantifiziert werden. Entscheidend ist die Anzahl der Proben innerhalb der relevanten Prozessdauer, z.B. Verteilungsprozess nach Ei natmen von 15NO-Markergas, allergische Reaktion, Infektion, etc.. Die Prozessdauern können stark variieren. Um das nicht-lineare Verhalten quantifizierbar zu machen, sollten jedoch mindestens 12-15 Einzelproben über die gesamte Prozessdauer genommen werden. Mit ausreichend hoher zeitlicher Auflösung lässt sich die Dynamik der zugrunde liegenden Prozesse über Zeitreihenanalyse ermitteln.

Nachfolgend wird eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens zur Ermittlung des Blutvolumens erläutert.

Zur Bestimmung des Blutvolumens wird nach einer ersten Blutprobennahme von einem Probanden, zu der die Konzentration cl des Markers 15N160 bestimmt wird, dem Probanden eine bestimmte Menge des gleichen Markergases 15N160 an den Probanden über die Atmung verabreicht, von dem Probanden also inhaliert.

Die Inhalation kann über ein Spirometer erfolgen, wie es in der DE 102 22 750 Cl beschrieben ist. Die darin beschriebene Vorrichtung ist zwar zum Inhalieren von CO gedacht, lässt sich aber ebenso zum Inhalieren von N-Isotop-basierten Gasen verwenden. Das Spirometer besteht aus einem Mundstück, einem C02-, einem H20-Absorber, einem Hauptabsperrventil, einer Gaszuführung sowie einem Gasreservoir (ca. 31). Nach Zudosierung des Gasreservoirs mit ca. 60-80 ml 15NO Eichgas (750 ppm 15NO in Stickstoff) wird das Reservoir mit reinem Sauerstoff auf 31 Gesamtvolumen aufgefüllt. Die 15NO-Konzentration im Spirometer wird überprüft. Der Proband/Patient umschließt das Mundstück fest mit den Lippen. Die Nasenatmung wird mit einer Nasenklammer verhindert. Auf Anweisung der Aufsichtsperson atmet der Proband maximal aus. Nach Öffnen des Absperrventils atmet der Proband tief das 15NO-Sauerstoffgemisch ein und hält für einen Zeitraum von 10 s die Luft an. Danach wechselt der Proband in seinen natürlichen Atem-

rhythmus und führt für eine Zeitdauer von 1min 50s die Rückatmung des 15NO-Sauerstoffgemisch durch. Kurz vor Erreichen der 2 Minutengrenze atmet der Proband maximal aus und die Aufsichtsperson schließt das Absperrventil. Die 15NO-Konzentration im Spirometer wird nach Ende der Rückatmung ermittelt. Zu den vorher ermittelten Zeitpunkten wurden nach der 15NO-Rückatmung Blutproben abgenommen. Entweder erfolgt eine direkte Messung oder ein Einfrieren der Proben mit flüssigem Stickstoff für eine spätere Messung .

Das 15N160 bindet an das Hämoglobin und über die Veränderung der Hb-15NO Konzentration lässt sich die Hb-Menge bestimmen. Hierfür ist einerseits die Kenntnis der maximalen NO-Menge, die an das Hämoglobin binden kann, erforderlich. Die maximale Menge, die an das Hämoglobin binden kann, wird ermittelt, indem eine Blutprobe mit NO gesättigt wird. Die Quantifizierung der freigesetzten NO Menge aus der gesättigten Probe gestattet eine Ermittlung der maximalen gebundenen NO-Menge.

Andererseits ist der Zeitpunkt der zweiten Probennahme entscheidend, da sich das NO mit einer bestimmten Zeitkonstante (Transport im Körper) verteilt, so dass die zweite Blutprobe nach Erreichen einer gleichmäßigen Verteilung des aufgenommenen Hb-15NO im Blut genommen wird. Wie oben beschrieben, wird in Vorversuchen die Zunahme und im weiteren Verlauf die Abnahme der Hb-15NO-Menge im arterialisierten und venösen Blut bei Probanden gemessen. Nach Erreichen gleicher NO-Konzentrationen im arterialisierten und venösen Blut ist die vollständige Mischung des aufgenommenen NO im Blut erreicht. Hierfür ist ein enges Zeitraster für die Blutentnahmen erforderlich. Bei den ersten Messungen zur Bestimmung des Blutvolumens mit 15NO wurde die Hb-15NO-Menge zu der aus der CO-Rückatmung bekannten Zeit bis zur Einstellung des entsprechenden Hb-CO-Plateauwertes durchgeführt. Eine Ermittlung der Zeitspanne bis zum Erreichen eines Plateauwertes für das Hb-15NO erfolgt empirisch. Bei der Bestimmung des Blutvolumens reicht auch eine Messung des freigesetzten 15NO anstelle des Isotopologenverhältnisses aus. Die Freisetzung des 15NO erfolgte aus 1 ml Vollblut.

Die Gesamthämoglobinmenge (tHb-Menge) aus den zuvor bestimmten Konzentrationen cl und c2 von erster und zweiter Probe bestimmt wird nach der Formel :

tHb-Menge = Kl* Μ^θ θΟ^ΔΗ^ΝΟΎο*^) 1

und wobei

Kl = aktueller Luftdruck*760 1:,<(l+(0.003661*aktuelle Tem- peratur in °C))_1

lunge (nach Rückatmung) +XN0 ausgeatmet (nach

ΔΗοχΝΟ% = (c2-cl) [Differenz der prozentualen Bindung zwischen dem basalen HbxNO und dem HbxNO nach xNO Rückatmung]

K2 = (ml xNO *(g Hb)-1) [maximale xNO Menge pro Gramm

Hämoglobin]

Menge des applizierten xNO Markergas

xNOSystem+ Lunge (nach Rückatmung) = xNO Konzentration (nach Rückatmung nicht in den Körper aufgenommen)

xNO ausgeatmet (nach Rückatmung) = xNO Konzentration alveolär nach Rückatmung * alveoläre Ventilation * Zeit,

und wobei XN vorzugsweise 15N ist.

Wie leicht zu erkennen ist, beinhaltet der Korrekturfaktor Kl eine Anpassung der Messungen an Luftdruck und Temperatur zum Zeitpunkt der Konzentrationsbestimmung. AHbxNO% beschreibt die Differenz zwischen erster gemessener Konzentration des betrachteten Markergases in der Blutprobe (basaler HbxNO-Wert), bevor dem Probanden das Markergas verabreicht wurde, und der gemessenen Konzentration des Markergases in der Blutprobe, nachdem dem Probanden Markergas verabreicht wurde und sich ein Gleichgewicht des NO-Gehalts in venösem und arteriellem Blut eingestellt hat. MxNO beschreibt die Menge des tatsächlich vom Blut aufgenommenen Markergases, nämlich die Menge des zu Beginn im Spirometer vorhandenen Markergases xNOadm abzüglich der Menge xNOSystem+ Lunge (nach Rückatmung) des nach Verabreichung des Markergases im Spirometer und in der Lunge verbliebenen Markergases sowie abzüglich der Menge xNO ausgeatmet (nach Rückatmung) des nach der Verabreichung des Markergases bis zu dem Zeitpunkt, zu dem sich ein gleicher NO-Konzentrationen im arterialisierten und venösen Blut eingestellt hat, ausgeatmeten Markergases. Der Faktor K2 bezeichnet die maxi-male 15NO Menge pro Gramm Hämoglobin (ml 15NO *(g Hb)-1), die experimentell bestimmt werden muss (s.o.). Die Belüftung der Lungenbläschen wird als alveoläre Ventilation bezeichnet. Diese entspricht der bei der Atmung ausgetauschten Luftmenge, d.h. dem Atemzugsvolumen minus dem Totraumvolumen. In der Formel wird der xNO-Verlust über die Atmung angegeben, wobei die

xNO-Konzentration, das ausgetauschte Volumen und die Dauer der betrachteten Atmung relevant sind.

Auf die Verwendung der Korrekturparameter, insbesondere der Parameter XNOsystem+ Lunge (nach Rückatmung) Und XNO ausgeatmet (nach Rückatmung) Oder die Faktoren Kl und K2 kann unter Umständen auch verzichtet werden.

Mittels der über die NO-Rückatmung bestimmten Hämoglobinmenge und der in etwa gleichzeitig gemessenen Hämoglobinkonzentration (Routinemethode) kann mit folgender Formel das Blutvolumen berechnet werden :

Blutvolumen (in ml) = Hämoglobinmenge (in g) * 100/

(Hämoglobinkonzentration in g/ml * Zellfaktor) wobei der Zellfaktor meist mit 0,91 angegeben wird.

Die Kenntnis des Blutvolumen zusätzlich zur Hämoglobinmenge ist in vielen klinischen und sportmedizinischen/sportwissenschaftlichen Fragestellung außerordentlich wichtig (z.B. Hypervolämie bei Herzinsuffizienz, Dialyseüberwachung, Blutverlust, Flüssigkeitsverlust, Trainingsanpassungen).

Neben der Bestimmung der Konzentrationsänderungen von N-Isotop-markierten Markern bei Verabreichung eines das Isotop enthaltenden Markers an einen Probanden lassen sich Messungen über den zeitlichen Verlauf des Isotopenverhältnisses 14N/15N bzw. des Verlaufs des Verhältnisses von diese Isotope enthaltenden Isotopologen, wie beispielsweise 15NO oder 14NO, Rückschlüsse auf Stoffwech-seizustände zu, auch ohne dass dem Probanden ein Marker verabreicht wurde.

Die Bestimmung des Isotopenverhältnisses 14N/15N im Körper eines Lebewesens ist dadurch gekennzeichnet, dass zu mindestens zwei verschiedenen Zeitpunkten der 14N bzw. 15N Anteil in identischen Proben untersucht wird. Proben können aus ausgeatmeter Luft, Blut, Urin, Speichel, Liquor sowie den Komponenten der flüssigen Bestandteile Serum, Erythrozyten, Leukozyten bestehen, wob ei in diesem Zusammenhang auch denkbar ist, dass Serum als Probe von einem Lebewesen genommen wird. Die untersuchten 14N/15N-haltigen Substanzen können insbesondere Stickstoffmonoxid (NO), Nitrat, Nitrit, Hb-NO, gelöstes NO, Nitrosothiole (RSNO), N-Nitroso-Verbindungen (RNNO) und/oder nitrosierten/nitrosylierten

Spezies (RXNO)sein. Die Zeitpunkte der Probennahme hängen von den untersuchten klinischen, pathologischen oder sportwissenschaftlichen Fragestellungen ab. Die Zeitkonstanten der erwarteten/beobachtbaren Veränderungen des Isotopenverhältnisses können im Minutenbereich, aber bei der Entwicklung von chronischen Krankheiten auch im Bereich einiger Jahre liegen. Die Verä nderungen des Isotopenverhältnisses 14N/15N werden durch vielfältige Prozesse (Nahrungsaufnahme, Krankheiten, Monatszyklus, Schlaf, Stress, Jahreszeiten/externe Ei nflüsse, Transport- und Diffusionsprozesse im Körper, o.a.) beeinflusst, die sich überlagern. Dadurch entstehen zeitlich komplexe Verläufe des Isotopenverhält-nisses über den beobachteten Zeitraum. Die Probenahme kann kontinuierlich oder semikontinuierlich erfolgen (beispielsweise bei natürlichem Atemrhythmus, mit definiertes Atemprotokoll, über gelegten Zugang zur Blutentnahme mit NaCI-Spülung, Entnahme von Kapillarblut im Ohrläppchen, über Mikrodosierpumpe).

So kann das Isotopenverhältnis 14N/15N verwendet werden, um den anabolen bzw. katabolen Stoffwechselzustand des untersuchten Lebewesens und seine Veränderungen infolge von Nahrungsaufnahme, Krankheit, Training o.ä. zu bestimmen. Katabole und anabole Prozesse des Gehirns unterscheiden sich zwischen Männern und Frauen. Desweiteren treten in diesen Prozessen mit zunehmendem Alter Veränderungen auf. Starke Unterschiede konnten bei fortgeschrittener Alzheimer Erkrankungen beobachtet werden. Die systemische Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion beruht häufig auf bestimmten Veränderungen der metabol ischen oder hormonellen Prozesse, um die physiologische Homöostase aufrecht zu erhalten. Typischerweise findet auch dabei ein Wechsel von Energiespeicherung zu Energieverbrauch des Systems statt. Chronisches Herzversagen (chronic heart failure) ist ein komplexer kataboler Zustand mit schlechter Verlaufsprognose.

Das wesentliche Merkmal von Tumorenzellen im Vergleich zu normalen Zellen besteht in einem veränderten Metabolismus der Tumorzellen, sei es als Auslöser oder als Folge des Tumorwachstums. Eine gesteigerte Glukoseaufnahme stellt für das Wachstum von Tumorzellen einen Vorteil dar. Zwischenprodukte der glykolytischen ATP Erzeugung werden von den Tumorzellen für anabole Reaktionen genutzt. Der gesamte Metabolismus (Glykolyse und TCA-Cycle) wird umge-stellt, um die anabolen Prozesse zu steigern, die mit Zellwachstum und Tumorstreuung verbunden sind.

Katabole und anabole Störungen des Fettmetabolismus sind vielfältig beschrieben. Die klinischen Ausprägungen und Symptome bilden sich aufgrund von leichten Veränderungen einzelner Schritte des normalen Lipidmetabolismus. Die kleinen Veränderungen der Enzymtätigkeit oder Enzymfunktion führen häufig entweder zu Akkumulation von falschen Metaboliten, d.h. vom Körper oder der Zelle nicht weiter verwertbaren oder entsprechend zu einem Mangel an den notwendigen Metaboliten.

Die gemessenen Veränderungen des Isotopenverhältnisses lassen auch Rück-Schlüsse auf die Entstehung chronischer Krankheiten zu.

Alle diese Veränderungen lassen sich mit dem vorliegenden Verfahrens der Bestimmung des 14N/15N Isotopenverhältnisses frühzeitig erkennen. Voraussetzung für das Erkennen des 14N/15N Isotopenverhältnisses und damit des katabolen oder anabolen Stoffwechselzustandes ist die Kenntnis der Ausgangswerte des Isotopenverhältnisses und der ablaufenden Prozesse.

Eine zeitliche und/oder räumliche Trennung der Probennahme und der Probenanalyse kann insbesondere bei Probennahmen zu Dopingtestzwecken sinnvoll sein.