Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

Aller à Demande

1. WO2021060637 - PROCÉDÉ D'INDUCTION DE LA DIFFÉRENCIATION EN CELLULES PRÉCURSEURS NEURONALES DE LA DOPAMINE À PARTIR DE CELLULES SOUCHES

Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2   3  

배경기술

4   5   6   7  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

8   9   10  

과제 해결 수단

11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98   99   100   101   102   103   104   105   106   107   108   109  

발명의 효과

110  

도면의 간단한 설명

111   112   113   114   115   116   117   118   119   120   121   122   123  

발명의 실시를 위한 형태

124   125   126   127   128   129   130   131   132   133   134   135   136   137   138   139   140   141   142   143   144   145   146   147   148   149   150   151   152   153   154   155   156   157   158   159   160   161   162   163   164   165   166   167   168   169   170   171   172   173   174   175   176   177   178   179   180   181   182   183   184   185   186   187   188   189   190   191   192   193   194   195   196   197   198   199   200   201   202   203   204   205   206   207   208   209   210   211   212   213   214   215  

산업상 이용가능성

216  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15  

도면

1   2a   2b   3   4a   4b   4c   5a   5b   6   7a   7b   8a   8b   8c   8d   9a   9b   9c   10a   10b   11a   11b   12   13a   13b  

명세서

발명의 명칭 : 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포 분화 유도 방법

기술분야

[1]
본 발명은 줄기세포 유래 중뇌 특이적 도파민 신경전구세포 분화 유도 및 대량 생산 방법에 관한 것이다.
[2]
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI18C0096에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 "첨단의료기술개발", 연구과제명은 "기능 및 효능 기반 전분화능줄기세포 유래 파킨슨병세포치료재 개발", 주관기관은 주식회사 에스바이오메딕스, 연구기간은 2018.04.30. ~ 2022.12.31.이다.
[3]
본 특허출원은 2019년 9월 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2019-0118370호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

배경기술

[4]
줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극 (환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 더 이상 분열하지 않는 완전히 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
[5]
현재 줄기세포는 세포치료제로서 각광을 받고 있는데, 신경세포의 손상에 의해 유발되는 다양한 신경 질환(neurological diseases)의 세포치료제로서도 많은 연구가 이루어지고 있다. 특히 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병보다 세포 이식치료에 가장 적절한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부 반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다.
[6]
한편, 세포 치료제로서의 줄기세포의 유용성을 높이기 위해서는 줄기세포를 효율적으로 특정세포로 분화시키는 기술 및 원하는 시기에 특정세포를 공급할 수 있는 기술이 필요하다.
[7]
그러나, 현재까지 줄기세포를 임상에 적용할 수 있는 수준의 고수율로 특정세포(특히, 도파민 신경세포)로 분화하는 기술 및 적정단계에서 세포를 보관하는 기술은 개발되어 있지 않은 상황이다.

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[8]
본 발명자들은 뇌신경계 질환을 위한 세포 치료제를 개발하기 위해 줄기세포를 중뇌-특이적 도파민 신경전구세포로 분화 유도 시킬 수 있는 제조 방법을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 중뇌 특이적 도파민 신경전구세포를 임상에 적용할 수 있을 정도의 고수율로 대량 생산할 수 있는 방법을 고안함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
[9]
따라서, 본 발명의 목적은 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)로의 분화 유도방법을 제공하는 것이다.
[10]
본 발명의 다른 목적은 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

과제 해결 수단

[11]
본 발명자들은 뇌신경계 질환을 위한 세포 치료제를 개발하기 위해 줄기세포를 중뇌-특이적 도파민 신경전구세포로 분화 유도 시킬 수 있는 제조 방법을 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 중뇌-특이적 도파민 신경전구세포를 임상에 적용할 수 있을 정도의 고수율로 대량 생산할 수 있는 방법을 고안하였다.
[12]
또한, 본 발명자들은 분화 유도된 중뇌-특이적 도파민 신경전구세포를 적정 단계에서 작업용 세포은행(working cell bank, WCB)으로 저장 할 수 있는 효율적인 방법을 규명하였다.
[13]
본 발명은 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)로의 분화 유도방법 및 도파민 신경전구세포의 대량 생산방법에 관한 것이다.
[14]
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
[15]
[16]
본 발명의 일 양태는 다음의 단계를 포함하는 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)로의 분화 유도방법에 관한 것이다.
[17]
a) 줄기세포(stem cells)를 단일 세포층의 형태로 배양하는 단계;
[18]
b) 배아체(embryoid body)를 형성시켜 유지 배양하는 단계;
[19]
c) 신경 로제트(neural rosette)를 형성시키는 단계; 및
[20]
d) 신경 로제트를 도파민 신경전구세포로 분화시키는 단계.
[21]
이하, 본 발명의 도파민 신경세포 제조방법에 대하여 상세히 설명한다.
[22]
[23]
a) 단계
[24]
본 단계는 미분화 줄기세포 단계에서 BMP 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달 신호 경로 억제제로 전처리하여 줄기세포에 자극을 가하는 과정이다. 본 과정에 의해 줄기세포는 상기 물질로 전처리 되지 않은 줄기세포에 비하여 외배엽(ectoderm), 특히 신경외배엽(neurectoderm)으로의 분화 효율이 증가된다.
[25]
상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체 줄기세포(Adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 또는 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포일 수 있다.
[26]
본 단계는 5-9일 또는 8일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[27]
상기 범위에서 분화를 진행하면 배아체 형성에 콜라게나아제를 사용하지 않는 방법으로 배아체를 얻을 수 있으며, 상기 범위를 벗어날 경우 목적 세포가 아닌 자연 분화가 일어나거나 분화 다음 단계인 배아체 형성에 문제가 발생할 수 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 기간이 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 기간을 설정할 수 있다.
[28]
본 단계는 단계가 종료되는 날로부터 1-3일 전부터 1일마다 BMP 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달 신호 경로 억제제가 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[29]
상기 BMP 신호 경로 억제제는 도소모르핀(dorsomorphin), Smad6, Smad7, 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 그렘린(Gremlin), Sog(shortgastrulation), 폴리스타틴(Follistatin), DAN(differential screening=selected gene aberrant in neuroblastoma), 세프베루스(Cerberus), 단테(Dante) 및/또는 PRDC(Protein Related to DAN and Cerberus)일 수 있으나, 당업계에 공지되어 있는 다양한 BMP 신호 경로 억제제는 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[30]
본 발명에서 "도소모르핀(dorsomorphin)"은 BMP 신호 경로를 억제하는 물질로, BMP 자체를 억제하거나 또는 BMP가 BMP 수용체에 결합하는 것을 억제하는 역할을 한다.
[31]
상기 도소모르핀은 다음과 같은 화학식 1로 표시할 수 있다:
[32]
[화학식 1]
[33]
[34]
본 단계에서 첨가되는 BMP 신호 경로 억제제의 농도는 1.0 내지 20.0uM, 4.0 내지 6.0uM 또는 5.0uM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[35]
상기 범위를 벗어날 경우 세포 사멸이 일어날 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포의 종류에 따라 작용하는 농도가 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 각각의 최적 농도를 설정할 수 있다.
[36]
상기 액티빈/노달 신호 경로 억제제는 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드, Smad6, Smad7 및/또는 폴리스타틴(Follistatin)일 수 있으나, 당업계에 공지되어 있는 다양한 액티빈/노달 신호 경로 억제제는 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[37]
본 발명에서 "4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드"는 당업계에서 SB431542로 알려져 있으며, 액티빈/노달(Activin/Nodal) 신호 경로를 억제하는 물질로, 액티빈/노달 자체를 억제하거나 또는 액티빈/노달이 그의 수용체에 결합하는 것을 억제하는 역할을 한다.
[38]
상기 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드는 다음과 같은 화학식 2로 표시할 수 있다:
[39]
[화학식 2]
[40]
[41]
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 SB431542과 혼용하여 사용된다.
[42]
본 단계에서 첨가되는 액티빈/노달 신호 경로 억제제의 농도는 1.0 내지 50.0uM, 4.0 내지 6.0uM 또는 5.0uM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[43]
상기 범위를 벗어날 경우 세포 사멸이 일어날 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포의 종류에 따라 작용하는 농도가 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 각각의 최적 농도를 설정할 수 있다.
[44]
본 단계는 TeSR2 세포배양 배지에서 배양되는 것일 수 있다. 이는 임상 진입 및 세포치료제로 사용하기 위함이며, TeSR2 세포배양 배지뿐만 아니라 임상 진입 가능한 줄기세포 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[45]
b) 단계
[46]
본 단계는 배아체(Embryoid Body)를 형성시키고, 형성된 배아체를 배양시키면서 SHH(sonic hedgehog) 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제로 처리하여 배아체에 자극을 가하는 과정이다. 본 과정에 의해 배아체는 상기 물질로 처리 되지 않은 배아체에 비하여 도파민 신경전구세포로의 분화 수율이 증가된다.
[47]
본 발명에서 "배아체(Embryoid Body)"는 배아 줄기세포로 대표되는 전분화능 줄기세포의 3차원 집합체를 의미하며, 전분화능 줄기세포는 배아체를 통해 초기 배아 발생단계의 분화과정을 재현할 수 있고 내배엽, 중배엽, 외배엽의 모든 삼배엽성 체세포로 분화가 가능하다.
[48]
본 단계는 3-6일, 4일, 5일 또는 6일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[49]
상기 범위에서 수행되는 경우 도파민 신경전구세포 분화율을 극대화할 수 있는 효과가 있으며, 상기 범위를 벗어날 경우 배아체 상태에 악영향을 미쳐 분화율이 저조해질 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 기간이 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 기간을 설정할 수 있다.
[50]
본 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 BMP 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달 신호 경로 억제제가 첨가되는 것일 수 있다. 이에 의해 신경외배엽으로의 분화 효율이 더욱 증가될 수 있다.
[51]
또한, 본 단계는 단계가 시작되는 날로부터 2-6일째에 1일마다 SHH 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제가 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[52]
상기 SHH 신호 경로 활성제는 SAG(Smoothened Agonist), 퍼모프아민(Purmorphamine), 할시노나이드(Halcinonide), 플루티카손(Fluticasone), 클로베타솔(Clobetasol) 및/또는 플루오시노니드(Fluocinonide)일 수 있으나, 당업계에 공지되어 있는 다양한 SHH 신호 경로 활성제는 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[53]
본 발명에서 "SAG(Smoothened Agonist)"는 SHH(sonic hedgehog) 신호 경로를 활성화하는 저분자 화합물로, SHH는 신경외배엽 발생 단계에서 중뇌 복측 도파민 신경세포의 분화와 분포에 중요한 역할을 한다.
[54]
또한, 하기 실시예에 따르면, 상기 SAG는 도파민 신경전구세포의 중요 마커 중 하나인 FOXA2 발현을 증가시키는 역할을 한다. FOXA2(winged helix/forkhead box A2)(HNF3beta)는 전사 인자(transcription factor)로 중추 신경계(central nervous system, CNS) 발생에 중요한 역할을 하며 중뇌 특이적 발달에 관여하는 여러 유전자 발현 및 중뇌 특이적 도파민 신경세포 생성에 영향을 미친다.
[55]
한편, SHH 신호 경로 활성제는 하기에서 설명할 GSK-3 억제제와 연계하여 고수율의 중뇌 특이적 도파민 전구세포 분화에 관여하기 때문에, SHH 신호 경로 활성제 단독 사용으로는 중뇌 특이적 도파민 전구세포로 분화가 불가능하다.
[56]
상기 SAG는 다음과 같은 화학식 3으로 표시할 수 있다:
[57]
[화학식 3]
[58]
[59]
본 단계에서 첨가되는 SHH 신호 경로 활성제의 농도는 0.1 내지 5.0uM, 0.6 내지 5.0uM 또는 1.0uM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[60]
상기 범위를 벗어날 경우 다른 세포로 분화할 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 농도가 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 농도를 설정할 수 있다.
[61]
상기 GSK-3 억제제는 6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile(CHIR99021), 3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione(SB216763), N6-[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]-3-nitro-2,6-pyridinediamine(CHIR98014), TWS119, Tideglusib, 3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrol-2,5-dione(SB415286), (2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-oxime(BIO), Valproic acid, 5-Iodo-7-β-D-ribofuranosyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-amine(Iodotubercidin), 1-Azakenpaullone, 커큐민(Curcumin), 올란자핀(Olanzapine) 및/또는 피리미딘(Pyrimidine)일 수 있으나, 당업계에 공지되어 있는 다양한 GSK-3 억제제는 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[62]
본 발명에서 "CHIR99021"는 윈트/베타-카테닌(Wnt/beta-catenin) 신호 경로를 활성화하는 저분자 화합물(GSK-3 억제제)로, 윈트/베타-카테닌 신호는 외배엽 및 신경발생단계를 조절하며 SHH과 함께 중뇌 도파민신경세포의 분화에 중요한 역할을 한다.
[63]
또한, 하기 실시예에 따르면, 상기 CHIR99021은 도파민 신경전구세포의 중요 마커 중 하나인 LMX1A 및 En-1의 발현을 증가시키는 역할을 한다.
[64]
한편, GSK-3 억제제는 상기에서 설명한 SHH 신호 경로 활성제와 연계하여 고수율의 중뇌 특이적 도파민 전구세포 분화에 관여하기 때문에, GSK-3 억제제 단독 사용으로는 도파민 신경전구세포 분화가 불가능하며, 후뇌 세포쪽으로 점차 발달하고, 처리를 지속하면 세포의 증식에 관여하게 되는데 이식 시 안전성에 문제가 생길 여지가 있다.
[65]
상기 CHIR99021은 다음과 같은 화학식 4로 표시할 수 있다:
[66]
[화학식 4]
[67]
[68]
본 단계에서 첨가되는 GSK-3 억제제의 농도는 0.1 내지 5.0uM, 1.6 내지 5.0uM 또는 2.0uM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[69]
상기 범위를 벗어날 경우 다른 세포로 분화할 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 농도가 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 농도를 설정할 수 있다.
[70]
본 단계는 bFGF가 포함되지 않은(bFGF-free) ES 세포배양 배지에서 배양되는 것일 수 있으나, EB 배양 가능한 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[71]
c) 단계
[72]
본 단계는 신경 로제트(neural rosette)를 형성시키는 과정이다. 본 과정에 의해 신경 외배엽 세포들 중 신경세포 쪽으로 분화가 예정된 세포들을 증식시키고, 선별 할 수 있게 된다.
[73]
본 발명에서 "신경 로제트(neural rosette)"는 여러 종류의 신경세포가 될 수 있는 운명을 가지는 세포 집단을 의미한다.
[74]
본 단계는 3-6일, 4일 또는 5일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[75]
상기 범위를 벗어날 경우 신경 로제트가 유지되지 않아 분화가 진행되지 않거나 다른 분화 방향으로 진행될 수 있는 문제가 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 기간이 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 기간을 설정할 수 있다.
[76]
본 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 SHH 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제가 첨가되는 것일 수 있다. 이에 의해 보다 여러 종류의 신경세포로 분화가 가능한 일반적인 신경 로제트와 달리, 도파민 신경전구세포가 될 수 있는 운명을 가진 세포를 대량으로 얻을 수 있다.
[77]
본 단계는 DMEM/F12 세포배양 배지에서 배양되는 것일 수 있으나, 신경 로제트가 형성/유지 가능한 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[78]
상기 세포배양 배지는 N2 supplement CTS, human insulin 및 bFGF를 추가적으로 포함할 수 있다.
[79]
d) 단계
[80]
본 단계는 신경 로제트를 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)로 분화시키는 과정이다. 본 과정에 의해 신경 로제트만 선별하여 신경세포를 제외한 다른 분화 세포들을 배제하고, 보다 더 바람직하게 도파민 신경전구세포 분화를 강화 할 수 있게 된다.
[81]
본 발명에서 "신경세포(neural cells)"는 신경계를 구성하는 세포로 뉴런(neuron)과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
[82]
본 발명에서 "도파민 신경세포(dopaminergic neural cells)"는 신경전달물질인 도파민(dopamine)을 분비하는 신경세포를 의미한다.
[83]
본 발명에서 "전구세포(precursor cells)"는 완전히 분화가 종료된 세포의 형질을 발현하기 이전의 분열이 가능한 세포를 의미하며, "progenitors", "precursors" 및 "precursor cell" 모두 동일한 의미로 사용될 수 있다.
[84]
따라서, 본 발명에서 "도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)"는 생체 내 이식 후 성숙단계(maturation)를 거쳐 도파민을 분비하는 신경 세포로 분열이 가능한 세포를 의미한다.
[85]
본 단계는 8-10일 또는 9일 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[86]
상기 범위 미만 시 도파민 전구세포 분화율이 낮아질 수 있고, 상기 범위 초과 시 대량 생산이 불가능할 수 있다. 한편, 사용되는 줄기세포 종류에 따라 작용하는 기간이 상이하기 때문에 상기 범위 내에서 줄기세포 별로 최적 기간을 설정할 수 있다.
[87]
본 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 SHH 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제가 첨가되는 것일 수 있다. 이에 의해 분화 일수가 지날수록 대부분의 세포(약 80% 이상까지)가 도파민 신경전구세포로 분화 될 수 있다.
[88]
본 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일 마다 배지를 교체하고 3일 마다 계대 배양하여 수행되는 것일 수 있다. 이에 의해 도파민 신경전구세포를 대량 증식시키고 도파민 신경전구세포의 상태를 최상으로 유지할 수 있으며 분화율을 높일 수 있다.
[89]
본 단계는 DMEM/F12 세포배양 배지에서 배양되는 것일 수 있으나, 도파민 전구세포가 분화/증식 가능한 배양액은 선택적으로 제한 없이 사용될 수 있다.
[90]
상기 세포배양 배지는 N2 supplement CTS 및 B-27 supplement CTS를 추가적으로 포함할 수 있다.
[91]
상기 방법은 다음의 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
[92]
e) 도파민 신경전구세포를 계대배양하여 증식시키는 단계.
[93]
e) 단계
[94]
본 단계는 도파민 신경전구세포를 증식시켜 대량 생산하는 과정이다. 본 과정에 의해 안정적인 세포 공급이 가능할 뿐만 아니라 도파민 신경전구세포의 분화율을 높일 수 있게 된다.
[95]
상기 방법에 의해 유도된 도파민 신경전구세포로는 분화율이 80%이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[96]
상기 방법에 의해 유도된 도파민 신경전구세포는 FOXA2, LMX1A 및/또는 En1 발현이 증가된 것일 수 있다.
[97]
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 방법에 의해 유도된 도파민 신경전구세포는 파킨슨병의 증상을 완화시키는 것일 수 있다.
[98]
상기 방법의 각 단계의 세포배양에는 세포외기질(extracellular matrix; ECM)이 추가적으로 포함된 것일 수 있다. 이는 미분화 줄기세포 및 신경세포들은 자력으로 배양 접시에 부착하여 성장할 수 없기 때문에, 세포외기질 또는 다른 지지세포의 도움을 받아야 유지 배양이 가능하기 때문이다.
[99]
상기 세포외기질은 예를 들어, 라미닌(Laminin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포외기질은 라미닌 외에도 다른 물질 단독 또는 혼합하여 사용 가능하고, 줄기세포 종류에 따라 다른 세포외기질을 사용할 수 있다.
[100]
상기 세포외기질의 농도는 3.5-5.5, 4.0 또는 5.0ug/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[101]
상기 범위에서 벗어날 경우 도파민 신경전구세포로 분화가 불가능하거나 부착력 문제로 인해 제조과정 상 문제가 발생할 수 있다.
[102]
상기 방법에 의해 수득한 신경전구세포는 특히 신경 퇴행성 질환, 예컨대 알쯔하이머병, 헌팅톤 질병, 파킨슨씨 질병 및 근위축성 측삭 경화증에 적용되어 이들 질환을 치료할 수 있다.
[103]
본 발명의 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)의 대량 생산방법에 관한 것이다.
[104]
a) 줄기세포(stem cells)를 배양하는 단계;
[105]
b) 배아체(embryoid body)를 형성시켜 유지 배양하는 단계;
[106]
c) 신경 로제트(neural rosette)를 형성시키는 단계;
[107]
d) 신경 로제트를 도파민 신경전구세포로 분화시키는 단계; 및
[108]
e) 도파민 신경전구세포를 계대배양하여 증식시키는 단계.
[109]
상기 도파민 신경전구세포의 대량 생산방법에 있어, 상기 도파민 신경전구세포의 분화 유도방법과 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.

발명의 효과

[110]
본 발명은 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포의 분화 유도방법 및 도파민 신경전구세포의 대량 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 줄기세포를 효율적으로 신경전구세포로 분화시킬 수 있는 바, 이를 관련 연구개발 및 제품화에 유용하게 사용할 수 있다.

도면의 간단한 설명

[111]
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 도파민 신경전구세포의 분화 유도방법을 모식화한 도이다.
[112]
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 최적 줄기세포 배양 기간을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[113]
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 최적 배아체 배양 기간을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[114]
도 4a 내지 도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아체 배양 시 SAG 및 CHIR99021의 최적 처리 시기를 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[115]
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 배아체 형성 단계의 필요 여부를 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[116]
도 6은 신경 로제트 형성 시 최적 배양 기간을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[117]
도 7a 및 도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도파민 신경전구세포로의 분화 시 최적 배양 기간을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[118]
도 8a 내지 도 8d는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도파민 신경전구세포로의 분화 시 SAG 및 CHIR99021의 최적 처리 기간을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[119]
도 9a 내지 도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따라, SAG 및 CHIR99021의 최적 처리 농도를 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[120]
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라, ECM의 최적 처리 농도를 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[121]
도 11a 및 도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도파민 신경전구세포의 최종 분화율을 확인한 도이다. (11a: 배아 줄기세포 유래, 11b: 유도 만능 줄기세포 유래)
[122]
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도파민 신경전구세포의 대량 생산을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)
[123]
도 13a 및 도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따라, 도파민 신경전구세포의 생체 내( in vivo) 효능을 확인한 도이다. (배아 줄기세포 유래)

발명의 실시를 위한 형태

[124]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[125]
[126]
인간 배아 줄기세포(human Embryonic stem cells, hESC) 배양
[127]
도파민 신경세포 분화를 위한 미분화된 hESCs(SNU32, 서울대줄기세포은행)는 CELLstart 코팅 배양 접시에서 TeSR2(STEMCELL, SCR5860) 배양액을 사용하여 배양하였다.
[128]
이때, 미분화 줄기세포는 단일(monolayer) 세포층 형태로 배양하였다. 7일간 배양을 원칙으로 하되, 90~95% 정도 세포가 증식하면 Versene(GIBCO, 15040-066)을 사용하여 4분간 37℃ 배양기에서 반응 후 스크래퍼(scraper)로 세포를 수거하고 15ml 튜브로 옮겼다. 1000P 파이펫으로 약 8~12회 파이펫팅 후 1:7 비율(CELLstart-CTS coating dish 기준)로 계대 배양하고, 7일간 매일 24시간이 지나기 전에 배양액을 교체하여 유지하였다.
[129]
[130]
유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 배양
[131]
상기 hESC 배양 방법과 동일한 방법으로, 도파민 신경세포 분화를 위한 미분화된 iPSCs(hFSiPS1, 국가줄기세포은행, 기탁 기관: 국립보건연구원 난치성질환과)를 배양하였다.
[132]
[133]
면역세포화학(Immunocytochemistry) 분석
[134]
세포를 4% 파라포름알데하이드 용액에 10분간 고정시켰다.
[135]
각각의 항체가 세포질 내로 투과가 잘되게 하기 위하여, 0.1% Trition X-100(in PBS) 용액으로 15분간 반응시키고, 2% 소혈청알부민(BSA, in PBS) 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
[136]
그 다음, 일차 항체(하기 표 1 참조)와 4℃에서 세포를 결합시켰다. 상기 일차 항체가 결합된 세포를 확인하기 위하여 각각의 일차 항체 유래 종에 맞는(하기 표 1 참조) 이차 항체를 사용하였다.
[137]
끝으로, 세포핵을 확인하기 위하여, 4',6-다이아미노-2-페닐인돌(DAPI)이 포함된 PBS에 10분간 반응시켜 핵 염색을 완료한 후 형광현미경을 사용하여 이미지를 획득하고, 중요 마커들을 확인 및 분석하였다.
[138]
[표1]
단백질(Protein) 종(Species) 제조사(Company) Cat. No. 희석(Dilution)
LMX1A Goat Santa Cruz sc-54273 1:100
FOXA2(HNF3beta) Mouse Santa Cruz sc-374376 1:50

[139]
[140]
유전자 발현(Gene expression) 분석 (qRT-PCR)
[141]
세포를 수거하여 총 RNA는 Easy-Spin®Total RNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology)를 사용하여 분리하였다. cDNA는 PrimeScript™RT Master Mix(TAKARA Bio Inc.)를 사용하여 총 RNA 1ug으로 합성하였다. mRNA 수준은 SYBR®Premix Ex Taq™(TAKARA Bio Inc.) 및 CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)을 사용하여 실시간 RT-PCR분석으로 정량화하였다. 유전자 발현 분석에 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
[142]
[표2]
유전자(Gene Name) 서열(5'-3')
En-1(Engrailed 1) F: CGT GGC TTA CTC CCC ATT TA (서열번호 1)
R: TCT CGC TGT CTC TCC CTC TC (서열번호 2)
GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) F: CAA TGA CCC CTT CAT TGA CC (서열번호 3)
R: TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG (서열번호 4)

[143]
[144]
실시예. 도파민 신경전구세포로의 분화 프로토콜
[145]
상기에서 배양된 hESC 또는 iPSC에 대하여, MCB(Master Cell Bank)을 해동한 시점부터 2회 계대배양으로 안정화를 거쳐 3회째 계대배양 접시를 사용하여 도파민 신경전구세포 분화를 시작하였다.
[146]
3회째 계대배양 접시를 만드는 날을 분화 시작일(d0)로 하여, 분화 6일차(d6)에 hESC 배양액(TeSR2, STEMCELL, SCR5860)에 5uM의 도소모르핀(dorsomorphin, 이하 DM)(Millipore, 171260) 및 5uM의 SB431542(이하 SB)(Sigma, S4317)를 8일차까지 2일간 전처리하여 신경 외배엽으로의 분화 점유도를 높여주었다.
[147]
분화 8일차(d8)에 단일 세포층 형태로 배양 중인 hESC에 대하여, 1ml 26G 주사기를 사용하여 1.5mm 간격으로 바둑판 모양(격자)을 만들고, 약 30분 동안 37℃배양기에 넣어 방치하거나, 또는 콜라게나아제(Collagenase; Animal Origin Free (CLSAFC), Worthington, LS004138)를 2ml 넣고 약 5분 동안 37℃배양기에 넣어 반응시켜 배아체의 토대가 되는 1.5mm 정사각형 세포 시트를 형성하여 배아체(Embryoid Body; 이하 EB)를 유도하고, bFGF-free hESC 배양액(EB 배양액)에서 배양하였다. 이때, 전처리한 5uM DM 및 5uM SB는 분화 12일차까지 4일간 처리하고, 분화 10일차(d10)부터 12일차(d12)까지는 도파민 패터닝 인자 1.0uM SAG(smoothened agonist, Millipore, 566661, 이하 SAG) 및 2.0uM CHIR99021(Milteny, 130-106-539)을 추가로 전처리하여 중뇌 도파민 신경전구세포의 점유도를 높여주었다.
[148]
분화 12일차(d12)에 20 ug/mL 인간 인슐린 용액 및 20 ng/mL bFGF가 첨가된 DMEM/F12 배양액(mN2+b)를 사용하여 Laminin-521-코팅 배양 접시에 상기 단계에서 형성된 EB를 부착(pEB 단계)하고, 5일 동안 도파민 패터닝 인자 1.0uM SAG(smoothened agonist) 및 2.0uM CHIR99021을 처리하였다.
[149]
분화 17일차(d17)에 부착된 EB에서 형성된 신경 로제트를 아큐타제(Accutase; Millipore, SCR003)로 2분간 처리하는 방법, 또는 유리 파이펫을 가공하여 연구자가 직접 분리하는 방법을 사용하여 별도의 Laminin-521 코팅 배양 접시에 재부착하였다. 재부착 시 배양액은 도파민 신경전구세포 배양액으로 사용중인 N2(N-2 supplement,CTS 등급, GIBCO, A1370701, 이하 N2) 및 B27(B-27 supplement xenofree, CTS 등급, GIBCO, A1486701, 이하 B27)이 첨가된 DMEM/F12 배양액(N2B27 배양액)에 1.0uM SAG 및 2.0uM CHIR99021을 추가한 배양액을 사용하는데, 재부착 할 때는 10uM Y27632를 추가하여 1시간 동안 세포의 부착을 돕고, 1시간 후 Y27632가 없는 배양액으로 재교체해주었다. 20일차(d20)까지 매일 24시간이 지나기 전에 배양액을 교체하며 도파민 신경전구세포 분화를 계속 유도하였다. 이때, 아큐타제를 처리하는 경우에는 신경 로제트를 제외한 다른 세포들을 분리 제거하고, 스크래퍼를 사용하여 신경 로제트 덩어리만 15ml 튜브로 옮겨 200P 파이펫으로 파이펫팅 약 40회로 잘게 부수어 Laminin-521 코팅 배양 접시에 재부착하였다. 또한, 유리 파이펫을 사용하는 방법은 실체현미경 하에서 로제트 부분만 유리 파이펫으로 떼어내고 부유시켜 15ml 튜브로 옮긴 후 200P 파이펫으로 파이펫팅 약 40회로 잘게 부수어 Laminin-521 코팅 배양 접시에 재부착하였다.
[150]
분화 20일차(d20)에 아큐타제를 사용하여 도파민 신경전구세포를 단일 세포로 분리하고, N2B27 배양액에 1.0uM SAG 및 2.0uM CHIR99021을 추가한 배양액에서 4.0x10 6 cells/35mm dish 밀도로 Laminin-521 코팅 배양 접시에 재부착하였다. 매일 배양액을 교체하고, 3일 간격으로 4.0x10 6 cells/35mm dish 밀도로 Laminin-521 코팅 배양 접시에 재부착하여 세포를 대량 증식 시킨 후 26일차(d26)에 WCB(Working Cell Bank)를 제조하였다.
[151]
[임상 진입] 26일차에 제조된 WCB로부터 재부착 방법과 같이 아큐타제를 사용하여 도파민 신경전구세포를 단일 세포로 분리하고 3.0x10 6 cells/vial 단위 또는 동결액에서 보증하는 범위 내로 분주하여 바이알(vial)을 제조하였다.
[152]
[이식 세포 준비] WCB를 해동하여 9일 후 사용하였다. 35mm 배양 접시 기준 4.0x10 6 세포가 필요하므로, 2 바이알(3.0x10 6 cell 기준)을 사용하여 트립판 블루 용액을 사용해서 세포 개수를 파악하고 살아있는 세포 4.0x10 6개를 35mm Laminin-521 코팅 배양 접시에 부착한 후 N2B27 배양액에서 총 분화 35일차(d35)까지 매일 배양액을 교체하며 배양하였다. 이때에도 35일차까지 3일 간격으로 재부착하는 방법을 사용하여 분화 유도 및 증식시켰다.
[153]
구체적인 프로토콜은 도 1에 나타내었다.
[154]
[155]
실험예 1. 줄기세포 배양 단계
[156]
1-1. DM 및 SB431542 처리 시기 최적화
[157]
배양 6일차부터 DM 및 SB431542를 처리하는 대신, 배양 8일차부터 DM 및 SB431542를 처리하는 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 비교하였다.
[158]
도 2a에서 확인할 수 있듯이, 배아체 형성 단계인 배양 8일차부터 DM 및 SB431542를 처리하는 경우(기존의 방법)에 비하여, 줄기세포 배양 단계인 배양 6일차부터 DM 및 SB431542를 전처리하는 경우(본 발명의 방법) 형성된 신경 로제트의 상태 및 수율이 더 좋아진다는 것을 알 수 있었다.
[159]
이러한 결과는, 배아체 형성 이전인 미분화 세포 단계에서부터 DM 및 SB431542를 전처리함으로써 배아체 형성 시 신경외배엽성 분화 점유도를 높일 뿐만 아니라, 최종 도파민 신경전구세포의 분화율을 획기적으로 증가시킬 수 있음을 시사한다.
[160]
[161]
1-2. 배양 기간 최적화
[162]
배양 8일차에 배아체 형성을 위한 격자를 만드는 대신, 7일차부터 9일차까지 DM 및 SB431542를 전처리하고 배양 9일차에 배아체 형성을 위한 격자를 형성시키는 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 비교하였다.
[163]
도 2b에서 확인할 수 있듯이, 배양 9일차에 배아체를 형성시키면 세포의 부착력이 매우 약해져 줄을 그었을 때 세포가 그대로 배양액으로 떠버리고 격자를 내기도 전에 배양 접시에서 떨어져 나와 1.5mm 정사각형 세포 시트를 만들기 어려웠으나(도 2b 왼쪽), 배양 8일차에 배아체 형성을 위한 격자를 만들면(본 발명의 방법) 정상적으로 1.5mm 세포 시트를 만들 수 있음을 알 수 있었다(도 2b 오른쪽).
[164]
[165]
실험예 2. 배아체(Embryoid Body) 형성 및 유지배양 단계
[166]
2-1. 배양 기간 최적화
[167]
배양 12일차(배아체 형성/유지 4일차)에 EB를 배양 접시에 부착하는 대신, 배양 13일차까지 DM 및 SB431542를 처리하면서 EB를 유도하는 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 비교하였다.
[168]
도 3에서 확인할 수 있듯이, 4일차(배양 12일차)까지는 EB가 대부분 단독으로 잘 유지되나, 5일차(배양 13일차) 이후 높은 빈도로 EB가 서로 붙어서 다시 큰 덩어리가 되는 현상이 발생하였다.
[169]
[170]
2-2. SAG 및 CHIR99021 처리 시기 최적화
[171]
배양 10일차부터 SAG 및 CHIR99021를 처리하는 대신, 배양 6일차 또는 8일차부터 SAG 및 CHIR99021를 처리하는 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 비교하였다.
[172]
도 4a 내지 4c에서 확인할 수 있듯이, 분화 6일차에 SAG 및 CHIR99021을 처리하는 경우(도 4a) 신경 로제트는 제대로 형성되지 않고 다른 분화 세포 형태들이 많이 발견되었고, 분화 8일차에 SAG 및 CHIR99021을 처리하는 경우(도 4b) 분화 10일차부터 SAG 및 CHIR99021을 처리하는 경우(도 4c)에 비하여 신경 로제트 부분의 형태가 무너지면서 신경 로제트의 상태가 나빠지는 것을 알 수 있었다.
[173]
[174]
2-3. 단일(monolayer) 분화 비교
[175]
배양/분화 공정의 단순화가 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 배아체 형성 과정(배양 8일차~12일차) 없이 나머지 조건은 상기 실시예의 방법과 동일한 프로토콜을 사용하여 도파민 신경전구세포로 분화시킨 후, 총 분화 27일차의 FOXA2 및/또는 LMX1A 발현 여부를 본 발명의 방법과 비교하였다.
[176]
도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 배아체 형성 없이 단층으로 신경 외배엽으로 분화를 진행하는 경우(도 5a) 배아체를 형성하여 분화를 진행하는 경우(본 발명의 방법, 도 5b)에 비하여 FOXA2 및/또는 LMX1A 발현 수준이 상당히 낮게 나타났다.
[177]
[178]
실험예 3. 신경 로제트(neural rosette) 형성 단계
[179]
3-1. 분화 기간 최적화
[180]
배양 17일차(신경 로제트 형성 5일차)에 신경 로제트를 별도의 배양 접시에 재부착하는 대신, 배양 18일차(신경 로제트 형성 6일차)까지 신경 로제트를 형성시키는 방법을 사용하여 본 발명의 방법과 비교하였다.
[181]
도 6에서 확인할 수 있듯이, 신경 로제트 형성 5일차까지는 신경 로제트가 좋은 상태로 유지되며 증가하는 반면(본 발명의 방법), 6일차가 되면 높은 빈도로 바깥쪽의 신경 로제트부터 하얗게 뜨는 현상이 발생하였다. 또한, 세포의 형태가 변하면서 가운데 로제트 중심부는 검게 변해 PBS로 씻어(수세)주거나 배양액을 교체할 때, 세포가 대부분 죽어서 자연적으로 떨어져 나가게 되어 신경 로제트 수급에 어려움이 있었다.
[182]
한편, 신경외배엽 분화와 중뇌 도파민 신경세포로의 분화를 유도하는 과정에서 분화유도 여부를 판별하는 초기 체크포인트는 신경전구세포가 증식하면서 형성되는 신경 로제트의 형성여부이며 로제트 형성량 및 유지 기간은 향후 중뇌 도파민 신경전구세포의 생성 및 양적 확보에 매우 중요하다.
[183]
[184]
실험예 4. 도파민 신경전구세포로의 분화 단계
[185]
4-1. 분화 기간 최적화
[186]
도파민 신경전구세포로의 분화율이 가장 높은 WCB 제조시기를 확립하기 위하여, 배양 26일차에 WCB를 제작하는 대신, 배양 23일차에 WCB를 제작하는 방법을 사용하여 도파민 신경전구세포로의 최종 분화율을 본 발명의 방법과 비교하였다.
[187]
도 7a 및 7b에서 확인할 수 있듯이, 23일차에 WCB를 제작하고 해동(Thawing)하여 사용하는 경우(도 7a) 26일차에 WCB를 제작하고 해동하여 사용하는 경우(본 발명의 방법, 도 7b)에 비하여 분화율이 낮게 나타났다.
[188]
[189]
4-2. SAG 및 CHIR99021 처리 기간 최적화
[190]
배양 26일차까지 SAG 및 CHIR99021를 처리하는 대신, 배양 20일차 또는 35일차까지 SAG 및 CHIR99021를 처리하는 방법을 사용하여 도파민 신경전구세포로 분화시키고, En1 발현 여부 및 세포 형태를 본 발명의 방법과 비교하였다.
[191]
도 8a 내지 8d에서 확인할 수 있듯이, SAG 및 CHIR99021을 20일차까지만 처리한 경우(도 8a) 분화가 진행될수록 SAG 및 CHIR99021을 35일차까지 처리한 경우(도 8b)에 비하여 En1 발현이 빠른 속도로 감소하는 문제가 발생하였다. 또한, 도 8c에서 확인할 수 있듯이, SAG 및 CHIR99021을 35일차까지 처리한 경우 세포 증식률은 감소하지 않으면서 세포 형태는 도파민 신경전구세포에서 조금 더 분화가 진행된 성숙한 세포의 형태를 보이기 시작하는 문제가 발생하였다. 반면, SAG 및 CHIR99021을 26일차까지만 처리한 경우(본 발명의 방법, 도 8d) En1 발현이 덜 감소하고 세포 형태도 전구세포 형태를 띄는 기간으로 26일까지 SAG, CHIR99021을 처리하는 방법(도 8d)을 선정하게 되었다.
[192]
[193]
실험예 5. SAG 및 CHIR99021 처리 농도 최적화
[194]
SAG 및 CHIR99021를 각각 1.0uM 및 2.0uM 농도로 처리하는 대신, SAG 및 CHIR99021를 각각 0.5uM 및 1.0uM 농도 또는 1.0uM 및 1.5uM 농도로 처리하는 방법을 사용하여 도파민 신경전구세포로 분화시키고, FOXA2 및/또는 LMX1A 발현 여부를 본 발명의 방법과 비교하였다.
[195]
도 9a 내지 9c에서 확인할 수 있듯이, SAG 및 CHIR99021을 각각 0.5uM 및 1.0uM 농도로 처리하거나(도 9a) 각각 1.0uM 및 1.5uM 농도로 처리하는 경우(도 9b)에 비하여 SAG 및 CHIR99021을 1.0uM 및 2.0uM 농도로 처리하는 경우(본 발명의 방법, 도 9c) FOXA2 및/또는 LMX1A 발현 수준이 가장 높게 나타났다.
[196]
[197]
실험예 6. ECM 처리 농도 최적화
[198]
CELLstart 및 다양한 농도(2~7ug/mL)의 ECM(Laminin 521)에 대하여, 상기 실시예의 방법과 동일한 프로토콜을 사용하여 줄기세포를 배양시켜 세포 부착력 테스트를 진행하였다.
[199]
도 10a 및 10b에서 확인할 수 있듯이, CELLstart의 경우 줄기세포 배양 단계 및 신경 로제트 유지 배양 단계까지는 아무런 문제가 없었으나, 도파민 전구세포로 분화시켜 증식시키는 단계에서 세포가 거의 부착되지 않고 떨어지거나 그물망 형태를 보이며 자라는 현상이 나타났다(도 10a). Laminin-521의 경우 2ug/mL 및 3ug/mL 농도에서는 실험 수행이 어려울 정도로 부착력이 매우 떨어졌으며, 6ug/mL 및 7ug/mL 농도에서는 높은 빈도로 자연 분화가 발생하였다. 반면, 4ug/mL 및 5ug/mL 농도에서는 비교적 우수한 부착력을 나타냈으며, 같은 기간 세포의 형태나 개수 관점에서는 5ug/mL 농도가 가장 우수하였다(도 10b).
[200]
상기 결과를 기초로, 줄기세포 배양 단계에서는 CELLstart를 사용하고, 이후 배아체 단계를 제외한 모든 단계에서는 Laminin-521 5ug/mL을 사용하는 것이 가장 적합한 것으로 판단하였다.
[201]
[202]
실험예 7. 도파민 신경전구세포의 대량 증식(분화율 증가) 확인
[203]
일반적으로 GMP 시설에서의 대량 생산을 위해서는 미분화 줄기세포를 대량으로 증식시켜 보관하는 MCB(Master Cell Bank)와 이식을 위해 도파민 신경전구세포를 대량 증식시켜 보관하는 WCB(Working Cell Bank)로 프로토콜 공정을 분리하여 사용한다. 따라서, 분화율을 높이고 세포의 증식률은 어느 정도 감소시켜 이식 시 증식에 대한 안정성을 높이기 위하여, MCB를 사용하여 WCB를 만드는 시점 및 WCB를 해동하여 대량으로 도파민 전구세포를 증식시키는 시점이 매우 중요하다.
[204]
이와 관련하여, 상기 실시예의 프로토콜을 사용하여 줄기세포를 도파민 전구세포로 분화시키며 FOXA2 및/또는 LMX1A 발현 여부를 참고한 결과, 도 11a 및 11b에서 확인할 수 있듯이, 분화 27일부터 36일차까지 상기 FOXA2 및/또는 LMX1A의 발현이 계속적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. 다만, 35일차 이상 분화를 진행하게 될 경우 분화율이 오히려 감소하고 세포 형태가 점차 전구세포의 범위를 벗어나기 때문(도 8c의 분화 35일차 SAG, CHIR99021 중단과 같은 형태를 보임)에 분화 35일차 세포를 최종 분화로 판단하였다.
[205]
이에, 본 발명에서는 분화 26일을 WCB 제조시점으로 설정하였으며(실험예 4-1의 결과에 기초하여, 세포를 얼리지 않고 연속적으로 분화시키는 방법과 얼렸다가 해동했을 때에도 연속적으로 분화시키는 방법이 동일한 분화율을 나타내야 하기 때문), 26일차 WCB를 해동하여 9일간 증식시켜 35일차 세포를 이식세포로 선정하였다.
[206]
따라서, 상기 본 발명의 프로토콜을 사용하여 MCB(Master Cell Bank) 1 vial(약 3x10 6/세포)로 도파민 신경전구세포 분화를 시작하는 경우, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 약 1,300억개의 도파민 신경전구세포의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
[207]
[208]
실험예 8. 본 발명의 프로토콜을 사용하여 제조된 세포의 생체 내( in vivo ) 이식 효과 확인
[209]
8-1. 6-OHDA 손상 파킨슨병(PD)-모델 제작
[210]
200-250g의 암컷 Sprague-Dawley계 래트(Orient Bio Inc.)를 이식 대상으로 사용하였다. 30mg/kg Zoletil(Virbac) 및 10mg/kg Rompun(Bayer)을 혼합하여 마취제로 사용하였다. 좌표 (AP -0.40, ML -0.13, DV -0.70, TB -0.45)에 따라 3uL의 30mM 6-OHDA를 래트의 내측 전뇌(medial forebrain) 번들에 주입하여 반-파킨슨병 모델(hemi-parkinsonian model)을 유도하였다.
[211]
[212]
8-2. 본 발명의 프로토콜을 사용하여 제조된 세포 이식 후 PD-모델의 행동 회복 확인
[213]
상기 실시예의 분화 프로토콜을 사용하여 줄기세포를 분화시킨 후, 분화 35일(d35) 세포를 사용하였다. 최종 농도가 8.75x10 4 세포/uL가 되도록 PBS(CTS)에 현탁시켜 이식용 세포 현탁액을 제조하였다. 이때, 대조군(Control)으로는 PBS만을 이식한 그룹을 사용하였다. 상기 실험예 8-1의 6-OHDA 손상 4주 후 동물 군 분리를 완료하고 이식 2일 전부터 쥐가 희생될 때까지 실험 기간 동안 매일 10mg/kg의 사이클로스포린 A(cyclosporine A, 종근당)를 복강 내 주사하여 면역억제(Immunosuppressive) 처리하였다. 제조된 세포 현탁액을 좌표(AP +0.08, ML -0.30, DV -0.40 및 -0.50,TB -0.24)에 따라 래트 당 4uL씩 정위 방법으로 이식하였다. 이식 전, 이식 후 4, 8, 12 또는 16주에 암페타민(2.5mg/kg, Sigma-Aldrich)을 복강 내 주사하고, 30분 동안 래트의 회전 여부를 기록하였다. 비교를 위하여 H9 배아 줄기세포(H9 hESCs, WiCell Inc., 미국) 유래 도파민 신경전구세포로 동일한 실험을 수행하였다.
[214]
도 13a 및 도 13b에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 방법(프로토콜) 이전의 방법으로 분화시킨 세포(상기 H9 배아 줄기세포 유래 도파민 신경전구세포)는 이식 16주 후에만 대조군에 비하여 유의한 운동기능 향상을 보였던 반면(도 13a), 본 발명의 방법(프로토콜)을 사용하여 분화시킨 세포를 이식한 그룹은 이식 8주, 12주 그리고 16주 모두 대조군에 비해서 유의하게 운동기능이 향상된 것을 확인하였다(도 13b).
[215]
이러한 결과는, 본 발명의 방법(프로토콜)으로 제조된 세포가 생체 내에서 더 많이 생존 가능하고, 운동기능을 개선 시키는 효과가 더 크다는 것을 나타낸다.

산업상 이용가능성

[216]
본 발명은 줄기세포 유래 중뇌 특이적 도파민 신경전구세포 분화 유도 및 대량 생산 방법에 관한 것이다.

청구범위

[청구항 1]
다음의 단계를 포함하는 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)로의 분화 유도방법: a) 줄기세포(stem cells)를 단일 세포층의 형태로 배양하는 단계; b) 배아체(Embryoid Body)를 형성시켜 유지 배양하는 단계; c) 신경 로제트(neural rosette)를 형성시키는 단계; 및 d) 신경 로제트를 도파민 신경전구세포로 분화시키는 단계.
[청구항 2]
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함하는 것인, 방법. e) 도파민 신경전구세포를 계대배양하여 증식시키는 단계.
[청구항 3]
제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(Embryonic stem cells), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs), 성체 줄기세포(Adult stem cells), 핵 치환 배아 줄기세포(Somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell) 또는 직접 분화법(direct reprogramming)에 의해 생성되는 줄기세포인, 방법.
[청구항 4]
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 세포외기질(extracellular matrix; ECM)에서 배양하는 것인, 방법.
[청구항 5]
제 1 항에 있어서, 상기 a) 단계는 단계가 종료되는 날로부터 1-3일 전부터 1일마다 BMP 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달 신호 경로 억제제를 첨가하는 것인, 방법.
[청구항 6]
제 1 항에 있어서, 상기 b) 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 BMP 신호 경로 억제제 및 액티빈/노달 신호 경로 억제제를 첨가하고, 단계가 시작되는 날로부터 2-6일째에 1일마다 SHH(sonic hedgehog) 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제를 첨가하는 것인, 방법.
[청구항 7]
제 1 항에 있어서, 상기 c) 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 SHH 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제를 첨가하는 것인, 방법.
[청구항 8]
제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 SHH 신호 경로 활성제 및 GSK-3 억제제를 첨가하는 것인, 방법.
[청구항 9]
제 1 항에 있어서, 상기 d) 단계는 단계가 시작되는 날로부터 1일마다 배지를 교체하고 3일 마다 계대 배양하여 수행되는 것인, 방법.
[청구항 10]
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 BMP 신호 경로 억제제는 도소모르핀(dorsomorphin)이고, 상기 액티빈/노달 신호 경로 억제제는 4-(5-벤조[1,3]다이옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2일)-벤즈아미드(SB431542)인, 방법.
[청구항 11]
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SHH 신호 경로 활성제는 SAG(Smoothened Agonist)이고, 상기 GSK-3 억제제는 CHIR99021인, 방법.
[청구항 12]
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 도파민 신경전구세포로의 분화율이 80%이상인, 방법.
[청구항 13]
제 1 항에 있어서, 상기 도파민 신경전구세포는 FOXA2 및/또는 LMX1A 발현이 증가된 것인, 방법.
[청구항 14]
제 1 항에 있어서, 상기 도파민 신경전구세포는 파킨슨병의 증상을 완화시키는 것인, 방법.
[청구항 15]
다음의 단계를 포함하는 도파민 신경전구세포(dopaminergic neural precursor cells)의 대량 생산방법: a) 줄기세포(stem cells)를 단일 세포층의 형태로 배양하는 단계; b) 배아체(Embryoid Body)를 형성시켜 유지 배양하는 단계; c) 신경 로제트(neural rosette)를 형성시키는 단계; d) 신경 로제트를 도파민 신경전구세포로 분화시키는 단계; 및 e) 도파민 신경전구세포를 계대배양하여 증식시키는 단계.

도면

[도1]

[도2a]

[도2b]

[도3]

[도4a]

[도4b]

[도4c]

[도5a]

[도5b]

[도6]

[도7a]

[도7b]

[도8a]

[도8b]

[도8c]

[도8d]

[도9a]

[도9b]

[도9c]

[도10a]

[도10b]

[도11a]

[도11b]

[도12]

[도13a]

[도13b]