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1. WO2003020935 - REGULATION DU TEMPS DE FLORAISON DE VEGETAUX A TRAVERS L'EXPRESSION DU PHYTOCHROME C

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[ JA ]
明細書

フィトクロム cの発現制御による植物の開花時期の調節

技術分野

本発明は、植物の開花(出穂)時期の調節に関与する PhyC遺伝子の利用に関 する。

背景技術

イネは短日植物で日長が短くなると花を付ける(出穂する)。この日長を感 知している光受容体がフィトクロム(phytochrotne ; phy) と呼ばれる色素結合 分子である。イネにはフィトクロムをコードする遺伝子として、 phyA遺伝子、 p hyB遺伝子および phyC遺伝子の 3種類が存在する(Kay, S. A. et. al. , Nucleic . Acids. Res. 17: 2865—2866, 1989、 Dehesh, K. et. al. , Mol. Gen. Genet. 225 : 305—313, 1991、 Tahir, M. et. al. , Plant Physiol. 118 : 1535, 1998) 。 イネと同じ単子葉類におけるフイトクロム遺伝子の突然変異体に関しては、 ソルガムで phyB遺伝子突然変異体 (ma3R)が単離されている(Childs, K. L. et. al. , Plant Physiol. 113 : 611-619, 1997) 。 ma3R突然変異体は、開花時期が 早まるが、それに加えて低クロロフィル含量、茎の徒長、頂芽優性の昂進等の 特徴的な表現型を示し、明らかに正常の草型とは異なる。最近、本発明者らは 、イネの phyA遺伝子突然変異体を単離し、その表現型を詳しく解析した。その 結果、開花時期に関しては、長日条件、短日条件のいずれでも対照の日本晴と 差がなかった(Takano, M. et. al. , Plant Cell 13 : 521-534, 2001) 。また 、すべてのフィトクロムが検出限界以下である突然変異体(se5) は、日長に関 係なく早く花が咲く(lzawa, T. et. al., Plant J. 22 : 391-339, 2000) 。し かしながら、この変異体では、 phyA、 phyB、 phyC遺伝子は正常であり、 plasti

d heme oxidaseをコードする遺伝子に異常があることが知られている(Izawa, T. et. al. , Plant J. 22 : 391-339, 2000) 。

このように、これまでのところ、代表的な実験植物であるシロイヌナズナを はじめ、どの植物においても、 phyC遺伝子突然変異体が単離されたという報告 例はなく、さらに植物の開花時期に関する phyC遺伝子の役割についても明らか になっていなかった。

発明の開示

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 phyC 遺伝子突然変異体を単離し、その表現型を解析することで、 phyC遺伝子の利用 法を提供することにある。より詳しくは、開花時期(出穂時期)が早まる phyC 遺伝子突然変異体を提供すること、さらに、 phyC遺伝子の発現を抑制すること で植物の開花を促進する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、 phyC 遺伝子の機能を明らかにするために、ミュータントパネルを用いた突然変異体 の単离 g法 (Hirochika, H. In Molecular Biology of Rice, Springer-Verelag ( Tokyo) , pp. 43-58, 1999)を用いて、 phyC遺伝子突然変異体を単離した。 .

この方法では、短日植物であるイネの組織培養中に活性化されるレトロトラ ンスポゾン Tosl7を利用して作製した挿入突然変異体ラインを使用する。イネ種 子を組織培養すると、ゲノム中の Tosl7と呼ばれるレトロトランスポゾンが活性 化されて転移し、それらが染色体に挿入されると遺伝子破壊が起こることが知 られている。該種子をー且カルス化してから植物体を再生させることにより、 容易に多数の独立した突然変異体ラインを作製することができる。

このように作製した突然変異体ラインの中から、目的の変異体を単離した。 具体的には、突然変異体ラインを 980個体ずつ、 Z軸 8列、 Y軸 12列、 X軸 10列の、 ちょうどマイクロタイタープレートを 10段積み重ねたような 3次元マトリクス(

ミュータントパネル)に配置させ、 X/Y/Z軸毎のプールから抽出した DNAを目的 の突然変異体のスクリーユングに利用した。これらのプール DNAを銬型として、 phyC遺伝子の配列に特異的なプライマーと Tosl7の LTRに特異的なプライマーと の組み合わせで PCRを行うと、 Tosl7が phyC遺伝子特異的なプライマーの近傍に 存在する(即ち、 phyC遺伝子に揷入されている)時のみ、増幅したバンドが検 出された。従って、わず力 8回の PCRで、一つのパネル、 980個体の突然変異体ラ インの中に目的の突然変異体が存在するか否かを確認できた。もし特異的な増 幅が検出されれば、同じパネルの X軸、 Y軸で同様のプライマーの組み合わせで P CRを行い、それぞれの軸において増幅される列を確認し、 3次元マトリクスの座 標上で交差する点として目的の突然変異体を特定した。

検討の結果、 phyC遺伝子のタンパク質コード領域(第 1ェクソン)に Tosl7が 挿入された phyC遺伝子突然変異体を単離することに成功した。さらに、 phyC遺 伝子突然変異体は、長日条件で育てたとき、対照に比べて 1週間程度開花(出穂 ) 時期が早まることが見出された。従って、 phyC遺伝子は、長日条件を感知し て開花を遅らせていることが初めて明らかになった。これまでに、 phyC遺伝子 が植物の開花時期の決定に関与しているという報告は皆無である。この結果は 、 phyC遺伝子の発現を抑制することにより、長日条件において植物の開花を促 進させることが可能となることを示している。特に、 phyC遺伝子突然変異体は 開花時期以外の形質にはほとんど変化が認められないため、 phyC遺伝子の発現 量を制御することにより、特異的に開花を促進することができるという特徴を 持つ。 phyC遺伝子を利用した植物の開花の促進は、栽培地域や栽培時期に適応 した新たな形質を有する有用農作物や観賞用植物等の品種の改良に大きく貢献 し得る。また、長日条件において開花が促進されるイネの phyC遺伝子突然変異 体は、収穫時期が早められた新たなイネとしての利用が大いに期待される。 即ち、長日条件において植物の開花時期(出穂時期)の調節に関与する phyC 遺伝子を利用した植物の開花の促進に関し、より具体的には、

〔1〕植物の開花の促進のために用いる、以下(a ) 〜(c ) のいずれかに 記載の核酸、

( a ) 植物の phyC遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンス核酸

( b ) 植物の phyC遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有 する核酸

( c ) 植物の phyC遺伝子の発現を、共抑制により阻害効果を有する核酸 〔2〕植物が短日植物である、〔1〕に記載の核酸、

〔3〕短日植物がイネである、〔2〕に記載の核酸、

〔4〕 〔 1〕〜〔3〕のいずれかに記載の核酸を含むベクター、

〔5〕 〔 1〕〜〔3 ] のいずれかに記載の核酸、または〔4〕に記載のべク タ一を保持する形質転 m½物細胞、

〔6〕 〔5〕に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、

〔7〕 〔6〕に記載の形質転物体の子孫またはクローンである、形質転 換植物体、

〔8〕 [ 6〕または〔7〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料、

〔9〕 〔6〕または〔7〕に記載の形質転換植物体の製造方法であって、〔 1〕〜〔3〕のいずれかに記載の核酸、または〔4〕に記載のベクターを植物 細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、

〔1 0〕植物体の細胞内における内因性の phyC遺伝子の発現を抑制すること を特徴とする、植物の開花を促進させる方法、

〔1 1〕 〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の核酸、または〔4〕に記載のベ クタ一を植物に導入することを特徴とする、〔1 0〕に記載の方法、

〔1 2〕植物が短日植物である〔9〕〜〔1 1〕のいずれかに記載の方法、

〔1 3〕短日植物がイネである〔1 2〕に記載の方法、

〔1 4〕イネの phyC遺伝子突然変異体、

〔1 5〕 〔1 4〕に記載の突然変異体の子孫またはクローンである、イネの p hyC遺伝子突然変異体、

〔1 6〕 〔1 4〕または〔1 5〕に記載のイネの phyC遺伝子突然変異体の繁 殖材料、を提供するものである。

本発明者らにより、イネの phyC遺伝子の変異によって、長日条件におけるィ ネの開花時期(出穂時期)が早められることが明らかになった。従って、植物 の phyC遺伝子発現を抑制することで、長日条件において植物の開花を促進させ ることが可能である。

本発明は、植物の開花を促進させるために用いる核酸を提供する。本発明の 好ましい態様においては、長日条件において植物の phyC遺伝子の発現を抑制す ることにより、植物の開花を促進させる。

本発明において開花とは通常、花が咲くことを指すが、イネを含むイネ科植 物等においては出穂を意味する。本発明において開花を促進させるとは、開花 時期を早めることを指す。また、本発明において、長日条件とは、一日の喑期 が限界喑期以下の光周期条件を指すが、具体的には通常、 14時間明 /10時間暗の 条件を例示することができる。

本発明の上記 phyC遺伝子とは、植物のフィトクロムと呼ばれる色素結合タン パク質のうちの C型のタンパク質をコードする遺伝子を指す。 phyC遺伝子は、種 々の植物において見出されている。従って、本発明においては、開花を促進さ せたい所望の植物について、該植物の phyC遺伝子の発現を抑制することにより 開花を促進させることができる可能性がある。本発明において、 phyC遺伝子の 発現を抑制して、長日条件において開花を促進させる植物としては、好ましく は短日植物であり、さらに好ましくはイネ科の植物であり、具体的にはイネを 例示することができる。この短日植物とは、限界暗期よりも長い継続した喑期 を含む光周期が与えられると花芽を形成する、あるいは花芽形成が促進される 植物を言う。本発明の方法により開花を促進させたい植物として、例えば、有 用農作物や鑑賞用植物等を挙げることができる。具体的には、有用農作物とし ては、例えばイネ等の単子葉植物や、ダイズ等の双子葉植物が挙げられる。ま た、観賞用植物としては、例えばキク、アサガオ、ポインセチア、コスモス等 の花卉植物が挙げられる。

本発明の phyC遺伝子としては、具体的には、イネの phyC遺伝子(GenBankァク セッション番号: AB018442) 、シロイヌナズナの phyC遺伝子(GenBankァクセ ッシヨン番号: Z32538) 等を例示することができる。

また、当業者においては公知の方法、例えば、ハイブリダィゼーシヨン技術 (Southern, E. M. et. al. , journal of Molecular Biology 98 : 503, 197o やポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 技術(Saiki, R. K. et. al. , Science 230: 1 350-1354, 1985、 Saiki, R. K. et. al. , Science 239: 487-491, 1988) を利 用して、上記の phyC遺伝子のホモログを単離し、該遺伝子の塩基配列の情報を 取得することが可能である。例えば、イネの phyC遺伝子の塩基配列(GenBankァ クセッション番号 AB018442) もしくはその一部をプローブとして用いるハイブ リダイゼーション技術、または phyC遺伝子の塩基配列に特異的にハイブリダィ ズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる PCR技術により、他の所望 の植物から phyC遺伝子と高い相同性を有する DNAを単離することが可能である。 このような DNAを単離するためには、通常ストリンジヱントな条件下でハイブ リダイゼーション反応を行う。ストリンジヱントなハイブリダイゼーション条 件としては、 6M尿素、 0. 4%SDS、 0. 5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジ エンシーのハイブリダィゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシ 一の高い条件、例えば 6M尿素、 0. 4%SDS、 0. lxSSCの条件を用いれば、より相同 性の高い DNAの単離を期待することができる。単離した DNAの配列の決定は、公 知の方法で行うことができる。

単離された DNAが、 phyCタンパク質をコードする DNAであるかは、通常、配列 の相同性から判定する。配列の相同性は、 BLASTn (核酸レベル)や BLASTx (ァ ミノ酸レベル)のプログラム(Altschul, S. F. et. al. , J. Mol. Biol. 215: 4 03-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、 Karl in and

Altschulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264-22 68, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877, 1993)に基づいている 。 BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score =

100、 wordlength = 12とする。また、 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する 場合には、パラメータ一は例えば score = 50、 wordlength = 3とする。また、 G apped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、 Altschulら

(Nucleic. Acids. Res. 25 : 3389-3402, 1997) に記載されているように行う ことができる。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プロダラ ムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公 知である (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov.ノ。

本発明の方法において開花が促進する植物を作製する場合には、 phyC遺伝子 の発現を抑制するための DNAを適当なベクターに揷入して、これを植物の細胞に 導入し、これにより得られた形質転^ t物細胞を再生させる。「phyC遺伝子の 発現を抑制」には、遺伝子の転写の抑制おょぴタンパク質への翻訳の抑制が含 まれる。また、 DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。

本発明において、植物の内在性遺伝子の発現の抑制は、当業者においては、 例えばアンチセンス技術を利用する方法によって行うことができる。植物細胞 におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電 気穿孔法で導入したアンチセンス RNAが植物においてアンチセンス効果を発揮す ることで初めて実証した(Ecker, J. R. and Davis, R. W. Proc. Natl. Acad. USA

83 : 5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンス RNA の発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(Krol, A. R . et. al. , Nature 333: 866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制 させる手段として確立している。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制 する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形

成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつ くられた部位とのハイプリッド形成による転写抑制、合成の進みつつある RNAと のハイプリッド形成による転写阻害、イントロンとェキソンとの接合点でのハ イブリツド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハ イブリッド形成によるスプライシング抑制、 mRNAとのハイプリッド形成による 核から細胞質への移行抑制、キヤッビング部位やポリ(A)付加部位とのハイプリ ッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド 形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイプリ ッド形成による翻訳抑制、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイプリ ッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用 部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等である。これらは、転写、 スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する( 平島および井上「新生化学実験講座 2核酸 IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化 学会編,東京化学同人, pp. 319-347, 1993)。従って、本発明は、植物の phyC遺 伝子の転写産物と相補的なアンチセンス核酸を提供する。上記ァンチセンス核 酸には、アンチセンス DNA、アンチセンス RNAおよび該アンチセンス RNAをコード する DNAが含まれる。

本発明で用いられるァンチセンス核酸は、上記のいずれの作用で標的遺伝子 の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、 mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域 に相補的なアンチセンス核酸を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろ う。しかし、コード領域もしくは 3'側の非翻訳領域に相補的な核酸も使用し得 る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセン ス核酸を含む DNAも、本発明で利用されるアンチセンス DNAに含まれる。使用さ れるアンチセンス DNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3' 側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。

本発明のアンチセンス核酸は、例えば配列番号: 3に記載の DNAの配列情報を

基にホスホロチォネート法 (Stein, C. A. et. al. , Nucleic. Acids. Res. 16 : 3209-3221, 1988) 等により調製することが可能である。調製された核酸は、 公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンス核酸の配列は、形 質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であること が好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくて もよい。本発明のアンチセンス核酸は、標的とする遺伝子の転写産物に対して 好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有する。アンチセン ス核酸を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンス核 酸の長さは、少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さ らに好ましくは 500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス核酸の長さ は 5kbよりも短く、好ましくは 2. 5kbよりも短い。

内在性遺伝子の発現の抑制は、リボザィムを利用して行うことも可能である 。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子のことをいう。リボザィムには種々 の活性を有するものがあるが、中でも RNAを切断する酵素としてのリボザィムの 研究により、 RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザィムの作製が可能とな つた。従って、本発明は植物の phyC遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボ ザィム活性を有する核酸を提供する。本発明の上記核酸には、リボザィム活性 を有する RNAおよび該 RNAをコードする DNAが含まれる。

一般にリボザィムには、グループ Iイントロン型や、 RNasePに含まれる M1RNA のように 400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーへッド型やへ ァピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメィンを有するものもある(小 泉誠おょぴ大塚栄子,タンパク質核酸酵素, 35 : 2191, 1990)。例えばハンマー へッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15の C15の 3'側を切断する 1 活性には U14が 9位の Aと塩基対を形成することが重要とされ、 15位の塩基は Cの他に Aまたは Uでも切断されることが示されている(Koizumi, M. et. al. , FE BS Lett. 228: 225, 1988)。リボザィムの基質結合部を標的部位近傍の RNA配 歹 IJと相補的になるように設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を 認識する制限酵素的な RNA切断リボザィムを作出することが可能である(Koizumi , M. et. al. , FEBS Lett. 239: 285, 1988、小泉誠おょぴ大塚栄子,タンパク 質核酸酵素, 35 : 2191, 1990、 Koizumi, M. et. al. , Nucleic. Acids. Res. 1 7: 7059, 1989) o

また、ヘアピン型リボザィムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピ ン型リボザィムは、例えばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマ ィナス鎖に見出される(Buzayan, J. . Nature 323: 349, 1986)。このリボザ ィムも、標的特異的な RNA切断を起こすように設計できることが示されている(K ikuchi, Y and Sasaki, N. Nucleic Acids Res. 19 : 6751, 1992、菊池洋,化 学と生物, 30 : 112, 1992)。

標的を切断できるよう設計されたリボザィムは、例えば、植物の細胞中で転 写されるように力リフラワーモザイクウィルスの 35Sプロモーター等のプロモー ターおよび転写終結配列に連結される。し力し、その際、転写された RNAの 5'末 端や 3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザィムの活性が失われてし まうことがある。このようなとき、転写されたリボザィムを含む RNAからリボザ ィム部分だけを正確に切り出すために、リボザィム部分の 5'側や 3'側に、トリ ミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザィムを配置させることも 可能である(Taira, K. et. al., Protein Eng. 3: 733, 1990、 Dzianott, A. M . and Bujarski, J. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4823, 1989、 Grossh ans, C. A. and Cech, R. T. Nucleic. Acids. Res. 19 : 3875, 1991、 Taira, K. et. al. , Nucleic. Acids. Res. 19 : 5125, 1991)。また、このような構成 単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の ¾位を切断できるようにして、 より効果を高めることもできる(Yuyama, N. et. al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992) 0 このようなリボザィムを用いて本発明で標的とな る遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができ

る。

内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似 した配列を有する核酸の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成 されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した 配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および 標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構 の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7 : R793, 1997、 Curr. Biol. 6: 810, 1996)。従って本発明は、植物の phyC遺伝 子の発現を、共抑制により阻害効果を有する核酸を提供する。本発明の該核酸 には、共抑制により阻害効果を有する DNA、および共抑制により阻害効果を有す る RNAが含まれる。

本発明の上記核酸を用いて、 phyC遺伝子が共抑制された植物体を得るために は、例えば phyC遺伝子若しくはこれと類似した配列を有する DNAを発現するべク ター DNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から phyC変異体の形質を有 する植物、即ち長日条件において開花が促進した植物を選択すればよレ、。共抑 制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくと も 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上(例えば 95%以 上)の配列の同一性を有する。

さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナ ントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによつても達 成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺 伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活 性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子をいう。

また本発明は、上記核酸または該核酸を含むベクター、該核酸または該核酸 を含むベクターを保持する形質転換植物細胞、該形質転換植物細胞を含む形質 転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、

およぴ該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。

さらに、本発明は、上記の形質転 l物体の製造方法であって、本発明の核 酸を植物の細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法 を提供する。

本発明の核酸の植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例え ばァグロバクテリゥム法、電気穿孔法(エレクト口ポーレーシヨン法)、パー ティクルガン法により実施することができる。

上記ァグロバクテリウム法を用いる場合、例えば Nagelらの方法(Microbiol. Lett. 67: 325, 1990) が用いられる。この方法によれば、組み換えベクター をァグロバタテリゥム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたァグロバ クテリゥムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。 本発明の核酸が DNAである場合、上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、 該 DNAが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロ モーターの下流には本発明の DNAが位置し、さらに該 DNAの下流にはターミネ一 ターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方 法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモ 一ターとして、例えばカリフラワーモザイクウィルス由来の CaMV35S、トウモロ コシのュビキチンプロモーター(特開平 2- 79983号公報)等を挙げることができ る。

また、上記ターミネータ一は、カリフラワーモザイクウィルス由来のターミ ネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネータ一等を例示す ることができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネータ一であれ ば、これらに限定されない。

また、本発明の核酸を導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植 物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植 物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス 、懸濁培養細胞等が挙げられる。

また、本発明の核酸の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択する ために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしく は選抜マーカー遺伝子を含むブラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するの が好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイ グロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子

、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐 14であるネオマイシンホスホトラン スフエラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐 t¾であるァセチルトラン スフヱラーゼ遺伝子等が挙げられる。

組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の 種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。こ れにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。

次いで、本発明の核酸を導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物 体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能であ る (Toki et. al. , Plant Physiol. 100: 1503-1507, 1995) 。例えばイネにお いては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコール によりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体(インド型イネ品種が適してい る)を再生させる方法(Datta, S. K. et. al. , In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds. ) pp66-74, 1995) 、電気ノヽレスによりプロ トプラストへ遺伝子導入し、植物体(日本型イネ品種が適している)を再生さ せる方法 (Toki et. al. , Plant Physiol. 100: 1503 - 1507, 1992) 、パーティ クルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法(Chris tou et. al. , Bio/technology, 9: 957-962, 1991) およびァグロパクテリゥム を介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法(Hiei et. al. , Plant J. 6 : 271-282, 1994) 等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野に おいて広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いる

ことができる。

形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その 後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、開花が促進した植 物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。

なお、このように再生され、かつ栽培した形質転 mffi物体中の導入された外 来核酸の存在は、公知の PCR法やサザンハイブリダィゼーシヨン法によって、ま たは植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる

。この場合、形質転^ ί物体からの核酸の抽出は、公知の J. Sambrookらの方法

(Molecular loning, 第 2||R, Cold SpringHarbor laboratory Press, 1989) に準じて実施することができる。

再生させた植物体中に存在する本発明の核酸よりなる外来遺伝子を、 PCR法を 用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を铸型と して増幅反応を行う。また、本発明の核酸が DNAである場合には、該 DNAの塩基 配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドを プライマーとして用レ、、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこ ともできる。増幅反応においては、 DNAの変性、アニーリング、伸張反応を数十 回繰り返すと、本発明の DNA配列を含む DNA断片の増幅生成物を得ることができ る。増幅生成物を含む反応液を例えばァガロース電気泳動にかけると、増幅さ れた各種の DNA断片が分画されて、その DNA断片が本発明の DNAに対応することを 確認することが可能である。

一旦、染色体内に本発明の核酸が導入された形質転^ t物体が得られれば、 該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。ま た、該植^体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(^えば種子、果実、 切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に該 植物体を量産することも可能である。

本発明においては、上記の如く、植物の phyC遺伝子の発現を抑制することで

、植物の開花を促進することができる。

さらに、本発明においては、イネの PhyC遺伝子突然変異体、該イネ phyC遺伝 子突然変異体の子孫またはクローン、また、該イネ PhyC遺伝子突然変異体の繁 殖材料が提供される。

本発明におけるイネの phyC遺伝子突然変異体には、長日条件下において開花 が促進したイネの phyC遺伝子突然変異体(ホモ変異体)だけでなく、ヘテロ変 異体も含まれる。該ヘテロ変異体は、ホモ変異体の作製に用いることができる 点で有用である。また、本発明におけるイネの phyC遺伝子突然変異体には、本 発明で単離した phyC遺伝子突然変異体(ホモ変異体およびへテロ変異体)の他 に、実施例に記載しているミユータントパネルを用いた突然変異体の単離法に よつて新たに単離される phyC遺伝子突然変異体(ホモ変異体およびへテ口変異 体)をも含む。

図面の簡単な説明

図 1は、 phyC遺伝子突然変異体における Tosl7の挿入部位を示す図である。 A では、黒枠の部分を境にして(244番目のヒスチジン残基(H) と 245番目のダル タミン酸残基(E) との間に) Tosl7が挿入されていることを示す。 Bでは、染 色体上の Tosl7の挿入部位を模式的に示す。

図 2は、 phyC遺伝子突然変異体を単離したことを示す写真である。 phyC突然 変異のへテロ変異体を自殖して得た後代(#1〜9) において、 Xhol処理により生 じる phyC遺伝子を含む 3. 8kbの断片を認識するプローブを用いたサザンハイプリ ダイゼーシヨンにより解析した結果を示す。( + /+) は野生型、(+/— ) は p hyC遺伝子のヘテロ変異体、(一/一)は phyC遺伝子のホモ変異体を示す。

図 3は、競合的 RT-PCRによる phyC遺伝子転写産物の発現量を示す写真である 。 log (Comp) は Competitor濃度の対数を示す。 phyCは phyC遺伝子転写産物、 Co mpは Competitor由来の増幅産物を示す。(+/ + ) は野生型、(+/— ) は phyC 遺伝子のヘテロ変異体、(一/一)は phyC遺伝子のホモ変異体を示す。

図 4は、 phyC遺伝子突然変異体の圃場栽培における開花日数(出穂日数)を 示す図である。 osphyA- 2は phyA遺伝子突然変異体、(+/土)は自殖後分離した へテ口変異体や野生型の個体、 osphyC-1は phyC遺伝子突然変異体を示す。

図 5は、 phyC遺伝子突然変異体を日本晴に戻し交配し、その分離 F2集団にお ける遺伝子型と開花日数との関係を示す図である。

図 6は、 phyC遺伝子突然変異体における長日条件と短日条件での開花日数( 出穂日数)を示す図である。横軸の 14L/10Dおよび 10. 5L/13. 5Dは、それぞれ、 長日条件および短日条件を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実 施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] PhyC遺伝子突然変異体の単離

本発明者らは、ミュータントパネルを用いた突然変異体の単離法を用いて、 p hyC遺伝子突然変異体の単離を行った。まず、イネの phyC遺伝子の cDNAの塩基配 列 (GenBankァクセッション番号 AB018442) を参考に、 phyC遺伝子のプライマ— を作製した。 phyC遺伝子は大きな遺伝子なので、すべての領域をカバーするた めに 6種類のプライマー(BR、 DR、 EF、 FR、 GF、 HR) をデザインした(表 1 ) 。 また、 Tosl7については、両端の LTR配列に外向きにニケ所(LTR1、 LTR4) プラ イマ一をデザインした(表 2 ) 。

(表 1 )

phyC-特異的プライマー * phyG-特異的プライマ一配列プライマー部位 ** HC5"J w^y ·, / GTGATGGCAGACCATCAACC 1412-1393 ρι HC^Jw7? - ノ CCAGTGTCTCCATCATCATCC 1367-1347

Π UΡT Gクリせ . ノ CATACCTAAGCGGGAAAGGGAC 1449-1428

fS クリ S货县, . Δ **ノ AAAGGGACAAACCTCGGGCTTG 1435-1414

\ πϋ7 Έ&ゥ ·リノ CGTACAAGTTCCATGAGGATGAGC 1018-1041

EF1 (SS列番号 : 6) GAGGTGATTGCTGAGTGCAAGAG 1047-1069

FR (配列番号:7) ATCGACCAGAGGCTTCCCTATG 2306-2285

FR1 (配列番号 : 8) TGGCTTCCATGACAGGTAATCC 2286-2265

GF (配列番号 : 9) GCCTAATTGAGACAGCAACTGCG 2176-2198

GFl (配列番号:10) TTGGCTGTTGACATCACTGG 2205-2224

HR (配列番号: 1 1 ) ACGAGCTTCTGGCTTATGTAAAGG 3586-3563

HRl (配列番号:1 2) TGGCGGAACATCTCTTGTATCAG 3532-3510

*BR1 DR1 EF1 FR1 GFlおよび HRlは、それぞれ、 BR DR EF FR GFおよび HRの nested PCRプライマ一を示す。

**イネ phyC遺伝子の cDNAの塩基配列(GenBankァクセッション番号 AB018442) に おける、プライマーの部位を示す。

(表 2 )

Tos17特異的プライマー * Tos17特異的プライマ一配列

LTR1 (配列番号: 1 3) TTGGATCTTGTATCTTGTATATAC LTR2 (配列番号: 1 4) GCTAATACTATTGTTAGGTTGCAA LTR4 (配列番号: 1 5) CTGGACATGGGCCAACTATACAGT LTR5 (配列番号: 1 6) ATTAGCTTGTATATATA 1 1 I AACA

*LTR2および LTR5は、それぞれ、 LTR1および LTR4の nested PCRプライマーを示す

9600個体分のミュータントパネルを 12通り(phyC特異的プライマー: 6種類 X Tosl7特異的プライマー: 2種類)のプライマーの組み合わせで PCRスタリ一

ユングを行った結果、 BRと LTR4の間で特異的な増幅が認められた。ミュータン トパネルの DNAプールには 80 (X軸)〜120個体(Z軸)由来の DNAが含まれる、即 ち、一個体に付いてみれば 1/120〜1/80に希釈されており、铸型の濃度はかなり 低いことになる。また、 Tosl7の LTRの塩基配列は AT含量が高く、設計されたプ ライマーの Tmが低いことから、一回の PCRで特異的な増幅を検出することは難し い。そこで感度を上げ、かつ特異性も高めるために、それぞれのプライマーの 下流に別のプライマー(BR1、 DR1、 EF1、 FR1、 GF1、 HR1、 LTR2、 LTR5) をデザ インして、二回の PCR (nested PCR) によって増幅を検出した。その結果非特異 的なバンドが多数出現したので、サザンハイプリダイゼーシヨンによって、特 異的な増幅を特定し、特定されたバンドを切り出して、 DNA断片を抽出した。該 DNA断片をシークェンスし、 Tosl7の挿入位置を決定したところ、発色団(開環 型テトラピロール)の結合部位より上流(アミノ酸配列において 244番目)に挿 入されており(図 1 ) 、完全突然変異体(null mutant) と予想された。

また、 Tosl7の挿入をサザンハイブリダィゼーシヨン解析を用いて確認した。 イネのゲノム DNAを Xholで切断し、サザンハイブリダィゼーシヨン解析すると、 報告されているイネ phyC遺伝子のゲノム DNA配列(D. Basu et al. Plant Mol. B iol. 44: 27-42, 2000)から、野生型において 3. 8kbのバンドが検出されると予 想される。これに対し、 Tosl7の挿入変異体では 7. 5kbと 0. 4kbの 2本のバンドが 検出されると予測される。 phyC突然変異のヘテロ変異体を自殖して得た後代(# 1〜9) 力ら抽出した DNAに対し、 Xhol処理により生じる phyC遺伝子を含む 3. 8kb の断片を認識するプローブ(変異体では 7. 5 kbの断片を認識する phyCの全長 cDN Aからなるプローブ)を用いたサザンハイブリダィゼーションにより解析した結 果、予測通りのバンドパターンが得られた。また、 phyC遺伝子に揷入された Tos 17が分離して、 #2、 5、 6、 7ではホモ変異体に、 #1、 4、 8、 9ではへテロ変異体 に、 #3では Tosl7が失われていることが分かった(図 2 B ) 。以上の結果より、 phyC遺伝子突然変異体を 1系統(osphyC- 1) 分離することができた。

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[実施例 2 ] RT- PCRによる phyC遺伝子の転写産物の確認

単離された突然変異体において、 phyC遺伝子が発現していないことを確認す るために、 phyC遺伝子突然変異をへテロに持つ個体を自家受粉して、その分離 後代の植物体(#1〜9) 力、ら DNAを抽出して遺伝型を決定すると共に、 RNAを抽出 し、表 1の BRおよび EFをプライマーとして競合的 RT- PCRを行った(図 3 ) 。そ の際、両端にそれぞれ BRおよび EFの配列を持ち、その間に、 phyCの cDNAとは全 く無関係の 340bpの配列が挿入されている DNA断片を、競合 DNA (competitor) と して用いた。検討の結果、 phyC遺伝子が野生型(#3) あるいはヘテロ(#1、 4、 8、 9) の個体では、 phyC遺伝子の増幅バンドが認められるのに対して、ホモの p hyC遺伝子突然変異体(#2、 5、 6、 7) では予想される位置にバンドが認められ ず、 phyC遺伝子が発現していないことが確認された。

[実施例 3 ] 開花時期(出穂時期)に対する phyC遺伝子突然変異の影響 開花時期を調べるため、日本晴と phyC遺伝子突然変異体の種子を 2000年 6月 28 日に播種し、 7月 14日に圃場に移植した。これらのイネを自然日長で生育させ、 開花時期を観察した。図 4に示すように、対照として植えた phyA遺伝子突然変 異体 (osphyA-2) や自殖後分離したヘテロ変異体や野生型の個体が播種後 60〜6 1日で開花したのに対して、 phyC遺伝子突然変異体は約 1週間早い 54日で開花し た。

また、 phyC遺伝子突然変異と開花の促進が連鎖していることを確認するため に、 phyC遺伝子突然変異体を日本晴に戻し交配し、その分離 F2集団について遺 '伝子型と開花日数を調べた。 F2集団(n=54) およひ'対照としての日本晴(n=63 ) は、 2002年 5月 15日に播種し、 6月 5日に圃場に移植した。図 5に示すように、 分離したヘテロ及び野生型の個体(n=45) は、最も早いもので 91日、平均して 播種後 93. 2日で開花したのに対して、 phyC遺伝子突然変異体(n=9) は最も遅い ものでも 84日、平均して 83. 1日で開花し、遺伝子型と開花時期はこの集団では 完全に一致した。対照の日本晴は、ヘテロ及び野生型とほぼ同様に平均して 94. 1日で開花した。

さらに、短日および長日条件における開花時期を調べるために、人工気象器 (短日: 10. 5時間明/13. 5時間喑、長日: 14時間明 /10時間暗)でも育てた(図 6 ) 。短日条件では、日本晴、 phyA遺伝子突然変異体、および phyC遺伝子突然 変異体の間で開花日数に差がなく、いずれも約 50日で開花したが、長日条件で は、日本晴および、 phyA突然変異体が開花まで約 90日を要したのに対して、 ph yC遺伝子突然変異体は約 1週間早い、約 83日で開花した。従って、 phyC遺伝子は 、長日を関知して開花を遅らせるように働いていると判断される。

また、該 phyC遺伝子突然変異体において、開花時期以外の形質(草丈、草姿 、クロロフィル含量、クロロフィル a/b比等)の観察を行ったが、有意な差は認 められなかった。

産業上の利用の可能性

本発明により、植物の phyC遺伝子を利用した植物の開花(出穂)の促進方法 が提供された。特に、 phyC遺伝子突然変異体は開花時期以外の形質(草丈、草 姿、クロロフィル含量、クロロフィル a/b比等)には変化が認められないため、 phyC遺伝子の発現量を抑制することにより、特異的に開花を促進することがで きると考えられる。 phyC遺伝子を利用した植物の開花の促進は、栽培地域や栽 培時期に適応した新たな形質を有する有用農作物や観賞用植物等の品種の改良 に貢献し得るものと大いに期待される。また、本発明において、長日条件にお いて開花が促進される植物の phyC遺伝子突然変異体が提供された。該変異体は 、収穫時期が早められた新たなイネとしての利用が大いに期待される。