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1. WO2021027867 - RÉCEPTEUR ANTIGÉNIQUE CHIMÉRIQUE, SON PROCÉDÉ DE CONSTRUCTION ET SON APPLICATION

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19  

附图

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说明书

发明名称 : 嵌合抗原受体及其构建方法和应用

[0001]
优先权和相关申请
[0002]
本申请要求2019年8月14日提交的名称为“嵌合抗原受体及其构建方法和应用”的中国专利申请201910748321.2的优先权,该申请包括附录在内的全部内容作为参考并入本申请。

技术领域

[0003]
本发明属于生物技术领域,具体涉及嵌合抗原受体及其构建方法和应用。

背景技术

[0004]
随着肿瘤治疗的发展,嵌合抗原受体T(Chimeric Antigen Receptor-T,CAR-T)细胞免疫疗法逐渐成为备受关注的治疗手段。CAR-T细胞所表达的CAR一般包含胞外抗原结合域、跨膜区、共刺激因子结构域和和胞内信号结构域。通常CAR-T细胞是由患者T细胞经CAR基因转导并扩增而来,最后再回输到该患者体内。CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原,引起特异性的抗肿瘤免疫应答,而不受主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)的限制。目前,美国FDA已经批准了两款自体CAR-T细胞产品上市,分别是诺华的Kymriah和凯特的YesCAR-Ta,分别用于急性淋巴细胞白血病(ALL)和难治性/复发性非霍奇金淋巴瘤和的治疗。大量临床试验证明,CAR-T作为个性化的活细胞药极具抗肿瘤潜力(Maude et al.,2018;Park et al.,2018;Schuster et al.,2017)。
[0005]
尽管多种多样的肿瘤抗原正在被应用于临床研究中,但CD19仍是目前CAR-T研究中最为广泛的靶点。尽管CAR-T治疗在血液肿瘤治疗中达到了前所未有的疗效,但仍有部分患者对CAR-19-T并不反应;或者即使初始治疗有一定的疗效,CAR-19-T的持久性仍存在很大问题。部分研究表明CAR-T 疗效受限的一部分原因来自于肿瘤细胞表面抗原的丢失或下调(Grupp et al.,2013;Ruella et al.,2016)。在非霍奇金淋巴瘤中,Neelapu报道了他们的CAR-19-T产品的二期临床结果,108个病人CAR-T治疗后长达至少一年的跟踪,其中42%的病人得到了很好的响应,但仍有部分患者复发,其中CD19阴性复发逃逸是主要原因(Neelapu et al.,2017)。在急性淋巴瘤治疗中,CAR-19-T的总体响应率为81%,大部分的复发病人(15/22)呈现出了CD19阴性逃逸(Kantarjian et al.,2016)。因此,靶点抗原逃逸是目前CAR-T治疗的重要瓶颈之一。
[0006]
解决CAR-T治疗过程中抗原丢失的主要方法是通过靶向多个抗原,从而解决单一肿瘤抗原的阴性逃逸。在胶质瘤的CAR-T临床前研究中,研究者首次进行了多CAR-T同时治疗的尝试。HER2和IL-23Rα2的双CAR-T与单CAR-T相比,能显著阻止抗原逃逸,并达到更优的抑瘤效果(Hegde et al.,2013)。在B细胞恶性肿瘤的双CAR-T临床前研究中,Zah开发了一种CD19-CD20串联形式的双CAR-T,在免疫缺陷老鼠中能显著抑制CD19阴性肿瘤细胞的自发逃逸(Zah et al.,2016)。串联形式的双CAR-T共用一个传导信号,而并联形式的双CAR-T分别采用各自的传导信号(参见图1),因此与串联形式的双CAR-T相比,并联CAR-T信号独立,不会相互干扰,能最有效的发挥CAR-T细胞的治疗效果。Plue在并联形式的双CAR19-CAR22方面进行了相关研究(WO2016/102965A1),发现4-1BBzeta/OX40zeta和CD28zeta的双CAR19-CAR22组合具有最优的体外杀瘤效果,表明并联双CAR-T的不同的胞内刺激因子的组合会导致差异性的体内外抑瘤效果。因此对于并联形式的双CAR-T而言,在繁多的不同的胞外抗原结合域、跨膜区、共刺激因子结构域中找寻到最合适的组合极为关键。
[0007]
本发明提供的并联形式的双特异性CAR-T采用独立的两个嵌合抗原受体,与串联形式的双特异性CAR-T相比,具有信号独立、互不影响的优势。WO2016/102965A1专利发明针对肿瘤靶点CD19和CD22进行研究,该专利对并联形式的双CAR19-CAR22进行了4种胞内刺激因子组合的体外杀瘤活性 的比较(包括41BBz-41BBz、OX40z-OX40z、41BBz-28z和OX40z-28z),但是该专利的筛选数据单一、组合较少,且无相关体内数据。本发明针对肿瘤靶点CD19、CD20和CD22进行研究,对多种组合形式的并联双CAR19-CAR20以及并联双CAR19-CAR22进行了更为系统的体内外杀瘤活性的比较确认。
[0008]
发明内容
[0009]
发明要解决的问题
[0010]
针对现有技术中存在的问题,本申请提供了一系列特异性嵌合抗原受体及其构建方法和应用,特别是提供了包含两个含有不同抗原结合区的嵌合抗原受体的双特异性CAR-T。
[0011]
用于解决问题的方案
[0012]
本发明人鉴于上述现有技术中存在的问题,进行了深入的研究、反复试验,分别对并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20和并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22中的CAR20结构和CAR22结构不同的胞外铰链区、跨膜区和共刺激因子结构域进行了系统优化和比较,从而完成了本发明。即本发明如下所述:
[0013]
在本发明的第一方面,首先提供了嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体由抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区、共刺激域和CD3z信号结构域组成。
[0014]
对本领域技术人员而言,所述“共刺激域”(Co-stimulatory Domain,CSD)也可以称为共刺激因子或共刺激因子结构域。
[0015]
在本发明具体的实施方案中,所述胞外铰链区选自由CD8胞外铰链区(CD8hinge)、CD28胞外铰链区(CD28hinge)、ICOS胞外铰链区(ICOShinge)或IgG4mt10+N297A胞外铰链区(IgG4mt10+N297Ahinge)组成的组中的任一种;
[0016]
所述跨膜区选自由CD8跨膜区(CD8TM)、CD28跨膜区(CD28TM)或ICOS跨膜区(ICOSTM)组成的组中的任一种;
[0017]
所述共刺激域选自由4-1BB共刺激域(4-1BBCSD)、CD28共刺激域 (CD28CSD)、ICOS共刺激域(ICOSCSD)或OX40共刺激域(OX40CSD)组成的组中的任一种。
[0018]
在本发明具体的实施方案中,所述包含胞外铰链区、跨膜区和共刺激域的结构分别为:CD8hinge-CD8TM-4-1BBCSD、CD28hinge-CD28TM-CD28CSD、ICOShinge-ICOSTM-ICOSCSD、CD28hinge-CD28TM-OX40CSD、IgG4mt10+N297Ahinge-CD8TM-4-1BBCSD、IgG4mt10+N297Ahinge-CD28 TM-CD28CSD或IgG4mt10+N297Ahinge-ICOSTM-ICOSCSD。
[0019]
上式中,“-”独立地为连接肽或肽键;hinge为铰链区;TM为跨膜区;CSD为共刺激域。
[0020]
其中,所述IgG4mt10+N297Ahinge-CD8TM-4-1BBCSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:36,编码所述氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:33;
[0021]
所述IgG4mt10+N297Ahinge-CD28TM-CD28CSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:37,编码所述氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:34;
[0022]
所述IgG4mt10+N297Ahinge-ICOSTM-ICOSCSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:38,编码所述氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:35。
[0023]
上文所述嵌合抗原受体中包含的抗原结合区为单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
[0024]
其中,所述scFv由抗体重链可变区和轻链可变区通过15~20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。所述单域抗体又称纳米抗体(nanobody)或重链抗体(heavy chain antibody,hcAb),其体积约为传统抗体的1/10。与传统抗体不同的是,单域抗体仅由重链构成,其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域,而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能。
[0025]
在本发明具体的实施方案中,所述抗原结合区识别CD20或者识别CD22。
[0026]
进一步的,所述抗原结合区为Leu16,其中所述Leu16为识别CD20的人源化scFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0027]
或者,所述抗原结合区为M971,其中所述M971为识别CD22的scFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0028]
在本发明的第二方面,提供了嵌合抗原受体T细胞,即CAR-T细胞,所述CAR-T细胞能够表达本发明第一方面所述的任一种特异性嵌合抗原受体。其中,所述CAR-T细胞表达两个独立的嵌合抗原受体。
[0029]
在本发明一个实施方案中,所述两个独立的嵌合抗原受体分别为CAR19和CAR20;其中所述CAR19识别CD19,所述CAR20识别CD20。
[0030]
在本发明另外的实施方案中,所述两个独立的嵌合抗原受体分别为CAR19和CAR22;其中所述CAR19识别CD19,所述CAR22识别CD22。
[0031]
在本发明的第三方面,提供了一种核酸分子,所述核酸分子编码本发明第一方面所述的任一种特异性嵌合抗原受体。
[0032]
在本发明的第四方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第三方面所述的核酸分子。
[0033]
在本发明的第五方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体或在所述宿主细胞的染色体中整合有本发明第三方面所述的核酸分子。
[0034]
在本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物中含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的任一种特异性嵌合抗原受体。
[0035]
在本发明的第七方面,提供了如本发明第一方面所述的任一种特异性嵌合抗原受体、如本发明第三方面所述的核酸分子、如本发明第四方面所述的载体或如本发明第五方面所述的宿主细胞在制备治疗抗肿瘤的药物或抗肿瘤的制剂中的应用。
[0036]
其中,所述肿瘤为血液肿瘤,优选的所述血液肿瘤为B细胞恶性肿瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、淋巴瘤、肥大细胞瘤或滤泡性淋巴瘤。
[0037]
在本发明的第八方面,提供了一种制备CAR-T细胞的方法,其特征在于, 所述CAR-T细胞表达如本发明第一方面所述的特异性嵌合抗原受体,所述方法包括以下步骤:
[0038]
将本发明第三方面所述的核酸分子或者本发明第四方面所述的载体导入T细胞内,从而获得所述CAR-T细胞。
[0039]
发明的效果
[0040]
1,本发明提供包含并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20慢病毒载体可体外感染人T淋巴细胞,7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR20-T细胞对于CD19 +K562-luc-GFP靶细胞和CD20 +K562-luc-GFP靶细胞均具有较高的杀伤效率;其中包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞在较低的效靶比的情况下,对于靶细胞仍然具有较高的杀伤效率。
[0041]
2,本发明提供的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20-T细胞细胞均能保持较高比例的干细胞中央记忆型T细胞(TSCM)。其中,包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞能够较好的表达CAR19 +CAR20 +双阳性群体。
[0042]
3,本发明提供的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20-T细胞均具有较好的体内抑瘤效果。特别的,与包含PCTL152的CAR19-CAR20-T细胞相比,包含PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞能更加明显的提高荷瘤小鼠的生存率;与传统的单CAR19-T细胞、单CAR20-T细胞以及串联形式的CAR20-19-T细胞相比,包含PCTL153的并联形式的双CAR19-CAR20-T细胞能明显提高荷瘤小鼠的生存率。
[0043]
4,本发明提供的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22-T细胞在效靶比为10∶1的情况下,对于靶细胞CD19 +K562-luc-GFP的杀伤效率均大于90%。另外,所述双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22-T细胞在一系列不同的效靶比情况下,对于靶细胞CD22 +K562-luc-GFP均具有杀伤效果,且具有明显的效靶比的依赖性。
[0044]
为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂,下面特举 较佳实施例,并配合说明书附图,作详细说明如下:

附图说明

[0045]
图1为串联形式的双特异性CAR-T和并联形式的双特异性CAR-T的结构示意图;
[0046]
图2为7种并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20的结构示意图;
[0047]
图3为7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD19 +K562-luc-GFP的杀伤效率;
[0048]
图4为7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD20 +K562-luc-GFP的杀伤效率;
[0049]
图5为7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR20-T细胞的T细胞表型;
[0050]
图6为包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞表达CAR19 +CAR20 +双阳性群体的结果;
[0051]
图7为包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞在小鼠体内抑瘤活性验证试验中所述给药方案的示意图;
[0052]
图8为G1、G3和G4组所述荷瘤小鼠在分别给予PBS、包含PCTL152的CAR19-CAR20-T细胞的载体、包含PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞的载体后的生存率;
[0053]
图9为包含PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞、单CAR19-T细胞、单CAR20-T细胞以及串联形式的CAR20-19-T细胞在小鼠体内抑瘤活性验证试验中所述给药方案的示意图;
[0054]
图10为G1、G3、G4、G5和G7组所述荷瘤小鼠在分别给予PBS、包含CAR-19-T细胞的载体、包含CAR-20-T细胞的载体、包含PCTL153的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20-T细胞的载体和包含串联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR20-19-T细胞的载体后的生存率;
[0055]
图11为7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR22-T 细胞对于靶细胞CD19 +K562-luc-GFP的杀伤效率;
[0056]
图12为7种包含不同结构的双特异性嵌合抗原受体的CAR19-CAR22-T细胞对于靶细胞CD22 +K562-luc-GFP的杀伤效率。

具体实施方式

[0057]
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。应该强调的是,本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外,本文使用的任何章节标题仅用于组织目的,并不被解释为限制所描述的主题。
[0058]
除非在此另外定义,否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另有要求,单数形式的术语应包括复数形式,复数形式的术语应包括单数形式。更具体地,如在本说明书和所附权利要求中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式“一”,“一个”和“该”包括复数指示物。在本申请中,除非另有说明,否则使用“或”意指“和/或”。此外,术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外,说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。
[0059]
实施例1:并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20和CAR19-CAR22的设计
[0060]
本发明人设计了7种不同的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20,其中保持CAR19的结构固定不变,即均选择具有FMC63-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3z结构的CAR19(参见CN105392888A),并将其与7种不同的CAR20结构进行组合。其中,上述CAR19中的抗原结合域FMC63的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。上述CAR19中的CD8 hinge、CD8TM、4-1BB和CD3z的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO: 16所示。
[0061]
所述7种不同的CAR20包括:Leu16-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BBCSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL126),Leu16-CD28 hinge-CD28 TM-CD28CSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL137),Leu16-ICOS hinge-ICOS TM-ICOSCSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL138),Leu16-CD28 hinge-CD28 TM-OX40CSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL139),Leu16-IgG4mt10+N297A hinge-CD8 TM-4-1BBCSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL151),Leu16-IgG4mt10+N297A hinge-CD28 TM-CD28CSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL152),Leu16-IgG4mt10+N297A hinge-ICOS TM-ICOSCSD-CD3z(将同时包含该CAR20和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL153)。所述7种不同的CAR20的组成如表1所示:
[0062]
表1:7种不同CAR20的组成
[0063]
[0064]
具体来说,表1中所述7种不同CAR20中的scFv均通过常规的分子生物学手段对鼠源的scFv(其中所述鼠源scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)做了人源化处理,并将人源化处理后的scFv命名为Leu16,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0065]
所述CAR20的铰链区具有四种不同的选择,即CD8hinge、CD28hinge、ICOShinge或IgG4mt10+N297Ahinge,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:31所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。其中,所述IgG4mt10+N297Ahinge所示的铰链区是在天然的IgG4的基础上突变了8个氨基酸位点。具体来说,是将天然的IgG4中第228位氨基酸由S突变成P、将第233位氨基酸由E突变成P、将第234位氨基酸由F突变成V、将第235位氨基酸由L突变成A、将第265位氨基酸由D突变成A、将第297位氨基酸由N突变成A、将第309位氨基酸由L突变成V、将第409位氨基酸由R突变成K,去除了FcγR(Fc gamma receptor)的结合能力,避免了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicit,ADCC)和补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC),从而有效增强CAR-T的体内活性。
[0066]
所述CAR20的跨膜区具有三种不同的选择,即CD8TM、CD28TM或ICOSTM,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26所示。
[0067]
所述CAR20的共刺激因子结构域具有四种不同选择,即4-1BBCSD、CD28CSD、ICOSCSD和OX40CSD,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30所示。即7种双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20中的 CAR20部分编码相同的抗原结合结构域(即具有相同的scFv)和CD3z信号域,其中所述CD3z信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示(编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)。所述7种构建体之间的区别仅在于CAR20部分不同的铰链区、跨膜区和共刺激因子结构域组合。7种并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20的结构示意图如图2所示。
[0068]
本发明人还设计了7种不同的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22,其中保持CAR19的结构固定不变,即均选择具有FMC63-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3z结构的CAR19,并将其与7种不同的CAR22结构进行组合,所述7种不同的CAR22包括:M971-CD8 hinge-CD8 TM-4-1BBCSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL81),M971-CD28 hinge-CD28 TM-CD28CSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL103),M971-ICOS hinge-ICOS TM-ICOSCSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL105),M971-CD28 hinge-CD28 TM-OX40CSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL124),M971-IgG4mt10+N297A hinge-CD8 TM-4-1BBCSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL148),M971-IgG4mt10+N297A hinge-CD28 TM-CD28CSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL149),M971-IgG4mt10+N297A hinge-ICOS TM-ICOSCSD-CD3z(将同时包含该CAR22和上文所述CAR19的双特异性嵌合抗原受体称为PCTL150)。所述7种不同的CAR22的组成如表2所示:
[0069]
表2:7种不同CAR22的组成
[0070]
[0071]
具体来说,表2中所述7种不同CAR22中的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示,编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述CAR22的铰链区具有四种不同的选择,即CD8hinge、CD28hinge、ICOShinge或IgG4mt10+N297Ahinge,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:31所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:32所示。其中,所述IgG4mt10+N297A所示的铰链区是在天然的IgG4的基础上突变了8个氨基酸位点。具体来说,是将天然的IgG4中第228位氨基酸由S突变成P、将第233位氨基酸由E突变成P、将第234位氨基酸由F突变成V、将第235位氨基酸由L突变成A、将第265位氨基酸由D突变成A、将第297位氨基酸由N突变成A、将第309位氨基酸由L突变成V、将第409位氨基酸由R突变成K,去除了FcγR(Fc gamma receptor)的结合能力,避免了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicit,ADCC)和补体依赖的细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity,CDC),从而有效增强CAR-T的体内活性。
[0072]
所述CAR22的跨膜区具有三种不同的选择,即CD8TM、CD28TM或 ICOSTM,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:25所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:26所示。
[0073]
所述CAR22的共刺激因子结构域具有四种不同选择,即4-1BBCSD、CD28CSD、ICOSCSD和OX40CSD,它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:29所示;编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30所示。即7种双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22中的CAR22部分编码相同的抗原结合结构域(即具有相同的scFv)和CD3z信号域,其中所述CD3z信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示(编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示),所述7种构建体之间的区别仅在于CAR22部分不同的铰链区、跨膜区和共刺激因子结构域组合。
[0074]
实施例2:由不同结构的双特异性嵌合抗原受体制备的CAR19-CAR20-T细胞对靶细胞杀伤作用的比较
[0075]
利用实施例1中所述的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20制备双靶点CAR-T细胞,然后将所述双靶点CAR-T细胞与CD19 +K562-luc-GFP、CD20 +K562-luc-GFP两种不同的靶细胞按不同效应细胞(E):靶细胞(T)比例,即分别以E/T=1∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例共孵育18~24小时,用未进行基因修饰的T细胞(即未进行慢病毒感染的T细胞,下文称为NC-T细胞)作为本底对照,构建的靶细胞株上带有荧光素酶luciferase,通过化学发光的原理检测效应细胞对靶细胞的杀伤效果。具体操作如下:
[0076]
(1)外周血PBMC的分离、T细胞分离活化、慢病毒转导、体外培养:
[0077]
选择HBV、HCV和HIV检测阴性的健康供者,肘正中静脉抽血100ml,Ficoll密度梯度离心分离PBMC白膜层,根据全血流式检测CD3 +T细胞百分比,计算CD3 +T细胞数,按DynaBeads CD3/CD28与CD3 +T细胞比例3∶1,吸取使 用量磁珠,与白膜层细胞孵育30min,分离CD3 +T细胞,CD3 +T细胞经Dynabeads CD3/CD28(Lifetechnologies,货号:40203D)活化24小时后流式检测CD25 +CD69 +T细胞比例(CD25 +CD69 +T细胞比例:71%)。CD3 +T活化后,进行慢病毒转导。用Novonectin包被24孔板37℃孵育2小时,将上述操作后得到的细胞悬液分别与制备得到的各种慢病毒(即分别包含PCTL126,PCTL137,PCTL138,PCTL139,PCTL151,PCTL152,PCTL153的慢病毒)(MOI=8)、 F108(Sigma,货号:07579-250G-F,10μg/ml)、Tscm(2U/ml)配置成转导体系置于包被的24孔板中,细胞密度调整至1.0E+06/ml,500g离心30min,离心后37℃ CO 2培养箱静置培养48h。转染后以含5%FBS X-vivo15培养液(LONZA,货号:04-418Q)培养,隔日补充Tscm(终浓度2U/ml),计数细胞,调整细胞密度至0.5E+06/ml,培养至第8-10天收获细胞。
[0078]
(2)效应细胞双靶点CAR-T细胞的制备:①取出扩增5-7天的NC-T细胞(未进行慢病毒转染的T细胞)、各组CAR-T细胞,于显微镜下观察细胞生长状态是否正常;②将NC-T细胞和各组CAR-T细胞收集于15mL或50mL的离心管中,计数细胞总数(Cellometer k2细胞计数仪);③用无菌PBS(Hyclone,货号:SH30256.01)洗涤收集的细胞1-2次,1500rpm,25℃,离心5分钟;④用T细胞培养液X-VIVO15(LONZA,货号:04-418Q)(不含自体血清以及IL-2)重悬洗涤后的细胞沉淀,并将细胞密度调整至5.0E+07cells/mL。
[0079]
(3)靶细胞准备:①取出靶细胞CD19 +K562-luc-GFP和CD20 +K562-luc-GFP(Tsukahara et al.Biochem Biophys Res Commun.2013;438(1):84-89),于显微镜下观察细胞状态是否正常;②将上述两种靶细胞分别收集于15mL或50mL离心管中,并计算细胞总数;③用无菌PBS洗涤收集的细胞1-2次,1500rpm,25℃,离心5分钟;④用RPMI1640(gibco,货号:11875-093)(不含FBS)重悬洗涤后的细胞沉淀,并将细胞密度调整至5.0E+06cells/mL。
[0080]
(4)体外杀伤:①杀伤体系的配制:于1.5mL的离心管中将上述调整好 密度的效应细胞NC-T细胞和各组CAR-T细胞分别与靶细胞CD19 +K562-luc-GFP,CD20 +K562-luc-GFP按不同效靶比,具体分别以1∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1的比例将效应细胞CAR-T与靶细胞进行混合,用T细胞培养液X-VIVO15(LONZA,货号:04-418Q)(不含自体血清以及IL-2)将总体积补足至200μL;②将上述配制的200μL杀伤体系分别移入96孔V型板中共孵育24小时;③24小时后,轻轻吹打混匀96孔板V型板中各孔细胞,并分别转移100μL细胞悬液入白壁底不透96孔板中,加入100μL ONE-Glo TM Luciferase Assay Substrate,室温避光孵育10分钟后上Luminoskan Ascent化学发光分析仪检测化学发光(Luminescence)。
[0081]
杀伤效率的计算:杀伤效率=(NC-T细胞对应的数值-特定的CAR19-CAR20-T细胞在对应效靶比的数值)/NC-T细胞对应的数值
[0082]
试验结果:根据表3所示结果可以看出,在效靶比为10∶1的情况下,包含七种双特异性嵌合抗原受体(即PCTL126、PCTL137、PCTL138、PCTL139、PCTL151、PCTL152和PCTL153)的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD19+K562-luc-GFP的杀伤效率均大于90%,其中包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD19 +K562-luc-GFP的杀伤效率接近100%(具体参见表3和图3)。另外,包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞在效靶比较低的情况下,对于所述靶细胞依然具有较高的杀伤效率。
[0083]
表3:双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20-T细胞对CD19 +K562-luc-GFP靶细胞的杀伤效率
[0084]
[表0001]
1∶1 2.5∶1 5∶1 10∶1 20∶1
PCTL137 -273.22% 40.27% 94.13% 96.58% 98.60%
PCTL138 -178.91% 75.38% 97.68% 98.31% 99.41%
PCTL139 -153.56% 41.80% 96.77% 97.60% 98.72%
PCTL126 -26.72% 87.59% 97.59% 98.95% 99.65%
PCTL151 -28.95% 83.53% 93.95% 96.44% 99.07%
PCTL152 40.19% 95.92% 99.12% 99.58% 99.85%
PCTL153 43.95% 96.83% 97.71% 99.40% 99.72%

[0085]
根据表4所示结果可以看出,在效靶比为20∶1的情况下,包含七种双特异性嵌合抗原受体(即PCTL126、PCTL137、PCTL138、PCTL139、PCTL151、PCTL152和PCTL153)的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD20 +K562-luc-GFP的杀伤效率均大于80%,其中包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞对于靶细胞CD20 +K562-luc-GFP的杀伤效率接近100%(具体参见表4和图4)。
[0086]
表4:双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20-T细胞对CD20 +K562-luc-GFP靶细胞的杀伤效率
[0087]
[表0002]
1∶1 2.5∶1 5∶1 10∶1 20∶1
PCTL137 -269.38% -201.37% -2.41% 72.28% 81.53%
PCTL138 -204.88% -49.82% 11.09% 71.10% 80.52%
PCTL139 -279.06% -160.74% 13.09% 81.29% 86.59%
PCTL126 -138.73% -33.19% 67.29% 71.61% 90.32%
PCTL151 -136.73% -12.02% 45.50% 70.90% 88.66%
PCTL152 -182.88% 15.71% 75.81% 92.37% 98.25%
PCTL153 -161.64% -32.69% 81.21% 89.58% 96.97%

[0088]
实施例3:由不同结构的双特异性嵌合抗原受体制备的CAR19-CAR20-T细胞显示的T细胞表型
[0089]
利用实施例1中所述并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20制备双靶点CAR-T细胞,并在慢病毒转染后的第7-10天,用常规的T细胞分化抗原抗体通过流式细胞仪分析细胞的分化群体。
[0090]
试验方法:选择实施例1制备的7种双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR20为试验材料,按照实施例2中所述的效应细胞的制备方法制备相应的双靶点CAR-T细胞。针对制备得到的7种双靶点CAR-T细胞,分别取1×10 6个CAR-T细胞,用PBS洗涤所述CAT-T细胞后孵育CD62L-PE-Cy5抗体(BD,货号:555545)和CD45RO-FITC抗体(BD,货号:555492),于4℃冰箱孵育30min。抗体孵育结束后用PBS(Hyclone,货号:SH30256.01)洗涤2-3遍,用500μl PBS重悬后置于流式管中准备上机检测。
[0091]
试验结果:如图5所示,结果显示所分析的双靶点CAR-T细胞均能保持较高比例的干细胞中央记忆型T细胞(TSCM)。有研究报道,干细胞中央记忆型T细胞群体的比例与CAR-T细胞在生物体内的杀瘤活性、扩增能力和持久免疫记忆能力紧密相关。由此提示,本发明提供的双靶点CAR-T细胞能够在生物内具有较好的杀瘤活性、扩增能力和持久的免疫记忆能力。
[0092]
实施例4:包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞表达CAR19和CAR20的检测
[0093]
试验方法:选择实施例2中具有较高杀伤效率的包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞作为试验材料,针对上述两种CAR-T细胞,分别取1×10 6个CAR-T细胞,用4%BSA洗涤(2500rpm,5min)3次后孵育抗体:(1)Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Human IgG(1∶100~1∶800),4℃冰箱孵育30min;抗体孵育结束后用4%BSA洗涤(2500rpm,5min),3次后孵育抗体:(2)PE标记的CAR19(iFMC63)idiotype(Qin et al.Mol Ther Oncolytics.2018;11:127~137)(1μg/ml),4℃冰箱孵育30min。抗体孵育结束后用4%BSA洗涤2-3遍(2500rpm,5min),用500μl PBS重悬后置于流式管中准备上机检测。
[0094]
试验结果:如图6所示,CAR19和CAR20蛋白在T细胞表面上均可同步检测到。所述结果表明,构建的包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞能够较好的表达CAR19 +CAR20 +双阳性群体。
[0095]
实施例5:包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞小鼠体内抑瘤活性验证
[0096]
试验方法:选择实施例2中具有较高杀伤效率的包含PCTL152和PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞作为试验组,选择PBS作为对照组。将PBS重悬的Raji-Luc细胞(百奥赛图,货号:B-HCL-010)以5×10 5个/0.2mL的浓度,0.2mL/只的体积通过尾静脉注射接种到 (B-NSG)小鼠。接种当天用小动物成像仪观察肿瘤接种是否成功,接种第3天用小动物成像仪测量肿瘤生长情况,当平均成像信号达1×10 6[(P/S)/(cm2/sr)]左右时,挑选肿瘤成像信号适中的8只小鼠入组,随机分配到3个组中,G1组2只,G3、G4组各3只,将荧光信号过强/过弱的小鼠淘汰。分组当天开始给药,给药后,第4天开始检测肿瘤生长情况(小动物成像仪检测、记录)及测量动物体重。之后每周1次小鼠成像仪检测(第4天、第11天、第18天和第25天)及每周2次测量动物体重。具体给药方案见图7,各组的给药种类、小鼠数量和给药剂量具体参见表5。
[0097]
表5:G1、G3和G4组的给药种类、小鼠数量和给药剂量
[0098]
[表0003]
组别 给药种类 小鼠数量 给药剂量
G1 PBS 2 PBS 200μl//只
G3 PCTL152 3 Total T 0.1E+07/200μl/只
G4 PCTL153 3 Total T 0.1E+07/200μl/只

[0099]
试验结果:截止至Day28,G1、G3组小鼠全部死亡,G4组小鼠生存率为67.7%。由此可见,与包含PCTL152的CAR19-CAR20-T细胞相比,包含PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞能明显提高荷瘤小鼠的生存率(参见图8)。
[0100]
实施例6:包含PCTL153的CAR19-CAR20-T细胞、单CAR19-T细胞、单CAR20-T细胞以及串联形式的CAR20-19-T细胞小鼠体内抑瘤活性验证
[0101]
试验方法:将PBS重悬的Raji-Luc细胞以5×10 5个/0.2mL的浓度,0.2mL/只的体积通过尾静脉注射接种到 (B-NSG)小鼠,共转接54只小鼠。接种当天用小动物成像仪观察肿瘤接种是否成功,接种成功后用小动物成像仪测量肿瘤生长情况,当平均成像信号达1×10 6[(P/S)/(cm2/sr)]左右时,挑选肿瘤成像信号适中的30只小鼠入组,随机分配到5个组中,每组6只,荷瘤小鼠活体成像信号过强/过弱淘汰。分组当天开始给药,给药后,对实验动物体重及肿瘤生长情况(小动物成像仪检测、记录)继续观察。在分组后第4天、第7天和第11天测量肿瘤生长情况,之后每周测量1次肿瘤生长情况(小动物成像仪检测、记录)。每周测量2次动物体重,进行临床观察,并记录测量值。具体给药方案见图9,各组的给药种类、小鼠数量和给药剂量具体参见表6。
[0102]
试验结果:与传统的单CAR19-T细胞(G3组,其中包含的CAR19的结构和序列与本发明实施例1中所述CAR19的结构和序列相同:FMC63-CD8hinge-CD8 TM-4-1BB-CD3z)、单CAR20-T细胞(G4组,其中包含的CAR20的结构和序列与本发明实施例1中所述PCTL153中的CAR20的结构和序列一 致:Leu16-IgG4mt10+N297A hinge-ICOS TM-ICOSCSD-CD3z)以及串联形式的CAR20-19-T细胞(G7组,CD20 scFv-(EAAAK)3-CD19 scFv-IgG4 hinge-CD28 TM-4-1BB-CD3z,具体参见Zah et al.Cancer Immunol Res.2016;4(6):498-508)相比,包含PCTL153的并联双CAR19-CAR20-T细胞(G5组)能明显提高荷瘤小鼠的生存率(参见图10)。
[0103]
表6:G1、G3、G4、G5和G7组的给药种类、小鼠数量和给药剂量
[0104]
[0105]
实施例7:由不同结构的双特异性嵌合抗原受体制备的CAR19-CAR22-T细胞对靶细胞杀伤作用的比较
[0106]
利用实施例1中所述的并联形式的双特异性嵌合抗原受体CAR19-CAR22制备双靶点CAR-T细胞,然后将所述双靶点CAR-T细胞与CD19 +K562-luc-GFP、CD22 +K562-luc-GFP两种不同的靶细胞按不同效应细胞(E):靶细胞(T)比例,即分别以E/T=5∶1、10∶1或20∶1的比例共孵育18~24小时,用未进行基因修饰的T细胞(即未进行慢病毒感染的T细胞,下文称为NC-T细胞)作为本底对照,构建的靶细胞株上带有荧光素酶luciferase,通过化学发光的原理检测效应细胞对靶细胞的杀伤效果。具体操作如下:
[0107]
(1)外周血PBMC的分离、T细胞分离活化、慢病毒转导、体外培养:
[0108]
选择HBV、HCV和HIV检测阴性的健康供者,肘正中静脉抽血100ml,Ficoll密度梯度离心分离PBMC白膜层,根据全血流式检测CD3 +T细胞百分比, 计算CD3 +T细胞数,按DynaBeads CD3/CD28与CD3 +T细胞比例3∶1,吸取使用量磁珠,与白膜层细胞孵育30min,分离CD3 +T细胞,CD3 +T细胞经Dynabeads CD3/CD28(Lifetechnologies,货号:40203D)活化24小时后流式检测CD25 +CD69 +T细胞比例(CD25 +CD69 +T细胞比例:71%)。CD3 +T活化后,进行慢病毒转导。用Novonectin包被24孔板37℃孵育2小时,将上述操作后得到的细胞悬液分别与制备得到的各种慢病毒(即分别包含PCTL81,PCTL103,PCTL105,PCTL124,PCTL148,PCTL149,PCTL150的慢病毒)(MOI=8)、 F108(Sigma,货号:07579-250G-F,10μg/ml)、Tscm(2U/ml)配置成转导体系置于包被的24孔板中,细胞密度调整至1.0E+06/ml,500g离心30min,离心后37℃ CO 2培养箱静置培养48h。转染后以含5%FBS X-vivo15培养液(LONZA,货号:04-418Q)培养,隔日补充Tscm(终浓度2U/ml),计数细胞,调整细胞密度至0.5E+06/ml,培养至第8-10天收获细胞。
[0109]
(2)效应细胞双靶点CAR-T细胞的制备:①取出扩增5-7天的NC-T细胞(未进行慢病毒转染的T细胞)、各组CAR-T细胞,于显微镜下观察细胞生长状态是否正常;②将NC-T细胞和各组CAR-T细胞收集于15mL或50mL的离心管中,计数细胞总数(Cellometer k2细胞计数仪);③用无菌PBS(Hyclone,货号:SH30256.01)洗涤收集的细胞1-2次,1500rpm,25℃,离心5分钟;④用T细胞培养液X-VIVO15(LONZA,货号:04-418Q)(不含自体血清以及IL-2)重悬洗涤后的细胞沉淀,并将细胞密度调整至5.0E+07cells/mL。
[0110]
(3)靶细胞准备:①取出靶细胞CD19 +K562-luc-GFP和CD22 +K562-luc-GFP(Tsukahara et al.Biochem Biophys Res Commun.2013;438(1):84~89),于显微镜下观察细胞状态是否正常;②将上述两种靶细胞分别收集于15mL或50mL离心管中,并计算细胞总数;③用无菌PBS洗涤收集的细胞1-2次,1500rpm,25℃,离心5分钟;④用RPMI1640(gibco,货号:11875-093)(不含FBS)重悬洗涤后的细胞沉淀,并将细胞密度调整至5.0E+06cells/mL。
[0111]
(4)体外杀伤:①杀伤体系的配制:于1.5mL的离心管中将上述调整好密度的效应细胞NC-T细胞和各组CAR-T细胞分别与靶细胞CD19 +K562-luc-GFP,CD22 +K562-luc-GFP按不同效靶比,具体分别以5∶1、10∶1、20∶1的比例将效应细胞CAR-T与靶细胞进行混合,用T细胞培养液X-VIVO15(LONZA,货号:04-418Q)(不含自体血清以及IL-2)将总体积补足至200μL;②将上述配制的200μL杀伤体系分别移入96孔V型板中共孵育24小时;③24小时后,轻轻吹打混匀96孔板V型板中各孔细胞,并分别转移100μL细胞悬液入白壁底不透96孔板中,加入100μL ONE-Glo TM Luciferase Assay Substrate,室温避光孵育10分钟后上Luminoskan Ascent化学发光分析仪检测化学发光(Luminescence)。
[0112]
杀伤效率的计算:杀伤效率=(NC-T细胞对应的数值-特定的CAR19-CAR20-T细胞在对应效靶比的数值)/NC-T细胞对应的数值
[0113]
试验结果:根据图11所示结果可以看出,在效靶比为10∶1的情况下,包含七种双特异性嵌合抗原受体(即PCTL81,PCTL103,PCTL105,PCTL124,PCTL148,PCTL149,PCTL150)的CAR19-CAR22-T细胞对于靶细胞CD19 +K562-luc-GFP的杀伤效率均大于90%(具体参见图11)。根据图12所示结果可以看出,七种双特异性嵌合抗原受体(即PCTL81,PCTL103,PCTL105,PCTL124,PCTL148,PCTL149,PCTL150)的CAR19-CAR22-T细胞对于靶细胞CD22 +K562-luc-GFP均具有杀伤效果,且具有明显的效靶比的依赖性(具体参见图12)。

权利要求书

[权利要求 1]
一种嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体由抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区、共刺激域和CD3z信号结构域组成。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的嵌合抗原受体,其特征在于: 所述胞外铰链区选自由CD8胞外铰链区(CD8hinge)、CD28胞外铰链区(CD28hinge)、ICOS胞外铰链区(ICOShinge)或IgG4mt10+N297A胞外铰链区(IgG4mt10+N297Ahinge)组成的组中的任一种; 所述跨膜区选自由CD8跨膜区(CD8TM)、CD28跨膜区(CD28TM)或ICOS跨膜区(ICOSTM)组成的组中的任一种; 所述共刺激域选自由4-1BB共刺激域(4-1BBCSD)、CD28共刺激域(CD28CSD)、ICOS共刺激域(ICOSCSD)或OX40共刺激域(OX40CSD)组成的组中的任一种。
[权利要求 3]
根据权利要求2所述的嵌合抗原受体,其特征在于,其中包含胞外铰链区、跨膜区和共刺激域的结构分别为:CD8hinge-CD8TM-4-1BBCSD、CD28hinge-CD28TM-CD28CSD、ICOShinge-ICOSTM-ICOSCSD、CD28hinge-CD28TM-OX40CSD、IgG4mt10+N297Ahinge-CD8TM-4-1BBCSD、IgG4mt10+N297Ahinge-CD28 TM-CD28CSD或IgG4mt10+N297Ahinge-ICOSTM-ICOSCSD。
[权利要求 4]
根据权利要求3所述的嵌合抗原受体,其特征在于, 所述IgG4mt10+N297Ahinge-CD8TM-4-1BBCSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:36; 所述IgG4mt10+N297Ahinge-CD28TM-CD28CSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:37; 所述IgG4mt10+N297Ahinge-ICOSTM-ICOSCSD的氨基酸序列为SEQ ID NO:38。
[权利要求 5]
根据权利要求2所述的嵌合抗原受体,其特征在于,所述抗原结合区为单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
[权利要求 6]
根据权利要求5所述的嵌合抗原受体,所述抗原结合区识别CD20或者 识别CD22。
[权利要求 7]
根据权利要求6所述的嵌合抗原受体,所述抗原结合区为Leu16,其中所述Leu16为识别CD20的人源化scFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[权利要求 8]
根据权利要求6所述的嵌合抗原受体,所述抗原结合区为M971,其中所述M971为识别CD22的scFv,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[权利要求 9]
一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞),其特征在于,所述CAR-T细胞表达如权利要求1~8中任一项所述的嵌合抗原受体。
[权利要求 10]
根据权利要求9所述的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞),其特征在于,所述CAR-T细胞表达两个含有不同抗原结合区的嵌合抗原受体。
[权利要求 11]
根据权利要求10所述的CAR-T细胞,其中所述的两个独立的嵌合抗原受体分别为CAR19和CAR20;其中所述CAR19识别CD19,所述CAR20识别CD20。
[权利要求 12]
根据权利要求10所述的CAR-T细胞,其中所述的两个独立的嵌合抗原受体分别为CAR19和CAR22;其中所述CAR19识别CD19,所述CAR22识别CD22。
[权利要求 13]
一种核酸分子,其特征在于,所述核酸分子编码如权利要求1~8中任一项所述的嵌合抗原受体。
[权利要求 14]
一种载体,其特征在于,所述载体含有如权利要求13所述的核酸分子。
[权利要求 15]
一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有如权利要求14中所述的载体或者在所述宿主细胞的染色体中整合有如权利要求13所述的核酸分子。
[权利要求 16]
一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中含有药学上可接受的载体以及如权利要求1~8任一项所述的嵌合抗原受体。
[权利要求 17]
如权利要求1~8任一项中所述的嵌合抗原受体、如权利要求13所述的核酸分子、如权利要求14所述的载体或如权利要求15所述的宿主细胞在制备治疗抗肿瘤的药物或抗肿瘤的制剂中的应用。
[权利要求 18]
根据权利要求17所述的应用,所述肿瘤为血液肿瘤,优选的所述血液肿瘤为B细胞恶性肿瘤、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、淋巴瘤、肥大细胞瘤或滤泡性淋巴瘤。
[权利要求 19]
一种制备CAR-T细胞的方法,其特征在于,所述CAR-T细胞表达如权利要求1~8中任一项的嵌合抗原受体,所述方法包括以下步骤: 将权利要求13所述的核酸分子或者权利要求14所述的载体导入T细胞内,从而获得所述CAR-T细胞。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]  
[ 图 9]  
[ 图 10]  
[ 图 11]  
[ 图 12]