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1. MX2012005262 - METODO PARA TRATAR LA INSUFICIENCIA CARDIACA CON PETIDOS TIPO ESTRESCOPINA.

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[ ES ]

MÉTODO PARA TRATAR LA INSUFICIENCIA CARDÍACA CON PÉPTIDOS

TIPO ESTRESCOPINA

REFERENCIA CRUZADA

La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. número de serie 61/258,181 , presentada el 4 de noviembre de 2009 y la solicitud de patente nacional de E.U.A. número 12/612,548, presentada el 4 de noviembre de 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con métodos para tratar la insuficiencia cardiaca en un sujeto mediante la administración de una cantidad efectiva de un polipéptido tipo estrescopina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La insuficiencia cardíaca es una afección cardiovascular común y ha alcanzado proporciones epidémicas en los Estados Unidos y Europa (Remme y otros, Eur. Heart J., 2001 , vol. 22, págs. 1527-1560). El número de ingresos hospitalarios por insuficiencia cardiaca aguda se acerca a 1 millón cada año sólo en los Estados Unidos. Actualmente, las tasas de reingreso y la mortalidad alcanzan de 30 % a 40 % en el transcurso de 60 días después de la alta (Cuffee y otros, JAMA, 2002, vol. 287(12), págs. 1541-7). En la insuficiencia cardiaca aguda es común el empeoramiento de la función hemodinámica, particularmente, con muy alta presión diastólica final del ventrículo izquierdo.

El tratamiento actual para la insuficiencia cardíaca aguda es multifactorial y, frecuentemente, difiere entre los pacientes. Si bien los diuréticos, vasodilatadores e inótropos positivos son el pilar en el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca aguda, estos tratamientos están asociados con las altas tasas de reingreso y mortalidad.

Por otra parte, las terapias inotrópicas existentes (por ejemplo, dobutamina) mejoran el gasto cardíaco, pero con un aumento del ritmo cardiaco y aumento del consumo miocárdico de oxígeno. Además, estos agentes inotrópicos llevan consigo un potencial proarrítmico en pacientes con insuficiencia cardíaca. Se cree que este riesgo cardiaco está asociado con el gasto de energía y la cantidad de calcio asociado con las acciones inotrópicas positivas directas de estos agentes.

En un esfuerzo por satisfacer esta necesidad médica creciente no satisfecha, muchos enfoques nuevos se estudiaron con un éxito limitado para mejorar el estado hemodinámico en forma segura y la evolución de los pacientes con este síndrome. Uno de estos agentes, el péptido urocortína humana 2 (h-UCN2), se estudió en sujetos sanos y en pacientes con insuficiencia cardíaca. Se demostró que este péptido incrementa la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI) y el gasto cardíaco (GC) en un modelo de insuficiencia cardíaca en ovejas (Rademaker y otros, Circulation, 2005, vol. 1 12, págs. 3624-3632). En estudios posteriores de infusión intravenosa en 8 sujetos sanos (Davis y otros, J. Am. Coll. Cardiol., 2007, vol. 49, págs. 461-471 ) y en 8 sujetos con insuficiencia cardiaca (Davis y otros, Eur. Heart J., 2007, vol. 28, págs. 2589-2597), los incrementos en la FEVI y en el GC estuvieron acompañados por un incremento en la frecuencia cardíaca y la disminución de la presión sanguínea con ambas dosis examinadas en cada uno de los dos estudios. Aparentemente, las infusiones intravenosas de una hora de h-UCN2 en sujetos sanos y pacientes se toleraron bien.

La estrescopina humana (h-SCP), un péptido de 40 aminoácidos, se relaciona con la h-UCN2 y ambos son miembros de la familia de péptidos de la hormona de liberación de corticotropina (CRH). Las acciones biológicas de la familia de péptidos de CRH son producidas por dos receptores acoplados a proteínas G con 7 dominios transmembrana, el receptor de CRH de tipo 1 (CRHR1 ) y el receptor de CRH de tipo 2 (CRHR2). A pesar de que estos receptores contienen alta homología de secuencias, los distintos miembros de la familia de péptidos de CRH expresan diferencias significativas en su afinidad de unión relativa, el grado de activación del receptor y la selectividad de estos dos receptores.

La urocortina humana 2 (h-UCN2) se evaluó en estudios previos de infusión intravenosa (Davis y otros, J. Am. Coll. Cardiol., 2007, vol. 49, págs. 461-471 ; Davis y otros, Eur. Heart J., 2007, vol. 28, págs. 2589-2597) en sujetos sanos y con insuficiencia cardíaca y provocó incrementos en la FEVI y el GC en los sujetos que estuvieron acompañados por un incremento significativo en la frecuencia cardíaca y una disminución en la presión sanguínea. Los índices de dosificación para los sujetos sanos fueron 5.16 ng/kg/min y 20.8 ng/kg/min, mientras que la h-UCN2 se infundió a un índice de 4.29 ng/kg/min y 17.2 ng/kg/min en los sujetos con insuficiencia cardiaca.

A diferencia de muchos de los miembros de la familia de la CRH, la h-SCP expresa una mayor selectividad para el CRHR2 y actúa como un mediador que ayuda en el proceso de atenuación de la iniciación y mantenimiento del estrés fisiológico (Bale y otros, Nat. Genet., 2000, vol. 24, págs. 410-414; Kishimoto y otros, Nat. Genet. , 2000, vol. 24, págs. 415-419). Además de su función aparente en el estrés fisiológico, se reportó que la h-SCP produce una serie de otras acciones fisiológicas. Tiene efectos sobre el sistema endocrino (Li y otros, Endocrínology, 2003, vol. 144, págs. 3216-3224), nervioso central, cardiovascular (Bale y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., 2004, vol. 101 , págs. 3697-3702; Tang y otros, Eur. Heart J., 2007, vol. 28, págs. 2561-2562), pulmonar, gastrointestinal, renal, músculo esquelético e inflamatorio (Moffatt y otros, FASEB J. , 2006, vol. 20, págs. 1877-1879).

Adicionalmente, la actividad del CRHR2 se ha implicado en la enfermedad debilitante del músculo esquelético, tal como sarcopenia (Hinkie y otros, Endocrínology, 2003, vol. 144(11 ), págs. 4939-4946), actividad motora de ingesta de alimentos (Ohata y otros, Peptides, 2004, vol. 25, págs. 1703-1709), tiene una función cardioprotectora (Brar y otros, Endocrínology, 2004, vol. 145(1), págs. 24-35) y expresa actividad broncorrelajante y antiinflamatoria (Moffatt y otros, FASEB J., 2006, vol. 20, págs. E1181 -E 1 187).

La pegilación es un proceso que consiste en unir a las moléculas uno o más polímeros de polietilenglicol (PEG). Frecuentemente, el proceso de pegilación se aplica a los anticuerpos, péptidos y proteínas para mejorar sus propiedades biofarmacéuticas y superar la susceptibilidad de un compuesto a las enzimas proteolíticas, la vida media corta en circulación, la utilidad corta en vivo, la baja solubilidad, el aclaramiento renal rápido y el potencial para generar anticuerpos contra el fármaco administrado (Harris y otros, Nature, 2003, vol. 2, págs. 214-221 ; Hamidi y otros, suministro del fármaco, 2006, 3, págs. 399-409; Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1 (8), págs. 352-356). Recientemente, la FDA aprobó los polímeros PEG para su uso como un vehículo o una base en alimentos, cosméticos y productos farmacéuticos. Generalmente, los polímeros PEG son relativamente no ¡nmunogénicos, tienen poca toxicidad, y se eliminan intactos por los ríñones o en las heces. Estas características pueden dar lugar a una serie de beneficios clínicos del compuesto si este proceso se desarrolla para preservar o mejorar la afinidad, la eficacia y el perfil farmacológico de la molécula original.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a las modalidades generales y preferidas que se definen, respectivamente, en las reivindicaciones

independientes y dependientes que se anexan, las cuales se incorporan como referencia en la presente descripción. Las características preferidas e ilustrativas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación con referencia a los dibujos de las figuras.

En sus muchas modalidades la presente invención se relaciona con un método nuevo para tratar a un paciente con insuficiencia cardíaca. Se proporciona un método para el tratamiento, la prevención, la inhibición o la mejora de una o más enfermedades asociadas con el CRHR2 y relacionadas con la insuficiencia cardíaca con el uso de péptidos tipo estrescopina.

El método para tratar la insuficiencia cardíaca comprende administrar una cantidad de péptido tipo estrescopina a un sujeto que lo necesite y, prácticamente, mantener la cantidad del péptido presente en el plasma de tal sujeto a concentraciones que producen un beneficio terapéutico sin un incremento sustancial en la frecuencia cardíaca de tal sujeto.

En una modalidad del método de tratamiento la concentración en plasma del péptido tipo estrescopina en el sujeto se mantiene prácticamente a concentraciones que producen un incremento en el rendimiento cardíaco sin un incremento significativo en la frecuencia cardíaca o una disminución significativa en la presión sanguínea del sujeto.

En una modalidad, después de la administración el perfil de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina del péptido tipo estrescopina se caracteriza por la concentración en plasma que se mantiene prácticamente menor que aproximadamente 7.2 ng/ml, preferentemente,

menor que aproximadamente 5.5 ng/ml, con mayor preferencia, menor que aproximadamente 4.7 ng/ml. La concentración relativa a la estrescopina de un péptido es la concentración que es el peso y la actividad del CRHR2 equivalentes a una cantidad de concentración del péptido tipo estrescopina de la siguiente secuencia (SEQ ID NO:1 ):

TKFTL SLDVP TNIMN LLFNI AKAKN LRAQA AANAH LMAQI-NH2.

Preferentemente, el péptido tipo estrescopina se administra para obtener un perfil objetivo de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina del péptido que se caracteriza por la concentración en plasma que se mantiene prácticamente entre aproximadamente 0.1 ng/ml y aproximadamente 7.2 ng/ml. Con mayor preferencia, la administración de péptido tipo estrescopina produce un perfil de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina con una concentración en plasma entre aproximadamente 0.1 ng/ml y aproximadamente 5.5 ng/ml.

Una ventaja en administrar péptidos tipo estrescopina a un sujeto que produce un perfil de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina con una concentración en plasma que se mantiene prácticamente menor que aproximadamente 7.2 ng/ml consiste en que el tratamiento produce un incremento en el rendimiento cardíaco sin un incremento significativo en la frecuencia cardíaca o una disminución significativa en la presión sanguínea del sujeto.

La administración para tratar la insuficiencia cardíaca se realiza, preferentemente, por medio de una de las vías parenterales que incluyen la administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. Estas vías de administración son favorables debido a que dan margen a un mejor control a incrementos con la dosis administrada de péptido tipo estrescopina para mantener prácticamente una concentración en plasma menor que aproximadamente 7.2 ng/ml en el perfil de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina.

En modalidades particulares de la presente invención un péptido tipo estrescopina comprende un péptido de la SEQ ID NO: 1 (h-SCP). En otras modalidades comprende una h-SCP modificada, en donde la h-SCP se ha alterado por unión covalente de un grupo reactivo, por la sustitución, deleción o adición conservadora de aminoácidos, por pegilación o una combinación de todas estas modificaciones.

En otras modalidades adicionales el péptido tipo estrescopina comprende un isómero óptico, enantiómero, diastereómero, tautómero, isómero cis-trans, racemato, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable de h-SCP o sus modificaciones.

En otra modalidad el grupo reactivo comprende, además, un conector. Preferentemente, únicamente un conector se une a un solo residuo en la secuencia de aminoácidos del péptido. Con mayor preferencia, el conector es acetamida o N-etilsuccinimida.

En otra modalidad adicional el péptido tipo estrescopina comprende una o más porciones de PEG con un peso molecular menor que 80 kDa. Preferentemente, la porción de PEG se une covalentemente al péptido. Con mayor preferencia, la porción o porciones de PEG se unen al péptido a través de un conector. Aún con mayor preferencia, la porción de PEG tiene un peso molecular ya sea de aproximadamente 2 kDa, aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 12 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa o aproximadamente 40 kDa.

Un conector permite fijar con mayor facilidad y de forma más selectiva la porción de PEG al péptido con respecto a la posición en la secuencia de aminoácidos, mientras que la pegilación del péptido prolonga la vida media del péptido pegilado, lo que prolonga la duración del beneficio terapéutico a un paciente. Por lo tanto, la modificación a la secuencia de aminoácidos del péptido tipo estrescopina se hace, preferentemente, de manera que haya únicamente un aminoácido de tipo X en la secuencia. Esto asegurará que la pegilación del péptido se dirija únicamente a una sola posición en la secuencia.

Los beneficios de un péptido tipo estrescopina pegilado incluyen una vida media prolongada del péptido pegilado que garantiza que la concentración en plasma del perfil de concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina se mantiene prácticamente menor que aproximadamente 7.2 ng/ml y se mantiene por un tiempo más prolongado en el intervalo objetivo para la concentración en plasma sanguíneo relativa a la estrescopina en comparación con el péptido tipo estrescopina no pegilado y así prolonga la duración del beneficio terapéutico para el paciente.

Otra modalidad de la presente invención presenta la administración de una composición farmacéutica que comprende por lo menos un compuesto de la presente invención.

Las modalidades adicionales y las ventajas de la invención serán evidentes de la discusión detallada, esquemas, ejemplos, y reivindicaciones a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 ilustra el perfil de plasma sanguíneo y la ventana terapéutica para administrar un péptido tipo estrescopina para tratar pacientes con insuficiencia cardíaca.

Las Figuras 2A, 2B y 2C ilustran la ventana terapéutica y el perfil de plasma sanguíneo con distintas vías de administración de péptidos tipo estrescopina.

Las Figuras 3A y 3B muestran el seguimiento analítico por

HPLC de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 102 derivatizado con yodoacetamida-PEG después de 2 horas de tiempo de reacción y después de la purificación, respectivamente.

La Figura 3C muestra el gráfico de espectroscopia de masas de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 102 derivatizado con yodoacetamida-PEG.

La Figura 4 muestra la potencia del agonista y la selectividad de los péptidos tipo estrescopina contra el CRHR1 y el CRHR2 humanos, respectivamente.

La Figura 5 muestra los efectos del antagonismo competitivo entre un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 1 y anti-sauvagina-30 (SEQ ID NO:1 18).

La Figura 6 muestra las curvas de concentración-efecto del agonista de varios péptidos tipo estrescopina obtenidos mediante la medición de la estimulación de cAMP en células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR2.

La Figura 7 muestra las curvas de concentración-efecto del agonista de la h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) que se determinó a través de la estimulación de cAMP en células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR2 sin y con 10 μΜ de péptidos tipo estrescopina con la secuencia, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:1 11 y SEQ ID NO:1 12, respectivamente.

La Figura 8 muestra la relajación de la aorta de rata aislada y precontraída por péptidos tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO: 115 (h-UCN2).

La Figura 9 ilustra la frecuencia cardíaca, la presión desarrollada del ventrículo izquierdo, y los cambios en la presión de perfusión coronaria en corazones de conejo perfundidos según la técnica de Langendorff, en presencia de péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1 y vehículo control tipo placebo.

La Figura 10 ilustra los efectos del péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1 administrado por inyección intravenosa en bolo en la frecuencia cardíaca, la presión arterial media (PAM) y la contractilidad del ventrículo izquierdo (+dP/dt) en ratas anestesiadas.

Las Figuras 1 1A y 1 1 B muestran el rendimiento cardíaco de perros sanos con la infusión intravenosa a distintos índices de infusión de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1.

Las Figuras 12A y 12B muestran el rendimiento cardíaco de perros con insuficiencia cardíaca inducida con infusión intravenosa a distintos índices de infusión de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1.

La Figura 12C muestra el rendimiento cardíaco para perros con IC en el caso de una sola inyección subcutánea en bolo de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 102.

Las Figuras 13A y 13B ilustran la farmacocinética de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 102 en perros después de la inyección intravenosa o subcutánea en bolo de distintas dosis.

La Figura 13C ilustra la farmacocinética de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1 en perros después de la dosificación intravenosa con 3 horas a varios índices de infusión.

Las Figuras 14A y 14B muestran los lazos representativos de presión-volumen del VI en perros con insuficiencia cardíaca (figura 14A) y sin insuficiencia cardíaca (figura 14B) después de una infusión de 2 horas de péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 1 .

La Figura 15A ilustra la farmacocinética de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO 1 en ratas por medio de inyección intravenosa o subcutánea en bolo.

Las Figuras 15B a la 15E ilustran la farmacocinética de péptidos tipo estrescopina pegilados (SEQ ID NOS:102, 103, 104, 105 y 106) en ratas después de la inyección intravenosa o subcutánea en bolo de distintas dosis.

Las Figuras 16A a la 16C muestran la media de la concentración en plasma de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO: 1 después de infusiones intravenosas de 7.5 horas en (figura 16A) sujetos sanos, (figura 16B) en sujetos con insuficiencia cardíaca y (figura 16C) después de una infusión de 54 ng/kg/min en sujetos sanos.

La Figura 17 muestra la frecuencia cardíaca de sujetos sanos con placebo con el tiempo durante un estudio con una infusión intravenosa de 7.5 horas de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1.

Las Figuras 18A a la 18C muestran el cambio (figura 18A) en la frecuencia cardíaca, (figura 18B) en el índice cardíaco y (figura 18C) en el volumen sistólico para sujetos sanos en comparación con sujetos con insuficiencia cardíaca durante una infusión intravenosa de 7.5 horas de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1.

La Figura 19 muestra el cambio en la frecuencia cardíaca después de la infusión de un péptido tipo estrescopina con la SEQ ID NO:1 para perros sanos, sujetos sanos y sujetos con insuficiencia cardíaca.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con péptidos nuevos que son agonistas selectivos del CHRH2 y composiciones de éstos para el tratamiento, mejora o inhibición de enfermedades cardiovasculares que incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia cardíaca. En una modalidad los nuevos y selectivos péptidos agonistas del CRHR2 incluyen péptidos tipo estrescopina y modificaciones de éstos.

Otra modalidad de la presente invención se refiere a la administración de péptidos tipo estrescopina a un paciente que requiere el tratamiento para la insuficiencia cardíaca dirigido a un rango específico de concentraciones terapéuticas en plasma sanguíneo de los péptidos administrados (Figura 1 ). La administración de péptidos tipo estrescopina en este rango mejora el rendimiento cardíaco en el paciente sin afectar negativamente el corazón. Los efectos negativos pueden incluir, entre otros, cualquiera de los siguientes: frecuencia cardíaca incrementada, presión sanguínea incrementada o reducida, consumo incrementado de oxígeno por el miocardio, arritmia ventricular de novo y otras respuestas cronotrópicas o inotrópícas que estresan significativamente el corazón deficiente.

Otra modalidad adicional de la invención está dirigida a péptidos tipo estrescopina y métodos para administrarlos que producen intervalos de tiempo prolongados durante los cuales la concentración en plasma sanguíneo se mantiene dentro del intervalo con beneficios terapéuticos (Figuras 2A-2C) y, preferentemente, produce una curva plasmática prácticamente plana.

En una modalidad de la invención un método para tratar o mejorar la insuficiencia cardiaca en un sujeto que lo requiere comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de por lo menos un péptido tipo estrescopina de manera que la concentración en plasma sanguíneo del péptido se mantiene prácticamente menor que 7.2 ng/ml.

En modalidades específicas el péptido tipo estrescopina se selecciona de un grupo que consiste en estrescopina humana (h-SCP) y modificaciones de esta. El péptido tipo estrescopina, o modificaciones de este, es, preferentemente, un péptido mamífero, específicamente, un péptido de ratón, rata, conejillo de indias, conejo, perro, gato, caballo, vaca, cerdo o primate, o un derivado de éstos. Preferentemente, el péptido es un péptido humano o derivado de este.

La modificación de un péptido tipo estrescopina, como se usa en la presente invención, comprende un cambio en la secuencia de aminoácidos del compuesto en por lo menos una posición en la secuencia de aminoácidos; la modificación incluye inserciones, deleciones y sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, un péptido tipo estrescopina modificado se une al receptor de CRH de tipo 2 de manera similar que el

péptido no modificado y, por lo tanto, presenta por lo menos cierta actividad fisiológica. Los ejemplos de péptidos tipo estrescopina y modificaciones de éstos se describen en más detalle en la sección a continuación.

Otra modalidad de la invención comprende un grupo reactivo unido covalentemente a un péptido tipo estrescopina. El grupo reactivo es elegido por su capacidad para formar un enlace covalente estable con un polímero o fracción, otra fracción química que extiende la vida media en circulación del péptido en el sujeto. En una modalidad tal polímero comprende un polímero de polietilenglicol (PEG) que prolonga la duración del péptido en la circulación del sujeto antes de su eliminación. En esta forma el grupo reactivo actúa como enlace entre el péptido mediante la reacción de una parte con uno o más aminoácidos del péptido y por la otra con el polímero. En una modalidad alternativa el grupo reactivo está inicialmente unido al PEG antes de formar un enlace químico con el péptido. En una modalidad preferida de los péptidos modificados, el grupo conector es una succinimida, más particularmente, la N-etilsuccinímida, o una acetamida. Por otra parte, el conector puede ser sulfona de vinilo u ortopiridil disulfuro. Preferentemente, las modificaciones químicas se realizan en péptidos aislados, por ejemplo, para aumentar la eficiencia de la reacción.

Los conectores útiles para unir el polipéptido y la porción de PEG impartirían inmunogenicidad y toxicidad mínimas al huésped. Los ejemplos de tales conectores se pueden encontrar en Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1(8), págs. 352-356 o en Roberts y otros, 2002, Adv. Dnig Del. Rev., vol. 54, págs. 459-476. Los ejemplos de fracciones químicas adecuadas, particularmente PEG y los polímeros equivalentes, se describen en Greenwald y otros, Adv. Drug Del. Rev., vol. 55, págs. 217-250. Por ejemplo, el copolímero de estireno anhídrido maleico-neocarzinostatina, el copolímero hidroxilo metacrilamida propilo, el dextrano, el ácido poliglutámico, el hidroxiletil almidón y el ácido poliaspártico son otros sistemas poliméricos que se pueden emplear para llevar a cabo el suministro y con características farmacocinéticas similares a un sistema de PEG.

En ciertas modalidades de la invención el péptido tipo estrescopina contiene un extremo C-terminal amidatado. Tales procedimientos de modificación se pueden realizar en un polipéptido aislado purificado o, como en el caso de la síntesis en fase sólida, se pueden realizar durante el procedimiento de síntesis. Tales procedimientos se revisan en Ray y otros, Nature Biotech., 1993, vol. 11 , págs. 64-70; Cottingham y otros, Nature Biotech., 2001 , vol. 19, págs. 974-977; Walsh y otros, Nature Biotech., vol. 24, págs. 1241-1252 y en la publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2008/0167231.

En una modalidad particular de la invención el compuesto comprende un péptido tipo estrescopina de una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO:82 o en la SEQ ID NO:102 que contiene un CONH2 en su término carboxi y un conector unido al residuo de cisteina en la posición 28 de la secuencia de aminoácidos, en donde el conector es N-etilsuccinimida o acetamida, y el conector unido a un polímero PEG de aproximadamente 20 kDa.

Una modalidad de la presente invención presenta compuestos de dosificación que comprenden péptidos tipo estrescopina como un método para administrar tal péptido tipo estrescopina para tratar pacientes con insuficiencia cardíaca.

Además, una modalidad de la presente invención muestra un método para tratar a un sujeto que padece o que fue diagnosticado con una enfermedad, trastorno o afección mediada por la actividad del CHRH2, el método comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de por lo menos un péptido tipo estrescopina.

Otra modalidad de la presente invención presenta un método para tratar o inhibir la progresión de una o más afecciones, enfermedades o trastornos mediados por CHRH2; el método comprende administrar al paciente que requiere el tratamiento una cantidad con eficacia farmacéutica de por lo menos un péptido tipo estrescopina.

A) Términos

La presente invención se entiende mejor con referencia a las siguientes definiciones, las figuras y la descripción ilustrativa proporcionada en la presente descripción.

Las siguientes abreviaturas se usan algunas veces en la presente especificación: pA50 o pEC5o = logaritmo negativo de base 10 de la concentración del agonista requerida para producir medio efecto máximo; EEM = error estándar de la media; Log Vi = logaritmo de base 10 del índice de infusión del agonista; MW = peso molecular; cAMP = adenosina 3', 5'-monofosfato cíclico; ADNc = ADN complementario; kb = kilobase (1000 pares de bases); kDa = kilodalton; ATP = adenosina 5'-trifosfato; nt = nucleótido; pb = par de bases; PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; PCR = reacción en cadena de la polimerasa, nm = nanomolar.

Los términos "comprende", "contiene" e "incluye" se usan en la presente en su sentido abierto, no limitante.

"Administrar" o "administración" significa el abastecimiento de un medicamento a un paciente de una manera que es farmacológicamente útil.

El "área bajo la curva" o "ABC" es el área según lo determina una curva de la concentración en plasma del fármaco. Frecuentemente, el ABC se especifica en términos del intervalo de tiempo por el cual se integra la curva de la concentración en plasma del fármaco, por ejemplo, inicio-final de la ABC. Por lo tanto, 0-48 h de la ABC se refiere a la ABC obtenida de la integración de la curva de la concentración en plasma durante un período de 0 a 48 horas, en donde 0 es convencionalmente el tiempo de administración del fármaco o forma de dosificación que comprende el fármaco para un paciente. ABCt se refiere al área bajo la curva de la concentración en plasma desde la hora 0 hasta la última concentración detectable en el tiempo t, y se calcula mediante la regla del trapecio. ABC¡nt o ABCo-- se refiere al valor de ABC extrapolado al infinito, calculado como la suma de ABCt y el área extrapolada al infinito, calculada por la concentración en el tiempo t (Ct) dividido por k.

La "presión sanguínea" (PS) es la presión (fuerza por unidad de área) ejercida al circular sangre en las paredes de los vasos sanguíneos. La presión de la sangre circulante disminuye a medida que se aleja del corazón a través de las arterias y capilares, y hacia el corazón a través de las venas. Generalmente, el término presión sanguínea se refiere a la presión de la arteria braquial, que es la presión sanguínea en el vaso sanguíneo principal de la parte superior izquierda o derecha del brazo que aleja la sangre del corazón. Para cada latido del corazón, la presión sanguínea varía entre la presión sistólica y diastólica. La presión sistólica es la presión pico en las arterias que se produce cerca del final del ciclo cardiaco cuando los ventrículos se contraen. La presión diastólica es la presión mínima en las arterias que se produce cerca del inicio del ciclo cardíaco cuando los ventrículos se llenan con sangre. Un ejemplo de valores normales determinados para un humano adulto, en reposo y sano es de 15.3 kPa (1 15 mmHg) para la presión sistólica y 10.0 kPa (75 mmHg) para la presión diastólica. La presión de pulso es la diferencia entre la presión sistólica y la presión diastólica. Las presiones arteriales sistólica y diastólica no son fijas sino experimentan variaciones naturales de un latido a otro y a lo largo del día en respuesta al estrés, factores nutricionales, fármacos, enfermedad, ejercicio y momentáneamente al levantarse.

"C" o "Cp" se refiere a la concentración de fármaco en el plasma sanguíneo, o suero, de un sujeto, que se expresa, generalmente, como masa por unidad de volumen, típicamente, nanogramos por mililitro (ng/ml). Por

conveniencia, esta concentración se puede mencionar en la presente descripción como "concentración del fármaco en plasma", "concentración plasmática del fármaco", "concentración en plasma sanguíneo" o "concentración en plasma". La concentración plasmática del fármaco en cualquier momento después de la administración del fármaco se menciona como Ct) como en C9h o C24h, etc. Una concentración máxima en plasma obtenida después de la administración de una forma de dosificación obtenida directamente de los datos experimentales sin interpolación se denomina Cmáx, en donde "tm^" es el tiempo transcurrido desde la administración de una forma de dosificación a un sujeto hasta el momento en que se alcanza la Cmá . El promedio o media de la concentración en plasma que se obtiene durante un periodo de interés se menciona como Cpr0m o Cmed¡a- Los expertos en la materia apreciarán que las concentraciones del fármaco en el plasma sanguíneo obtenidas en sujetos individuales varían debido a la variabilidad interpaciente en los muchos parámetros que afectan la absorción, distribución, metabolismo y excreción del fármaco. Por esta razón, a menos que se indique de otra manera, cuando se menciona una concentración del fármaco en plasma, el valor indicado es el valor medio calculado en base a los valores obtenidos de un grupo de sujetos a prueba o de múltiples administraciones en el mismo sujeto en distintas ocasiones.

Además, un experto en la materia apreciará la variabilidad en la concentración en plasma sanguíneo determinada de péptidos debido al ensayo usado para determinar la cantidad de péptidos, por ejemplo, el inmunoensayo tipo sandwich. La variabilidad puede ser, por ejemplo, debido al anticuerpo usado y se normaliza, generalmente, por múltiples métodos analíticos en base a la comparación con estándares de referencia. Por lo tanto, en vista de la dependencia de este ensayo, un experto en la materia ajusta los valores de concentración con respecto al ensayo básico al comparar las concentraciones obtenidas de los distintos ensayos.

"Mantenido prácticamente" o "que se mantiene prácticamente" con referencia al nivel de concentración en plasma sanguíneo se refiere a limitar las fluctuaciones máximas del valor de concentración hasta aproximadamente 10 % durante un período de tiempo más prolongado que aproximadamente 15 minutos. Las fluctuaciones del valor de concentración se determinan con respecto a un valor de concentración promediado en un momento que se promedia durante por lo menos 1 a 2 horas. Adicionalmente, mantener prácticamente un nivel de concentración en plasma sanguíneo menor que un límite superior específico se refiere a limitar el período de tiempo que el valor de concentración excede el límite superior hasta un período de tiempo, preferentemente, de menos de 15 minutos, con mayor preferencia, en donde el período de tiempo es menor que 10 minutos.

El "rendimiento cardíaco" implica las acciones fisiológicas en conjunto que realiza el corazón. El rendimiento cardíaco incrementado incluye efectos fisiológicos positivos en el rendimiento del corazón, mientras que los efectos que afectan negativamente las acciones del corazón disminuyen el rendimiento cardíaco. Tales efectos negativos pueden incluir, entre otros, cualquiera de los siguientes: frecuencia cardíaca incrementada, presión

sanguínea incrementada, consumo incrementado de oxígeno por el miocardio, arritmia ventricular de novo y otras respuestas cronotrópicas o inotrópicas que estresan significativamente el corazón sano o deficiente. Además, la incidencia de taquifilaxia no es beneficiosa para el rendimiento cardíaco. El rendimiento cardíaco incrementado o mejorado se puede determinar por el incremento de la fracción de eyección, más específicamente, la fracción de eyección (FE) del ventrículo izquierdo (VI), mayor volumen sistólico (VS), gasto cardíaco (GC) incrementado, función sistólica y diastólica mejoradas, particularmente, la función del VI, respuestas cronotrópica e inotrópica beneficiosas, frecuencia cardíaca estable o ligeramente reducida, presión sanguínea estable o reducida, por ejemplo, presión sistólica aórtica pico, presión diastólica final del VI, presión del VI durante la relajación isovolúmica o contracción, presión de enclavamiento de la arteria pulmonar media, además del consumo miocárdico de oxígeno constante o reducido y, generalmente, las respuestas hemodinámicas beneficiosas para el bienestar global del sujeto.

"Composición", significa un producto que contiene un compuesto de la invención (tal como un producto que comprende los ingredientes especificados en las cantidades especificadas, así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de tales combinaciones de los ingredientes especificados en las cantidades especificadas).

"Compuesto" o "fármaco" se refiere al péptido tipo estrescopina o a las formas farmacéuticamente aceptables de este. "Conjugado" se refiere al compuesto químico que se ha formado por la unión de dos o más compuestos.

"Dosificación" se refiere a la administración de un agente terapéutico en cantidades prescritas.

"Forma de dosificación" se refiere a uno o más compuestos en un medio, portador, vehículo o dispositivo adecuado para la administración a un paciente. "Forma oral de dosificación" se refiere a una forma de dosificación adecuada para la administración oral. Si no se indica de cualquier otra manera, una dosificación se refiere a una forma de dosificación adecuada para la administración de una dosis por medio de la vía parenteral. Preferentemente, la dosificación se suministra por administración continua intravenosa o subcutánea.

"Dosis" significa una unidad del fármaco. Convencionalmente, una dosis se ofrece como una forma de dosificación. Las dosis se pueden administrar a los pacientes de conformidad con una gran variedad de regímenes de dosificación o índices de infusión. Los regímenes de dosificación comunes incluyen una vez al día (qd), dos veces al día (bid), tres veces al día (tid), cuatro veces al día (qid), dos veces a la semana, quincenalmente o mensualmente. Los índices de infusión comunes para la administración intravenosa continua incluyen nanogramos por minutos de dosificación y por el peso del paciente en kilogramos, en donde la dosis se suministra de manera continua durante por lo menos aproximadamente 30 minutos, comúnmente, hasta algunas horas. Las cantidades de dosis comunes para la administración intravenosa o subcutánea en bolo incluyen microgramos por el peso del paciente en kilogramos y se administran, generalmente, por inyección.

"Curva plana del plasma" se refiere a una curva de la concentración en plasma que alcanza y mantiene un valor prácticamente constante después de un período definido de tiempo después de la administración de una forma de dosificación de conformidad con la presente invención. El intervalo de la concentración de valor constante se menciona como concentración en plasma "objetivo".

"Formas" se refiere a los diversos isómeros y mezclas de uno o más péptidos tipo estrescopina. El término "isómero" se refiere a los compuestos que tienen la misma composición y peso molecular pero difieren en las propiedades físicas y/o químicas. Dichas sustancias tienen la misma cantidad y tipos de átomos pero difieren en la estructura. La diferencia estructural puede darse en la constitución (isómeros geométricos) o en una capacidad para rotar el plano de la luz polarizada (estereoisómeros). El término "estereoisómero" se refiere a isómeros de constitución idéntica que difieren en la disposición de los átomos en el espacio. Los enantiómeros y diastereómeros son estereoisómeros en donde un átomo de carbono sustituido asimétricamente actúa como un centro quiral. El término "qulral" se refiere a una molécula que no puede superponerse sobre su imagen exacta, lo que implica la ausencia de un eje y un plano o centro de simetría.

"Frecuencia cardíaca" (FC) se refiere a la cantidad de latidos por unidad de tiempo y se expresa, usualmente, como latidos por minuto (Ipm). La frecuencia cardíaca humana en reposo promedio es de aproximadamente 70 Ipm para hombres adultos y 75 Ipm para mujeres adultas. La frecuencia cardíaca varía significativamente de un individuo a otro, según su estado físico, edad y genética. Los atletas de resistencia tienen, frecuentemente, frecuencias cardiacas en reposo muy bajas. La frecuencia cardíaca se puede determinar mediante el monitoreo del pulso. Un incremento de más de 5-10 Ipm a partir de los valores iniciales de la FC de un individuo en reposo durante más de aproximadamente 15 min confirma un "incremento considerable" en la FC.

"Vía pa renteral" se refiere a una vía de administración que implica penetrar la piel o la membrana mucosa e incluye, generalmente, la vía de administración intravenosa (IV), subcutánea (SC) e intramuscular (IM).

"Paciente" o "sujeto" significa un animal, preferentemente, un mamífero, con mayor preferencia, un humano, en necesidad de la intervención terapéutica.

"Farmacéuticamente aceptable" significa las entidades moleculares y composiciones que son de la pureza y calidad suficientes para ser usadas en la formulación de una composición o medicamento de la presente invención. Dado que tanto el uso humano (clínico y de venta libre) y uso veterinario se incluyen igualmente en el alcance de la presente invención, una formulación incluirá una composición o medicamento, ya sea para uso humano o veterinario.

"Excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sustancia no tóxica, biológicamente tolerable y de cualquier otra forma biológicamente adecuada para administrar a un sujeto, tal como una sustancia inerte, agregada a una composición farmacológica o de cualquier otra forma

usada como vehículo, portador o diluyente para facilitar la administración de un agente y que sea compatible con éstos. Como ejemplos de excipientes se incluyen carbonato calcico, fosfato cálcico, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicoles de polietileno.

"Sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal de ácido o de base de los compuestos de la invención que es de pureza y calidad suficiente para ser usada en la formulación de una composición o medicamento de la presente invención y son toleradas y lo suficientemente no tóxicas para usar en una preparación farmacéutica. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las sales de adición ácidas las cuales pueden, por ejemplo, formarse al reaccionar el compuesto fármaco con un ácido farmacéuticamente aceptable adecuado tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succinico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido carbónico o ácido fosfórico.

"Curva de la concentración en plasma del fármaco", "curva de la concentración plasmática del fármaco", "curva de la concentración en plasma", "perfiles de concentración en plasma-tiempo", "perfil de la concentración en plasma" o "perfil del plasma" se refiere a la curva obtenida mediante la diagramación de la concentración plasmática del fármaco o de la concentración del fármaco en plasma o de la concentración en plasma en función en comparación con el tiempo. Usualmente, la norma es que el punto cero en la escala del tiempo (convencionalmente, sobre el eje x) es el tiempo de administración del fármaco o forma de dosificación que comprende el fármaco para un paciente.

"índice" se refiere a la cantidad de compuesto administrado en una forma de dosificación por unidad de tiempo, por ejemplo, nanogramos de fármaco suministrado por el peso de un paciente y por minuto (ng/kg/min) en el sistema circulatorio del paciente. Los índices de infusión del fármaco para las formas de dosificación se pueden determinar como un índice de administración del fármaco in vitro, por ejemplo, una cantidad de fármaco administrado en la forma de dosificación por unidad de peso y por unidad de tiempo que se determina en las condiciones adecuadas y en un fluido adecuado. El suministro de una cantidad de fármaco en el sistema circulatorio de un paciente se usa indistintamente para la administración de una cantidad equivalente de fármaco.

"Péptido tipo estrescopina" se refiere a un polipéptido homólogo en su secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 o un derivado del polipéptido, que incluye, pero no se limita a, h-SCP y sustituciones conservadoras de aminoácidos en la secuencia del polipéptido. Un péptido tipo estrescopina homólogo se refiere a un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la h-SCP (SEQ ID NO:1 ), excepto por hasta, pero no más de, 4 deleciones de aminoácidos y/o una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras se pueden llevar a cabo, por ejemplo, de conformidad con lo siguiente: los aminoácidos no polares alifáticos, polares sin carga y polares con carga se pueden sustituir por otro aminoácido alifático no polar, polar sin carga o polar con carga, respectivamente. Las sustituciones no polares, alifáticas ocurren, preferentemente, entre aminoácidos en el grupo que consiste en G, A y P o entre aminoácidos en el grupo que consiste en I, L y V. Las sustituciones polares sin carga, alifáticas ocurren, preferentemente, entre aminoácidos en el grupo que consiste en C, S, T y M o entre aminoácidos en el grupo que consiste en N y Q. Las sustituciones polares con carga, alifáticas ocurren, preferentemente, entre aminoácidos en el grupo que consiste en D y E o entre aminoácidos en el grupo que consiste en K y R. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden llevar a cabo, además, entre aminoácidos aromáticos que incluyen H, F, W y Y. Preferentemente, por lo menos una porción del péptido tipo estrescopina homólogo comprende una secuencia de aminoácidos con un 90 % de identidad de secuencias con la h-SCP con relación a deleciones y/o sustituciones no conservadoras de aminoácidos.

Generalmente, un péptido tipo estrescopina se refiere a un péptido que muestra una actividad agonista hacia los receptores de la hormona liberadora de corticotropina humana tipo 1 (CRHR1) y tipo 2 (CRHR2) que se parecen mucho a la actividad del CRHR1 y CRHR2 de estrescopina (h-SCP). Un péptido tipo estrescopina es un agonista selectivo del CRHR2 con menos actividad hacia el CRHR1. Selectividad hacia un receptor en la presente se refiere a la potencia de un péptido para inducir una respuesta de actividad en el receptor hacia el que el péptido es selectivo en comparación con otros receptores, en los que el péptido puede también inducir actividad, pero con menos potencia. La definición de péptidos tipo estrescopina no se limita a agonistas, sino que puede incluir, además, agonistas parciales. La actividad del CRHR1 y del CRHR2 de un péptido tipo estrescopina se puede evaluar, por ejemplo, en un ensayo de adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP).

La concentración "relativa a la estrescopina" de un péptido o derivado de este se refiere a la concentración que es el peso y la actividad del CRHR2 equivalentes a una cantidad de concentración del péptido estrescopina de la SEQ ID NO:1. Dado que el peso molecular y la actividad del CRHR2 son distintos para varias formas de péptidos tipo estrescopina, es confuso reportar la concentración en plasma sanguíneo para una forma de dosificación sin tomar en cuenta el peso o la actividad del CRHR2 del péptido. Se prefiere reportar la concentración en plasma sanguíneo de un péptido como la concentración relativa a la estrescopina que es la concentración del péptido normalizada con respecto al peso y la actividad del CRHR2 equivalentes a la estrescopina. Por ejemplo, el peso molecular de un derivado pegilado de un péptido tipo estrescopina (SEQ ID NO:102) es de 25,449 Da, mientras que el peso molecular de la estrescopina (SEQ ID NO:1) es de 4,367 Da. Además, la actividad agonista del péptido tipo estrescopina de la SEQ ID NO:102 tiene un valor pAso de 8.15 determinado en un ensayo con cAMP del CRHR2 contra un valor pAso de 9.40 para la estrescopina de la SEQ ID NO:1. Por lo tanto, la relación de la potencia agonista de un péptido de la SEQ ID NO: 102 y la estrescopina de la SEQ ID NO:1 se reduce por un factor de 0(940"8 15) = 17.78, mientras que el péptido tiene una masa 5.6 veces mayor que la estrescopina de la SEQ ID N0:1 . Para dosificar hasta un nivel en plasma sanguíneo equivalente de 100 pg/ml de estrescopina de la SEQ ID NO: 1 , se debe dosificar hasta una concentración en plasma sanguíneo del péptido tipo estrescopina de la SEQ ID NO: 102 que es 100.8 (= 5.6*17.78) veces mayor, particularmente, 10 ng/ml, suponiendo la misma distribución para los tejidos del plasma. En caso de que la concentración se indique en unidades molares, que son independientes del peso, se debe administrar una dosis del péptido tipo estrescopina de la SEQ ID NO: 102 que es 5.6 veces mayor que la concentración de estrescopina de la SEQ ID NO: 1 para alcanzar una equivalencia farmacológica en base a la actividad del CRHR2. En resumen, la concentración relativa a la estrescopina de 100 pg/ml de un péptido de la SEQ ID NO: 102 es equivalente a una concentración de 10 ng/ml del mismo péptido. Un índice de infusión "relativa a la estrescopina" es el índice basado en alcanzar una concentración "relativa a la estrescopina".

La "vida media terminal" (t¼ o t½ terminal) es el tiempo requerido para alcanzar la mitad de la concentración en plasma del estado de seudoequilibrio, un estado en el que la curva del plasma es plana, entre la absorción del fármaco y la eliminación del fármaco. Cuando el proceso de absorción no es un factor limitante, la vida media es un parámetro híbrido controlado por el aclaramiento plasmático y el grado de distribución. En contraste, cuando el proceso de absorción sí es un factor limitante, la vida media terminal refleja el índice y el grado de absorción y es independiente del proceso de eliminación. La vida media terminal es especialmente

relevante para múltiples regímenes de dosificación, debido a que controla el grado de acumulación del fármaco, las fluctuaciones de concentración y el tiempo requerido para alcanzar el equilibrio.

"Cantidad con eficacia terapéutica" se refiere a la cantidad de compuesto que provoca la respuesta biológica o medicinal en un sistema tisular, animal o humano, que busca el investigador, veterinario, médico u otro especialista, que incluye el alivio terapéutico de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata.

El término "tratamiento", como se usa en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso, o prevenir el trastorno o afección en que dicho término se aplica, o uno o más síntomas de tal trastorno o afección. El término "tratamiento", como se usa en la presente descripción, a menos que se indique de cualquier otra forma, se refiere al acto de tratar.

B) Compuestos

La presente invención se relaciona con los siguientes péptidos y derivados de éstos. Generalmente, la presente invención se relaciona con todos los compuestos que con la administración a los pacientes que requieren el tratamiento para insuficiencia cardíaca mejoran el rendimiento cardíaco en el paciente sin afectar negativamente el corazón. La mejoría se puede determinar por el gasto cardíaco incrementado y la fracción de eyección, mientras que los efectos negativos pueden incluir la frecuencia cardíaca incrementada, consumo incrementado de oxígeno por el miocardio, presión sanguínea reducida entre otras respuestas que estresan el corazón deficiente. Los compuestos de la presente invención incluyen, además, péptidos agonistas del CRHR2 nuevos y selectivos que incluyen péptidos tipo estrescopina y modificaciones de éstos.

Además, los compuestos de la presente invención se refieren a porciones químicas o peptídicas que se unen a o forman un complejo con el CRHR2, tal como los polipéptidos de h-SCP o de h-SCP mimética. Los compuestos preferidos son péptidos con una actividad agonista incrementada hacia el CRHR2 según, por ejemplo, un ensayo con cAMP con un pA50 en el intervalo de aproximadamente 7.5 y superior, o pKi (logaritmo negativo de Kf) en el intervalo de aproximadamente 7.5 y superior. Aparte de presentar una alta afinidad de unión, los péptidos tipo estrescopina son agonistas del CRHR2 que muestran un nivel superior de activación del receptor. Los péptidos que son homólogos a la h-SCP son, por lo tanto, preferibles, ya que estos péptidos poseen de forma natural propiedades físicas y químicas similares.

Los miembros de la familia de factores de liberación de la corticotropina presentan una vida media moderadamente corta. Los agonistas selectivos de CRHR2 prometen un perfil terapéutico único. Para el tratamiento de los trastornos mediados por el CRHR2, que incluyen, pero no se limitan a, las enfermedades cardiovasculares y metabólicas, una modalidad de la presente invención está dirigida a una variante de acción prolongada de péptidos tipo estrescopina. Un péptido tipo estrescopina de acción prolongada proporciona beneficios particulares para el tratamiento de enfermedades

crónicas, en donde la necesidad de la exposición terapéutica continua y el cumplimiento del tratamiento prescrito por parte del paciente son un desafío.

En consecuencia, una modalidad de la presente invención se dirige, generalmente, a las variación(es) de la secuencia de la h-SCP, las variaciones de la secuencia de sitios específicos, y las consideraciones de interferencia espacial o estérica, de tal manera que se conserva el perfil terapéutico deseado y/o la relación estructura-actividad en relación con el CRHR2.

Las modalidades de péptidos tipo estrescopina, amidatados en los términos C, se proporcionan en las Tablas 1 a la 5. El grupo reactivo o conector es, preferentemente, la succinimida o la acetamida. Los péptidos modificados contienen opcionalmente un grupo PEG. El PEG puede variar en longitud y peso y es, preferentemente, aproximadamente 20 kDa. Opcionalmente, el número de grupos reactivos pueden ser más de uno, con un grupo reactivo preferible.

TABLA 1

Estrescopina humana con péptidos tipo estrescopina con término C amidatado y variante Cvs



TABLA 2



TABLA 3

Péptidos tipo estrescopina con variante Cys peqilado con conector de N- etilsuccinimida (NES) y PEG con un peso de aproximadamente 20 kPa



TABLA 4

Péptidos tipo estrescopina con variante Cys pegílado con PEG de peso molar variable y conector N-etilsuccinimida (NES) o acetamida ÍIA)



TABLA 5

Péptidos tipo estrescopina con secuencia de aminoácidos (aa) acortada en comparación con el péptido de la SEQ ID NO:1


Los compuestos de fármacos de la presente invención incluyen, además, una mezcla de estereoisómeros, o cada isómero puro o sustancialmente puro Por ejemplo, el presente compuesto puede tener opcionalmente uno o más centros asimétricos en un átomo de carbono que contiene cualquiera de los sustituyentes. Por lo tanto, el compuesto puede existir en la forma de enantiómero o diastereómero o una mezcla de éstos. Cuando el presente compuesto contiene un enlace doble, el presente compuesto puede existir en la forma de isomerismo geométrico (compuesto- cis, compuesto-trans) y cuando el presente compuesto contiene un enlace insaturado tal como carbonilo, entonces el presente compuesto puede existir en la forma de un tautómero y el presente compuesto también incluye estos isómeros o una mezcla de éstos. El compuesto inicial en la forma de una mezcla racémica, enantiómero o diastereómero se puede usar en los procesos para la preparación del presente compuesto. Cuando el presente compuesto se obtiene en la forma de un diastereómero o enantiómero, se pueden separar mediante un método convencional tal como cromatografía o cristalización fraccionada. Adicionalmente, el presente compuesto incluye una sal intramolecular, hidrato, solvato o polimorfismo de éstos.

Además, los compuestos de fármacos adecuados son aquellos que ejercen un efecto fisiológico local o un efecto sistémico, ya sea después de penetrar la mucosa o, en el caso de administración oral, después del transporte en el tracto gastrointestinal con la saliva. Las formas de dosificación preparadas a partir de las formulaciones de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuadas para los compuestos de fármacos que ejercen su actividad durante un período prolongado de tiempo, particularmente los fármacos que tienen una vida media de al menos varias horas.

C) Rutas de síntesis v purificación

Un polipéptido "aislado" es un polipéptido sustancialmente libre de o separado de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejido de donde se produce y se aisla el polipéptido, o

sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando el polipéptido se sintetiza químicamente. Por ejemplo, la proteína que está sustancialmente libre del material celular puede incluir las preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30 %, o preferentemente 20 %, o con mayor preferencia 10 %, o incluso con mayor preferencia 5 %, o aún con mayor preferencia 1 % (en peso seco), de proteínas contaminantes.

Ruta biológica

En modalidades preferidas el polipéptido aislado es sustancialmente puro. Por lo tanto, cuando el polipéptido se produce por recombinación, esta sustancialmente libre de medio de cultivo, por ejemplo, medio de cultivo que representa menos de aproximadamente 20 % o, con mayor preferencia, 10 % o, aún con mayor preferencia, 5 % o, todavía con mayor preferencia, 1 % del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteina se produce por síntesis química, está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa a partir de precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteina. Por lo tanto, tales preparaciones del polipéptido tienen menos de aproximadamente 30 % o, preferentemente, 20 % o, con mayor preferencia, 10 % o, aún con mayor preferencia, 5 % o, todavía con mayor preferencia, 1 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos al polipéptido de interés.

La expresión del polipéptido en ambientes celulares se puede alcanzar mediante el uso de polinucleótidos aislados. Un polinucleótido "aislado" es uno que está sustancialmente separado de o libre de moléculas de ácido nucleico con diferentes secuencias de ácido nucleico. Las modalidades de moléculas de polinucleótidos aislados incluyen ADNc, ADN genómico, ARN y ARN no codificante. Los polinucleótidos preferidos se obtienen a partir de muestras biológicas derivadas de un humano, por ejemplo, de muestras de tejido.

Los vectores se pueden usar para suministrar y propagar polinucleótidos que codifican el polipéptido. La introducción de tales vectores en las células huéspedes puede provocar la producción del ARNm o proteina codificados de la estrescopina mimética. Por otra parte, los vectores de expresión se pueden combinar con elementos purificados que incluyen, pero no se limitan a, los factores de la transcripción, la polimerasa de ARN, los ribosomas, y los aminoácidos para producir de manera eficiente las reacciones de transcripción/traducción en condiciones libres de células. Los polipéptidos miméticos de estrescopina expresados a partir de las reacciones resultantes se pueden aislar para una mayor purificación, modificación y/o formulación.

El término vector de expresión se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar a otro ácido nucleico al cual se enlazó. Un tipo ejemplar de vector es un plásmido, que se refiere a un lazo de ADN circular de cadena doble en la que los segmentos adicionales de ADN se pueden insertar. Otro ejemplo de un vector es un vector viral en donde se

puede insertar segmentos adicionales de ADN. Algunos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, los vectores de bacterias que tiene un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, los vectores, no episomales de mamíferos) se integran en el genoma de una célula huésped a la introducción en la célula huésped y, por lo tanto, se replica junto con el genoma del huésped. Por otra parte ciertos vectores de expresión son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que están vinculados operativamente. Los vectores de utilidad en las técnicas de ADN recombinante pueden ser en forma de plásmidos. Por otra parte, otras formas de vectores, tales como los vectores virales (por ejemplo, los retrovirus de replicación defectuosa, los adenovirus y los virus adeno-asociado), que cumplen funciones equivalentes, se pueden seleccionar por el experimentado en la materia como adecuado para el uso previsto.

Una célula huésped se refiere a una célula que contiene una molécula de ADN ya sea en un vector o integrado en un cromosoma de la célula. Una célula huésped puede ser una célula huésped nativa que contiene la molécula de ADN endógenamente o una célula huésped recombinante. Un ejemplo de una célula huésped es una célula huésped recombinante, que es una célula que se transformó o transfectó por una secuencia de ADN exógeno. Una célula se ha transformado por el ADN exógeno cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. El ADN exógeno puede o no estar integrado (enlace covalente) en el ADN de los cromosomas que componen el genoma de la célula. En procariotas y levaduras, por ejemplo, el ADN exógeno se puede mantener en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a las células eucariotas, una célula establemente transformada o transfectada es aquella en el que el ADN exógeno llega a estar integrado en el cromosoma de manera que sea heredado por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de las células eucariotas para establecer líneas celulares o clones que comprenden una población de células hijas que contienen el ADN exógeno. Un clon se refiere a una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una linea celular se refiere a un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro por muchas generaciones. Las células recombinantes huéspedes pueden ser procariotas o eucariotas, incluidas las bacterias tales como E. coli, las células de hongos como la levadura, las células de mamíferos, tales como líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono, y de roedores, insectos y células, tales como Drosophila y líneas celulares derivadas del gusano de seda. Una célula huésped recombinante se refiere no solo a la célula particular del sujeto, sino también a la progenie o descendencia potencial de una célula. Particularmente porque ciertas modificaciones pueden ocurrir en las generaciones venideras ya sea debido a una mutación o influencias del medio ambiente, la progenie puede no ser idéntica a la célula madre, pero todavía están destinadas a ser incluidas en el alcance del término.

Los vectores ilustrativos de la presente invención incluyen, además, sistemas de expresión diseñados específicamente que permitan la traslación del ADN entre huéspedes como bacterias-levaduras o bacterias-células animales o bacterias-hongos o bacterias-células de invertebrados. Aquellos con experiencia en la materia conocen numerosos vectores de clonación y la selección de un vector de clonación apropiado está en el ámbito del experimentado en la materia. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas ver, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook y otros, (1989), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, vol. 2, págs. 16.3-16.81.

Para obtener un nivel alto de expresión de un gen o ácido nucleico clonado, tal como un ADNc que codifica un polipéptido mimético de estrescopina, una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de polipéptidos miméticos de estrescopina se subclona, preferentemente, en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción, y para un ácido nucleico que codifica una proteina, un sitio de unión al ribosoma para la iniciación traduccional. Los promotores bacterianos adecuados son conocidos en la materia y los describen, por ejemplo, Sambrook y otros, (1989), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York and Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60(3): 512-38. Los sistemas bacterianos de expresión para expresar las proteínas mimétícas de la estrescopina descritas en la presente invención están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp., y Salmonella (Palva y otros, 1983, Gene, 22:229-235; Mosbach y otros, 1983, Nature, 302:543-545). Los kits para los sistemas de expresión están

disponibles comercialmente. Los sistemas de expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras y células de insectos se conocen en la materia y también están disponibles en el mercado. En modalidades ejemplares, el vector de expresión eucariota es un vector de baculovirus, vector de adenovirus, un vector adeno-asociado, o un vector retroviral.

El promotor se refiere a una secuencia reguladora de ADN que está implicado en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción de un gen. Los promotores están, frecuentemente, corriente arriba (es decir, 5 ') en el sitio de iniciación de la transcripción del gen. Un gen se refiere a un segmento de ADN implicado en la producción de un péptido, polipéptido o proteína, que incluye la región codificante, las regiones no codificantes anteriores (5'UTR) y las siguientes (3'UTR) a la región codificante, así como las secuencias no codificantes intermedias (¡ntrones) entre los segmentos codificantes (exones) individuales. La codificación se refiere a la especificación de determinados aminoácidos o señales de terminación en tripletes de tres bases (codones) de ADN o ARNm.

El promotor para la expresión directa del polinucleótido se puede seleccionar regularmente para adaptarse el uso particular. El promotor se coloca, opcionalmente, a la misma distancia del sitio de inicio de transcripción heteróloga, ya que está desde el sitio de inicio de transcripción en su entorno natural. Como será evidente para el experimentado en la materia, sin embargo, alguna variación en esta distancia se puede acomodar sin pérdida de la función de promotor.

Además del promotor, el vector de expresión puede contener una unidad de transcripción o cásete de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión del polinucleótido de codificación del mimético de la estrescopina en las células huéspedes. Un cásete de expresión ilustrativo contiene un promotor unido operativamente a la secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido mimético de estrescopina y las señales necesarias para la poliadenilación eficaz del transcrito, los sitios de unión a ribosomas y la terminación de la traducción. La secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido mimético de estrescopina canina puede estar unida a una secuencia de péptidos señal escindible para promover la secreción de la proteína codificada por la célula transfectada. Los péptidos señal ilustrativos incluyen los péptidos señal del activador tisular del plasminógeno, la insulina y del factor de crecimiento neuronal, y la hormona esterasa juvenil de Heliothis virescens. Los elementos adicionales del cásete pueden incluir potenciadores y, si se usa el ADN genómico como gen estructural, los intrones con los sitios de empalme donantes y aceptores funcionales.

Además de una secuencia promotora, el cásete de expresión puede contener, además, una región de terminación de la transcripción corriente abajo del gen estructural para proporcionar la terminación eficiente. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia del promotor, el gen de la estrescopina humana, o se puede obtener a partir de genes diferentes.

En modalidades ilustrativas, se puede usar cualquier vector adecuado para la expresión en células eucariotas o procariotas conocidos en la

materia. Los vectores bacterianos de expresión ilustrativos incluyen plásmidos, tales como los plásmidos que se basan en el pBR322, pSKF, pET23D, y los sistemas de fusión de expresión como GST y LacZ. Los ejemplos de vectores de expresión mamíferos incluyen, por ejemplo, pCDM8 (Seed, 1987, Nature, 329:840) y pMT2PC (Kaufman y otros, 1987, EMBO J., 6:187-193). Los vectores de expresión mamíferos disponibles comercialmente que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de los polipéptidos de la invención incluyen, por ejemplo, pMAMneo (Clontech, Mountain View, CA), pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), pCiNeo (Promega, adison, Wl), pMCI neo (Stratagene, La Jolla, CA), ρΧΤ (Stratagene, La Jolla, CA), pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) e IZD35 (ATCC 37565).

Las etiquetas del epítopo se pueden agregar, además, a las proteínas recombinantes para proporcionar métodos convenientes de aislamiento, por ejemplo, c-myc, la etiqueta hemoglutinina (HA), la etiqueta 6-His, la proteína de unión a maltosa, la etiqueta VSV-G, o la etiqueta anti-FLAG, y otras disponibles en la materia.

Los vectores de expresión que contiene los elementos reguladores de los virus eucarióticos se pueden usar en vectores de expresión eucariota, por ejemplo, los vectores de SV40, vectores del virus del papiloma, y los vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucarióticos ilustrativo incluyen el pMSG, el pAV009/A +, el pMTO10/A +, el pMAMneo 5,

el baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permite la expresión de proteínas, bajo la dirección del promotor de CMV, el promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, el promotor de la metalotioneína, el promotor del virus del tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor polihedrina, u otros promotores que muestran eficacia para la expresión en células eucariotas.

Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan la amplificación del gen, tal como la neomicina, la tirnidina quinasa, la higromicina fosfotransferasa B, y la dihidrofolato reductasa. Alternativamente, los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican la amplificación del gen también son adecuados, tales como con el uso de un vector baculovirus en células de insectos, con una secuencia que codifica un péptido mimético de estrescopina bajo la dirección del promotor polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.

Los elementos que se pueden incluir en los vectores de expresión incluyen, además, un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica la resistencia a los antibióticos para permitir la selección de bacterias que albergan los plásmidos recombinantes, y los sitios de restricción únicos en las regiones del plásmido que no sean esenciales para permitir la inserción controlada de secuencias eucariotas. El gen particular de resistencia a antibióticos se puede seleccionar de los muchos genes de resistencia conocidos en la materia. Las secuencias de procariotas se pueden elegir de tal manera que no interfieren con la replicación del ADN en las células eucariotas, si es necesario o deseado.

Los métodos de transfección conocidos se pueden usar para producir las líneas celulares de bacterias, levadura, mamíferos, insectos que expresan grandes cantidades de una mimética de SCP, que luego se purifica mediante el uso de técnicas estándar, tales como la precipitación selectiva con sustancias como el sulfato de amonio, la cromatografía en columna, y los métodos de inmunopurificación.

La transformación de células eucariotas y procaríotas se puede llevar a cabo de conformidad con técnicas estándar (ver, por ejemplo, Morrison, 1977, J Bact. , 132:349-351 ; Clark-Curtiss y otros, Methods in Enzymology, 101 :347-362).

Cualquiera de los procedimientos conocidos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos extrañas en las células huéspedes se puede usar para introducir el vector de expresión. Éstos incluyen el uso de reactivos tales como el Superfect (Qiagen), los liposomas, la transfección con fosfato de calcio, el polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la microinyección, los vectores de plásmido, los vectores virales, la aceleración de partículas bíolístíca (pistola de genes), o cualquier otro método conocido para introducir el ADN genómico clonado, el ADNc, el ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped (véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra). El procedimiento particular de ingeniería genética seleccionado debe ser capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el ARN, el ARNm, el ADNc, o el gen de una estrescopina mimética.

Como sería evidente para los experimentados en la materia, para la transfección estable de células de mamíferos, según el vector de expresión y la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de las células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica para un marcador de selección (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) puede introducirse en las células huéspedes junto con el gen de interés. Los marcadores de selección ejemplares son los que confieren resistencia a fármacos, tales como el G- 18, la puromicina, la geneticina, la higromicina y el metotrexato. Las células transfectadas establemente con el ácido nucleico introducido se pueden seleccionar y localizar por la selección del fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras células mueren).

Un elemento de regulación heterólogo se puede insertar en una línea celular estable o microorganismo clonado, de manera que esté operativamente enlazado y active la expresión de genes endógenos, mediante el uso de técnicas como la recombinación homologa dirigida, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos núm. 5,272,071 y en la publicación internacional núm. WO 91/06667. Después de introducir el vector de expresión en las células, las células transfectadas se cultivan, preferentemente, en condiciones óptimas que favorecen la expresión del polipéptido mimético de estrescopina, el cual se recupera del cultivo con el uso de las técnicas estándar que se indican a continuación. Los métodos de cultivo de células procariotas o eucariotas se conocen en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook y otros, supra; Freshney, 1993, CULTURE OF ANIMAL CELLS, 3 ° ed.

Como alternativa del uso de sistemas celulares para la producción de polipéptidos, se ha demostrado que los sistemas libres de células tienen la capacidad para la expresión génica y la síntesis en sistemas procariotas (Zubay G., Annu Rev Genet., 1973, 7:267-287) y eucariotas (Pelham y otros, Eur J Biochem., 1976, 67:247-256; Anderson y otros, Meth Enzymol., 1983, 101 :635-644). Estos sistemas pueden usar ya sea nucleótidos de ARNm o de ADN para las reacciones de síntesis de polipéptidos. Una técnica preferida para la producción de polipéptidos libres de células usa el lisado de reticulocitos, la ARN polimerasa, los nucleótidos, las sales y el inhibidor de ribonucleasa en una reacción rápida de transcripción/traducción acopladas (TNT®, Promega, Madison, Wl, Estados Unidos).

Síntesis en fase sólida

Los péptidos de la presente invención se pueden preparar con el uso de la técnica de síntesis en fase sólida descrita inicialmente por Merrifield, in J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963). Otras técnicas de síntesis de péptidos se pueden encontrar, por ejemplo, en M. Bodanszky y otros, (1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2.° ed.; Kent and Clark-Lewis in Synthetic Peptides in Biology and Medicine, págs. 295-358, eds. Alítalo, K., y otros, Science Publishers, (Amsterdam, 1985); así como otros trabajos de referencia conocidos para aquellos con experiencia en la materia. Un resumen de las técnicas de síntesis de péptidos se puede encontrar en Steward y otros, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, III. (1984), que se incorpora en la presente descripción como referencia. Además, se puede usar la síntesis de péptidos mediante métodos de solución, tal como se describe en The Proteins, Vol. II, 3.° ed., págs. 105-237, Neurath, H. y otros, Eds., Academic Press, New York, N.Y. (1976). Los grupos de protección adecuados para su uso en tales síntesis se encuentran en los textos anteriores, así como en J. F. W. McOmie, Protective Groups ¡n Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973), que se incorpora en la presente descripción como referencia. Generalmente, estos métodos de síntesis implican la adición secuencial de uno o más residuos de aminoácidos o residuos de aminoácidos adecuados protegidos, a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, tanto el grupo amino o carboxilo del primer residuo de aminoácido está protegido por un grupo de protección adecuado selectivamente extraible. Otro grupo de protección selectivamente extraible se usa para los aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como la lisina.

Las técnicas de síntesis de bloque también se pueden aplicar a los métodos de síntesis de péptidos tanto de fase sólida y en solución. En lugar de la adición secuencial de un solo residuo de aminoácido, los bloques preformados que comprenden dos o más residuos de aminoácidos en la secuencia se usan ya sea como subunidades de partida o unidades añadidas con posterioridad, en lugar de los residuos de aminoácidos solos.

Mediante el uso de la síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se conecta a un soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino desprotegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina entonces selectivamente y el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido se mezcla y se hace reaccionar con el residuo que ya está unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo se elimina de este residuo de aminoácido que acaba de agregarse, y el siguiente aminoácido (convenientemente protegido) se añade a continuación, y así sucesivamente. Después de que todos los aminoácidos deseados se han enlazado en la secuencia apropiada, cualquier terminal restante y el grupo lateral de protección de los grupos (y el soporte sólido) se eliminan de forma secuencial o simultánea, para proporcionar el péptido final. Los péptidos de la invención se encuentran, preferentemente, desprovistos de los aminoácidos bencilados o metilbencilados. Tales fracciones protectoras de grupos se pueden usar en el curso de la síntesis, pero se retiran antes de que los péptidos se usen. Las reacciones adicionales pueden ser necesarias, como se describe en otra parte, para formar enlaces intramoleculares para restringir la conformación.

La síntesis de soporte sólido se puede lograr con los sintetizadores de proteínas automatizados (Protemist®, CelIFree Sciences, Matsuyama Ehime 790-8577, Japón; Symphony SMPS-1 10, Rainin, Woburn, MA, Estados Unidos; ABI 433A peptide synthesizer, Applied Biosystems, Foster City, CA, Estados Unidos). Estas máquinas tienen la capacidad para

llevar a cabo reacciones automatizadas de proteínas que permiten un mayor control y optimización de la síntesis.

Purificación

Es posible usar un número de procedimientos para aislar o purificar el polipéptido de la invención. Por ejemplo, se puede usar la cromatografía en columna para purificar polipéptidos, en base a sus propiedades físicas, es decir, su hidrofobicidad. Alternativamente, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas se pueden fusionar en forma reversible con el polipéptido de la invención. Con un ligando adecuado para la proteína fusionada, el polipéptido mimético de estrescopina se puede adsorber selectivamente a una columna de purificación y, después, liberar de la columna en una forma sustancialmente pura. La proteína de fusión podrá, entonces, eliminarse por la actividad enzimática. Las estrategias alternativas de purificación en columna pueden usar anticuerpos contra el polipéptido mimético de estrescopina. Estos anticuerpos se pueden conjugar a las matrices de las columnas y los polipéptidos se pueden purificar a través de estas columnas de inmunoafinídad.

Las proteínas recombinantes se pueden separar de las reacciones huéspedes por técnicas de separación adecuadas, tal como el fraccionamiento con sal. Este método se puede usar para separar las proteínas de la célula huésped no deseadas (o proteínas derivadas de los medios de cultivo celular) de la proteína recombinante de interés. Una sal ejemplar es el sulfato de amonio, que precipita las proteínas mediante la

reducción efectiva de la cantidad de agua en la mezcla de proteínas (las proteínas se precipitan, después, sobre la base de su solubilidad). Cuanto más hidrofóbica es una proteína, mayor es la probabilidad de precipitar a bajas concentraciones de sulfato de amonio. Un protocolo de aislamiento ilustrativo incluye la adición de sulfato de amonio saturado a una solución de proteína, de manera que la concentración de sulfato de amonio resultante está entre 20-30 %, para precipitar las proteínas más hidrofóbicas. El precipitado se descarta después (a menos que la proteina de interés sea hidrofóbica) y el sulfato de amonto se añade al sobrenadante a una concentración conocida para precipitar la proteína de interés. El precipitado se solubiliza después en tampón y el exceso de sal se elimina para lograr la pureza deseada, por ejemplo, a través de la diálisis o la diafiltración. Otros métodos conocidos que dependen de la solubilidad de las proteínas, tal como la precipitación con etanol frío, se pueden usar para fraccionar mezclas complejas de proteínas.

En otros ejemplos de técnicas de aislamiento o purificación, el peso molecular del polipéptido de la invención se puede usar para aislarlo de las proteínas de mayor y menor tamaño con el uso de la ultrafíltración a través de membranas de distintos tamaños de poro (por ejemplo, membranas Amicon o Millipore). Como primer paso, la mezcla de proteínas se ultra-filtra a través de una membrana con un tamaño de poro que tiene un menor peso molecular de corte que el peso molecular de la proteína de interés. Después, la materia retenida de la ultrafíltración se ultrafiltra contra una membrana con un corte molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante pasará a través de la membrana en el filtrado, y el filtrado se puede pasar después por una cromatografía.

Modificaciones químicas

El polipéptido de la invención se puede someter a modificaciones químicas dirigidas, tales como nivelación con maleimida, fijación de polietilenglicol (PEG), maleidificación, acilación, alquilación, esterificación y amidificación, para producir análogos estructurales del polipéptido. El experimentado en la materia apreciará la existencia de una variedad de técnicas de modificación química y fracciones; véase, por ejemplo las patentes de los Estados Unidos núms. 5,554,728; 6,869,932; 6,828,401 ; 6,673,580; 6,552,170; 6,420,339; pub. de pat. de los Estados Unidos núm. 2006/0210526 y la sol. int. de pat. 2006/0210526 y sol. int. de pat. núm. WO 2006/136586. Preferentemente, las modificaciones químicas se llevan a cabo en el polipéptido aislado, por ejemplo, para aumentar la eficiencia de reacción.

En ciertas modalidades de la invención, el polipéptido de la invención contiene un término C amidatado. Tales procedimientos de modificación de polipéptidos se pueden llevar a cabo en el polipéptido purificado aislado o, en el caso de síntesis en fase sólida, se pueden llevar a cabo durante el procedimiento de síntesis. Tales procedimientos se describen en Ray y otros, Nature Biotechnology, 1993, vol. 11 , págs. 64 -70; Cottingham y otros, Nature Biotechnology, 2001 , vol. 19, págs. 974-977;

Walsh y otros, Nature Biotechnology, 2006, vol. 24, págs. 1241-1252; solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0167231.

Los polipéptidos de la invención pueden contener ciertos conectores intermedios útiles para unir el polipéptido y la porción de PEG. Tales conectores transmitirán inmunogenicidad y toxicidad mínima a los huéspedes Los ejemplos de tales conectores se pueden encontrar en Bailón y otros, PSTT, 1998, vol. 1 (8), págs. 352-356.

En ciertas modalidades la presente invención está dirigida a un conjugado que comprende un polipéptido aislado que consiste esencialmente en una secuencia como se expone en la SEQ ID NO:29 que contiene un CONH2 en su término carboxi y un conector intermedio conjugado con el residuo de cisteína en la posición 28 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29. En ciertas modalidades el conector intermedio es ta N-etilsuccinimida. En modalidades adicionales el conector intermedio puede ser sulfona de vinilo. En modalidades adicionales el conector intermedio puede ser acetamida. En ciertas modalidades el conector intermedio puede ser ortopiridil disulfuro.

En modalidades adicionales la invención se dirige a un conjugado que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO:29 con un CONH2 en su término carboxi, un conector N-etilsuccinimida conjugado con el residuo de cisteína en la posición 28 de la SEQ ID NO:29, en donde el conector N-etilsuccinimida se une, además, a una porción de PEG. En ciertas

modalidades el peso molecular de la porción de PEG puede estar en el intervalo de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 80 kDa. En ciertas modalidades la masa del PEG es aproximadamente 20 kDa. En modalidades preferidas el péptido tipo estrescopina comprende un polipeptido de la SEQ ID NO:82 o de la SEQ ID NO:102. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 5 kDa. En ciertas otras modalidades la masa de PEG es aproximadamente 12 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 20 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 80 kDa. En ciertas modalidades la fracción de PEG es lineal. En otras modalidades la fracción de PEG es ramificada. Las fracciones de PEG se pueden sintetizar de acuerdo a los métodos conocidos por alguien con experiencia en la materia. Por otra parte, las fracciones de PEG están disponibles comercialmente, tales como Sunbright® ME-020MA, Sunbright® ME-050MA, y Sunbright® ME-200MA (NOF Corp, Japón; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos.)

La presente invención se relaciona, además, con sales farmacéuticamente aceptables del polipéptido de la invención y métodos de uso de tales sales. Una sal farmacéuticamente aceptable se refiere a una sal de un ácido o base libre del polipéptido que es no tóxica, biológicamente tolerable o de cualquier otra forma biológicamente adecuada para la administración a un sujeto. Véase, generalmente, S.M. Berge, y otros, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm.

Sci., 1977, 66:1-19, y Handbook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection, and Use, Stahl y Wermuth, Eds., Wiley-VCH and VHCA, Zurich, 2002. Las sales farmacéuticamente aceptables son aquellas que son farmacéuticamente efectivas y adecuadas para el contacto con los tejidos de pacientes, sin toxicidad, irritación o respuesta alérgica indebida. Un polipéptido puede tener un grupo suficientemente acídico, un grupo suficientemente básico o ambos tipos de grupos funcionales, y reaccionar de manera acorde con cierto número de bases inorgánicas u orgánicas para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Como ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables se incluyen sulfatos, pirosulfatos, bisulfatos, sulfitos, bisulfitos, fosfatos, monohidrógeno-fosfatos, dihidrógenofosfatos, metafosfatos, pirofosfatos, cloruros, bromuros, yoduros, acetatos, propionatos, decanoatos, caprilatos, acrilatos, formiatos, isobutiratos, caproatos, heptanoatos, propiolatos, oxalatos, malonatos, succinatos, suberatos, sebacatos, fumaratos, maleatos, butino-1 ,4-dioatos, hexina-1 ,6-dioatos, benzoatos, clorobenzoatos, metilbenzoatos, dinitrobenzoatos, hidroxibenzoatos, metoxibenzoatos, ftalatos, sulfonatos, xilenesulfonatos, fenilacetatos, fenilpropionatos, fenilbutiratos, citratos, lactatos, γ-hidroxibutiratos, glicolatos, tartratos, metano-sulfonatos, propanesulfonatos, naftaleno-1 -sulfonatos, naftaleno-2-sulfonatos y mandelatos.

Si el péptido de la invención contiene un nitrógeno básico, la sal farmacéuticamente aceptable deseada se puede preparar por cualquier método adecuado disponible en la materia, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido

yodhídrico, ácido perclórico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido bórico, ácido fosfórico, y similares, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fenilacético, ácido propiónico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido pamoico, ácido isetiónico, ácido succínico, ácido valérico, ácido fumárico, ácido sacarínico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicilico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido láurico, un ácido piranosidilo, tal como el ácido glucurónico o ácido galacturónico, un ácido alfa-hidroxi, tal como el ácido mandélico, ácido cítrico, o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido naftoico, o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido laurilsulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, hidroxietanosulfónico, un ácido cidohexanosulfámico, cualquier mezcla de ácidos compatible tal como las que se dan como ejemplos en la presente, y cualquier otro ácido y mezcla de éstos que se consideran equivalentes o sustitutos aceptables a la luz del nivel ordinario del experto en esta tecnología.

Si el polipéptido de la invención contiene un grupo ácido, tal como un ácido carboxílico o ácido sulfónico, la sal farmacéuticamente aceptable que se desea obtener se puede preparar por cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante el tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria),

un hidróxido de metal alcalino, un hidróxido de metal alcalinotérreo, cualquier mezcla compatible de bases, tal como las indicadas como ejemplos en la presente descripción, y cualquier otra base o mezcla de éstos considerados como equivalentes o sustitutos aceptables de acuerdo con el conocimiento de las personas con experiencia en la materia. Como ejemplos ilustrativos de sales adecuadas se incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, carbonatos, bicarbonatos, aminas primarias, secundarias y terciarias y aminas cíclicas, tales como bencílaminas, pirrolidina, piperidina, morfolina y piperazína, y sales inorgánicas derivadas del sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, aluminio y litio. Las bases orgánicas o inorgánicas representativas incluyen adicionalmente benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamína, meglumina y procaína.

La invención también se refiere a profármacos farmacéuticamente aceptables de los compuestos, y a métodos de tratamiento que emplean dichos profármacos farmacéuticamente aceptables. El término "profármaco" significa un precursor de un compuesto designado que, después de la administración a un sujeto produce el compuesto in vivo a través de un proceso químico o fisiológico tal como solvolisis o clívaje enzimático, o bajo condiciones fisiológicas. Un "profármaco farmacéuticamente aceptable" es un profármaco no tóxico, biológicamente tolerable y, de alguna otra manera, biológicamente adecuado para su administración al sujeto. Los procedimientos ilustrativos para la selección y preparación de derivados de profármacos adecuados se describen, por ejemplo, en "Design of Prodrugs", ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985.

Como ejemplos de profármacos se incluyen los compuestos que tienen un residuo de aminoácido o una cadena de polipéptidos de dos o más residuos de aminoácidos (por ejemplo, dos, tres o cuatro) enlazados en forma covalente mediante una amida o enlace éster un amino libre, hidroxilo o grupo de ácido carboxílico del compuesto. Como ejemplos de aminoácidos se incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, que comúnmente se denominan con tres letras, así como 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvalina, beta-alanina, gamma-ácido aminobutírico, citrulina homocisteína, homoserina, ornitina y metionina sulfona.

Se pueden producir otros tipos de profármacos, por ejemplo, al derivar grupos de estructuras de carboxilo libre del compuesto como amidas o alquilo ésteres. Como ejemplos de amidas se incluyen las derivadas del amoniaco, alquilo aminas primarias de C1-6 y aminas secundarias dialquilo de (C1.6). Las aminas secundarias incluyen entidades anulares heterocicloalquilo ó heteroarilo con 5 o 6 elementos. Como ejemplos de amidas se incluyen las que derivan del amoníaco, aminas alquilo primarias de C -3 y d C^alquiloJaminas. Como ejemplos de ésteres de la invención se incluyen ésteres de alquilo de Ci. 7, cicloalquilo de C5-7, fenilo, y fenilalquilo de (Ci^). Entre los ésteres preferidos se incluyen los metil ésteres. Los profármacos pueden prepararse, además, al derivar grupos hidroxilo por medio del uso de grupos que incluyan hemisuccinatos, ésteres fosfato, dimetilaminoacetatos y

fosforiloximetiloxicarbonilos, según los procedimientos descritos en Fleisher y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 1996, 19, 1 15-130. Los derivados de carbamato de los grupos hidroxilo y amino también pueden producir profármacos. Los derivados de carbonatos, ésteres sulfonatos, y ésteres sulfato de grupos hidroxilo pueden, además, proporcionar profármacos. La derivación de grupos hidroxi como ésteres (aciloxi)-metil y (aciloxi)-etilo, en donde el grupo acilo puede ser un éster alquilo opcionalmente sustituido con una o más funcionalidades de éter, amina, o ácido carboxílico, o en donde el grupo acilo es un éster aminoácido según se describió anteriormente, también sirve para producir profármacos. Los profármacos de este tipo se pueden preparar como se describió en Greenwald, y otros, J Med Chem. 1996, 39, 10, 1938^40. Las aminas libres pueden derivarse además como amidas, sulfonamidas o fosfonamidas. Todas estas entidades de profármacos pueden incorporar grupos que incluyen funcionalidades de éter, amina y ácido carboxílico.

La presente invención se refiere, además, a los metabolitos farmacéuticamente activos de los compuestos, los que se pueden usar también en los métodos de la invención. Un "metabolito farmacéuticamente activo" significa un producto farmacológicamente activo del metabolismo en el cuerpo del compuesto o sal de este. Los profármacos y metabolitos activos de un compuesto se pueden determinar mediante técnicas de rutina conocidas o disponibles en la materia. Véase, por ejemplo, Bertolini, y otros, J Med Chem. 1997, 40, 201 1-2016; Shan, y otros, J Pharm Sci. 1997, 86 (7), 765-767; Bagshawe, Drug Dev Res. 1995, 34, 220-230; Bodor, Adv Drug Res. 1984, 13,

224-331 ; Bundgaard, Design of Prodrugs (Elsevier Press, 1985); and Larsen, Design and Application of Prodrugs, Drug Design and Development (Krogsgaard-Larsen, y otros, eds., Harwood Academic Publishers, 1991 ).

D) Composiciones farmacéuticas

En modalidades particulares de la invención los péptidos tipo estrescopina se usan solos o en combinación con uno o más ingredientes adicionales para formular composiciones farmacéuticas. Una composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto de acuerdo con la invención.

En algunas modalidades la composición farmacéutica comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO:29, en donde el polipéptido contiene un CONH2 en su término carboxi y comprende, además, un conector N-etilsuccinimida o acetamida unido al residuo de cisterna en la posición 28, en donde el conector se une, además, a una porción de PEG. Las porciones de PEG se clasifican según su peso molecular y sus características físicas, tales como ser lineales o ramificadas y se contienen una o más porciones conectoras usadas para unir el PEG al sustrato polipeptídico. En ciertas modalidades preferidas el polipéptido contiene uno o más de estos conectores.

En ciertas modalidades la composición farmacéutica que comprende la porción de PEG puede contener una porción de PEG con un peso en el intervalo de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 80 kDa.

En ciertas modalidades la masa de la fracción de PEG es aproximadamente 2 kDa. En modalidades adicionales, la masa de PEG es aproximadamente 5 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 12 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 20 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 30 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 40 kDa. En ciertas modalidades la masa de PEG es aproximadamente 80 kDa. Dichas composiciones pueden comprender, además, un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La descripción proporciona, además, composiciones (que incluye composiciones farmacéuticas) que comprenden un compuesto o derivados descritos en la presente descripción, y uno o más de vehículo, excipiente, y diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades de la invención, una composición puede contener, además, pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. En una modalidad específica, la composición farmacéutica es farmacéuticamente aceptable para la administración a un humano. En ciertas modalidades la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un compuesto o derivado descritos en la presente descripción. La cantidad de un compuesto o derivado de la invención que será terapéuticamente o profilácticamente efectiva se puede determinar por las técnicas clínicas estándar. Los ejemplos de cantidades efectivas se describen con más detalle en las secciones siguientes. En ciertas

modalidades de la invención, una composición puede contener, además, un estabilizador. Un estabilizador es un compuesto que reduce el índice de degradación química de los péptidos de la composición modificados. Los estabilizadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, los antioxidantes, como el ácido ascórbico, los tampones de pH, o tampones salinos.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para su administración a un sujeto, preferentemente, un humano. En ciertas modalidades las composiciones se encuentran en forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, pildoras, comprimidos, polvos, y formulaciones de liberación sostenida. Las composiciones pueden también ser, particularmente, formas de unidad de dosificación. Los ejemplos de las formas de unidad de dosificación incluyen, pero no se limitan a: comprimidos, tabletas, comprimidos, tales como comprimidos de gelatina blanda elástica, obleas, grageas, tabletas para chupar, dispersiones, supositorios, ungüentos, cataplasmas (emplastos), pastas, polvos, apositos, cremas; emplastos, soluciones, parches, aerosoles (por ejemplo, aerosoles nasales o inhaladores), geles, formas de dosificación líquida adecuadas para la administración oral o de la mucosa de un paciente, que incluye suspensiones (por ejemplo, las suspensiones liquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua, o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elixires, formas de dosificación líquida adecuadas para la administración parenteral a un sujeto, y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos cristalinos o amorfos) que se pueden reconstituir para proporcionar formas de dosificación líquidas, adecuadas para la administración parenteral a un sujeto.

En una modalidad concreta el sujeto es un mamífero tal como una vaca, caballo, oveja, cerdo, ave, gato, perro, ratón, rata, conejo o cobaya. En una modalidad preferida el sujeto es un ser humano. Preferentemente, la composición farmacéutica es adecuada para la administración veterinaria y/o a humanos. De acuerdo con esta modalidad el término "farmacéuticamente aceptable" significa, aprobado para su uso en animales y, más particularmente, para el uso en humanos, por una agencia regulatoria del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas.

Los vehículos farmacéuticos adecuados para ser usadas en las composiciones son líquidos estériles, tales como el agua y aceites, se incluyen aquellos de petróleo, o de origen animal, vegetal o sintético. En una modalidad particular el aceite es el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral o aceite de sésamo. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica es administrada por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerina acuosas se pueden emplear también como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los ejemplos adicionales de vehículos farmacéuticos adecuados son conocidos en la materia, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18.° ed. (Mack Publishing, Easton Pa.).

Los excipientes adecuados para usar en las composiciones incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerina, talco, cloruro sódico, leche descremada seca, glicerina, propilenglicol, agua, y etanol. Si un excipiente particular es adecuado para ser incorporada en una composición farmacéutica, depende de una variedad de factores bien conocidos en la materia, que incluye pero no se limita a, la vía de administración y los ingredientes activos específicos en la composición.

En ciertas modalidades de la invención una composición es una composición anhidra. Las composiciones anhidras se pueden preparar mediante el uso de ingredientes anhidros o que contienen baja humedad y condiciones de bajo contenido de humedad o de baja humedad. Las composiciones que comprenden péptidos modificados con una amina primaria o secundaria son preferentemente anhidros si el contacto sustancial con la humedad y/o la humedad durante la fabricación, el envasado y/o el almacenamiento es el esperado. Una composición anhidra se debe preparar y almacenar de tal manera que su naturaleza anhidra se mantenga. Por consiguiente, las composiciones anhidras se envasan, preferentemente, mediante el uso de materiales conocidos para evitar la exposición al agua de manera que se puedan incluir en los formularios de kits adecuados. Los ejemplos de envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, láminas herméticamente selladas, plásticos, envases de dosis unitarias (por ejemplo, frascos), envases tipo burbujas, y los paquetes de tira.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos o derivados descritos en la presente descripción, o sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, se formulan para ser compatibles con la ruta de administración prevista. Las formulaciones son, preferentemente, para la administración subcutánea, pero pueden ser para la administración por otros medios, tales como por inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o la nariz), intradérmica, oral, bucal, parenteral, vaginal o rectal. Preferentemente, las composiciones se formulan para proporcionar una mayor estabilidad química del compuesto durante el almacenamiento y el transporte. Las formulaciones pueden ser liofilizadas o formulaciones líquidas

En una modalidad los compuestos o derivados se formulan para la administración intravenosa. Las formulaciones intravenosas pueden incluir vehículos estándar, tales como soluciones salinas. En otras modalidades los compuestos o derivados se formulan para la inyección. En una modalidad preferida los compuestos o derivados son formulaciones liofilizadas estériles, sustancialmente libres de contaminación de material celular, productos químicos, virus o toxinas. En una modalidad particular los compuestos o derivados se formulan en forma líquida. En otra modalidad particular las formulaciones de inyección se presentan en envases estériles de dosis única. En una modalidad particular las formulaciones de inyección se presentan en envases estériles de dosis única. Las formulaciones pueden o no contener un conservante añadido. Los preparados líquidos pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos

oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

E) Administración

Un compuesto o derivado que se describe en la presente descripción, o una sal farmacéuticamente aceptable de este se administra, preferentemente, como un componente de una composición que comprende, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. El compuesto o derivado se administra, preferentemente, por vía subcutánea. Otro método de administración preferido es mediante inyección intravenosa o infusión intravenosa continua del compuesto o derivado. Preferentemente, la administración se hace a través de infusión para alcanzar un estado de reposo seudo estático en los niveles en plasma sanguíneo por absorción sistémica lenta y aclaramiento del compuesto o derivado.

En ciertas modalidades el compuesto o derivado se administra por cualquier otra vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, o por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, rectal, y la mucosa intestinal). Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a: parenteral, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmico, rectal, por inhalación o por vía tópica, particularmente, en los oídos, la nariz, los ojos o la piel. En la mayoría de los casos la administración tendrá como resultado la liberación del compuesto o derivado al torrente sanguíneo. En modalidades preferidas el compuesto o derivado se administra por vía intravenosa o por vía subcutánea.

La preparación puede ser en forma de tabletas, cápsulas, sachets, grageas, polvos, gránulos, pastillas, polvos para reconstitución, preparaciones líquidas o supositorios. Preferentemente, las composiciones se formulan para infusión intravenosa o inyección de bolo, infusión subcutánea o inyección de bolo, o inyección intramuscular.

El compuesto se administra, preferentemente, por rutas no orales. Por ejemplo, se pueden formular composiciones para administración rectal en forma de supositorio. Para uso parenteral, que incluye rutas intravenosas, intramusculares, intraperitoneales o subcutáneas, se pueden proporcionar los agentes de la invención en soluciones o suspensiones acuosas estériles, reguladas a un pH adecuado e isotonicidad o un aceite parenteralmente aceptable. Los vehículos acuosos adecuados incluyen la solución de Ringer, solución de dextrosa, y cloruro sódico isotónico. Dichas formas pueden presentarse como dosis unitarias en forma de ampollas o dispositivos de inyección descartables, tales como multidosis, por ejemplo, frascos de los que se puede sacar la dosis adecuada, o en forma sólida o preconcentrada que se puede usar para preparar una formulación inyectable. Las dosis de infusión ilustrativas se pueden administrar durante un período en el intervalo desde varios minutos hasta varios días. En otra modalidad adicional una cantidad efectiva del péptido de la invención puede estar

recubierta en nanoparticulas o proporcionada en un "depósito" adecuado para el suministro subcutáneo (Hawkins y otros, Adv Drug Deliv Rev., 2008, vol. 60, págs. 876-885; Montalvo y otros, Nanotechnology, 2008, vol. 19, págs. 1 -7).

Los agentes activos se pueden administrar mediante métodos de inhalación. Tales métodos pueden usar técnicas de formulación de polvo seco (Johnson y otros, Adv Drug Del Rev., 1997, vol. 26(1 ), págs. 3-1 5) y/o aerosol (Sangwan y otros, J Aerosol Med. , 2001 , vol. 14(2), págs. 185-195; Int. patente internacional núm. WO2002/094342).

En las modalidades de los métodos de tratamiento de acuerdo con la invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente activo de acuerdo con la invención se administra a un individuo que padece de o se diagnostica como que tiene una enfermedad, trastorno o afección, tales como la insuficiencia cardiaca, la diabetes, la pérdida de músculo esquelético, y la sarcopenia. Las afecciones adicionales incluyen la actividad motora inadecuada, consumo de alimentos, o la necesidad de una actividad cardioprotectora, broncorrelajante, y/o antiinflamatoria. Las cantidades o dosis terapéuticamente efectivas de los agentes activos de la presente invención se pueden determinar con métodos de rutina tales como modelado, estudios de aumento de dosis o pruebas clínicas, y tomando en consideración factores de rutina, por ejemplo, el modo o ruta de administración o suministro de fármaco, la farmacocinética del agente, la gravedad y curso de la enfermedad, trastorno o afección, la terapia previa o actual del sujeto, la condición de salud del sujeto y sus respuesta a los fármacos y la opinión del médico tratante.

Un índice de dosis intravenosa ejemplar está en el intervalo de aproximadamente 0.2 ng a aproximadamente 52 ng de agente activo relacionado con estrescopina por kg de peso del sujeto por minuto, preferentemente, aproximadamente 0.2 ng/kg/min a aproximadamente 22 ng/kg/min, o equivalentemente de aproximadamente 0.3 pg/kg aproximadamente 32 pg/kg al día. En el caso de la infusión en bolo o inyección subcutánea, la dosis total se puede administrar en unidades de dosis única o divididas (por ejemplo, BID, TID, QID, dos veces a la semana, cada dos semanas o mensual). Para un humano de 70 kg, un intervalo ilustrativo para una cantidad de dosis adecuada es de aproximadamente 1 mg/día a aproximadamente 1 pg/día. Se pueden usar regímenes de dosis semanales como una alternativa a la administración diaria.

En otra modalidad preferida el péptido agonista del CRHR2 de la SEQ ID NO: 102, que comprende un conector acetamida que une un PEG de aproximadamente 20 kDa con el residuo de cisteína en la posición 28 de la secuencia de péptidos, se administra a una dosis de 10 pg kg por inyección subcutánea en bolo a un paciente que lo requiere. La frecuencia de esta dosis debe estar en el intervalo desde una vez al día a menos frecuente lo que se basa en las necesidades terapéuticas del sujeto y otras consideraciones clínicas.

Una persona con experiencia en la materia usaría información de modelos, pruebas clínicas e información de factores de rutina, como se mencionó anteriormente, para determinar las cantidades efectivas del fármaco para el tratamiento.

En una modalidad un compuesto de la SEQ ID NO.1 o una composición farmacéutica de este se administra por infusión intravenosa para alcanzar un estado de reposo de la concentración en plasma sanguíneo del compuesto terapéuticamente activo después de aproximadamente 1 hora para un período de tratamiento previsto de 24 horas. Después de interrumpir la administración del fármaco el efecto terapéutico se pierde en aproximadamente 30 minutos. Esta modalidad puede ser adecuada para una situación de cuidados agudos (Figura 2A).

En otra modalidad un compuesto de la SEQ ID NO:1 o una composición farmacéutica de este se administra por infusión subcutánea para alcanzar un estado de reposo de concentración en plasma sanguíneo del compuesto terapéuticamente activo en aproximadamente 4 horas. Después de interrumpir la administración del fármaco el efecto terapéutico se pierde en aproximadamente 1 hora. Esta modalidad puede ser adecuada para cuidados ambulatorios (Figura 2B).

En otra modalidad adicional un compuesto de la SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 102 o una composición farmacéutica de éstos se administra por una o más inyecciones subcutáneas en bolo durante un periodo de tiempo en el intervalo de 1 a 7 días para alcanzar un estado de reposo de la concentración en plasma sanguíneo en aproximadamente 4-8 horas o más. Después de interrumpir la administración del fármaco el efecto terapéutico se pierde en aproximadamente 3-5 días y se reduce el efecto del compuesto. La ventaja de esta modalidad es el bajo mantenimiento por parte del paciente y del profesional en cuidados de la salud y se puede adaptar a una situación de cuidados ambulatorios. Un tratamiento de rescate posible en vista de un evento adverso puede involucrar beta-bloqueadores entre otros medicamentos (Figura 2C).

Una vez producida la mejora en la enfermedad, trastorno o afección del paciente, la dosis puede ajustarse para el tratamiento de prevención o mantenimiento. Por ejemplo, la dosificación o frecuencia de administración, o ambas, se pueden reducir en función de los síntomas, hasta un nivel en el que el efecto terapéutico o profiláctico deseado se mantenga. Si los síntomas se alivian a un nivel adecuado se puede concluir el tratamiento. Los pacientes pueden, sin embargo, requerir un tratamiento intermitente a largo plazo si vuelven a aparecer los síntomas.

En ciertas modalidades los compuestos o derivados se administran en combinación con uno o más agentes biológicamente activos como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas modalidades los compuestos o derivados se administran antes de, simultáneamente con o después de la administración de uno o más agentes biológicamente activos distintos. En una modalidad el agente o agentes biológicamente activos distintos se administran en la misma composición farmacéutica con un compuesto o derivado descrito en la presente descripción. En otra modalidad el agente o agentes biológicamente activos distintos se administran en una composición farmacéutica separada con un compuesto o derivado descrito en la presente descripción. De conformidad con esta modalidad, el agente o agentes biológicamente activos distintos se pueden administrar al sujeto por rutas de administración iguales o distintas a las que se usan para administrar el compuesto o derivado.

En otra modalidad el compuesto o derivado se puede administrar con uno o más compuestos o composiciones distintas para reducir el riesgo o para tratar una enfermedad cardiovascular. Los compuestos o composiciones que reducen el riesgo o tratan las enfermedades cardiovasculares incluyen, pero no se limitan a, agentes antiinflamatorios, agentes antitrombóticos, agentes antiplaquetarios, agentes fibrinoliticos, agentes trombolíticos, agentes que reducen lipidos, inhibidores directos de la trombina, inhibidores anti-Xa, inhibidores anti-lla, inhibidores de los receptores de la glucoproteína llb/llla e inhibidores directos de la trombina. Los ejemplos de agentes se pueden administrar en combinación con el compuesto o derivado descrito en la presente descripción incluyen bivalirudina, hirudina, hirugeno, Angiomax, agatroban, PPACK, aptámeros de trombina, aspirina, inhibidores de GPIIb/llla (por ejemplo, Integrelin), inhibidores de P2Y12, tienopiridina, ticlopidina y clopidogrel.

En modalidades, el compuesto se formula en formas de dosificación adecuadas para la administración a los pacientes que necesitan de este. Los procesos y equipo para preparar las partículas del fármaco y del portador se describen en Pharmaceutical Sciences, Remington, 17.° ed., págs. 1585-1594 (1985); Chemical Engineers Handbook, Perry, 6.° Ed., págs. 21 -13 a 21 -19 (1984); Parrot y otros, J. Pharm. Sci. , 61 (6), págs. 813-829 (1974) y Hixon y otros, Chem. Engineering, págs. 94-103 (1990).

La cantidad de compuesto que se incorpora en las formas de dosificación de la presente invención pueden variar, generalmente, desde aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % en peso de la composición en dependencia de la indicación terapéutica y el período de administración deseado, por ejemplo, cada 12 horas, cada 24 horas, y similares. Dependiendo de la dosis del compuesto que se desea administrar, se pueden administrar una o más de las formas de dosificación. Dependiendo de la formulación, el compuesto estará, preferentemente, en forma de una sal de HCI o en forma de base libre.

Además, esta invención también se relaciona con una composición farmacéutica o una forma de dosificación farmacéutica, como se describió anteriormente en la presente descripción, para el uso en un método de terapia o diagnóstico del cuerpo animal humano o no-humano.

Esta invención se relaciona, además, con una composición farmacéutica para usar en la fabricación de una forma de dosificación farmacéutica para la administración oral a un mamífero que necesite el tratamiento, caracterizada porque dicha forma de dosificación se puede administrar en cualquier momento del día, independientemente de los alimentos que tomó dicho mamífero.

Esta invención se relaciona, además, con un método de terapia o diagnóstico del cuerpo animal humano o no-humano, el método comprende administrar a dicho cuerpo una dosis terapéutica o diagnóstica efectiva de una composición farmacéutica que se describe en la presente descripción.

Esta invención se relaciona, además, con un paquete farmacéutico adecuado para la venta comercial; el paquete comprende un contenedor, una forma de dosificación como se describe en la presente descripción, y asociados a dicho paquete material escrito que no se limita a si la forma de dosificación se puede administrar con o sin alimentos.

Los siguientes ejemplos de formulación son sólo ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las invenciones de ninguna manera.

EJEMPLOS

F) Síntesis de ejemplo

Síntesis 1. Síntesis y purificación del polipéptido

El polipéptido de la SEQ ID NO:29 se preparó por una reacción de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de múltiples péptidos Rainin Symphony (modelo SMPS-110) con el uso de la versión 3.3.0 del programa. Resin (NovaSyn TGR®, 440 mg, aproximadamente 0.1 mmoles, 0.23 mmol/g de sustitución, lote núm. A33379) que se usó para la síntesis de péptidos amidas fue una combinación de polietilenglicol y poliestireno funcionalizados con un conector amida Rink ácido-lábil modificado.

Los aminoácidos que se usaron en la síntesis contenían grupos de protección Να-9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) en el terminal C y los siguientes grupos protectores de cadena lateral: Arg (2,2,4,6,7-

pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo, PBF), Asp(butox¡ terciario, OtBu), Asn(tritilo, Trt), Gln(Tr.), Cys(Trt), His(Trt), Lys(t-butoxicarbonilo, Boc), Ser(butilo terciario, tBu) y Thr(tBu).

Las reacciones de acoplamiento se llevaron a cabo mediante la mezcla de resina de N-metilpirrolidinona (NMP) pre-hinchada (0.1 mmoles), un exceso molar de 5 veces de amino ácido-Fmoc en DMF (2.5 mi) y se añadió un exceso molar de 5 veces de hexafluorofosfato (HBTU) con un exceso molar de 10 veces de la N-metilmorfolina (NMM) en DMF (2.5 mi), entonces se acoplaron por 45 minutos. Para la eliminación de Fmoc, las reacciones se incubaron con una solución 20 % de piperidina/DMF por 2 minutos. La solución se drenó y se añadió 20 % de piperidina/DMF fresca y se incubó por 18 minutos. Las reacciones se lavaron con NMP y las adiciones subsecuentes de aminoácidos se realizaron por la repetición de las etapas de acoplamiento. Para el acoplamiento de terminal C a Ile40, Gln39, Asn19, Asn12 y Val9 numeradas desde el terminal N, las etapas de acoplamiento se realizaron dos veces.

El clivaje del péptido de la resina se realizó mediante un programa de clivaje de dos horas y la incubación con 9 mi de la mezcla de clivaje que comprende ácido trifluoroacético (TFA) (100 mi), 1 ,2-etanoditiol (EDT) (20.0 mi), fenol (7.5 g), tioanisol (5 mi), triisopropilsilano (TIS) (5 mi) y agua (5 mi). La solución del péptido clivado se transfirió a un tubo de centrífuga BD de 50 mi de polipropileno, y el péptido se precipitó con éter etílico frío (40 mi). La mezcla se centrifugó y el éter etílico se decantó del péptido. Se añadió éter etílico (40 mi), la mezcla se agitó y se centrifugó, y el éter etílico se decantó. Estas etapas (adición de éter etílico fresco, agitación, centrifugación, y decantación) se repitieron dos veces más. El péptido se secó al vacío para dar 408 mg (92 % de rendimiento) del producto crudo.

La purificación del polipéptido se llevó a cabo en un sistema de HPLC preparativo Waters (Waters, MA, Estados Unidos). El péptido crudo (-100 mg) se disolvió en 20/30/50 de ácido acético/ acetonítrilo/ agua que contenía 0.1 % de TFA. El material se inyectó en dos columnas Vydac C-18 (10 mm, 2.5 x 25 cm). Después de la inyección, un gradiente de 0-45 % del solvente B (solvente B= 80 % de acetonítrilo que contenía 0.1 % TFA) más de 5 min y 45-70 % del solvente B por 60 minutos con un índice de flujo de 6 ml/min se usó para purificar el péptido. Las fracciones se recogieron y se analizaron por RP-HPLC analítico, MALDI-TOF MS, y CE. Las fracciones más puras se reunieron y se liofílizaron para dar 23 mg del producto. MALDI-TOF MS rindió un peso molecular del producto para igualar 4400.5, el cual es mayor que el peso molecular que se calculó para Ci95H326N56053S3 de 4399.2 por un átomo de hidrógeno La liofílizacíón se realizó mediante la congelación instantánea del líquido en un baño de hielo seco de acetona durante aproximadamente 30 minutos. Después de la congelación, el producto, en un frasco abierto, se cubrió con papel de filtro y se colocó en alto vacío. Después de 24 horas bajo alto vacío la muestra seca se retiró del vacío y se guardó en un recipiente sellado para su uso futuro.

Síntesis 2. Conjugación del polipéptido con N-etilmaleimida

La nivelación sitio dirigida con N-etilmaleimida sobre los residuos de cisteína, como se muestra en el Esquema 1 , se logró bajo las condiciones siguientes.

N-etilmaleimida


TKrTLSLDVPTNIMNLLFNIAKAKNLríCO/vAANAHL AQI-amida (SEO iD NO:29i

En un vial de polipropileno de 2.5 mi se disolvió 2.0 mg del péptido de la invención en 1.0 mi de agua. Se añadieron inmediatamente veinte microlitros de 0.1 M de N-etilmaleimida acuosa. La reacción se agitó suavemente a temperatura ambiente por 2 horas. Las mezclas de reacción se purificaron en una columna de HPLC Summit APS (Dionex, CA, Estados Unidos) que se ajustó con una columna Vydac C18 300 Angstrom, (10X250 mm; Grace Davison, IL, Estados Unidos) con el uso del siguiente protocolo que se muestra en la Tabla 6. Las fracciones finales se recogieron, y se analizaron por HPLC, y las fracciones puras se reunieron y se liofilizaron.

TABLA 6


Síntesis 3. Conjugación del polipéptido con vodoacetamida-PEG Yodoacetamida-PEG, una cadena lineal de polietilenglicol de 20 kDa con un término de yodoacetamida y presente en cantidades limitantes a un pH ligeramente alcalino con el polipéptido de la SEQ ID NO:29 produjo la modificación de la cisteína como una reacción exclusiva, tal como se muestra en el Esquema 2. El tiol de cisteína actuó como un punto de unión selectivo para la yodacetamida-PEG. La unión derivativa alfa sulfahidrilacetamida que resultó fue aquiral.

ESQUEMA 2


TKFTLSLDVPTNIMNLLFNIAKAKNLRCQAAANAHLMAQI-amida

A un recipiente cónico de 15 mi se añadió 25 mg (5.68 mmoles, 1.0 eq) de péptido de SEQ ID NO: 1. En el mismo recipiente se añadió 140 mg (6.82 mmoles, 1.2 eq, 95 % activo) de PEG-20 yodoacetamida (lote núm. M77592) de Nippon, Oil and Fat (NOF) Corp. 10 mi de agua y la solución se agitó hasta que todos los sólidos se disolvieron. Para la solución turbia, se añadió 50 mi de piridina con un pH de la solución de aproximadamente 8.91. Después de 2 horas se retiró una alícuota de 20 mi de muestra y se analizó por HPLC de fase reversa por medio del uso de una columna Phenomenex C6-fenil con 0.1 % TFA /acetonitrilo como eluyente. La muestra presentó una reacción casi completa después de 2 horas (Figura 3A). La mezcla de reacción se purificó directamente por HPLC por medio del uso de una columna Phenomenex C6-fenil 10 x 150 mm. Los eluyentes para la purificación fueron 0.1 % agua TFA y 80 % de acetonitrilo en 0.1 agua TFA. Las purificaciones se hicieron en lotes de muestra de 2-3 mi) (Figura 3B). Las fracciones purificadas se combinaron y liofiliza ron en un recipiente cónico de 50 mi. El sólido liofilizado se diluyó en 10 mi de agua y se re-liofilizó. Aproximadamente 1 mg del producto final se diluyó a 1 mg/ml y se sometió a análisis espectroscópico de masas (Figura 3C). El peso promedio del compuesto pegilado de SEQ ID NO: 102 fue de 25.449 dalton debido en parte a la heterogeneidad en la longitud del polímero PEG, y el compuesto apareció como un sólido blanco amorfo.

Síntesis 4. Pegilación del polipéptido con conector N-etilmaleimida

En un vial de polipropileno de 2.5 mi se disolvió 2.0 mg (~ 0.44 nmol) del polipéptido en 2.5 mi de agua seguido por la adición inmediata de polietilenglicoles activados y derivados de N-etilmaleimida de distinto peso molecular con el uso de las cantidades que se muestran en la Tabla 7.

ESQUEMA 3

Reactivo PEG


(SEO ID NO:82)

La mezcla de reacción se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 2 horas.

TABLA 7



Las mezclas de reacción se purificaron en una columna de HPLC Summit APS (Dionex, CA, Estados Unidos) ajustada con una columna Gemini 5u C6-fenil 110 Angstrom (10X100 mm; Phenomenex, CA, Estados Unidos) con el uso del protocolo de la Tabla 8.

TABLA 8


G) Ejemplos biológicos

Estudio núm. 1 : actividad agonista de CRHR2 y CRHR1 -Ensayo con cA P

La actividad agonista de CRHR2 y de CRHR1 de la familia de

CRH se caracterizó en dos líneas de células SK-N-MC (neuroblastoma humano) transfectadas ya sea con CRHR2 humano o con CRHR1 humano en un ensayo de adenosina 3',5'-monofosfato cíclico (cAMP). La h-SCP (SEQ ID NO:1 ) fue equipotente con h-UCN2 (SEQ ID NO:1 15) en este ensayo y demostró ser el agonista más selectivo de CRHR2 en la familia de CRH (Figura 4). La concentración requerida para el 50 % del efecto máximo (A50) fue de 0.4 nM.

El CRHR1 (número de acceso X72304) o CRHR2 (número de acceso U34587) humanos se clonaron en el vector de expresión pcDNA3.1/Zeo y se transfectaron establemente en células SK-N-MC por electroporación. Las células se mantuvieron en MEM w/sal de EarI con SFB al 10 %, 50 U.l. de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 0.1 mM de amino ácidos no esenciales, . 600 g/ml G418. Las células se cultivaron a 37 °C en C02 al 5 %.

Las células se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios (Biocoat de BD Biosciences) durante la noche a 50,000 células/pocilio. Las células se lavaron con PBS, después, se resuspendieron en DMEM F-12 sin rojo fenol, que contenía 10 μΜ isobutilmetilxantina

(IBMX). Las células se incubaron con los péptidos a concentraciones en el intervalo de 1 pM a 10 μΜ durante 60 minutos a 37° Celcius Para la evaluación posterior de cualquier actividad antagonista de aquellos péptidos que no producen una respuesta agonista, los péptidos se preincubaron a 10 μΜ por 20 minutos antes de la adición de h-SCP por 60 minutos. Forescolina (10 μΜ), un estimulante directo de la adenilato ciclasa, se usó como control positivo. Los ensayos se detuvieron por la adición de 0.5 M de HCI y se mezclaron por rotación orbital durante 2 horas a 4° Celcius.

Para evaluar la actividad del polipéptido de la invención en el CRHR2, se usó una prueba de medición de cAMP intracelular con el uso de un ensayo radioactivo Flash píate (catálogo núm. Cus56088; Perkin Elmer, MA, Estados Unidos).

Las células SK-N-MC transfectadas se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios Biocoat (BD Biosciences, San José, CA, Estados Unidos) durante la noche a 50,000 células/pocilio. Las células se lavaron primero con PBS y luego se suspendieron con DMEM/F-12 sin rojo fenol, que contenía μΜ de isobutilmetilxantina (IBMX). Las células en suspensión se transfirieron a una placa flash de 96 pocilios recubierta con fluido de centelleo. Las células se incubaron con péptidos en el intervalo desde 1 pM a 1 μΜ, por 60 minutos, a 37° Celcius. Se usó la forescolina a 10 μΜ como control positivo. Después de la estimulación con el ligando, las células se lisaron por la adición de 0.5 M de HCI y se mezclaron por rotación orbital durante 2 horas a 4o Celcius con el fin de liberar el cAMP intracelular al medio.

El medio que contenía el cAMP intracelular liberado se trasladó a una placa flash de 96 pocilios recubierta con fluido de centelleo que contenía un anticuerpo anti-cAMP. En este ensayo, el cAMP intracelular compite con el cAMP marcado con 125l por la unión al anticuerpo. Para generar una curva estándar, cAMP en el intervalo de 2.5 a 250 pmoles/ml se incluyó en el experimento. Se determinó el [ 25l]-cAMP en un contador de centelleo TopCount (Perkin Elmer, MA, Estados Unidos).

Los datos de la curva de concentración-respuesta de los agonista individuales se ajustaron a la ecuación de Hill, véase la fórmula a continuación, por medio del uso de GraphPad Prism (software GraphPad, La Jolla, CA, Estados Unidos), para proporcionar cálculos de la concentración de agonista necesarias para generar los parámetros de una mitad de la respuesta máxima (A50), y la asíntota máxima (A50) y la asíntota máxima (a) y los parámetros de la pendiente Hill (nH). En esta ecuación, [A] es la concentración de agonista y E es el efecto medido:

[A]% + [AY"

Para fines de presentación la media de los parámetros calculados ajustados se usaron para general una curva única E/[A] que se muestra superpuesta sobre la media de los datos experimentales. Los cálculos de potencia para los agonistas, pA50 se expresan como el logaritmo negativo del punto medio de cada curva y se enumeran con su error estándar de la media (EEM) Se calculó el logaritmo en base 10 de los valores del índice de infusión del agonista (Log Vi) por sustracción del valor de pA5o del valor de control pA5o de h-SCP correspondiente (SEQ ID NO:1 ) dentro del mismo lote de ensayo. Los valores de EEM de los valores Log Vi se dan por la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de los valores EEM del control h-SCP (SEQ ID NO: 1) y los valores pA5o del compuesto del ensayo.

TABLA 9

Péptido antagonista del CRHR - anti-sauvaqina-30

FHLLR KMIEI EKQEK EKQQA ANNRL LLDTI-NH2 SV30 SEQ ID NO:118

La respuesta de cAMP mediada por CRHR2 a la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) se bloqueó por el antagonista selectivo de CRHR2, anti-sauvagina-30 (SV30, SEQ ID NO: 1 18 que se enumera en la Tabla 9), en una forma dependiente de la concentración que coincide con el antagonismo competitivo superable (Figura 5). La presencia de anticuerpos anti-sauvagina-30 produjo un valor de pA2 de 7.82 para el compuesto de la SEQ ID NO: 1 .

TABLA 10


Los péptidos humanos y de ratas (véase la Tabla 10) se usaron en la estimulación de las células SK-N-MC transfectadas con h-CRHR1 o h-CRHR2 en el ensayo cAMP de flash píate. Los péptidos se incubaron durante 1 hora a 37° Celcius. Las curvas se calcularon por medio del uso del análisis de regresión no lineal de concentración-respuesta sigmoidea en GraphPad Prism. Los valores de pA50 que se obtuvieron así se muestran en la Tabla 11 , en adición a los valores de la literatura.

TABLA 11

Publicado Experimental

Receptor Péptido pA5o pA5o EEM nH EEM EEM n

CRHR1 r-UCN1 9.82 1 9.19 0.07 1.15 0.19 99.61 3.28 12

CRHR1 h-SRP > 7 3 6.34 0 03 1.61 0.15 NA 20

CRHR1 h-SRP > 7 3 6.2 0.04 1.33 0.17 NA 11

CRHR1 h-SRP > 7 3 6.28 0.03 1.26 0.13 NA 17

CRHR1 h-UCN2 6.02 0.02 1.69 0.18 NA 15

CRHR1 h-UCN3 <5

CRHR1 h-SCP <5

CRHR2 r-UCN1 10.06 2 9.08 0.05 1.07 0.11 110.5 2.49 12

CRHR2 h-UCN2 9.37 2/ 9.12 5 8.04 0.05 0.9 0.09 114.7 2.89 16

CRHR2 h-UCN3 9.922 9.26 0.05 1.02 0.11 101.8 2.18 12

CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.41 0.06 0.99 0.12 99.31 2.69 16

CRHR2 h-SRP ~ 9 4 9.32 0.05 1.08 0.11 113.5 2.3 16

CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.15 0.03 1 .04 0.06 97.53 1.29 32

CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.36 0.04 1 .39 0.05 116.1 2.59 20

CRHR2 h-SCP ~ 9 4 9.39 0.02 1.55 0.12 98.2 1.31 30

CRHR2 h-UCN2 9.37 2/ 9.12 5 9.22 0.04 0.72 0.05 128.9 2.95 40

CRHR2 h-SRP ~ 9 4 9.58 0.05 1 .06 0.13 108.7 2.48 25

CRHR2 h-SRP ~ 9 4 9.23 0.03 0.99 0.06 98.56 1.42 36

Los datos en cursiva representan aproximaciones de potencia; NA=datos no disponibles debido a la baja potencia y el suministro de péptidos limitado, los valores de los datos publicados se obtuvieron con los péptidos sintetizados internamente por el autor que se usan para la estimulación por cAMP de los siguientes sistemas transfectados:

células CHO- 1 transfectadas con h-CRHR1 o con 2 m-CRHR2b (Lewis, K. y otros, 2001 , PNAS, vol. 98, págs. 7570-5);

células HEK-293 transfectadas con h-CRHR1 o 4 h-CRHR2b, valores aproximados de las curvas de concentración-respuesta (Hsu, SY y otros, 2001 , Nat. Med., vol. 7, págs. 605-1 1);

células HEK-293 transfectadas con m-CRHR2b (Brauns, O. y otros, 2002, Peptides, vol. 23, págs. 881 -888).

Los efectos de la amidación del dominio C terminal de la h-SCP sobre la actividad agonista, en términos de potencia y/o actividad intrínseca, se

investigaron a partir de que bibliotecas de péptidos recombinantes no amidatados serían difíciles de ensayar en las células SK-N-MC transfectadas con CRHR2.

Para investigar la contribución de los diferentes aminoácidos a la actividad agonista del péptido se sintetizaron varios péptidos modificados, lo que comenzó con 1-7 eliminaciones en la secuencia terminal N. Cada péptido se disolvió en agua a concentraciones de patrones de 1 m y se almacenó en tubos Eppendorf (núm. de catálogo 022 364 1 11 ) en alícuotas a -40° Celcius. Los péptidos se descongelaron sólo una vez, en el día del experimento, y se diluyeron más en el tampón del ensayo de cAMP.

Todos los péptidos que produjeron el cAMP en las células SK-N- MC transfectadas con el h-CRHR2, lograron respuestas máximas similares dentro de cada replica experimental. Sin embargo, la respuesta máxima a h-SCP (SEQ ID NO:1) varió entre repeticiones diarias, por lo que los datos se normalizaron a la respuesta máxima a h-SCP obtenidos dentro de cada repetición. Después, los datos de 3-5 experimentos de copia se combinaron para el cálculo final de los parámetros de la curva concentración-efecto del agonista (Figura 6). Los valores de pA¾) obtenidos se muestran en la Tabla 12.

El h-SCP no amidatado (SEQ ID NO: 1 13) fue aproximadamente 200 veces menos potente que el péptido parental amidatado aunque la respuesta máxima fue indistinguible. En un lote el péptido h-SCP parental de 40 aminoácidos (SEQ ID NO:1) produjo un valor de pA50 de 9.41 ± 0.03. La amidación terminal si bien es importante para la potencia, no es esencial y se obtuvo una curva totalmente definida de concentración-efecto con el

péptido no-amidatado con la misma respuesta máxima que el péptido amidatado parental.

La eliminación de un aminoácido (SEQ ID NO: 107) no tuvo un efecto significativo en la potencia (pA5o 9.24 ± 0.05), mientras que la supresión de tres (SEQ ID NO: 108) y cuatro (SEQ ID NO: 109) aminoácidos resultó en una reducción progresiva de los valores de pA50 (8.49 ± 0.08 y 7.33 ± 0.9), respectivamente, y también se muestran en la Tabla 12. La eliminación de cinco o más aminoácidos (SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO:1 1 1 y SEQ ID NO: 112).) resultó en la pérdida completa de la actividad agonista (Figura 6). Por lo tanto, los tres últimos péptidos se evaluaron como antagonistas de la h-SCP a una concentración de 10 μΜ (Figura 7). Ninguno de los péptidos tuvo un efecto significativo en la curva de concentración-efecto de h-SCP, lo que indica que los péptidos no solo no tuvieron eficacia intrínseca detectable, sino tampoco una ocupación del receptor importante, es decir una afinidad menor de 10 pM.

Eliminaciones de 4 o más aminoácidos en el dominio terminal N en la secuencia de h-SCP afectan la potencia del péptido. Los péptidos con una a cuatro eliminaciones de aminoácidos del dominio terminal N tuvieron una reducción progresiva de la potencia, mientras que los péptidos con eliminaciones de cinco o más aminoácidos resultaron en la pérdida completa de la actividad agonista y la afinidad del receptor (KA >10 μΜ). Esto último se esperaba, en base a un reporte previo de un análisis similar que se realizó en h-UCN2 (Isfort, R.J. y otros, 2006, Peptídes, vol. 27, págs. 1806-1813), debido a que las deleciones están cerca del aminoácido conservado en la posición 6 y el ácido aspártico en la posición 8.

TABLA 12

SEQ ID NO: pAso EEM nH EEM. <-m4x. EEM n

1 9.41 0.04 1.18 0.1 1 98.68 1.59 22

113 7.10 0.06 1.07 0.13 107.4 5.45 18

107 9.25 0.05 1.07 0.12 11 1.3 2.52 9

108 8.49 0.08 0.82 0.10 106.3 5.05 12

109 7.34 0.09 0.74 0.10 109.6 6.16 12

1 10 NR 12

11 1 NR 12

1 12 NR 12

NR = no hay respuesta

Además, se investigaron los efectos de la mutación de cisterna, la nivelación con N-etilmaleimida y la pegilación sobre la actividad agonista del péptido. El control pA50 de h-SCP (SEQ ID NO:1) varió para los diferentes lotes de ensayo desde 9.47 a 9.74 con EEM de 0.03 a 0.1 1 . Una vez más, varios péptidos modificados se sintetizaron de acuerdo a los esquemas anteriores, y los resultados del ensayo para estos péptidos se enumeran en la Tabla 13.

TABLA 13

Log Vi Log Vi

SEQ ID NO pA5o EEM EEM SEQ ID NO pAM EEM EEM

[M] [M]

2 8.97 0.02 0.72 0.03 55 -7.93 -1.61

3 8.97 0.03 0.72 0.03 56 -7.20 -2.34

4 8.65 0.06 1.03 0.07 57 -7.64 -1.90

5 8.93 0.04 0.76 0.05 58 -7.14 -2.40

6 9.07 0.04 0.61 0.05 59 -7.22 -2.32

7 7.60 0.09 2.08 0.10 60 -6.32 >3.22

8 -6.82 2.86 61 -6.22 >3.32

9 7 80 0.06 1.89 0.07 62 -6.06 >3.48

10 8.28 0.08 1.30 0.09 63 -7.45 -2.12

1 1 8.76 0.06 0.82 0.07 64 -6.98 -2.59

12 7.86 0.10 1.72 0.11 65 -6.82 -2.75

13 9.59 0.04 -0.01 0.06 66 8.31 0.04 1.26 0.05

14 -7.34 >2 67 -6.35 >3

15 8.68 0.04 0.90 0.06 68 -6.96 -2.61

16 8.93 0.03 0.76 0.03 69 7.45 0.05 2.09 0.05

17 9.50 0.07 0.02 1.02 70 -7.34 -2.07

18 8.41 0.09 1.11 1.72 71 -7.35 -2.26

19 8.01 0.04 1.67 0.04 72 8.04 0.04 1.50 0.04

20 9.00 0.08 0.52 0.74 73 8.29 0.10 1.1 1 0.18

21 8.75 0.06 0.77 1.44 74 -7.33 -2.28

22 9.17 0.04 0.52 0.04 75 8.24 0.06 1.30 0.06

23 8.55 0.03 1.13 0.04 76 6.84 0.09 2.70 0.09

24 8.94 0.03 0.74 0.03 77 8.27 0.05 1.27 0.05

25 9.17 0.08 0.35 2.51 78 -7.89 -1.52

26 9.44 0.04 0.08 2.58 79 8.50 0.12 1.11 0.15

27 8.76 0.10 0.76 2.61 80 7.60 0.10 1.75 0.15

28 9.36 0.07 1.61 0.09 81 7.83 0.03 1.82 0.07

29 9.47 0.06 0.00 0.07 82 8.40 0.15 1.12 0.19

30 8.40 0.05 1.28 0.05 83 7.91 0.05 1.63 0.05

31 8.02 0.08 1.61 0.09 84 -6.82 -2.84

32 9.41 0.05 0.11 2.80 85 8.51 0.08 0.89 0.17

33 9.07 0.06 0.45 2.83 86 8.79 0.12 0.82 0.15

34 -6.32 >3.19 87 -6.00 >3.68

35 8.93 0.06 0.70 0.07 88 8.12 0.03 1.55 0.04

36 9.10 0.07 0.42 2.88 89 8.48 0.08 0.98 0.14

37 8.58 0.10 1.05 0.11 90 -7.49 -2.17

38 -6.67 >2.95 91 -6.23 >3.43

39 9.21 0.04 0.41 0.06 92 8.12 0.03 1.55 0.04

40 9.08 0.04 0.55 0.06 93 8.20 0.04 1.47 0.04

41 7.45 0.27 2.07 2.94 94 -7.00 >2.39

95 9.31 0.12 0.43 0.14 42 -7.75 -1.72

96 8.74 0.11 1 0.13 43 9.79 0.04 -0 32 0.05

97 -9.00 -0.74 44 -7.5 -1.97

98 9.50 0.10 0.18 0.13 45 9.48 0.05 -0.01 0.06

99 8.94 0.1 0.8 0.12 46 9.43 0.05 0.04 0.06 00 8.64 0.07 1.1 0.1 47 9.5 0.06 -0.03 0.07 01 7.84 0.13 1.9 0.15 48 9.44 0.05 0.03 0.06

49 9.36 0.06 0.11 0.07

50 9.48 0.06 -0.01 0.07

51 8.79 0.04 0.68 0.05

52 9.42 0.04 0.05 0.05

53 -7.25 -2.22

54 9.55 0.04 -0.08 0.05 Los resultados que ejemplifican el perfil de actividad de varias modificaciones del polipéptido de la invención se muestran en la Tabla 14 e incluyen polipéptido de estrescopina (h-SCP), urocortina 2 (h-UCN2) y polipéptido h-SCP-IA-PEG (SEQ ID NO: 102), en donde h-SCP-IA-PEG es un péptido que tiene la secuencia de SCP con una sustitución de cisteína en la posición 28 como se expone en la SEQ ID NO.29 y un polímero de PEG se une por medio de un conector acetamida (IA) a la cisteína en la posición 28. Los datos son la media ±EE de una a tres repeticiones y se expresan como el % de la respuesta máxima que se obtiene a h-SCP dentro de cada repetición del experimento.

TABLA 14

SEQ ID NO. pAso EEM nH EEM Iméx. EEM n

1 9.40 0.02 1.26 0.08 100.1 1.11 28

1 15 9.51 0.02 1.34 0.09 1 16.9 1.33 24

102 8.15 0.02 1.05 0.05 1 11.1 1 .95 32

Además, el polipéptido h-SCP-IA-PEG se incubó en presencia de 100 nM de anti-sauvagina-30, un antagonista selectivo competitivo del receptor h-CRHR2, lo que produjo un desplazamiento hacia la derecha en la curva de concentración-respuesta del polipéptido h-SCP-IA-PEG con el valor pA50 aproximado correspondiente de 6.89, cuando la respuesta máxima se limitó a 100 %.

Estudio núm. 2: actividad de unión a radioligandos de CRHR1 y

CRHR2

El perfil de unión de h-SCP (SEQ ID NO:1) a CRHR2 se determinó en estudios de unión a radioligandos en una preparación de membrana de las células SK-N-MC transfectadas establemente con CRHR2 humano por medio del uso de [125l]-anti-sauvagina-30 como la radiomarcación. Las células se cosecharon por raspado y los precipitados resultantes se congelaron inmediatamente a -80° Celcius (aproximadamente 50 x 106 células/precipitado).

Los precipitados de células congelados se descongelaron en hielo en 15 mi de tampón de ensayo que estaba compuesto de 10 mM HEPES, 130 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 5 mM MgCI2l y 0.089 mM de bacitracina a pH 7.2 y 21 ± 3°Celsius. Después, la solución se homogeneizó a continuación, con un triturador de tejidos Polytron en un ajuste de 10 y 7x3 s (Brinkmann Instruments, Westbury, NY). El homogeneizado se centrifugó a 4o Celcius a 800 x g durante 5 min y se desechó el precipitado. El sobrenadante se centrifugó nuevamente a 26,892 x g durante 25 min a 4o Celcius y el precipitado final se resuspendió en tampón de ensayo. Todos los ensayos de unión se realizaron en placas con filtro de 96 pocilios Multiscreen GF/B (Millipore, Billericay, MA, Estados Unidos) que se empaparon previamente en tampón de ensayo con 0.3 % PEI por 1 hora. Para los estudios de competencia, las membranas celulares de 45 μΙ de volumen se incubaron con 60 pM [125l]-anti-sauvagina-30 en un volumen de 50 μΙ para el ensayo de CRHR2 o con [125l]-(Tyr°)-sauvagina para el ensayo de CRHR1 en

presencia de 15 μΙ del ligando competidor por 120 minutos con un volumen total de 150 μΙ. La unión no específica se determinó por la inclusión de 1 μΜ de r-UCN1 (SEQ ID NO:114). La radioactividad que se unió se separó por filtración por medio del uso de un colector Multiscreen Resist (Millipore Corp., Billerica, MA, Estados Unidos). Los filtros se lavaron tres veces con PBS helado a pH 7.5 y la radioactividad retenida en los filtros se cuantificó por su centelleo líquido que se midió por un contador TopCount (Packard BíoScience, Boston, MA, Estados Unidos). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Los datos de las curvas de competencia individuales se expresaron como el porcentaje de unión específico de [125l]-anti-sauvagina-30 o [125l]-(Tyr°)-sauvagina (B) dentro de cada experimento. Estos datos se analizaron por medio del uso de una logística de cuatro parámetros por medio del uso de GraphPad Prism con la asíntota superior (amáx) y la inferior (amin) ponderados al 100 % y 0 %, respectivamente, mediante la inclusión de estos valores dos unidades logarítmicas por encima y menor que las concentraciones mínima y máxima del competidor, respectivamente:

((|o8 -|'-l)

La curva de competencia que se obtuvo con h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) fue bifásica. Esto indica un estado de alta y baja afinidad de unión al receptor que se caracteriza por un alto logaritmo negativo de concentración al 50 % de inhibición (plC5o) y uno bajo pICso de 6.6. El sitio de unión de alta afinidad mostró que se inhibía por 100 μΜ de guanosina 5'-0-[gamma-tio]

trifosfato (GTPyS). En contraste, h-UCN2 (SEQ ID NO: 115) mostró sólo una unión de alta afinidad, lo que sugiere que h-UCN2 se comportó como un agonista de mayor eficacia intrínseca de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) en el ensayo. Los valores de pKi que resultaron de este análisis de datos se muestran en la Tabla 15.

TABLA 15

Receptor

CRHR1 CRHR2

SEQ ID NO pK, pK,

1 4.6±0.28 1.16±0.65 5.71 ±0.04 1.00±0.04

1 14 8.69±0.15 0.9110.27 8.51 ±0.05 1.19*0.14 1 15 ND 7.74±0.05 1.28±0.15 1 16 4.9611.69 0.7911.21 6.4910.07 0.6810.08 1 17 ND 7.57±0.04 1.26±0.14 1 18 5.81±0.20 1.0010.49 7.78±0.05 1.15±0.12

ND = No detectable

Estudio núm. 3: relajación del músculo liso vascular - anillos de aorta de rata

La capacidad de la h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) para relajar el músculo liso vascular se examinó en anillos de aorta de rata aislados, precontraidos con fenilefrina (PE) (Figura 8). Este polipéptido (SEQ ID NO: 1 ) produjo una relajación dependiente de la concentración con un valor pAso de 6.05±0.12, pero fue 10 veces menos potente que h-UCN2 (SEQ ID NO: 1 15) que tiene un valor pA50 de 7.01 ±0.13. Las respuestas causadas por h-SCP (SEQ ID NO.1) se inhibieron por anti-sauvagina-30 (SEQ ID NO:1 8).

Estudio núm. 4: caracterización cardiovascular en corazón aislado de conejo

El efecto de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) sobre la frecuencia cardiaca (FC), la contracción del ventrículo izquierdo (VI), y el tono vascular se evaluó en un ensayo de corazón de conejo Langendorff retrógrado-perfundido. Un bolo de un vehículo control tipo placebo o h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) se administró directamente en el bloque de perfusión. La h-SCP (SEQ ID NO:1 ) produjo incrementos dependientes de la concentración en la frecuencia cardíaca y la presión desarrollada del ventrículo izquierdo (dP/dtmá)<) y una disminución correspondiente en la presión de perfusión coronaria (PPC) a una concentración para 50 % de respuesta igual que 52 nM, 9.9 nM y 46 nM, respectivamente (Figura 9), y no se observó ninguna respuesta en el caso del vehículo control.

Estudio núm. 5: hemodinámica en ratas anestesiadas (IV en bolo)

El perfil hemodinámico de la h-SCP (SEQ ID NO:1) se determinó en ratas Sprague-Dawley macho anestesiadas con pentobarbital sódico (Figura 10). Un micromanómetro con punta de catéter integrado SPR-320 Mikro-Tip® (Millar Instruments, Houston, TX, Estados Unidos) se colocó en la arteria femoral derecha para obtener mediciones de presión sanguínea y otro directamente en el ventrículo izquierdo para la medición de la presión del VI. La administración intravenosa en bolo de h-SCP (SEQ ID NO:1) con un intervalo

de dosis de 0. 3 pg/kg a 44 pg/kg, equivalente a un intervalo de 0.03 nmol/kg a 10 nmol/kg, produjo incrementos dependientes de la dosis en la frecuencia cardiaca, presión desarrollada del VI (+dP/dt) y una disminución correspondiente en la presión sanguínea, es decir, la presión arterial media (PAM). Los cambios en los parámetros hemodinámicos inducidos por la h-SCP (SEQ ID N0.1 , círculo completo en la Figura 10) se bloquearon por tratamiento previo con anti-sauvagina-30 (SEQ ID NO: 118, círculo abierto en la Figura 10). Además, en estas ratas sanas anestesiadas el anti-sauvagina-30 no inhibe los parámetros de los valores iniciales que coinciden con los estudios en ratas conscientes que reportan Gardíner (Gardiner y otros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2007, vol. 321 , págs. 221-226).

Estudio núm. 6: perfil hemodinámico, angiográfico y ecocardiográfico en perros sanos anestesiados

Los efectos de la h-SCP (SEQ ID NO:1) en la función cardiovascular se evaluaron, además, en perros mestizos anestesiados después de infusiones intravenosas en bolo de 30 minutos. La función hemodinámica y la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo se evaluaron con el uso de métodos hemodinámicos, angiográficos, ecocardiográficos y radiográficos convencionales y los resultados se resumen en la Tabla 16. El vehículo control o h-SCP (SEQ ID NO:1) se administró por bolo intravenoso en un intervalo de dosis de 0.13 pg kg a 13.1 pg/kg, equivalente a un intervalo de 0.03 nmol/kg a 3.0 nmol/kg. La h-SCP (SEQ ID NO:1 ) produjo cambios dependientes de la dosis en la presión sanguínea, en la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo y en la frecuencia cardíaca; el incremento en la frecuencia cardíaca de 45 % fue el mayor en magnitud.

TABLA 16

Dosis en bolo

(Mg/kg) VEH 0.13 1.3 2 6 4.4 13.1 (nmol/kg) 0.03 0.3 0.6 1.0 3.0

WIFD 56 (1.8) 55 (1.9) 54 (1.8) 52 (2.1)* 51 (2.3)* 46 (2,0)*

WIFS 26 (0.8) 25 (1.1) 23 (1.2)* 22 (1.0)* 22 (1.0)* 18 (0,8)*

AVIFD 13.0 (0.4) 12.9 (0.4) 12.7 (0.3)* 12.5 (0.4)* 12.4 (0.3)* 11.4 (0.3)*

AVIFS 7.1 (0.2) 6.9 (0.2) 6.5 (0.4)* 6.2 (0.3)* 6.0 (0.2)* 5.2 (0.2)*

AFAVI 45 (1.2) 46 (0.8) 49 (1.1)" 50 (1.6)* 52 (1.4)" 53 (1.5)*

FEVI 53 (1.2) 55 (0.8)* 57 (0.6)* 57 (0.5)* 58 (0.7)* 60 (0.7)*

VS 29 (1.3) 30 (1.0) 30 (1.1) 30 (0.9) 30 (1.4) 28 (1.3) dP/dt del VI 194.5 (14.1) 206.1 (23.6) 214.1 (14.1) 223.3 (14.8) 224.2 (18.3) 234.6 (17.1)

[1459 (106)] [1546 (177)] [1606 (106)] [1675 (111)] [1682 (137)] [1760 (128)*]

PSAP 12.5 (0.28) [94 12.3 (0.56) 12.1 (0.41) [91 12.0 (0.37) [90 12.0 (0.40) [90 11.7 (0.27)

(2.1)1 [92 (4.2)] (3.1)] (2.8)*] (3.0)*] [88 (2,0)*]

FC 74 (3) 73 (5) 85 (6)* 92 (6)* 94 (6)* 107 (7)*

GC 2.19 (0.18) 2.19 (0.16) 2.56 (0.14)* 2.72 (0.17)* 2.80 (0.12)* 2.86 (0.12)*

N 7 7 7 7 7 7

WIFD = volumen del ventrículo izquierdo al final de EE = error estándar de la media

la diástole (mi) WIFS = volumen del ventrículo izquierdo al final de la

AVIFD = área del ventrículo izquierdo al final de la sístole (mi)

diástole (cm2) AVIFS = área del ventrículo izquierdo al final de la

AFAVI = acortamiento fraccionario del área del sístole (cm2)

ventrículo izquierdo (%) FEVI = fracción de eyección del ventrículo izquierdo (%)

VS = volumen sistólico (mi) Vl+dP/dt = contractilidad del ventrículo izquierdo (kPa/s

PSAP = presión sistólica aórtica pico (kPa (mmHg)) (mmHg/s)),

N = número de perros estudiados FC = frecuencia cardíaca (latidos/min),

*p< 0.05 en comparación con vehículo control GC = gasto cardíaco (l/min)

(solución salina): prueba t pareada Valores = media (± s.e.m.) de los cambios a partir del

VEH = vehículo control (solución salina) = valor inicial VEH

Los descubrimientos descritos anteriormente se examinaron, además, en un estudio en donde la h-SCP (SEQ ID NO:1) se infundió durante

un período de 30 min. a las mismas dosis totales que se administraron en bolo, como se describió anteriormente con los resultados que se presentan en la Tabla 17 y Figuras 11A y 1 1 B. Como en el caso de la dosificación en bolo, la h-SCP (SEQ ID NO:1) produjo cambios dependientes de la dosis (infusión) en la presión sanguínea, en la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo y en la frecuencia cardíaca. Sin embargo, en el rango menor de la curva de respuesta a la dosis (infusión) hubo una reducción significativa en la respuesta cronotrópica positiva y de presión sanguínea con un incremento marcado y significativo en la función cardíaca que se determinó como un incremento en el GC y en la FEVI. El índice de infusión para un efecto mínimo fue de 43 ng/kg/mín, equivalente a 1.29 pg/kg de la dosis total administrada durante 30 minutos. La concentración en plasma correspondiente de h-SCP (SEQ ID NO: 1) fue de 4,577 pg/ml.

Determinación de la concentración en plasma

Se desarrolló un inmunoensayo tipo sandwich con el uso de un anticuerpo policlonal de cabra purificado por afinidad, específico para h-SCP que se recubierto previamente sobre una microplaca con electrodos integrados. Las moléculas de h-SCP presentes en la muestra se unen al anticuerpo policlonal de captura recubierto sobre la placa. Después de lavar cualquier sustancia no unida, se agregó un anticuerpo monoclonal anti-h-SCP de ratón marcado con sulfo. Este anticuerpo conjugado se une a las moléculas de h-SCP capturadas en la microplaca y la cantidad de analitos se determinó por

electroquimioluminiscencia. La cantidad de señal generada es directamente proporcional a la concentración de h-SCP en la muestra o estándar. El intervalo de la curva estándar es de 3.125 a 1600 pg/ml con un intervalo cuantificable de 10 a 800 pg/ml. Para este ensayo se requiere un volumen de muestra de 25 μΙ (por duplicado). Este inmunoensayo es específico para la estrescopina humana y de perro y la urocortina III humana (h-UCN3). El ensayo no reconoce el péptido relacionado con estrescopina humana (h-SRP), urocortina I (h-UCN1) o urocortina II (h-UCN2). Después de finalizar el análisis, en base a una comparación de estándares de referencia entre el método ELISA y HPLC, se aplicó un factor de corrección de 1.57 en todos los datos bioanalíticos.

TABLA 17

índice IV VEH 22 43 86 146 437

(ng/kg/m¡n)

Tiempo IV (min) 30 30 30 30 30 30

WIFD 55.7 (1.1) 53.0 (0.8) 55,2 (1.9) 54.2 (2.2) 49.5 (2.9)* 46.0 (3.7)"

WIFS 27.2 (1.1) 24.5 (0.5) 23.5 (1.9) 23.5 (1.2) 20.7 (1.2)" 18.2 (1.4)"

AVIFD 12.2 (0.15) 12.2 (0.3) 11.9 (0.2) 11.8 (0.4) 11.5 (0.3)' 10.8 (0.5)"

AVIFS 6.5 (0.2) 6.3 (0.2) 5.8 (0.4) 5.9 (0.4) 5.6 (0.4)' 5.1 (0.5)"

AFAVI 46.8 (1.1) 49 (0.4) 51.5 (3.3) 50.0 (2.0) 51 (1.8) 53.5 (2.2)'

FE VI 50.8 (1.6) 54.0 (0.6) 57.5 (3.2) 56.5 (1.5) 58.2 (1.8)" 60.7 (1.9)"

VS 28.7 (0.7) 28.5 (0.5) 31.7 (1.9) 30.7 (1.5) 28.7 (2.2) 28 (2.8)

Vl+dP/dt 1623 (55.8) 1598 (135) 1875 (167.8) 1622 (81.4) 1594 (93.4) 1657 (97.9)

PSAP 97.2 (2.5) 95.0 (6.2) 95.2 (5.1) 91.7 (2.4) 90.0 (0.8) 89.5 (0.9)

FC 83.4 (1.8) 81.2 (1.8) 88.7 (4.4) 91.0 (5.7) 102.5 (9.4)' 117.3 (9.5)"*

GC 2.39 (0.08) 2.32 (0.09) 2.82 (0.20)" 2.81 (0.27) 2.97 (0.37)" 3.25 (0.45)" [SEQ ID NO:1] 67,148 (1298)

(pg/ml) 70.3 (19.0) 620 (81.4) 4,577 (1577) 5141 (878) 23,614 (2432) 15376.9

(pmol/l) 16.1 (4.4) 142 (18.6) 1 ,048.1 (361.1) 1177.3 (201.1 ) 5407.6 (556.9) (297.2)

Dosis total

(MQ/kg) 0.0 0.66 1.29 2.58 4.38 13.11

(nmol/kg) 0.0 0.15 0.30 0.59 1.00 3.00

N 12 4 4 4 4 4

[X] = concentración en plasma del compuesto X

* taquicardia funcional, *p<0.05 en comparación con vehículo control (solución salina), "p<0.005 en comparación con vehículo control (solución salina): prueba t no pareada

Estudio núm. 7: perfil hemodinámico, anqioqráfico y ecocardiográfico en perros anestesiados con insuficiencia cardíaca (IC) avanzada

Los efectos de la h-SCP (SEQ ID NO:1) en la función cardiovascular se evaluaron, además, en perros anestesiados con insuficiencia cardiaca avanzada e irreversible de etiología isquémica (Sabbah y otros, 1991 , Am. J. Physiol., vol. 260, págs. H1379-H1384; Sabbah y otros, 1994, Circulation, vol. 98, págs. 2852-2859; Chandler y otros, 2002, Circ. Res., vol. 91 , págs. 278-280). En perros mestizos se produjo insuficiencia cardíaca avanzada y progresiva por múltiples microembolizaciones intracoronarias secuenciales con microesferas de látex de poliestireno. Se administró infusiones de la dosis de 2.2, 4.3 y 7.3 ng/kg/min por vía intravenosa durante 60 minutos justo después o justo antes de las mediciones hemodinámicas, angiográficas, ecocardiográficas y Doppler con el uso de métodos hemodinámicos, angiográficos, ecocardiográficos y readiográficos convencionales. El polipéptido de h-SCP (SEQ ID NO:1) produjo incrementos dependientes de la dosis (infusión) en la FEVI y el VS y redujo la presión del

ventrículo izquierdo al final de la diástole (PVIFD), la presión del ventrículo izquierdo durante la relajación isovolúmica (Vl-dP/dt), resistencia vascular sistémica (RVS) y el volumen del ventrículo izquierdo al final de la sístole (WIFS) que se correlacionaron con la concentración en plasma. No se registró ningún cambio significativo en la frecuencia cardíaca, presión sistólica aórtica pico, Vl+dP/dt, presión media de la arteria pulmonar, presión de enclavamiento de la arteria pulmonar, presión del atrio derecho ni en el consumo miocárdico de oxígeno después de cualquiera de las infusiones intravenosas de 1 hora (Tabla 18 y Figuras 12A y 12B). La mejoría en la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo no se relacionó con el desarrollo de arritmias ventriculares de novo.

TABLA 18

índice IV VEH 22 4.3 7.3

(ng/kg/min)

Tiempo IV (min) 60 60 60 60

FC (latidos/min) 80 ±3 76 ±2 73 ±3 74 ±2

PSAP (kPa 12.3 ±0.3 (92 ±2) 12.0 ±0.4 (90 ±3) 11.6 ±0.3 (87 ±2) 11.6 ±0.3 (87 ±2)

(mmHg))

PVIFD (kPa 2.0 ±0.08 (15 ±0.6) 1.73 ±0.12 (13 ±0.9*) 1.73 ± 0.053 (13 ± 1.60 ±0.08 (12 ±

(mmHg)) 0.4*) 0.6**)

Vl+dP/dt (kPa/s 215.2 ±19.2 (1614 ± 196.9 ± 13.9 (1477 ± 186.7 ±9.5 (1400 ± 186.4 ±9.9 (1398 ±

(mmHg/s)) 144) 104) 71) 74)

Vl-dP/dt (kPa/s 180.0 ± 20.5 (1350 ± 162.1 ±5.9 (1216 ± 145.9 ± 5.6 (1094 ± 148.3 ±10.9 (1112 ±

(mmHg/s)) 154) 44) 42*) 82*)

PMAP (kPa 2.13 ±0.11 (16 ±0.8) 2.0 ±0.067 (15 ±0.5) 2.0 ±0.067 (15 ±0.5) 1.87 ±0.053 (14 ±

(mmHg)) 0.4)

PEAP (kPa 1.47 ±0.08 (11 ±0.6) 1.20 ±0.08 (9.0 ±0.6) 1.33 ±0.08 (10 ±0.6) 1.20 ±0.04 (9.0 ±0.3)

(mmHg))

PAD (kPa (mmHg)) 0.813 ± 0.067 (6.1 ± 0.760 ± 0.067 (5.7 ± 0.720 ± 0.053 (5.4 ± 0.67 ± 0.053 (5.0 ±

0.5) 0.5) 0.4) 0.4)

RVS (dinas-s-cm'5) 4922 ± 143 4414 ± 193 4144 ±243* 3958 ± 182**

VFD (mi) 67 ± 2.5 66 ±2.5 65 ± 2.5 64 ±2.4

VFS (mi) 49 ± 2.0 46 ± 1.7 43 ± 1.7 41 ± 1.8*

FE (%) 27 ± 0.5 31 ± 0.5~* ab 33 ± 0.5~* c 35 ± 0.9W

VS (mi) 18 ± 0.6 20 ± 0.9' 22 ± 0.9" 22 ± 0.9"

GC (l/min) 1.41 ± 0.06 1.56 ± 0.11 1.61 ± 0.13 1.67 ± 0.09

FSCVI (ml/min) 46 ± 3.0 52 ± 5 57 ± 6 59 ± 6

Eficiencia del VI (%) 18.7 ± 2.0 23.0 ± 3.1 26.0 ± 4.4 23.3 ± 3.2

C O2 (pmols/min) 218 ± 22 191 ± 14 177 ± 19 196 ± 18

[SEQ ID NO:1]

(pg/ml) 21.3 ± 8.0 141.4 ± 18.2 178.3 ± 21.1 279.1 ± 29.6

(pmol/l) 4.9 ± 3.0 32.4 ± 4.2 40.8 ± 4.8 63.9 ± 6.8

Dosis total

(M9/kg) 0.0 0.13 0.26 0.44 (nmol/kg) 0.0 0.03 0.06 0.10

N 7 7 7 7+

PVIFD = presión del ventrículo izquierdo al final de la RVS = resistencia vascular sistémica

diástole FSCVI = flujo sanguíneo coronario total del ventrículo

Vl+dP/dt = presión del ventrículo izquierdo durante la izquierdo

contracción isovolúmica dif. O2SCA = diferencia de oxigeno en el seno

Vl-dP/dt = presión del ventrículo izquierdo durante la coronario arterial

relajación isovolúmica CMO2 = consumo miocárdico de oxigeno

P AP = presión media de la arteria pulmonar PAD = presión media del atrio derecho

PEAP = presión de enclavamiento de la arteria

pulmonar

* p<0.05 en comparación con valor inicial, " p <0.01 en comparación con valor inicial, p O.001 en comparación con valor inicial, 8 p <0.01 en comparación con 4.3 ng/kg/min, b p <0.001 en comparación con 7.3 ng/kg/min, c p <0.05 en comparación con 7.3 ng/kg/min: análisis de la varianza (ANOVA)

Los resultados de este estudio indican que una administración intravenosa aguda de 60 minutos de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) dependiente de la dosis mejora la función del ventrículo izquierdo (sistólica y díastólica) en perros con insuficiencia cardíaca avanzada. Las acciones de la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) sobre la función cardiovascular fueron rápidas en el inicio y rápidamente reversibles. La mejoría en la función del VI parece ser consecuencia de los cambios en la dimensión del VI al final de la sístole y la diástole en ese volumen del ventrículo izquierdo al final de la diástole (WIFD) y el WIFS disminuye a medida que incrementa el volumen sistólico

(VS) del ventrículo izquierdo. Estos cambios ocurrieron sin cronotropía (incremento en la frecuencia cardíaca), inotropía (incremento en Vl+dP/dt) positivas ni incremento en CMO2. La mejoría marcada en la función del VI dependió de la concentración en plasma y no se relacionó con ningún incremento evidente en las arritmias ventriculares de novo.

Para determinar el umbral efectivo de dosis-infusión en perros con insuficiencia cardiaca avanzada, se llevó a cabo otro estudio a infusiones menores de la dosis. Adicionalmente, se aprovechó la oportunidad para analizar si el incremento en la FEVI producido por infusiones mayores de la dosis de 4.3 ng/kg/min permanecería estable con un período de infusión más prolongado, por ejemplo, 120 minutos. Los resultados se presentan en la Tabla 19.

TABLA 19

Indice IV (ng/kg/m¡n) VEH 0.22 0.43 4.3 4.3

Tiempo IV (min) 60 60 60 120

FC (latidos/min) 78±1.6 75±1.1 77±1.0 79±2.0 81±3.6

PSAP (kPa (mmHg)) 12.8 ± 0.64 12.9 ± 0.44 12.4 ± 0.48 12.3 ± 0.55 12.3 ± 0.57

(96±4.8) (97±3.3) (93±3.6) (92±4.1) (92±4.3)

PVIFD (kPa (mmHg)) 1.87 ± 0.12 1.87 ± 0.15 1.73 ± 0.19 1.60 ± 0.19 1.60 ± 0.16

(14±0.9) (14±1.1) (13±1.4) (12+1.4) (12±1.2)

Vl+dP/dt (kPa/s (mmHg/s)) 248.4 ± 12.8 245.6 ± 16.9 225.4 ± 12 8 222.2 ± 11.7 218.6 ± 11.7

(1863±96) (1842±127) (1691 ±96) (1667±88) (1640±88)

Vl-dP/dt (kPa/s (mmHg/s)) 218.0 ± 22.8 193.1 ± 20.7 166.5 ± 16.0 155.5 ± 10.9 149.9 ± 12.3

(1635±171) (1448±155) (1249±120) (1166±82) (1124±92)

PMAP (kPa (mmHg)) 1.87 ± 0.107 2.0 ± 0.093 2.0 ± 0 11 2.0 ± 0.11 2.0 ± 0.12

(14±0.8) (15±0.7) (15±0.8) (15±0.8) (15±0.9)

PEAP (kPa (mmHg)) 1.32 ± 0.067 1.33 ± 0.08 1.28 ± 0.093 1.20 ± 0.08 1.25 ± 0.107

(9.9±0.5) (10.1 ±0.6) (9.6±0.7) (9.0+0.6) (9.4±0.8)

RVS (dinas-s-cm'5) 4651 ±341 4757±287 4134±195 3638±191* d 3372±238" a c

WIFD (mi) 67±1.5 66±1.5 65±1.1 63±1.3 62±1.3

WIFS (mi) 49±1.1 48±1.2 45±1.2 42±1.4** a 39±1.4*** b e

FEVI (%) 27±0.4 28±0.6 30±0.9 34±1.4+" e 37±1.2"*' e

VS (mi) 18±0.5 18±0.5 19±0.5 21±0.8"+ a c 23±0.6"* a e

GC (l/min) 1.39±0.05 1.37±0.04 1.50±0.04 1.68±0.06"'a c 1.83±0.09*" e

[SEQ ID NO:1]

(pg/ml) 32.7±13.5 41.2±14.9 37.2±13.9 229±41.6 249±47.9

(pmol/l) 7.5±3.1 94±3.4 8.5±3.2 52.4±9.5 57±11

Dosis total

0.0 0.013 0.026 0.26 0.52

(pg/kg

(nmol/kg) 0.0 0.003 0.006 0.06 0.12

N 7 7 7 7 7

+p<0.05 en comparación con valor inicial, ++p<0.01 en comparación con valor inicial, +++p<0.001 en comparación con valor inicial, ap<0.01 en comparación con 0.22 ng/kg/min, bp<0.001 en comparación con 0.22 ng/kg/min, cp<0.05 en comparación con 0.43 ng/kg/min, p<0.05 en comparación con 0.22 ng/kg/min, ep<0.01 en comparación con 0.43 ng/kg/min: ANOVA.

Estos datos muestran que la dosis de infusión con un efecto mínimo en las mediciones hemodinámicas, ventriculográficas y Doppler de la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo en perros con insuficiencia cardíaca avanzada fue 0.43 ng/kg/min que es equivalente a 25.8 ng/kg de dosis

total administrada durante 60 minutos. La concentración en plasma correspondiente de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) fue 37.2 pg/ml. Además, los efectos cardiovasculares de una dosis-infusión de h-SCP (SEQ ID NO: 1) de 4.3 ng/kg/min fueron estables entre 60 y 120 minutos sin evidencia alguna de taquifilaxia, que incluye una respuesta reducida.

Para comprender los efectos cardiovasculares potenciales en neutralizar la formación de anticuerpos para h-SCP (SEQ ID NO:1 ), SV30 (SEQ ID NO:1 18), se administró un antagonista competitivo del CRHR2 a los perros (N=4) con insuficiencia cardíaca avanzada. Nuestros estudios demuestran que las dosis que bloquean el CRHR2 de SV30 en perros con insuficiencia cardíaca avanzada no tuvieron efecto alguno en los parámetros cardiovasculares. Esta misma dosis de infusión de SV30 bloqueó las acciones de la h-SCP (SEQ ID NO:1) en perros con insuficiencia cardíaca, tal como se muestra en la Tabla 20. Estos experimentos con SV30 indican que los parámetros cardiovasculares iniciales en perros con insuficiencia cardíaca avanzada no dependieron de la estimulación hormonal endógena de CRHR2. Se ha reportado hallazgos similares en ratas sanas conscientes y anestesiadas (Gardiner y otros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 2007, vol 321 , págs. 221 -226).

Esto sugiere que el efecto primario de neutralizar anticuerpos para la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) no produciría una función cardíaca deteriorada aún más con las concentraciones del tratamiento previo en sujetos sanos o pacientes con insuficiencia cardíaca.

TABLA 20

[SEQ ID NO:1 ] =

VEH AS-30

4.3 ng/kg/min + AS-30

FC (latidos/min) 77±3 79±3 82±4

PSAP (kPa (mmHg)) 13.1 ±0.53 (98±4) 12.5±0.67 (94±5) 12.010.53 (90±4)

PVIFD (kPa (mmHg)) 2.0±0.13 (15±1) 2.0±0.13 (15±1 ) 2.0±0.27 (15±2)

Vl+dP/dt (kPa/s 230.5±22.8 223.3±14.5 215.7H 0.5 (1618179)

(mmHg/s)) (1729±171) (1675±109)

PMAP (kPa (mmHg)) 2.13±0.067 (16±0.5) 2.13±0.093 (16±0.7) 2.1 1 (161.1310.8)

WIFD (mi) 69±2.5 68±2.7 6812.1

WIFS (mi) 50±1.8 50±1.9 4911.8

FEVI (%) 2710.4 27±0 2810.5

VS (mi) 19±0.6 18±0.8 1910.4

GC (l/min) 1.43±0.05 1 44±0.04 1.5510.08

N 4 4 4

Los resultados de una inyección subcutánea en bolo de 30 pg/kg de un péptido tipo estrescopina de la SEQ ID NO: 102 en perros con IC se muestran en la Figura 12C. La frecuencia cardíaca disminuyó durante las primeras horas, aunque la concentración en plasma incrementó como se esperaba de conformidad con los estudios de farmacocinética de inyección en bolo a dosis más bajas (Figura 13A y 13B). Después de alcanzar una concentración en plasma en estado de reposo, la frecuencia cardiaca permaneció razonablemente estable. Entretanto, el rendimiento de la FEVI y del GC incrementaron significativamente durante el mismo periodo de hasta 4 horas. La concentración en plasma objetivo de aproximadamente 60 ng/ml se alcanza en aproximadamente 2 horas y 10 minutos después del momento de la inyección, después, se nivela a aproximadamente 100 ng/ml después de

aproximadamente 3, y todavía conserva su nivel a aproximadamente 6 horas después de la inyección. La concentración relativa a la estrescopina de 60 ng/ml y de 100 ng/ml de un péptido de la SEQ ID NO:102 es de 600 pg/ml y 1000 pg/ml, respectivamente.

En resumen, a infusiones menores de la dosis (<7.3 ng/kg/min en perros con insuficiencia cardíaca), la h-SCP incrementó la FEVI, el VS y el GC sin respuestas cronotrópica e inotrópica positivas ni incremento en el consumo miocárdico de oxígeno en perros con insuficiencia cardíaca isquémica, inducida, avanzada, irreversible y progresiva. Además, a estas dosis bajas la mejoría marcada en la función del ventrículo izquierdo no se asoció con disminuciones en la PSAP, incrementos en la frecuencia cardíaca o cualquier incremento evidente en arritmias ventriculares de novo y fue fácilmente reversible. En perros con insuficiencia cardíaca, la dosis efectiva para incrementos significativos en la FEVI y en el GC fue de 0.43 ng/kg/min con una concentración en plasma correspondiente de 37.2 pg/ml.

En un estudio posterior, se tomó las mediciones iniciales hemodinámicas, ventriculográficas, ecocardiográficas y de presión-volumen del VI, antes de administrar por vía intravenosa a cada perro a una infusión continua de 4.3 ng/kg/min de h-SCP (SEQ ID NO:1) durante 120 min. Al final de la infusión de 120 min., se tomó nuevamente las mediciones completas hemodinámicas, ventriculográficas, ecocardiográpficas y de presión-volumen del VI. La derivación II en el electrocardiograma se monitoreó a lo largo del estudio para el desarrollo de arritmias ventriculares de novo. Las soluciones de dosificación no se ajustaron ni se corrigieron para el contenido peptídico debido a que el contenido peptidico del artículo de prueba usado en estos estudios se encontraba entre el límite convencional de 85 a 90 %, en donde no se requiere esta corrección. Se obtuvo muestras de sangre venosa al principio y después de la evaluación hemodinámica después de la infusión de 120 min. de h-SCP.

Todas las mediciones hemodinámicas se realizaron durante cateterizaciones del lado izquierdo y derecho del corazón en perros anestesiados en cada momento específico del estudio. Las presiones aórtica y del VI se determinaron con el uso de micromanómetros con punta de catéter. (Millar Instruments, Houston, TX) y la presión del VI al final de la diástole (PVIFD) se determinó a partir de la onda de la presión del VI. Se realizó una ventriculog rafia izquierda durante la cateterización cardiaca después de completar las mediciones hemodinámicas. Las ventriculog rafias se registraron en medios digitales a 30 cuadros por segundo durante una inyección automática de 15 mi de material de contraste (Conray; Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO). La corrección de la magnificación de imágenes se hizo con el uso de un rejilla radiopaca colocada al nivel del ventrículo izquierdo. El volumen del VI al final de la sístole (WIFS) y el volumen del VI al final de la diástole (WIFD) se calcularon a partir de angiografías de siluetas con el uso del método de área- longitud. Los latidos prematuros y los latidos postextrasístole se excluyeron del análisis. La FEVI se calculó como la relación de la diferencia entre el WIFD y el WIFS con el WIFD por 100. El volumen sistólico (VS) se calculó como la diferencia entre el WIFD y el WIFS. El gasto cardíaco (GC) se calculó como el producto de la frecuencia

cardiaca y el volumen sistólico. La resistencia vascular sistémica (RVS) se calculó como el cociente de la presión arterial promedio y el GC. La relación presión-volumen del VI se determinó durante la oclusión temporal con balón de la vena cava inferior para evaluar el declive de la relación presión-volumen al final de la sístole (RPVFS) y la relación presión-volumen al final de la diástole (RPVFD). Los puntos de presión-volumen al final de la sístole y la diástole se determinaron para los latidos al final de la expiración de la manera usual. Se usó el análisis de regresión lineal para determinar el declive de la RPVFS y de la RPVFD. Un incremento en el declive de la RPVFS infiere la mejoría en el rendimiento contráctil del VI, mientras que una disminución en el declive de la RPVFD infiere una mejoría en la relajación del VI.

La h-SCP (SEQ ID NO:1) produjo incrementos marcados, altamente reproducibles, dependientes de la concentración en plasma y estadísticamente significativos en el rendimiento IV global en perros con insuficiencia cardíaca avanzada que se manifestaron como incrementos en la FEVI, el VS y el GC sin cambios en MAoP, SAoP, FC ni Vl+dP/dt. La h-SCP (SEQ ID NO:1) redujo, además, el WIFS a un grado mucho mayor que el que produce al reducir el WIFD; por lo tanto, probablemente altera el estado contráctil del miocardio. La Figura 14A presenta datos de series periódicas de mediciones de presión y volumen del VI durante la oclusión temporal de la vena cava inferior en el punto de partida en perros con insuficiencia cardíaca. Se hace dos observaciones significativas en relación a estos datos. Primero, hubo un cambio muy leve en la FC durante los pocos segundos requeridos para obtener

estas mediciones. Segundo, la fuerza inherente de la técnica de lazos P-V para caracterizar alteraciones cardíacas específicas en animales intactos. La Figura 14B ¡lustra la RPVFS a medida que se desplaza hacia la izquierda y se pronuncia más con la infusión de h-SCP. El declive de la RPVFS en perros no tratados fue de 1.38±0.26 e incrementó hasta 2.26±0.46 en perros con insuficiencia cardíaca después de la infusión de h-SCP. El valor absoluto del declive de la RPVFD fue de 0.257 en perros no tratados y de 0.128 en perros tratados con h-SCP. Esta mejoría general en la función sistólica del VI global no se asoció con el desarrollo de arritmias ventriculares de novo en el transcurso de los 120 min. de duración de este estudio.

La h-SCP produjo cambios en la geometría del VI en general y reducciones significativas en el WIFS, específicamente, efectos que se tradujeron en incrementos marcados y significativos en la FEVI, VSVI y GC sin afectar Vl+dP/dt, MAoP, SAoP ni la FC. El hallazgo clave en el presente estudio, específicamente, el incremento marcado y significativo en el declive de la RPVFS del VI después de la infusión de h-SCP en perros con insuficiencia cardíaca avanzada es una característica del péptido que indica sus acciones dependientes de la carga (antes de la carga y después de la carga) en el miocardio. Con el uso del análisis de presión-volumen del VI continuo en tiempo real, en presencia de oclusión de la vena cava, se determinó los datos fisiológicos que coinciden con el perfil farmacológico de la h-SCP resultante de los efectos que aumentaron en gran medida la contractilidad miocárdica y en menor grado la relajación. Los cambios en el declive de la RPVFS del VI

afirman que el péptido actúa en el miocardio, sin excluir las acciones del músculo liso vascular, de manera que incrementa el gasto cardiaco al mantener e incluso incrementar el VSVI debido al declive del tamaño del VI sin el desarrollo de arritmias ventriculares de novo en estos perros.

Estudio núm. 8: farmacocinética en animales

La farmacocinética no clínica de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) y péptidos tipo estrescopina pegilados se estudió en ratas, perros y macacos cangrejeros (cyno). Los estudios de la farmacocinética no clínica y sus resultados se presentan en las Tablas 21 y 22. Los estudios de las farmacocinética no clínica se enfocaron en la caracterización de infusión intravenosa a concentraciones de dosis farmacológicamente relevantes, suplementadas con análisis IV y SC en bolo y toxicocinético.

Las concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) alcanzaron un estado de reposo evidente en el transcurso de 1 hora después de iniciar la infusión en perros (Figura 13C) y macacos cangrejeros, y en el transcurso de 2 horas en ratas. En los macacos cangrejeros, la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) mostró una farmacocinética lineal a concentraciones de dosis de 16.7 a 100 ng/kg/min analizadas, con valores de aclaramiento (CL) de aproximadamente 30 a 40 ml/min/kg. En comparación con las ratas y los macacos cangrejeros, la h-SCP (SEQ ID NO:1) tuvo valores menores de aclaramiento del plasma en perros a aproximadamente 4 ml/min/kg, y mostró una farmacocinética lineal en el intervalo farmacológicamente relevante de 3.3 a 33.3 ng/kg/min. Sin embargo, las exposiciones del plasma de la h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) en ratas incrementaron más allá de lo proporcional a la dosis tanto en los estudios de toxicocinética de infusión intravenosa de dosis altas como en los estudios en bolo, con valores altos de aclaramiento de 42 a 1 16 ml/min/kg para el bolo IV.

La h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) mostró un perfil de disposición bifásica después de la administración por infusión intravenosa y de la administración IV en bolo, con una fase inicial corta de rápida disminución de concentración y una fase terminal más prolongada, por ejemplo, de aproximadamente 1 hora en perros. Con el uso del análisis de dos compartimentos, se calculó que la vida media de fase alfa (t½ aifa) es de 5 minutos en ratas (Figura 1 5A) y macacos, y entre 1 0 y 20 minutos en perros. No hubo ninguna evidencia de que la vida media terminal (t½ terminal) prolongada tuviera alguna influencia notable en el tiempo requerido para alcanzar un estado de reposo evidente en infusión continua. La h-SCP alcanzo concentraciones en estado de reposo en el transcurso de 1 hora en perros y macacos y en el transcurso de 2 horas en ratas. La vida media inicial de la h-SCP es muy corta (<5 min. en ratas y macacos y de 1 0 a 20 min. en perros) seguida por una vida media terminal más prolongada (de aproximadamente 1 hora en perros). No hubo ninguna diferencia de género evidente en la farmacocinética de la h-SCP en ratas, perros o macacos.

TABLA 21

Estudios de farmacocinética no clínicos de péptido con la SEQ ID NO:1

Dosis ABCo- CL tl 2 ti/2

Estudio Sexo (ng/kg/min) (ng/ml) (ngxmin/ml) (ml/min/kg) Vss (ml kg) (min) (min)

Infusión M 83.3 0.752 74.5 116.4 18377 113.4 3.0 intravenosa

F 83.3 0.906 88.1 106 6 19413 103.8 2.3 en ratas3

horas 167 1.53 145.9 109.4 17643 110.8 1.3

6M y 6F/grupo

F 167 0.683 69.1 270.7 40895 59.4 3.2

333 2.858 290.9 1 18.5 18597 63.5 2.1

F 333 2.672 266.8 129.9 19067 58.2 1.9

Bolo IV en M *3,000 4.8 31.3 109.3 565 6.7 1.8 ratas

M 10,000 13.6 89.8 1 15.8 1081 39.5 2.7 3M/grupo

50,000 224.5 1465.3 41.8 359 34.5 2.9

M •300,000 780.2 5984.9 50.1 442 27.2 3.4

Infusión M 3.33 0.814 140.5 4.28 216 59.6 15.9 intravenosa

8.33 2.377 387.6 3.87 194 49.9 20.9 en perros3

horas M 16.7 5.055 768.5 3.99 172 57.2 14.3

3M/grupo

M 33.3 9.996 1583.3 3.95 161 65.3 13.7

Infusión 16.7 0.873 103.7 30.2 788 7.4 - intravenosa

F 16.7 0.613 78.6 39.7 848 5.3 - en macacos3

horas M 33.3 1.481 208.1 29.2 61 1 26.0 3.7

2M y 2F/grupo

F 33.3 0.958 140.3 42.9 931 14.8 4.0

M 100 4.447 587.7 30.7 899 94.3 2.9

F 100 3.163 460.0 39.1 921 143.9 3.1

* ng/kg para los datos de inyección en bolo; Vss = volumen en estado de reposo; M = machos, H = hembras

Además, la farmacocinética en ratas y perros de péptidos tipo estrescopina pegilados, tales como los polipéptidos de la SEQ ID NO: 102, 103, 104, 105 o 106 se muestran en las Figuras 13A y 13B y 15B a la 15E,

así como en la Tabla 22. Los datos continuaron mostrando un perfil de disposición bifásica típica tanto después de la administración por infusión intravenosa como después de la administración IV en bolo, con los valores de ti 2 aifa enumerados en la Tabla 22.

TABLA 22

Estudio de farmacocinética del péptido con la SEQ ID NO:102

Dosis Cmáx ABCo-x CL Un ana tmáx % de

Estudio (pg/kg) (ng/ml) (ngx h/ml) (ml/min/kg) Vz (ml/kg) (h) (h) H

Bolo SC en 15 17.9±8.4 342±107 711 36 ratas

150 77.6±24.1 191 ±464 6.3H .8 20

Bolo IV en 15 0.2710.02 510123 2210.5

ratas

Bolo SC en 5 24.6±2.6 3510±270 3218 71 perros

15 66.8±1 .9 6089H 808 511 41

Bolo IV en 15 0.0210.01 34±7 21 ±2

perros

Vz = volumen de distribución; % de H = biodisponibilidad

Estudio núm. 9: Estudios de dosificación humana

La dosis mínima farmacológicamente efectiva en perros con insuficiencia cardíaca fue de 0.43 ng/kg/min, que es notablemente menor que la dosis mínima efectiva en perros sanos (43 ng/kg/min). El nivel sin efecto adverso observable (NOAEL, por sus siglas en inglés) de 33.3 ng/kg/min se determinó en un estudio de seguridad cardiovascular de BPL en perros machos, considerada la especie más relevante y sensible para fármacos cardiovasculares.

Los cambios en la frecuencia cardíaca observados en los animales se invierten rápidamente después de la secesión de la infusión y se inducen a un margen de exposición de más de 15 veces menor que donde se observa otros efectos (reducciones de peso corporal o de reticulocitos). Además, los efectos no cardiovasculares observados en los estudios de toxicología son relativamente leves, monitoreables y reversibles. La h-SCP es relativamente no antigéníca en animales, pero en los casos en donde se induce el anticuerpo, parece no haber consecuencias fisiológicas adversas.

Un NOAEL de 33.3 ng/kg/min se determinó en un estudio de seguridad cardiovascular de BPL en perros machos, considerada la especie más relevante y sensible para fármacos cardiovasculares. Un estudio de farmacología no clínica en perros sanos mostró que el nivel de efecto biológico anticipado mínimo (MABEL, por sus siglas en inglés) en perros era de 22 ng/kg/min (Tabla 17). En base a estos valores se seleccionó una dosis inicial de 0.1 ng/kg/min.

En base al método basado en farmacocinética, se esperaba que una dosis inicial de 0.1 ng/kg/min alcanzara una concentración en plasma en estado de reposo (Cpss) de 8.6 pg/ml, que se encuentra muy debajo del límite superior de 12.0 ng/ml determinado en un estudio de seguridad cardiovascular de BPL en perros y tiene un margen de seguridad de 1 ,390 veces.

Además, los estudios clínicos indicaron que la dosis con el MABEL en humanos sanos es similar a la dosis con el MABEL en perros determinada en un estudio de farmacología no clínica y que la dosis para humanos muestra una respuesta cardíaca que corresponde con la dosis en perros.

En base a los estudios clínicos a continuación, se determinó que el aclaramiento (CL) de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) después de la infusión intravenosa en humanos sanos era de aproximadamente 30 l/h para un hombre de 70 kg. Al índice de infusión de 22 ng/kg/min en perros sanos, se determinó que la concentración en plasma de h-SCP era de 620 pg/ml (Tabla 17). Se requiere una dosis humana equivalente de 4.4 ng/kg/min para alcanzar una concentración en plasma en estado de reposo (Cpss) similar de 620 pg/ml, debido a que la dosis se puede calcular de conformidad con: dosiShumano = CLhumano* Cpss / pesOhumano, con un humano ce 70 kg de peso.

En sujetos sanos después de una infusión intravenosa de dosis ascendente continua de 7.5 horas de h-SCP (SEQ ID NO:1 ), se realizó análisis de farmacocinética no seccionados para determinar las concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ). Los parámetros de farmacocinética de h-SCP (SEQ ID NO:1) se resumen en la Tabla 23. La h-SCP (SEQ ID NO:1 ) en plasma alcanzó el estado de reposo poco después de iniciar la infusión intravenosa (Figura 16A). Después de terminar la infusión, las concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) mostraron una disminución rápida inicial seguida por una fase de eliminación terminal más lenta. En el transcurso de 30 minutos, la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) en plasma se redujo hasta <20 % de la concentración de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) al final de la infusión. La vida media terminal promedio estuvo en el intervalo de 2.13 a 28.48 horas y pareció haber incrementado con la dosis. Las vidas medias terminales más prolongadas a dosis más altas sugirieron la existencia de un compartimento más profundo además del modelo normal de 2 compartimentos. Sin embargo, la contribución del compartimento adicional a la exposición y acumulación de h-SCP (SEQ ID NO:1) general es probablemente insignificante, tal como lo indican las vidas medias efectivas. La vida media efectiva promedio se encontraba en el intervalo de 1.54 a 14.17 horas. El aclaramiento sistemático promedio fue, generalmente, consistente por los grupos de dosis y se encontraba en el intervalo de 0.27 a 0.42 l/kg.

TABLA 23

Parámetros de farmacocinética en plasma promedio (SD) de h-SCP después de una infusión intravenosa de dosis ascendente continua de

7.5 horas en sujetos sanos


Mediana (mínimo - máximo); bN=4; c N=1.

En sujetos con insuficiencia cardíaca después de una infusión intravenosa de dosis ascendente continua de 7.5 horas de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) se realizó análisis de farmacocinética no seccionados en las concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO:1 ). Los parámetros de farmacocinética de h-SCP (SEQ ID N0:1) se resumen en la Tabla 24. Parece que la farmacocinética de h-SCP (SEQ ID NO:1) en sujetos con insuficiencia cardíaca fue similar a la de los sujetos sanos. Al igual que se ha visto en sujetos sanos, la h-SCP (SEQ ID NO:1) en plasma alcanzó un estado de reposo poco después de iniciar la infusión intravenosa en sujetos con insuficiencia cardíaca (Figura 16B). Después de terminar la infusión, las concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO:1) mostraron una disminución rápida inicial seguida por una fase de eliminación terminal más lenta. En el transcurso de 30 minutos, la h-SCP (SEQ ID NO:1) en plasma se redujo hasta 20 % o menos de la concentración de h-SCP (SEQ ID NO:1) al final de la infusión (Figura 16B). El aclaramiento sistémico medio se encontraba en el intervalo de 0.19 a 0.46 l/h/kg. La vida media terminal promedio se encontraba en el intervalo de 0.24 a 7.04 horas, que probablemente se relaciona a la dosis relacionada, dado que el índice de infusión más alta fue únicamente de 54 ng/kg/min. La vida media efectiva se encontraba en el intervalo de 1.32 a 2.51 horas.

TABLA 24

Parámetros de farmacocinética en plasma promedio (SD) de h-SCP después de una infusión intravenosa de dosis ascendente continua de

7.5 horas en sujetos con insuficiencia cardiaca


a Mediana (mínimo - máximo); b N=1 ; c N=2.

En sujetos sanos después de una infusión de 24 o 72 horas de 54 ng/kg/min de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ), se realizó análisis de farmacocinética no seccionados en concentraciones en plasma de h-SCP (SEQ ID NO:1 ). Los parámetros de farmacocinética de h-SCP (SEQ ID N0: 1 ) se resumen en la Tabla 25. La farmacocinética de h-SCP (SEQ ID NO: 1) en sujetos sanos después de una infusión intravenosa continua de 24 ó 72 horas es similar a la de la infusión de 2.5 horas, en donde el aclaramiento medio se encuentra en el intervalo de 0.28 a 0.38 l/h/kg (Figura 16C). La vida media terminal promedio se encontraba en el intervalo de 23.40 a 28.81 horas y la vida media efectiva se encontraba en el intervalo de 5.84 a 9.62 horas.

TABLA 25

Parámetros de farmacocinética en plasma promedio (SD) de h-SCP después de una infusión intravenosa continua de 54 ng/kg/min en sujetos sanos

Mediana (mínimo - máximo); b N=5.

Estudio núm. 10: estudios de eficacia humana

La eficacia se basó en la evaluación farmacodinámica de hemodinámica, que se monitoreó con el uso de la técnica no invasiva de cardiografía por impedancia. Los valores de la frecuencia cardíaca se recolectaron por mediciones de cardiografía por impedancia. Se observó que la frecuencia cardíaca de sujetos que reciben placebo se elevó el día de las infusiones, al inicio antes de las infusiones y durante las primeras 3 a 4 horas después de iniciar las infusiones (Figura 17). En base a esta observación, parece que hubo un efecto potencial de período en la frecuencia cardíaca observada.

Se estableció un modelo de efectos combinados con valores iniciales como covariable, período y grupo de dosis (≤3 ng/kg/min - bajo, >3 a ≤36 ng/kg/min - medio, >36 ng/kg/min - alto) como efectos fijos y un efecto del sujeto aleatorio con el uso del cambio en la frecuencia cardíaca a partir de los valores iniciales en los sujetos sanos. El modelo sugirió tanto un efecto del tratamiento estadísticamente significativo (p<0.0001 ) como un efecto del período estadísticamente significativo (p=0.0171), pero no sugirió un efecto de los valores inicíales estadísticamente significativo (p=0.1931 ).

Para confirmar que el incremento estadísticamente significativo en la frecuencia cardíaca es a causa del grupo de dosis altas, se desarrolló un modelo similar de efectos combinados que excluyó el grupo de concentración de dosis altas (>36 ng/kg/min). Sí bien este modelo aún demostraba un efecto del período estadísticamente significativo (p=0.0002), no mostraba un efecto de la dosis estadísticamente significativo (p=0.1434) ni un efecto de los valores iniciales estadísticamente significativo (p=0.3684).

Análisis gráfico a posteriori

Se realizó un análisis gráfico a posteriori de los datos de hemodinámíca para ajustar para que incluya los valores inicíales elevados observados justo antes del inicio de la infusión, para obtener el mejor cálculo de cada parámetro hemodinámico y para corregir el efecto del periodo. Se preparó una presentación gráfica a posteriori a partir del grupo de datos (alta frecuencia) completo. Este grupo de datos contiene los datos crudos que el proveedor procesó adicionalmente (es decir, CardioDynamics) y que se reportaron únicamente en momentos específicos.

En este análisis a posteriori se usó un valor inicial extenso para cada valor que incluía todos los valores registrados antes del inicio de la infusión. Después, se obtuvo un valor promedio para cada parámetro a partir de los últimos 30 minutos de cada infusión de 2.5 horas y se usó como el efecto en ese período de la dosis infundida. Cada valor se modificó para el efecto del período de infusión mediante al sustraer el cambio medio de los valores iniciales observados en sujetos con placebo dosificados en ese mismo período (sustracción del placebo). El efecto de la dosis se calculó al promediar los valores de todos los sujetos que recibieron la misma dosis después de sustraer el placebo.

Sujetos sanos, infusión intravenosa de dosis ascendente continua de 7.5 horas

Los sujetos que recibieron placebo tuvieron una disminución media en la frecuencia cardíaca desde la frecuencia cardíaca inicial (valor obtenido inmediatamente antes de la infusión) de 5 a 10 Ipm durante la infusión. Una revisión de los datos de la frecuencia cardíaca en estos sujetos indicó que sus frecuencias cardíacas fueron de 5 a 10 Ipm más altas al inicio que sus frecuencias cardíacas el día antes de la infusión (Figura 17). Esto sugiere que los sujetos pudieron haber experimentado ansiedad antes del inicio de la infusión, lo que contribuyó a este incremento en los valores iniciales de la frecuencia cardíaca.

Se observó una disminución similar del valor inicial en la frecuencia cardíaca en sujetos sanos que reciben dosis menores de h-SCP (SEQ ID NO:1). En contraste, al final de cada período de infusión de 2.5 horas, los sujetos con dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1) ≥ 36 ng/kg/min tuvieron un incremento relacionado con la dosis en la frecuencia cardíaca con un incremento en la frecuencia cardíaca desde los valores iniciales que alcanzaron 30 Ipm a dosis de 72 ng/kg/min y mayores (Tabla 26). El incremento en la frecuencia cardíaca fue mayor a dosis más altas de h-SCP (SEQ ID NO:1) (Figura 18A). Este incremento en la frecuencia cardíaca ocurrió a una dosis similar a la dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1) que produjo una frecuencia cardíaca incrementada en perros (Figura 19).

En base a estas observaciones parece que en sujetos sanos las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) 36 ng/kg/min estaban relacionadas con un incremento en la frecuencia cardíaca a partir del valor inicial. Este incremento es particularmente notable en comparación con la disminución en la frecuencia cardíaca observada en los sujetos que reciben placebo. En contraste, en sujetos sanos las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) de menos de 36 ng/kg/min no hubo ningún incremento notable en la frecuencia cardíaca en comparación con el valor inicial y el cambio a partir del valor inicial fue similar al observado en los sujetos que reciben placebo.

En los sujetos sanos no se observó ningún cambio en el gasto cardiaco ni en el índice cardiaco con todas las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) <36 ng/kg/min. Los sujetos que reciben dosis mayores que 36 ng/kg/min tuvieron un incremento en el gasto cardíaco y en el índice cardíaco (Figura 18B). Estos incrementos en el gasto cardíaco y en el índice cardíaco observados a estas dosis mayores parecen ser únicamente a causa del incremento en la frecuencia cardíaca, debido a que a estas dosis mayores el volumen sistólico se redujo en comparación con el valor inicial (Figura 8C).

No se observó ninguna tendencia clara en la presión sanguínea sistólica y diastólica promedio con placebo o a dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) <108 ng/kg/min, pero sí se observó incrementos desde los valores iniciales a la dosis más alta (144 ng/kg/min) al final de la infusión.

Al final de cada período de infusión de 2.5 horas, la resistencia vascular sistémica promedio y el índice de resistencia vascular sistémica promedio se incrementaron moderadamente desde los valores iniciales con placebo y a dosis menores que 36 ng/kg/min, aunque la variable sin alteraciones, generalmente, a dosis de 36 a 72 ng/kg/min y mostraron disminuciones de los valores iniciales a dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1) > 108 ng/kg/min.

TABLA 26

Cambios en la frecuencia cardiaca en sujetos sanos (análisis a

posteriori)


En general, hubo una variabilidad notable en los datos para cada parámetro hemodinámico del estudio. La alta variabilidad en los parámetros hemodinámicos, afectada por la notable tendencia hacia una disminución en la frecuencia cardíaca media durante la infusión (con la máxima evidencia en sujetos que reciben placebo), combinada con el pequeño número de sujetos en cada grupo de tratamiento dificultó trazar conclusiones claras con respecto a los resultados del análisis hemodinámico especificado previamente. Se realizó análisis a posteriori diseñados para corregir estos efectos para explorar adicionalmente los datos hemodinámicos.

Sujetos con insuficiencia cardíaca estable, infusión intravenosa de dosis ascendente continua de 7.5 horas

Los sujetos con insuficiencia cardíaca que recibieron placebo tuvieron una disminución media en la frecuencia cardíaca durante la infusión desde la frecuencia cardíaca inicial (valor obtenido inmediatamente antes de la infusión). Una revisión de los datos de la frecuencia cardíaca data en estos sujetos indicó que sus frecuencias cardíacas fueron más altas al inicio que el día antes de la infusión. Como puede haber ocurrido en los sujetos sanos, los sujetos con insuficiencia cardíaca estable pudieron haber experimentado ansiedad antes del inicio de la infusión, lo que contribuyó a este incremento en los valores iniciales de la frecuencia cardíaca.

Una disminución similar en la frecuencia cardíaca del valor inicial se observó en los sujetos con insuficiencia cardíaca que reciben dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1) menores que 36 ng/kg/min. En contraste, los sujetos con insuficiencia cardíaca que reciben dosis de h-SCP (SEQ ID ΝΟ. ) >36 ng/kg/min tuvieron un incremento en la frecuencia cardíaca en comparación al valor inicial (Figura 18A). Este incremento en la frecuencia cardíaca ocurrió a una dosis similar a la dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1) que produjo una frecuencia cardíaca incrementada en sujetos y perros sanos (Figura 19). Los sujetos que reciben la máxima dosis de 54 ng/kg/min tuvieron un incremento en la frecuencia cardiaca que alcanzó 10 Ipm (Tabla 27).

TABLA 27

Cambios en la frecuencia cardiaca en sujetos con insuficiencia cardiaca

(análisis a posteriori)

Placebo h-SCP (SEQ ID NO:1)

Indice de

infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores

67.2 65.7 65.1 66.1 64.7 64.8 59.7 64.4 iniciales, 63.1 (4.2)

Sujetos con (6.2) (2.7)

Ipm (3.3) (4.1) (3.6) (4.5) (6.3) (5.4) insuficiencia

cardiaca -0.4 -1.3

0.0 (1.1) 1.5 (0.2) 0.2 (1.7) 0.8 (1.1) 3.6 (1.1) 3.8 (2.5) 7.0 (1.0)

CFB, Ipm (0.5) (1.5)

CFB -0.9

porcentual 0.0 (1.7) 3.0 (0.1) 0.2 (0.8) (2.2) 1.5 (2.6) 2.5 (1.8) 6.3 (1.7) 7.5 (4.9) ^

Resultados: media (error estándar de la media). El cambio absoluto y el cambio porcentual desde los valores iniciales se sustraen del placebo. N: número de sujetos que reciben cada una de las concentraciones de dosis. CFB=cambio de los valores iniciales.

En base a estas observaciones parece que en sujetos con insuficiencia cardíaca, las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) 36 ng/kg/min se asociaron con un incremento en la frecuencia cardiaca a partir del valor inicial. Este incremento es particularmente notable en comparación con la disminución en la frecuencia cardíaca observada en los sujetos que reciben placebo. En contraste, en sujetos con insuficiencia cardíaca, las dosis de h-SCP (SEQ ID NO: 1) menores que 36 ng/kg/min no tuvieron ningún incremento claro en la frecuencia cardíaca en comparación con los valores inicíales.

Al final del periodo de infusión de 2.5 horas, el gasto cardíaco medio y el índice cardíaco se redujeron de los valores iniciales con placebo, mientras que los resultados medios fueron variables para todas las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1). En contraste para los sujetos sanos, la respuesta del gasto cardíaco, índice cardiaco y volumen sistólico a la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) en sujetos con insuficiencia cardíaca fue detectable a todas las dosis. Los sujetos con insuficiencia cardíaca que reciben h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) tuvieron un incremento en el índice cardíaco (y gasto cardíaco) a todas las dosis de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) (Figura 18B). Este incremento en el índice cardíaco (y gasto cardíaco) se encontraba en el intervalo de aproximadamente 7 % a 15 %. No se observó ninguna relación relacionada dosis-respuesta. Los datos indican un efecto potencial de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) en el gasto cardíaco, índice cardíaco y volumen sistólico.

TABLA 28

Cambios en el gasto cardíaco en sujetos con insuficiencia cardiaca

(análisis a posteriori)

Placebo h-SCP (SEQ ID NO: 1)

Indice de

infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores 4.1 4.8 5.4 6.0 5.8 5.6 4.7 5.6

4.9 (0.1)

Sujetos con iniciales, l/min (0.6) (0.5) (0.4) (0.4) (0.4) (0.6) (0.2) (1.2) insuficiencia 0.7 0.5 0.3 0.5 0.8 0.7 0.7 0.4 cardíaca 0.0 (0.1)

CFB, l/min (0.3) (0.1) (0.3) (0.3) (0.2) (0.3) (0.2) (0.8)

CFB 14.2 10.2 7.0 9.2 15.5 12 4 13.3 11.5

0.0 (2.5)

porcentual (6.0) (2.4) (4.9) (4.3) (4.1 ) (4.2) (4.6) (14.1 )

Los sujetos con insuficiencia cardiaca que reciben h-SCP (SEQ ID NO: 1) a dosis <36 ng/kg/min tuvieron, además, un claro incremento en el volumen sistólico (entre 6 % y 13 %), observado a todas estas dosis menores (Figura 18C). Cuando se infundió dosis mayores que 36 ng/kg/min el volumen sistólico fue similar al valor inicial, lo que sugiere a estas dosis mayores que el incremento en el índice cardíaco se produjo únicamente a causa de la frecuencia cardíaca incrementada.

TABLA 29

Cambios en el índice cardiaco en sujetos con insuficiencia cardiaca

(análisis a posteriori)

Placebo h-SCP (SEQ ID NO:1)

Indice de

infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores

2.4 2.7 2.9 3.1 2.9 2.7 2.3 2.9 iniciales, 2.5(0.1)

Sujetos con (0.6) (0.3) (0.2) (0.1) (0.2) (0.2) (0.2)

l/min/m2 (0.1) insuficiencia

cardiaca 0.3 0.2 0.1 0.2 0.4 0.3 0.3 0.2

0.0(0.1)

CFB, l/min/m2 (0.1) (0.1) (0.1) (0.1) (0.1) (0.1) (0.1) (0.3)

13.9 10.1 6.9 9.1 14.5 12.4 12.6 7.5

0.0 (2.5)

CFB porcentual (5.7) (2.3) (4.9) (4.4) (3.8) (4.1) (4.4) (10.1)

TABLA 30

Cambios en el volumen sistólico en sujetos con insuficiencia cardiaca

(análisis a posteriori)

Placebo h-SCP (SEQ ID NO:1)

Indice de

infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores 79.9 62.0 73.9 83.4 92.8 89.9 87.6 79.1 86.4 Sujetos con iniciales, mi (5.4) (4.3) (7.4) (6.0) (6.6) (5.7) (9.1) (4.5) (11.1) insuficiencia

cardiaca CFB, ml 0.0(2.4)7.6(4.3)6.6(2.9)4.8(4.6)5.9(3.6)9.3(2.9)4.2(3.5)3.3(0.2) (12.2)

12.9 0.5 CFB porcentual 0.0(3.3)9.5(6.6)9.1 (3.4)7.3(5.1)7.6(3.7) (3.3) 6.0(4.5)5.4(0.2) (13.3) La presión sanguínea sistólica y diastólica promedio se incrementaron de los valores iniciales con placebo al final de la infusión. Por el contrario, la presión sanguínea sistólica y diastólica promedio se redujeron de los valores iniciales al final de la infusión a todas las dosis, excepto por una dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1 ) (1 ng/kg/min), con disminuciones mayores a dosis de h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) 36 ng/kg/min. Estos resultados de la presión sanguínea fueron distintos a los observados en los sujetos sanos, en donde no hubo ninguna tendencia hacia una disminución en la presión sanguínea. En contraste con los sujetos sanos, los sujetos con insuficiencia cardíaca que reciben h-SCP (SEQ ID NO:1) tuvieron una disminución en la presión sanguínea sistólica y la presión sanguínea diastólica a todas las dosis de h-SCP (SEQ ID NO:1). Esta disminución en la presión sanguínea sistólica se encontraba en el intervalo de 5 % a 21 % y en la presión sanguínea diastólica se encontraba en el intervalo de 9 % a 24 %. No hubo ninguna evidencia de un efecto incrementado con dosis más altas en los sujetos que reciben h-SCP (SEQ ID NO:1 ).

TABLA 31

Cambios en la presión sanguínea sistólica en sujetos con insuficiencia cardíaca (análisis a posteriori)

Placebo h-SCP (SEQ IDNO:1)

Indice de

infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores

14.35(0.63) 15.53(1.49) 16.41 (0.83) 15.48 (0.84) 16.03(0.89) 15.00(0.88) 15.39(1.23) 13.96(0.32) 14.77 (3.39) iniciales, kPa

Sujetos con (mm Hg) [107.6(4.7)] [116.5(11.2)1 [123.1 (6.2)] [116.1 (6.3)] [120.2(6.7)] [112.5(6.6)] [115.4 (9.2)] [104.7(2.4)] (110.8(25.4)] in UTlClcnQd

cardíaca CFB, kPa 0.0 (0.27) -2.43 (0.59) [- -0.65 (0.37) [- -1.27 (0.43) [- -1.41 (0.37) [- -1.17 (0.33) [- -2.19(0.40) [- -1.60 (0.57) [- -2.51 (1.87) [- (mm Hg) [0.0(2.0)] 18.2(4.4)] 4.9 (2.8)] 9.5 (3.2)] 10.6(2.8)] 8.8 (2.5)] 16.4 (3.0)] 12.0(4.3)] 18.8 (14.0)]

CFB

0.0(1.8) -15.8(2.2) -4.7 (2.4) -9.2 (2.6) -9.4 (2.3) -8.7 (2.6) -14.9 (2.2) -11.7(4.0) -21.4(15.9) porcentual

TABLA 32

Cambios en la presión sanguínea diastolica en suietos con insuficiencia cardíaca (análisis a posteríori)

Placebo h-SCP (SEQ ID NO:1)

Indice de infusión

(ng/kg/min) 0 0.3 1 3 9 18 36 45 54

N 7 2 4 8 7 9 5 2 2

Valores iniciales, 9.19(0.36) 9.71 (0.067) 9.97(0.51) 9.59(0.59) 9.57 (0.45) 9.24 (0.51) 9.25 (0.43) 8.93 (0.51) 9.36 (2.56) Sujetos con kPa (mm H9) [68.9(2.7)] [72.8(0.5)] [74.8(3.8)] [71.9(4.4)] [71.8 (3.4)] [69.3 (3.8)] [69.4 (3.2)] [67.0 (3.8)] (70.2 (19.2)] insuficiencia

cardíaca 0.0 (0.2) -1.15 (0.45) -1.15(0.413) -1.01 (0.28) -1.67 (0.213) -1.68 (0.32) -1.92 (0.71)

(0.0(1.5)] [-8.6 (3.4)] [-8.6 (3.1)] [-7.6 (2.1)] [-12.5(1.6)] [-12.6 (2.4)] [-14.4 (5.3)]

CFB, kPa (mm Hg)

CFB porcentual 0.0 (2.2) -12.6(4.6) -9.1 (2.5) -13.0(3.0) -11.9 (3.9) -11.4 (3.2) -18.5(2.3) -19.0 (4.0) -23.9 (10.6)

La resistencia vascular sistémica promedio y el índice de resistencia vascular sistémica promedio se incrementaron desde los valores iniciales con placebo, fueron variables a dosis de 0.3 a 9 ng/kg/min y se redujeron desde los valores iniciales a dosis≥18 ng/kg/min.

Se condujo un subestudio de ecocardiografía para examinar el efecto de la h-SCP (SEQ ID NO:1 ) en los parámetros cardíodinámicos. Se seleccionó 5 sujetos para participar en el subestudio de ecocardiografía. Un sujeto recibió placebo y 4 sujetos recibieron h-SCP (SEQ ID NO:1) a dosis en el intervalo de 9 a 45 ng/kg/min durante su último período de infusión de 2.5 horas cuando se obtuvo el ecocardiograma. El sujeto que recibió placebo tuvo una disminución en su fracción de eyección de 43.0 % a 40.9 %. Ambos sujetos que recibieron las dosis menores de 9 y 36 ng/kg/min tuvieron incrementos en sus fracciones de eyección de 20 % a 24.5 % y de 25.0 % a 30.3 %, respectivamente. Ambos sujetos que recibieron 45 ng/kg/min tuvieron disminuciones en sus fracciones de eyección de 36.0 % a 34.7 % y de 28.0 % a 26.1 %, respectivamente. Debido al pequeño número de sujetos que participaron en este subestudio y la dosis variada administrada, los resultados no son concluyentes, sino principalmente indicativos del efecto.

Sujetos sanos, infusión intravenosa continua de 24 y 72 horas,

54 nq/kq/min

Los sujetos sanos se recibieron placebo tuvieron frecuencias cardíacas que disminuyeron en comparación con los valores iniciales durante la infusión. Los sujetos que recibieron placebo tuvieron una disminución media en la frecuencia cardíaca de 5 a 10 Ipm durante la infusión desde la frecuencia cardíaca inicial (valor obtenido inmediatamente antes de la infusión). Una revisión de los datos de la frecuencia cardiaca en estos sujetos indicó que sus frecuencias cardíacas fueron de 5 a 10 Ipm más altas al inicio en comparación con la frecuencia cardíaca el día antes de la infusión. Esto sugiere que en estudios similares a los descritos anteriormente los sujetos pudieron haber experimentado ansiedad antes del inicio de la infusión, lo que contribuyó a este incremento en los valores iniciales de la frecuencia cardíaca.

En contraste con los sujetos que reciben placebo, que tuvieron una disminución en la frecuencia cardíaca durante la infusión, los sujetos que reciben h-SCP (SEQ ID NO: 1 ) a 54 ng/kg/min tuvieron un incremento en la frecuencia cardíaca de 5 a 10 Ipm durante la infusión en comparación con el valor inicial. Este incremento en la frecuencia cardíaca ocurrió rápidamente en el transcurso de 15 minutos. La frecuencia cardíaca tuvo la tendencia a disminuir durante las siguientes 4 a 12 horas, pero permaneció elevada con relación al valor inicial hasta descontinuar la infusión después de 24 o 72 horas. No se observó ninguna diferencia notable en la respuesta entre los sujetos machos y hembras.

En base a estas observaciones parece que la h-SCP (SEQ ID NO:1) a 54 ng/kg/min se asoció con un incremento en la frecuencia cardíaca desde el valor inicial, particularmente, en comparación con el placebo.

Los sujetos sanos que recibieron placebo tuvieron índices cardíacos y gastos cardíacos que disminuyeron en comparación con los valores iniciales durante la infusión. Estas disminuciones de los valores iniciales se produjeron, aparentemente, debido a la disminución en la frecuencia cardiaca durante las infusiones con placebo, dado que el volumen sistólico no cambió durante la infusión.

Para los sujetos que reciben h-SCP (SEQ ID NO:1) a dosis de 54 ng/kg/min, los efectos en el índice cardíaco, gasto cardíaco y volumen sistólico fueron variables e inconsistentes. Es posible que el tiempo disminuido para el llenado diastólico resultante de la frecuencia cardíaca más alta haya podido disminuir el volumen sistólico, el gasto cardíaco y el índice cardíaco en algunos sujetos, mientras que el incremento en la frecuencia cardíaca haya podido incrementar el gasto cardiaco y el índice cardíaco en otros sujetos.

No se observó ninguna tendencia en la presión sanguínea sistólica y díastólica promedio en los grupos con placebo y de 24 horas. La presión sanguínea sistólica y díastólica promedio se disminuyeron, generalmente, desde los valores iniciales en los grupos de machos de 72 horas y de hembras de 72 horas.

La resistencia vascular sistémica promedio y el índice de resistencia vascular sistémica promedio se incrementaron, en su mayor parte, desde los valores inicíales en los grupos con placebo y de 24 horas y se disminuyeron, en su mayor parte, desde los valores iniciales en los grupos de machos de 72 horas y los grupos de hembras de 72 horas.

Aunque la especificación anterior enseña los principios de la presente invención con ejemplos provistos para fines de ilustración, se entenderá que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones o modificaciones usuales que entran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.