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1. WO2020155945 - MÉTHODE DE PRÉPARATION DE COMPOSITION DE TRITERPÈNE D'ÉCORCE DE PAIN INDIEN ET SON APPLICATION

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

附图

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20  

说明书

发明名称 : 一种茯苓皮三萜组合物的制备方法及其应用

技术领域

[0001]
本发明涉及茯苓及茯苓皮中提取工艺及其应用的技术领域。

背景技术

[0002]
茯苓(Wolfiporia cocos)是我国传统的药食两用真菌,在我国中医药中应用广泛,超过20%的复方中含有茯苓成分。茯苓不同部位具有不同功效,《神农本草经》中对比了茯苓块与赤茯苓的功效、书中记载“白者入气分,赤者入血分,补心益脾,白优于赤,通利小肠,专除湿热,赤亦胜白”,李时珍在《本草纲目》中明确收载了茯苓皮主治“水肿肤胀,开水道,开腠理”。因此,随着茯苓块、茯苓皮入药部位由里及表,其宁心安神作用减弱而行水利尿作用逐渐增强。化学成分研究表明茯苓三萜类化合物是茯苓类药材的主要活性物质,目前发现的三萜类化合物主要有茯苓酸、去氢茯苓酸、去氢土莫酸、猪苓酸等。
[0003]
发明内容
[0004]
本发明以茯苓(Wolfiporia cocos)皮为研究对象,对其中含有4个化合物的组合物进行了提取工艺和生物活性研究,发现该组合物在降血糖、降血脂及非酒精性脂肪性肝病等方面具有很好的药用和食用价值。
[0005]
为此,本发明的第一目的,公开了一种提取茯苓皮组合物的方法,包括:
[0006]
(1)称取茯苓皮样品,加入到浸泡溶剂中浸泡、回流后收集滤液;
[0007]
(2)减压浓缩、干燥获得粗提物;
[0008]
(3)将粗提物悬浮于1mol/L NaOH水溶液,超声1h,过滤,得粗沉淀物;
[0009]
(4)将粗沉淀物悬浮于水中加入乙酸中和至pH=7,过滤,得沉淀物;
[0010]
(5)将沉淀物经重结晶溶剂回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得茯苓皮组合物。
[0011]
进一步地,所述的浸泡溶剂为无水乙醇、乙酸乙酯或80%甲醇,其加入量按照茯苓皮样品质量:有机溶剂体积的1g:20ml。
[0012]
进一步地,所述的茯苓皮样品为干燥的过80目筛的粉末。
[0013]
进一步地,所述的浸泡的时间为20min。
[0014]
进一步地,所述的回流的时间为2小时。
[0015]
进一步地,所述的浸泡、回流后收集滤液,还包括重复三次后合并滤液。
[0016]
进一步地,所述的1mol/L NaOH水溶液,其加入量按照粗提物质量:NaOH水溶液体积的1g:10~20ml。
[0017]
进一步地,所述的重结晶溶剂为乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)或乙酸乙酯/丙酮(v/v,3/1)。
[0018]
本发明的第二目的是公开了茯苓皮组合物在制备治疗糖尿病、高血脂、肥胖、非酒精性脂肪性肝病的药物或食品中的应用。
[0019]
本发明的有益之处在于:该组合物在茯苓中含量丰富,可以快速制备。同时在制备治疗糖尿病、高血脂、肥胖、非酒精性脂肪性肝病的药物或食品中具有较好的应用前景。

附图说明

[0020]
图1是式I化合物的核磁氢谱图。
[0021]
图2是式I化合物的碳谱图。
[0022]
图3是式II化合物的核磁氢谱图。
[0023]
图4是式II化合物的碳谱图。
[0024]
图5是式III化合物的核磁氢谱图。
[0025]
图6是式III化合物的碳谱图。
[0026]
图7是式IV化合物的核磁氢谱图。
[0027]
图8是式IV化合物的碳谱图。
[0028]
图9是实施例2中组合物的HPLC图。
[0029]
图10是实施例3中组合物的HPLC图。
[0030]
图11是实施例4中组合物的HPLC图。
[0031]
图12是实施例5中组合物的HPLC图。
[0032]
图13是实施例6中组合物的HPLC图。
[0033]
图14是实施例7中组合物的HPLC图。
[0034]
图15是实施例8中组合物的HPLC图。
[0035]
图16是组合物含量线性回归图。
[0036]
图17是组合物降低DIO小鼠空腹血胰岛素图。
[0037]
其中,(a)为DIO小鼠葡萄糖耐量(OGTT)实验图;(b)为DIO小鼠葡萄糖耐量(OGTT)曲线下面积图;(c)为DIO小鼠胰岛素耐量(ITT)实验图;(d)为DIO小鼠胰岛素耐量(ITT)曲线下面积图;(e)为DIO小鼠糖化血红蛋白含量(%)图;(f)为DIO小鼠血清胰岛素含量图;(g)为胰岛素敏感指数(ISI)图;图例为ND(正常小鼠),HFD(高脂饲料喂养的小鼠),Met(二甲双胍组),50mg/kg(喂养50mg/kg的组合物组),100mg/kg(喂养100mg/kg的组合物组)。
[0038]
图18是组合物改善DIO小鼠的脂代谢紊乱图。
[0039]
其中,(A)为TG(总甘油三酯);(B)为TC(总胆固醇);(C)为LDL(低密度脂蛋白胆固醇);(D)为NEFA(游离脂肪酸)。
[0040]
图19是组合物对DIO小鼠非酒精性脂肪性肝病具有改善作用图。
[0041]
其中,(a)为肝脏中总甘油三酯;(b)为肝脏中总胆固醇;(c)为肝脏中低密度脂蛋白;(d)为肝脏中游离脂肪酸;(e)为谷草转氨酶;(f)为谷丙转氨酶。
[0042]
图20是DIO小鼠皮下脂肪组织切片显微照片图。

具体实施方式

[0043]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0044]
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0045]
HPLC分析仪为Agilent 1200分析型液相色谱仪。HPLC的条件如下:以色谱甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液,上样量为每次15ul,色谱柱为Kromasil 10×250mm C18半制备柱,柱温为25℃,210nm波长进行检测。
[0046]
实施例1
[0047]
茯苓皮三萜组合物的分离纯化及结构鉴定
[0048]
35g茯苓皮提取物通过甲醇和二氯甲烷溶解,与40g 200-300目硅胶混合干燥,通过硅胶正相柱色谱分离(色谱柱长500mm,内径45mm),以正己烷:乙酸乙酯体系(正己烷:乙酸乙酯的体积比为1:0,50:1,30:1,20:1,15:1,10:1,4:1,2:1),二氯甲烷:甲醇体系(二氯甲烷:甲醇的体积比为1:0,100:1,50:1,30:1,10:1,5:1)依次进行梯度洗脱,每个梯度洗涤2L。
[0049]
根据薄层层析色谱行为分析,合并相似流分,在正己烷:乙酸乙酯(体积比为100/1~50/1)体系得到馏分PL-1;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为50/1~30:1)中得到馏分PL-2~8;在正己烷:乙酸乙酯(体积比为20:1)中得到馏分PL-9~11。将各流分减压浓缩。
[0050]
PL-10(4g)用二氯甲烷/甲醇(V/V:1/1)20ml超声溶解,溶解过程中,有沉淀析出,过滤,用10ml甲醇洗涤沉淀,得到沉淀1g,将沉淀用吡啶溶解以体积百分含量88%甲醇的酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01%三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备,流速为2ml/min,分别收集32.2min,36.4min,38.9min,42.6min的色谱峰,收集的液体分别经减压浓缩、干燥后分别获得140mg,68mg,185mg,43mg白色无定型粉末,经HPLC面积归一法分析测定四个化合物均为单一化合物,经质谱和核磁数据验证,四个化合物为式I~IV。
[0051]
二、化合物的结构确认
[0052]
通过分析质谱和核磁数据并与文献报道数值对比,确证式I所示化合物为(R)-2-((3S,5R,10S,13R,14R,17R)-3-羟基-4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,10,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊[a]菲-17-基)-6-甲基庚-5-己烯酸(松苓新酸,dehydrotrametenolic acid),其波谱数据如下所示:
[0053]
HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H] +455.7035(计算值C 30H 47O 3,455.7030);其分子式为C 30H 46O 31H-NMR(500MHz,吡啶-d 5):δ5.61(d,J=6.1Hz,1H,H-7),5.37(d,J=6.1Hz,1H, H-11),5.32(t,J=7.4Hz,1H,H-24),3.45(t,J=7.7Hz,1H,H-3),1.66(s,3H,H-26),1.62(s,3H,H-27),1.22(s,3H,H-28),1.13(s,3H,H-29),1.06(d,J=2.9Hz,6H,H-19,30),1.00(s,3H,H-18)。 13C-NMR(125MHz,吡啶-d 5):δ36.4(C-1),28.7(C-2),78.0(C-3),39.3(C-4),49.8(C-5),23.5(C-6),121.2(C-7),142.8(C-8),146.6(C-9),37.8(C-10),116.6(C-11),36.0(C-12),44.3(C-13),50.5(C-14),31.6(C-15),27.3(C-16),48.1(C-17),16.3(C-18),23.0(C-19),48.9(C-20),178.5(C-21),33.3(C-22),26.7(C-23),124.8(C-24),131.7(C-25),25.8(C-26),17.7(C-27),28.8(C-28),16.6(C-29),25.9(C-30)。
[0054]
据此,确定该化合物的结构式如式I所示:
[0055]
[0056]
其中,核磁氢谱如图1,碳谱(溶剂为氘代吡啶)如图2.
[0057]
通过分析质谱和核磁数据并与文献报道数值对比,式II所示化合物2-((3S,5R,10S,13R,14R,17R)-3-羟基-4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-17-基)-6-甲基戊-5-己烯酸,(3β-羟基-羊毛甾-8,24-二烯-21-酸,trematenolic acid),其波谱数据如下所示:
[0058]
HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H] +457.3688(计算值C 30H 49O 3,457.3682);其分子式为C 30H 48O 31H-NMR(500MHz,吡啶-d 5):δ5.31(t,J=7.2Hz,1H,H-24),3.42(dd,J=9.0,7.0Hz,1H,H-3),2.64(td,J=11.1,3.4Hz,1H,H-20),1.65(s,3H,H-26),1.60(s,3H,H-27),1.22(s,3H,H-28),1.05(s,6H,H-19,30),1.00(s,3H,H-29),0.99(s,3H,H-18)。 13C-NMR(125MHz,吡啶-d 5):δ36.1(C-1),28.7(C-2),78(C-3),39.5(C-4),50.9(C-5),18.7(C-6),26.6(C-7),134(C-8),134.6(C-9),37.4(C-10),21.3(C-11),29.4(C-12),44.9(C-13),49.9(C-14),30.9(C-15),27.5(C-16),47.7(C-17),16.3(C-18),19.4(C-19),49(C-20),178.6(C-21),33.3(C-22),26.7(C-23),124.9(C-24),131.6(C-25),25.8(C-26),17.7(C-27),28.6(C-28),16.4(C-29),24.5(C-30)。
[0059]
据此,确定该化合物的结构式如式II所示:
[0060]
[0061]
核磁氢谱如图3,碳谱(溶剂为氘代吡啶)如图4。
[0062]
通过分析质谱和核磁数据并与文献报道数值对比,式Ⅲ所示化合物(2R)-2-((3S,10S,13R,14R,17R)-3-羟基-4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,10,12,13,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊[a]菲-17-基)-6-甲基-5甲烯基庚酸,(去氢齿孔酸,dehydroeburicoic acid),其波谱数据如下所示:
[0063]
HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H] +469.3679(计算值C 31H 49O 3,469.3682);其分子式为C 31H 48O 31H-NMR(500MHz,吡啶-d 5):δ5.62(d,J=6.1Hz,1H,H-11),5.36(d,J=6.2Hz,1H,H-12),4.92(s,1H,H-31),4.87(s,1H,H-31),3.46(m,1H,H-3),2.64(td,J=11.0,3.3Hz,1H,H-20),1.20(s,3H,H-28),1.11(s,3H,H-29),1.02/1.05(s,6H,H-30,19),1.00/1.01(d,J=7.5Hz,6H,H-26,27),1.02(s,3H,H-18)。 13C-NMR(125MHz,吡啶-d 5):δ36.4(C-1),28.7(C-2),78.0(C-3),39.3(C-4),49.8(C-5),23.6(C-6),121.3(C-7),142.8(C-8),146.6(C-9),37.9(C-10),116.6(C-11),36.0(C-12),44.3(C-13),50.5(C-14),31.6(C-15),27.3(C-16),48.1(C-17),16.3(C-18),23.0(C- 19),49.1(C-20),178.4(C-21),31.8(C-22),32.8(C-23),155.8(C-24),34.2(C-25),22.0(C-26),21.9(C-27),28.8(C-28),16.6(C-29),25.9(C-30),107.0(C-31)。
[0064]
据此,确定该化合物的结构式如式Ⅲ所示:
[0065]
[0066]
核磁氢谱如图5,碳谱(溶剂为氘代吡啶)如图6。
[0067]
通过分析质谱和核磁数据并与文献报道数值对比,式Ⅳ所示的化合物为(2R)-2-((3S,10S,13R,14R,17R)-3-羟基-4,4,10,13,14-五甲基-2,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊[a]菲-17-基)-6-甲基-5-甲烯基庚酸,(齿孔酸,eburicoic acid),其波谱数据如下所示:
[0068]
HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H] +m/z:[M+H] +471.3841(计算值C 31H 51O 3,471.3838);其分子式为C 31H 50O 31H-NMR(500MHz,吡啶-d 5):δ4.88/4.89(s,each 1H,H-31),3.82(dd,J=9.0,7.0Hz,1H,H-3),2.65(td,J=11.1,3.4Hz,1H,H-20),1.23(s,3H,H-28),1.16(s,3H,H-19),1.08(s,3H,H-30)1.06/1.08(d,J=4.5Hz,H-26,27),1.02(s,6H,H-18,29)。 13C-NMR(125MHz,吡啶-d 5):δ36.1(C-1),28.7(C-2),78.0(C-3),39.5(C-4),50.9(C-5),18.7(C-6),28.6(C-7),135.2(C-8),134.3(C-9),37.4(C-10),21.3(C-11),29.4(C-12),44.9(C-13),49.9(C-14),30.9(C-15),27.5(C-16),47.7(C-17),16.3(C-18),19.4(C-19),49.2(C-20),178.4(C-21),31.9(C-22),32.8(C-23),155.9(C-24),34.2(C-25),22.0(C-26),21.9(C-27),28.6(C-28),16.4(C-29),24.5(C-30),107.0(C-31)。
[0069]
据此,确定该化合物的结构式如式Ⅳ所示:
[0070]
[0071]
核磁氢谱如图7,碳谱(溶剂为氘代吡啶)如图8。
[0072]
实施例2、茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的简易制备方法一
[0073]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取100g,再用0.5升无水乙醇浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏10g。将粗提物悬浮于100ml1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于500ml的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物MSPC1.02g,回收率为1.0%,经HPLC(如图9)分析,四个化合物总量占到该组合物的80%以上。
[0074]
实施例3.茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的简易制备方法二
[0075]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取100g,再用0.5升乙酸乙酯浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述乙酸乙酯浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏2.6g。将粗提物悬浮于52毫升1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于26mL的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ 所示化合物组合物1.5g,收率为1.5%,经HPLC(如图10)分析,四个化合物总量占到组合物的75%以上。
[0076]
实施例4.茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的简易制备方法三
[0077]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取100g,再用0.5升无水乙醇浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏9.8g。将粗提物悬浮于196ml 0.1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于100ml的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物2.1g,收率为2.1%,经HPLC(如图11)分析,四个化合物总量占到组合物的55%以上。
[0078]
实施例5.茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的简易制备方法四
[0079]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取100g,再用0.5升无水乙醇浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏9.8g。将粗提物悬浮于196ml 1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于100ml的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/丙酮(v/v,3/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物1.5g,收率为1.5%,经HPLC(如图12)分析,四个化合物总量占到组合物的75%以上。
[0080]
实施例6.茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的简易制备方法五
[0081]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取100g,再用0.5升80%甲醇浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏9.8g。将粗提物悬浮于196ml 1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于100ml的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/乙醇(v/v,1/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物1.3g,收率为1.3%,经HPLC(如图13)分析,四个化合物总量占到组合物的65%以上。
[0082]
实施例7.茯苓皮中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物的大规模简易制备方法
[0083]
取茯苓皮样品,充分干燥后,粉碎后过80目筛,称取2kg,再用10升无水乙醇浸泡20min,回流提取2小时,过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-回流-过滤的操作3次后合并滤液,减压浓缩、干燥获得乙醇提取物浸膏112g。将粗提物悬浮于2.2升1mol/L NaOH水溶液超声1h,过滤,沉淀悬浮于1.1L的水中加入乙酸中和至pH=7,过滤。沉淀经乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得到纯度较高的式Ⅰ-Ⅳ所示化合物组合物9.8g,经HPLC(如图14)分析,四个化合物总量占到组合物的80%以上。
[0084]
实施例8、茯苓皮,茯苓块以及组合物中式Ⅰ-Ⅳ所示化合物定量分析
[0085]
8.1 HPLC的条件如下:HPLC分析仪为Agilent 1200分析型液相色谱仪。以色谱乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)将样品配制为1mg/ml的溶液,上样量为每次10ul,色谱柱为Kromasil 4.5×250mm C18(5μm),流动相为85%MeCN+15%Water(加入0.01%TFA),柱温为40℃,210nm波长进行检测。液相色谱图如15,式I-IV四个化合物均达到基线分离。
[0086]
8.2精密配制含有2mg/ml的I-IV的四种化合物的乙酸乙酯/乙醇(V/V=3/1)混合溶液,梯度对半稀释,得到一系列系列浓度的混合对照品溶液。分别吸取上述混合对照品溶液10μL进样,按本实施例中色谱条件进样测定,记录峰面积,以峰面积值为纵坐标,对照品进样浓度为横坐标,进行线性回归,结果见下表和图16。
[0087]
[0088]
[0089]
8.3精密度试验取同一份混合对照品溶液,连续重复进样6次,每次10μL,测得I-IV的RSD(n=6)分别为0.44%,0.64%,0.46%,0.58%,结果表明方法精密度良好
[0090]
8.4重复性试验取同一样品6份,按本实施例项下方法制备供试品溶液,进样测定,计算I-IV含量的RSD分别1.30%,1.18%,0.97%,1.68%,为结果表明方法重复性良好。
[0091]
8.5稳定性试验取同一供试品溶液,分别于0、4、8、12、16、20h,在“4.1”项下色谱条件测定,并记录峰面积,式I-IV的峰面积RSD分别为0.93%、0.96%、1.17%、1.28%,表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
[0092]
8.6加样回收率试验精密量取已知含量的供试品溶液0.5mg 6份,分别加入I-IV混合对照品适量,按本实施例项下方法制成供试品溶液,精密量取各供试品溶液0.5mL,按选择条件测定吸收值,计算回收率。结果见下表
[0093]
[0094]
8.7样品含量测定分别称取茯苓皮提取物,茯苓块提取物,以及实施例三中的组合物5mg,按本实施例项下操作制备样品溶液,进样10μL,在上述色谱条件下平行测定3次,计算各样 品中4种成分的含量,结果见表3
[0095]
[0096]
实施例9组合物MSPC促进3T3-L1细胞葡萄糖摄取活性试验
[0097]
3T3-L1细胞用含10%小牛血清和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基,CO 2培养箱中培养传代,经CCK8法确定式I-IV化合物没有细胞毒性。
[0098]
以每孔10000个细胞密度接种3T3-L1细胞到96孔板,37℃、含5%的CO 2及饱和湿度培养箱中贴壁生长,待3T3-L1细胞基本长满后可进行诱导分化,首先用10%小牛血清的DMEM高糖培养液含10μM地塞米松、0.5mM IBMX及1.0μg/mL胰岛素诱导分化48h后,改用10%胎牛血清的DMEM高糖培养液含1.0μg/mL胰岛素作为培养液进行培养,诱导分化,连续分化10d后3T3-L1细胞镜下可见大量脂肪颗粒,脂肪颗粒占90%以上即为分化完成,再用于葡萄糖摄取使用。
[0099]
NBDG法测定3T3-L1分化好的脂肪细胞。用KRPH缓冲液清洗分化好的3T3-L1细胞,并将细胞在KRPH缓冲液中饥饿1h,接下来用不同浓度的组合物MSPC处理24h后,更换培养液,使用含100μM 2-NBDG DMEM培养液培养30min,弃上清,PBS清洗2次,立即于荧光酶标仪466nm和540nm波长处检测。通过比较荧光强度与空白组的相对比来评价茯苓单体化合物对3T3-L1细胞萄葡糖摄取活性的影响。胰岛素做为对照。
[0100]
经试验证明,20μg/ml时,组合物MSPC对葡萄糖的摄取是空白组的1.2倍,20μM式I-IV化合物分别对葡萄糖的摄取是空白组的1.1,1.3,1.1,1.1倍,说明该组合物和单体化合物对葡萄糖摄取有一定的促进作用。
[0101]
实施例10组合物MSPC增敏胰岛素,抑制胰岛素抵抗
[0102]
分化好的3T3-L1脂肪细胞,用KRPH缓冲液清洗分化好的3T3-L1细胞,并将细胞在KRPH缓冲液中饥饿1h,接下来用含100nM胰岛素及不同浓度的式I-IV化合物单体处理24h,更换培养液,使用含100μM 2-NBDG DMEM培养液培养30min,弃上清,PBS清洗2次,立即于荧光酶标仪466nm和540nm波长处检测。通过比较荧光强度与空白组的相对比来评价式I-IV化合物以及组合物MSPC对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的改善作用。
[0103]
经试验证明,在100nM胰岛素胁迫作用下,葡萄糖的摄取显著增加,是空白组的3.13倍,而式I-IV化合物(20μM)以及组合物MSPC(20μg/ml)则可以增敏胰岛素,进一步增加葡萄糖的摄取,分别是空白对照组的3.27,3.88,3.34,3.45以及3.67倍,可以改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗状态,增加脂肪细胞对葡萄糖摄取和利用的能力,从体外细胞水平上可以说明该化合物具有改善胰岛素抵抗的作用。
[0104]
实施例11组合物MSPC对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的药效学评价
[0105]
11.1实验材料
[0106]
11.1.1实验动物
[0107]
C57BL/6J(4周,雄性)小鼠,SPF级,购于中国医学科学院北京协和医学院,动物研究所,用60%高脂高营养饲料喂养。
[0108]
11.1.2受试药物及化合物:组合物和二甲双胍
[0109]
11.1.3主要试剂
[0110]
葡萄糖、CMC-Na、生理盐水、血糖试纸、胰岛素、小鼠胰岛素超敏ELISA试剂盒、小鼠糖化血红蛋白超敏ELISA试剂盒、小鼠总血红蛋白超敏ELISA试剂盒、血清总胆固醇(CHO)测定试剂盒、血清高密度脂蛋白-胆固醇测定试剂盒、血清低密度脂蛋白-胆固醇测定试剂盒、血清甘油三酯(TG)测定试剂盒、血清游离脂肪酸检测试剂盒(FFA)测定试剂盒、丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、蒽酮、硫脲、5-磺基水杨 酸、4%多聚甲醛
[0111]
11.1.4主要实验仪器及耗材血糖仪,离心机,低温冷冻离心机,酶标仪,电子天平,磁力搅拌器
[0112]
11.2.实验方法
[0113]
11.2.1实验分组及模型建立
[0114]
C57BL/6J小鼠高脂饲料喂养4周,根据体重情况进行筛选,入选小鼠随机分为模型组和给药组,C57BL/6J小鼠(正常饮食)作为对照。
[0115]
4周后将体重上升20%以上的小鼠视为建模成功,测定空腹血糖,依据血糖值并结合体重情况平均分组:(1)以喂养正常饲料的C57BL/6J小鼠作为空白对照组(2)模型对照组(3)二甲双胍100mg/kg(4)组合物MSPC50mg/kg(5)组合物MSPC100mg/kg。每组10只,连续给药5周。
[0116]
11.2.2葡萄糖耐量实验(OGTT)
[0117]
给药第25天测葡萄糖耐量:动物禁食2小时取血(0时)给药,给药并口服葡萄糖(2.0g/kg),分别30,60,120分钟尾尖取血测血糖值,绘制血糖随时间变化曲线,计算曲线下面积。
[0118]
11.2.3胰岛素耐量实验(ITT)
[0119]
给药第27天,动物禁食并给予化合物后2小时取血(0时),皮下注射胰岛素(0.4IU/kgB.W.,0.1ml/20gB.W.),分别于注射胰岛素后40分钟和90分钟取血测血糖,绘制血糖随时间变化曲线,计算曲线下面积。
[0120]
11.2.4血脂、肝功能水平测定取血浆测定血甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、游离脂肪酸水平。取血浆用谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒测定,评价肝脏功能。
[0121]
11.2.5肝脏、脂肪组织组织切片与HE染色
[0122]
取小鼠肝脏、脂肪组织放入4%多聚甲醛中过夜,进行石蜡包埋,做组织切片,并进行HE染色,显微镜下观察并记录切片状态。
[0123]
11.3实验结果
[0124]
11.3.1组合物MSPC对DIO小鼠的血糖控制及改善胰岛素抵抗情况
[0125]
给药第25天进行OGTT实验,结果显示组合物以及二甲双胍组能显著降低糖耐量曲线下面积(area under the curve,AUC),给药第27天进行ITT实验,结果显示组合物100mg/kg组以及二甲双胍组能显著降低胰岛素耐量曲线下面积,表明组合物可以改善DIO小鼠的胰岛素抵抗,促进机体糖摄取。
[0126]
给药35天后检测各组DIO小鼠的糖化血红蛋白指标:相比于模型对照组,二甲双胍组以及组合物100mg/kg剂量组均可使DIO小鼠糖化血红蛋白值恢复到较低的水平,表明组合物对DIO小鼠血糖的长期控制情况良好。
[0127]
高脂饮食诱导的糖尿病模型小鼠具有明显的高胰岛素血症,给药后二甲双胍组以及组合物100mg/kg均可显著降低DIO小鼠空腹血胰岛素水平,增强胰岛素敏感指数。DIO各剂量组均可显著增强胰岛素敏感指数。
[0128]
如图17,组合物MSPC对DIO小鼠血糖控制及胰岛素增敏情况(a):DIO小鼠葡萄糖耐量(OGTT)实验;(b):DIO小鼠葡萄糖耐量(OGTT)曲线下面积;(c):DIO小鼠胰岛素耐量(ITT)实验;(d):DIO小鼠胰岛素耐量(ITT)曲线下面积;(e):DIO小鼠糖化血红蛋白含量(%)(f)DIO小鼠血清胰岛素含量(g)胰岛素敏感指数(ISI);图例为ND(正常小鼠),HFD(高脂饲料喂养的小鼠),Met(二甲双胍组),50mg/kg(喂养50mg/kg的组合物组),100mg/kg(喂养100mg/kg的组合物组)。
[0129]
11.3.3组合物MSPC对DIO小鼠脂代谢紊乱的影响
[0130]
溶剂对照DIO小鼠糖尿病病情逐渐发展,具有典型的2型糖尿病症状,高血糖同时伴有明显的脂代谢紊乱,总甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)和游离脂肪酸(FFA)水平显著升高(P<0.01)。给药治疗后二甲双胍组和组合物100mg/ml组均显著降低血TG,TC,FFA水平,降低高密度脂蛋白(LDL)含量,如图18,表明100mg/ml组合物可以显著改善DIO小鼠的脂代谢紊乱,改善脂代谢水平。图18,血液DIO小鼠脂代谢相关指标(A):TG(总甘油三酯);(B):TC(总胆固醇);(C):LDL(低密度脂蛋白胆固醇)(D):NEFA(游离脂肪酸)。
[0131]
11.3.4组合物MSPC对DIO小鼠非酒精性脂肪性肝病具有改善作用
[0132]
给药35天后,组合物100mg/kg组以及二甲双胍组可降低肝脏中的总甘油三酯,总胆固醇,低密度脂蛋白,游离脂肪酸,谷丙转氨酶(ALT)以及谷草转氨酶(AST)含量,表明组合物对DIO小鼠非酒精性脂肪性肝病具有改善作用。图19,肝脏DIO小鼠脂代谢相关指标(a):肝脏中总甘油三酯;(b):肝脏中总胆固醇;(c):肝脏中低密度脂蛋白;(d):肝脏中游离脂肪酸;(e)谷草转氨酶;(f)谷丙转氨酶。
[0133]
11.3.5组合物MSPC对DIO小鼠组织切片病理形态的影响
[0134]
结合肉眼观察和组织病理切片的HE染色对DIO小鼠脂肪组织学分析结果表明模型组小鼠腹内白色脂肪细胞形态大小不一。二甲双胍组和100mg/kg组合物治疗后可见肝脏脂肪空泡基本消失。图20,给药35天后DIO小鼠皮下脂肪组织切片显微照片(HE:20×)。

权利要求书

[权利要求 1]
一种提取茯苓皮组合物的方法,其特征在于,包括: (1)称取茯苓皮样品,加入到浸泡溶剂中浸泡、回流后收集滤液; (2)减压浓缩、干燥获得粗提物; (3)将粗提物悬浮于1mol/L NaOH水溶液,超声1h,过滤,得粗沉淀物; (4)将粗沉淀物悬浮于水中加入乙酸中和至pH=7,过滤,得沉淀物; (5)将沉淀物经重结晶溶剂中回流,形成热饱和溶液,溶液重结晶,得茯苓皮组合物。
[权利要求 2]
权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的浸泡溶剂为无水乙醇、乙酸乙酯或80%甲醇,其加入量按照茯苓皮样品质量:有机溶剂体积的1g:20ml。
[权利要求 3]
权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的茯苓皮样品为干燥的过80目筛的粉末。
[权利要求 4]
权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的浸泡的时间为20min。
[权利要求 5]
权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的回流的时间为2小时。
[权利要求 6]
权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的浸泡、回流后收集滤液,还包括重复三次后合并滤液。
[权利要求 7]
权利要求1所述的法,其特征在于,所述的1mol/L NaOH水溶液,其加入量按照粗提物质量:NaOH水溶液体积的1g:10~20ml。
[权利要求 8]
权利要求1所述的法,其特征在于,所述的重结晶溶剂为乙酸乙酯/乙醇(v/v,3/1)或乙酸乙酯/丙酮(v/v,3/1)。
[权利要求 9]
茯苓皮组合物在制备治疗糖尿病、高血脂、肥胖、非酒精性脂肪性肝病的药物或食品中的应用。
[权利要求 10]
式I-IV化合物分别在制备治疗糖尿病、高血脂、肥胖、非酒精性脂肪性肝病的药物或食品中的应用。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]  
[ 图 9]  
[ 图 10]  
[ 图 11]  
[ 图 12]  
[ 图 13]  
[ 图 14]  
[ 图 15]  
[ 图 16]  
[ 图 17]  
[ 图 18]  
[ 图 19]  
[ 图 20]