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1. WO2008000846 - PROCÉDÉ DE STÉRILISATION DE SUBSTANCES À BASE DE CACAO À L'AIDE DE CO2 SUPERCRITIQUE

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[ ES ]

MÉTODO PARA LA ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES DE CACAO
MEDIANTE CO2 SUPERCRÍTICO

SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención describe un método para Ia esterilización de productos derivados del cacao que se puede llevar a cabo utilizando un fluido supercrítico, particularmente CO2 supercrítico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Según el diccionario de Ia Real Academia el proceso de esterilizar es aquél que se lleva a cabo sobre un objeto para eliminar o destruir los posibles gérmenes patógenos que éste pudiera tener. Hoy día sabemos que un objeto esterilizado no se mantiene en ese estado indefinidamente. La esterilización es un tratamiento cuyo resultado es preservar y mantener los productos tratados inalterados durante períodos de tiempo más o menos largos según los casos. El concepto de esterilidad puede definirse como Ia ausencia de todas formas de vida viables, es decir, Ia ausencia total de microorganismos vivos. Un microorganismo está vivo desde el punto de vista microbíológico cuando es capaz de multiplicarse, por consiguiente, un microorganismo muere cuando pierde de forma irreversible Ia capacidad de reproducirse. En Ia práctica, Ia muerte de un microorganismo se alcanza cuando no es posible detectarlo en medio de cultivo en el cual ha demostrado que es capaz de proliferar. Así que el término de esterilidad se expresa como Ia probabilidad matemática de que un producto permanezca contaminado con microorganismos supervivientes después de haber sido expuesto a un proceso de esterilización. La Farmacopea Europea fija un nivel teórico de supervivencia de no más de un microorganismo en 106 unidades esterilizadas de producto final.
Existen diversas posibilidades de inhibición del crecimiento microbiano en alimentos, siendo las más eficaces y disponibles para Ia industria alimentaria las basadas en Ia aplicación de tratamientos térmicos. Los principales métodos térmicos de conservación de alimentos son el escaldado, Ia pasteurización y Ia esterilización.

La esterilización es una operación unitaria en Ia que los alimentos son calentados a una temperatura suficientemente elevada (entre 1100C y 14O0C) y un tiempo suficientemente largo, como para destruir al máximo Ia actividad microbiana

(véase por ejemplo el documento de patente ES 2238700 T3 que se refiere a un método para Ia desinfección o Ia esterilización de alimentos como Ia carne o los productos vegetales y los piensos los cuales se exponen a vapor sobrecalentado de agua u otro líquido que se aplica mediante un campo de potencial electrostático). Sin embargo, un tratamiento térmico excesivo puede provocar Ia aparición de compuestos indeseables, pérdida de nutrientes, así como Ia posible merma o reducción del compuesto activo de interés haciendo que disminuya Ia calidad del alimento.
Por ello, se han propuesto otros procedimientos para Ia esterilización que incluyen el uso de radiación ultravioleta, Ia radiación ionizante o Ia aplicación de microondas. Aunque estos tratamientos son caros y los alimentos irradiados no tienen buena aceptación en el consumidor.
Actualmente también se está empleando el tratamiento con alta presión, que ya se ha utilizado a nivel comercial para Ia pasteurización. En este método, se aplican presiones que oscilan desde 3000 bar a 17000 bar. Pero esta técnica supone altos costes de equipo, requiere medidas especiales de seguridad y no permite operar en continuo, ya que se realiza en autoclaves por cargas y sobre todo, no consigue eliminar las especies más resistentes que son las esporas.
La esterilización mediante CO2 comprimido es una técnica de conservación de productos termolábiles, que se ha comenzado a investigar con gran interés desde Ia década de los 80, fundamentalmente para productos líquidos alimentarios. Hay diferentes patentes sobre el empleo de este fluido para Ia destrucción de microorganismos y Ia desactivación de enzimas en productos líquidos (JP 9206044 (A), JP 3,042,830, JP-A 2000-139433, JP-A 2002-78478; JP 2003310227; US 2005084581 , WO 2005034655, WO 2005 001059). Los resultados descritos en estas patentes y en Ia literatura indican que el tratamiento con CO2 a alta presión puede ser útil para destruir microorganismos tales como bacterias, mohos y levaduras, así como para Ia desactivación de muchas enzimas causantes del deterioro de los alimentos. Todo ello, en condiciones suaves de temperatura y moderada presión, y sin afectar las propiedades físico-químicas y organolépticas de los productos tratados.

El tratamiento de productos alimentarios sólidos ha sido muy poco investigado y no existen patentes al respecto, probablemente debido a que es más complicado poner en contacto el CO2 con materiales sólidos es por Io que no se ha investigado todavía. Quizá se podría reseñar el trabajo exploratorio realizado por Haas y col. en "Inactivation of microorganisms by carbón dioxide under pressure", J. Food Safety 9, 253 (1989) donde investigaron el tratamiento en Ia eliminación de Ia microflora natural en algunos productos como Ia harina, los componentes de Ia pizza (queso, salsa de tomate, cebollas frescas, pan,) o en ingredientes tales como el romero, el polvo de ajo y el pimiento verde. También investigaron el método en frutas enteras como fresas, melones y pepino con el objetivo de retrasar Ia aparición de moho. El resultado fue considerado satisfactorio aunque observaron destrucción parcial del tejido graso.
Por otro lado, es conocida Ia capacidad del CO2 supercrítico para extraer diferentes compuestos de matrices sólidas como aceites y grasas, o ceras y otros compuestos de valor añadido como β-caroteno, α-tocoferol y otros a partir de Ia hoja del olivo (ES 2238183 A1). En concreto, cuando el alimento es cacao existen referencias del uso del CO2 supercrítico para Ia extracción de Ia grasa (US 3923847, GB 1356750), de sustancias estimulantes como Ia cafeína, teobromina o xantina (EP 0061017 A2, US 4861607) y de otro tipo de compuestos funcionales como los polifenoles y los aromas naturales (JP 2046267). La extracción con CO2 supercrítico implica varias ventajas respecto al uso de disolventes orgánicos que son tóxicos.
Sus propiedades físico-químicas varían ampliamente con Ia presión y temperatura. Esto significa que con pequeñas variaciones en las condiciones de operación se puede variar Ia densidad y por tanto, las propiedades de solvatación y Ia selectividad. También existe Ia posibilidad de incrementar Ia selectividad y el poder del disolvente mediante Ia adición de modificadores o co-disolventes. El proceso se simplifica y se abarata puesto que Ia separación posterior del producto se puede realizar mediante manipulaciones en las condiciones de operación. Después de Ia extracción, una disminución de Ia presión y/o temperatura puede hacer que los compuestos menos solubles precipiten, logrando una separación fraccionada, sin necesidad de etapas posteriores de separación. Como no queda residuo del disolvente en los productos, porque el CO2 en condiciones atmosféricas es gas, Ia purificación del producto es mucho más simple.

El CO2 es inerte, no tóxico, accesible y barato. Está considerado como un disolvente "GRAS" es decir, apto para el uso en productos alimentarios. Como posee una características críticas suaves de temperatura (31 ,30C) y de presión (73,8 bar), los compuestos orgánicos que sean termolábiles pueden procesarse sin peligro de desnaturalización o descomposición.
Además, debido a Ia demanda cada vez mayor que existe de los alimentos funcionales, que en muchos casos incorporan uno o más principios activos de naturaleza termolábil, resulta muchas veces necesario el empleo de técnicas de extracción y conservación que operen a temperaturas suaves y evitando el uso de agentes químicos que pueden dejar residuos no aptos para consumo humano. Más aún, si ambos procesos pueden llevarse a cabo en Ia misma etapa, el proceso se simplifica y abarata enormemente y cumple con los requisitos de un proceso medioambientalmente sostenible.
Todas estas ventajas, unido a las cada vez mayores restricciones al uso de disolventes orgánicos en el procesamiento de productos de consumo humano, hacen que hayamos considerado Ia utilización de los fluidos supercríticos y en concreto, del

CO2 supercrítico como disolvente muy adecuado para llevar a cabo operaciones de extracción en productos de cacao y sorprendentemente hemos encontrado que es el disolvente ideal también para llevar a cabo Ia esterilización de materiales de cacao aunque en este caso requiere Ia previa humidificación de dichos materiales de cacao.

Por todo Io anterior, los autores de Ia presente invención han elaborado un proceso para esterilizar cacao y sus derivados utilizando CO2 supercrítico que permite obtener un producto con las siguientes características y ventajas:
• Permite eliminar esporas de microorganismos termorresistentes a temperaturas mucho más bajas que las que se utilizan en los métodos convencionales de esterilización (650C vs 12O0C) y a presiones mucho más moderadas que las utilizadas en los métodos tradicionales de pasteurización (300 bar vs 3000 bar).
• Produce un cacao/derivado de cacao con una calidad intacta de sus características, tanto organolépticas como en contenidos de principios activos deseables para Ia salud. El producto de cacao esterilizado según Ia invención contiene un 99.99% de Ia suma total de flavanoles: monómeros de catequina y epicatequina así como dímeros de procianidinas B1 y B2.
• Preserva los principios activos termolábiles, presentes originalmente o añadidos (por ejemplo, vitamina C).
• Permite obtener productos de cacao desgrasado (<1% de grasa) ya que nuestros resultados no coinciden con los de EP 0061017 A2 (ES 8302708) donde describen un procedimiento para extraer xantina de cacao previamente hinchado con agua, tratándolo con CO2 supercrítico y establecen en todos los ejemplos que después del tratamiento "no se produjo pérdida de material graso".
• El CO2 tiene las ventajas siguientes sobre cualquiera de los otros disolventes orgánicos: a) no necesita una eliminación posterior; b) no deja residuo en el producto; c) puede aislar los compuestos extraídos selectivamente cambiando Ia presión, eliminándose así muchas operaciones de separación y purificación.
• Como el CO2 es muy selectivo, el proceso de esterilización es un proceso económico y amigo del medioambiente (sigue los principios de Ia Química Verde y el Desarrollo Sostenible).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Esta invención describe un método de esterilización mediante el empleo de CO2 en estado supercrítico para su aplicación al cacao y sus derivados. Más concretamente, se refiere a un método para esterilizar un material de cacao caracterizado porque esencialmente comprende humidificar dicho material de cacao previamente y luego tratarlo con CO2 en estado supercrítico o en condiciones cercanas al punto crítico, de forma que estén a unas condiciones de presión y temperatura adecuadas, y en contacto durante un periodo de tiempo suficiente para que al separar el CO2, en dicho material de cacao, prácticamente desgrasado en su totalidad, se consiga un nivel de esporas termorresistentes aerobias termófilas inferior a 10 ufc/g, un nivel de esporas termorresistentes aerobias mesófilas inferior a 10 ufc/g y un nivel de mohos y levaduras inferior a 10 ufc/g.

Los microorganismos presentes en el producto que pueden ser eliminados por Ia presente invención son bacterias y sus esporas, hongos y sus esporas, levaduras, etc. Asimismo también se podrían producir desactivaciones de diferentes enzimas como pectinasa, amilasa, proteinasa, lipasa, carboxipeptidasa, etc. Tal y como se usa en esta invención, el término esterilización se aplica cuando se consigue un nivel de esporas termorresistentes aerobias termófilas inferior a 10 ufc/g, un nivel de esporas termorresistentes aerobias mesófilas inferior a 10 ufc/g y un nivel de mohos y levaduras inferior a 10 ufc/g. La viabilidad de las células se determina utilizando técnicas conocidas en el arte.
El producto de partida que forma el "material de cacao" de Ia presente invención, es el Clon CCN-51 de Ia región de Quevedo (Ecuador), seleccionado por su alto contenido en polifenoles. Otro aspecto importante con referencia a Ia materia prima para Ia elaboración del material de cacao es que se utilizan semillas no fermentadas y sin tostar. Con este mismo material de partida los autores de Ia presente invención han descrito en Ia patente WO 2005/115160 A1 publicada el 08.12.2005, un proceso por el que se obtiene un concentrado de cacao con alto concentrado de polifenoles, que comprende las etapas de: a) someter las semillas de cacao sin fermentar a un escaldado en agua a una temperatura de 85-1000C durante un tiempo de 3 a 15 minutos; b) secar las semillas a una temperatura no mayor de 850C obteniéndose unas semillas con una humedad de no más de 15%; c) moler las semillas obtenidas en la etapa anterior hasta que al menos un 99% del producto tenga un tamaño de partícula de 300 μm; d) someter las semillas molidas a una extracción; y e) concentrar dicho extracto de cacao con polifenoles; en cuyo proceso opcionalmente se puede incluir una etapa de desgrasado que se realiza antes de Ia etapa (d). Para llevar a cabo el desgrasado de las semillas se mencionan dos posibles métodos. Uno de ellos es por medio de una prensa que puede reducir el contenido de grasa hasta un 8-9% y el otro es por medio de extracción de Ia grasa con un disolvente orgánico como hexano, acetato de etilo, etc o empleando CO2 supercrítico u otro gas también en estado supercrítico, tal como el butano o el propano, en cuyo caso se puede reducir el contenido de grasa hasta menos del 2%.
Además, en Ia solicitud de patente española P 200600462, los mismos autores describen un proceso para Ia obtención de polvo de cacao rico en polifenoles y de bajo contenido en materia grasa que se caracteriza porque consta de las siguientes etapas: 1 ) pelado; 2) despulpado; 3) escaldado; 4) secado; 5) desgrasado; 6) estabilizado; 7) molido; y 8) micronizado, por el que se obtiene un polvo de cacao que presenta un contenido de polifenoles superior al 18% en peso de materia seca, un contenido de materia grasa inferior a un 1% en peso, un contenido de agua de un 7% en peso y un tamaño de partícula en un 99% inferior a 75 mieras. Igualmente, con similares etapas, en Ia solicitud de patente española P200601376 llevan a cabo Ia etapa de desgrasado por prensado a una temperatura menor de 800C, obteniéndose un contenido de grasa en Ia torta o barquillo de cacao entre 8% y 30% en base seca.

En Ia presente invención se puede realizar Ia extracción del cacao por medio del CO2 supercrítico a partir del cacao con el contenido original de grasa o bien parcialmente desgrasado por prensado, pero en ambos casos para obtener el efecto de esterilización se debe humedecer la semilla previamente con agua. El contenido de agua que Ia torta o polvo de cacao debe contener al ser tratada con el CO2 supercrítico debe ser entre 1 y 50% de humedad, preferiblemente entre 5% y 40% de humedad, por Io que se debe medir Ia humedad del producto de cacao a tratar y humidificarlo adicionalmente hasta el porcentaje de agua deseado para el tratamiento con el CO2 supercrítico.

En el método para esterilizar un material de cacao se puede realizar en diversos productos, todos obtenidos de variaciones en las distintas etapas del procedimiento de obtención, pero el material preferido es el polvo obtenido a partir de Ia torta o barquillo formado, una vez molido hasta un tamaño de partícula inferior a 500 mieras, no habiéndose observado que Ia diferencia de tamaño ejerza influencia en Ia esterilización del producto.

El proceso de esterilización del material de cacao, una vez que dicho material de cacao se ha humedecido consiste en ponerlo en contacto con el CO2 en unas condiciones de 50 a 500 bar de presión y una temperatura de 200C a 1000C. Se ha determinado que el caudal de CO2 debe estar comprendido entre 5/2Og CO2/h/g de cacao y 12Og CO2/h/g de cacao, durante un tiempo determinado que depende de las variables mencionadas pero puede estar comprendido aproximadamente entre 15 minutos y 6 horas.
Se ha encontrado que variando Ia presión del CO2 cuando el proceso se lleva a cabo a presiones superiores a 300 bar aumenta Ia velocidad de extracción. Asimismo se ha observado que a esa presión, las temperaturas comprendidas entre 650C a 800C son las adecuadas para eliminar por debajo de 10 ufc/g el nivel de esporas termorresistentes.
Una realización preferida de Ia invención es partir de una torta o polvo de cacao que se ha obtenido a partir de semillas se cacao sin fermentar previamente peladas, despulpadas, escaldadas, secadas y desgrasadas por prensado, para esterilizarlo poniéndolo en contacto con el CO2 a presiones superiores a 300 bar y a una temperatura de 650C, estando dicho material de cacao previamente humedecido con un 10% de agua. Otra forma de realización preferida es poner en contacto dicho material de cacao previamente humedecido con un 5% de agua y el CO2 a presiones superiores a 300 bar y una temperatura de 8O0C.

El contacto entre cacao y CO2 supercrítico o en condiciones cercanas al punto crítico, al que se Ie ha adicionado un modificador para aumentar el rendimiento de Ia extracción tal como etanol, agua, alcoholes o compuestos que son habitualmente utilizados como co-disolventes y conocidos en el arte. También se puede añadir otro agente esterilizante como por ejemplo, el peróxido de hidrógeno, ácido acético, ácido peracético, ácido trifluoroacético, etc. Se ha comprobado que el contacto entre dicho material de cacao y el CO2 se favorece mediante Ia utilización de redistribuidores o rellenos, es decir, que se favorece Ia extracción tal y como se sabe del estado de Ia técnica. Sin embargo nosotros hemos encontrado poca diferencia en el proceso de esterilización debido a estas variables.
Como ya hemos mencionado el cacao esterilizado obtenido por el método de Ia invención tiene un nivel de esporas termorresistentes aerobias termófilas inferior a 10 ufc/g, un nivel de esporas termorresistentes aerobias mesófilas inferior a 10 ufc/g y un nivel de mohos y levaduras inferior a 10 ufc/g.

También, en el polvo de cacao esterilizado por medios tradicionales, se ha inoculado con esporas de Aspergillus niger Y Aspergillus ochraceus, las cuales se han eliminado tratando el cacao en polvo con CO2 supercrítico según Ia invención.

Además, el cacao obtenido por el método de Ia invención, una vez esterilizado puede tener un contenido en grasa igual o menor del 1%; los posibles compuestos termolábiles que estaban presentes al inicio del proceso, bien de forma natural y/o añadidos, no se pierden como consecuencia del proceso. Igualmente, el contenido de polifenoles totales (medidos Folin-Ciocalteu) remanente en el polvo esterilizado es del 99% respecto al contenido inicial, y además, Ia suma total de flavanoles; monómeros de catequina y epicatequina así como dímeros de procianidinas B1 y B2 remanentes en el polvo esterilizado es del 99.99% respecto al contenido inicial.

EJEMPLOS
A continuación se describen varios ejemplos que utilizan como material preferente polvo de cacao, aunque podrían aplicarse a otros productos derivados del cacao.
Los siguientes ejemplos muestran los resultados del método en polvo de cacao y el mismo contaminado con organismos esporulados.

EJEMPLO 1. ESTERILIZACIÓN DEL POLVO DE CACAO
El producto que se ha utilizado para ejemplificar el proceso ha sido un polvo de cacao no fermentado, que ha sido obtenido a partir de un grano de cacao previamente pelado, despulpado y escaldado a 950C durante 5 minutos para inactivar Ia enzima polifenol oxidasa, secado en un secadero convencional a una temperatura máxima de 600C, descascarillado en un equipo de Lehmann hasta conseguir un contenido del 2% en peso de cascara residual sobre grano, y desgrasado mediante un prensado mecánico en continuo utilizando "expeliere" hasta conseguir una torta de polvo de cacao con un contenido en grasa inferior al 12%. La torta de polvo de cacao obtenido ha sido estabilizada a una temperatura de 150C, haciéndola pasar por un enfriador de paletas de acero inoxidable. Esta torta de cacao estabilizada, ha sido molida y tamizada en un molino de martillos hasta conseguir un polvo de cacao molturado con un cuya distribución de tamaño de partícula del 99.99% inferior a las 500 mieras.
El método para realizar el análisis microbiológico se describe a continuación.

Para el análisis microbiológico se resuspendió 1 gramo de polvo de cacao en

100 mi de agua de peptona (10 g peptona de caseína /I y 5 g NaCI/l) bajo condiciones estériles. A continuación se realizaron diluciones seriadas que fueron después sembradas en placas de Petri conteniendo los medios específicos para cada tipo de microorganismo. Para el recuento total de microorganismos se utilizó el medio PCA (del inglés "píate count agar"- Scharlab) y las placas se incubaron a 370C durante 24 horas. En el caso de los aerobios mesófilos, aerobios termófilos, esporas mesófilas termorresistentes y esporas termófilas termorresistentes, Ia siembra se realizó en placas con DTPB agar (del inglés "Dextrose Tryptone Purple Bormocresol"- Scharlab), aunque Ia temperatura de incubación fue de 550C y el tiempo de incubación de 48 horas para los microorganismos termófilos. El recuento de esporas termorresistentes se realizó después de que las sucesivas diluciones fueron introducidas en un baño de agua termostatada a 8O0C. Cuando Ia temperatura en las mismas alcanzó dicho valor se mantuvo así durante cinco minutos para eliminar las bacterias viables y garantizar que el recuento fuera únicamente de esporas. El análisis de enterobacterias, incluyendo Eschθríchia coli y Salmonella sp. se efectuó en el medio específico VRBD agar (del ingles "Violet Red BiIe Dextrose Agar"- Scharlab) a 370C durante 24 horas.

La eficacia del tratamiento se determinó a partir de los datos de viabilidad celular residual después del tratamiento que se cuantificó en ufc/g. Primeramente se analizó Ia materia prima molida (materia madre) para establecer el punto de referencia del método de esterilización. En Ia Tabla 1 aparecen los resultados.



Tabla 1. Contenido microbiológico de Ia muestra de
polvo de cacao original, sin tratamiento.

A continuación se presentan los resultados de recuento microbiológico y de eficacia de extracción realizados en las muestras de polvo de cacao tratadas con CO2 después de dos horas de operación a diferentes condiciones. Primero se describe el equipo y el procedimiento de operación.

1.A. EQUIPO EXPERIMENTAL
El equipo utilizado se muestra en Ia Figura 1. Consta de una línea de alimentación del CO2, un extractor/esterilizador y un sistema de toma de muestra. El CO2 se alimenta líquido a su presión de vapor (aprox. 49 bar) previo enfriamiento en un baño termostatado a -100C, para que no gasifique durante su bombeo que se realiza con una bomba de membrana (Dosapro Milton Roy) con cabezal refrigerado. Un serpentín de 100 cm de longitud de tubo de acero inoxidable 316 insertado en una manta calefactora sirve para precalentar el CO2 antes de introducirse al extractor/esterilizador, que es un recipiente a presión (Reactor micro-clave Robinson Mahoney, Autoclave Engineers) de acero inoxidable 316 y de 50 cm3 de capacidad. El control de Ia temperatura se realiza con una camisa calefactora conectada a un termopar situado en Ia pared externa del recipiente. La temperatura en el interior del esterilizador se mide con un termopar, mientras que Ia presión se monitoriza con un manómetro. Una válvula de seguridad tarada a 35 MPa y un disco de ruptura evitan que Ia presión alcance valores superiores a los permitidos. La cantidad de CO2 que pasa por unidad de tiempo es determinada en un medidor de flujo másico conectado al final de Ia línea.

1.B. PROCEDIMIENTO
El material molido se coloca en el esterilizador formando un lecho poroso fijo en el que se intercalan redistribuidores o dispositivos para favorecer el contacto y evitar Ia formación de canales preferentes. Se conecta Ia camisa calefactora y cuando se ha alcanzado Ia temperatura de operación deseada, se comienza a bombear CO2. Su temperatura se ajusta al pasar por el precalentador. Su presión de entrada y el flujo se regulan con Ia bomba y con Ia válvula. Una vez ajustadas las condiciones de presión y temperatura, el CO2 entra en el lecho por Ia parte inferior, y Io atraviesa. El CO2 junto con los elementos disueltos llega a Ia válvula donde se reduce Ia presión hasta condiciones atmosféricas. El CO2 pasa a estado gas y los materiales extraídos precipitan (por ejemplo Ia manteca) y se recogen en un tubo previamente tarado. A intervalos de tiempo fijos, se pesa Ia manteca y se lee Ia cantidad de CO2 que ha sido necesario utilizar para extraer dicha cantidad en el medidor de flujo másico. Después es liberado a Ia atmósfera.


Figura 1. Equipo para Ia esterilización-extracción con CO2 supercrítico de productos derivados del cacao. Pl = presión interior. Tl = Temperatura interior.

1.C. USO DE DISPOSITIVOS PARA FAVORECER EL CONTACTO CON EL FLUIDO SUPERCRÍTICO
El polvo de cacao tendía a compactarse dentro del esterilizador, de tal forma que el CO2 pasaba formando canales preferenciales fundamentalmente alrededor del lecho junto a Ia pared del extracto quedando Ia parte externa de un color más claro y el centro más oscuro evidenciando que Ia manteca sólo era extraída en Ia periferia. Esto se manifestaba en una baja eficacia de Ia reacción. Por ello, se exploró el uso de diversos tipos de relleno y redistribuidores. Su impacto en las curvas de extracción se compara en Ia Figura 2. Como se observa, el uso de abalorios de aprox. 3 mm de diámetro con perforaciones internas y Ia utilización de redistribuidores hechos con malla de paso fino en acero inoxidable fueron los métodos más eficaces para permitir el contacto del CO2 con Ia torta. En el proceso industrial, se podría utilizar rellenos o redistribuidores comerciales disponibles. Pero para operar en el laboratorio, Ia forma mas simple fue introducir un redistribuidor cada 2 cm de lecho y así se procedió para los sucesivos experimentos.



Tiempo (h)

Figura 2. Efecto en las curvas de extracción del uso de diferentes rellenos y de
redistribuidores. Condiciones de operación: 300 bar y 4O0C

1.D. EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DEL GRADO DE HUMEDAD INICIAL DEL CACAO
En un método no térmico de conservación que pretende ser aplicado a compuestos termolábiles, Ia temperatura debe estar limitada a un intervalo moderado para no ocasionar daños al producto a tratar. Por esa razón, Ia temperatura que se ha estudiado ha oscilado entre 40 y 8O0C. En este intervalo de temperaturas y variando Ia presión entre 150 y 300 bar no se ha logrado reducir el contenido microbiano de las muestras tratadas.
Por otro lado, se ha observado que Ia humectación de Ia materia prima es necesaria para lograr Ia esterilización completa. Aunque el material de partida ya contenía una humedad del 8%, se ha explorado el efecto que el aumento de Ia humedad inicial del polvo de cacao tenía en Ia eficacia del tratamiento.
Para ello se pulverizó el polvo de cacao con diferentes cantidades de agua (0, 10 y 25%), determinando en cada caso el porcentaje de humedad obtenido mediante pesada. El contenido de 0% corresponde al material de partida con Ia humedad que traía. A las muestras así pretratadas se las sometió al proceso con CO2 a diferentes temperaturas y 300 bar. A 400C independientemente de Ia cantidad de agua utilizada (hasta un 25%) no se logró reducir el recuento microbiológico.
Los resultados obtenidos a mayores temperaturas se muestran en Ia Tabla 2. El grado de esterilización objetivo se consigue por ejemplo combinando 8O0C y 5% de humedad inicial, o bien a 650C con un 10% de agua. Es decir, que sólo combinando un cierto grado de humedad con una temperatura ligeramente elevada, es posible reducir el contenido microbiológico hasta las condiciones especificadas por Ia legislación para este tipo de productos. Hay que tener en cuenta que Ia carga microbiológica de Ia materia prima, corresponde fundamentalmente a organismos esporulados y termorresistentes aerobios. Ello explica que Ia temperatura que haya que alcanzar sea al menos de 650C, aunque con métodos convencionales, para eliminar este tipo de microorganismos haya que superar los 12O0C.
De Ia tabla también se deduce que Ia velocidad de paso del CO2 por cantidad de muestra entre los límites indicados, no afecta significativamente el grado de esterilización alcanzado. Este factor sin embargo, tiene el interés de que permite evaluar Ia influencia que tiene el tiempo de contacto en Ia muestra. Siempre es adecuado operar con tiempos cortos para afectar a Ia materia prima Io menos posible.

Como se observa para las mayores relaciones de CO2, alrededor de 10O g CO2/h/g cacao, el tiempo de contacto es de tan solo 20 minutos y ese tiempo es suficiente para alcanzar Ia esterilización.

Tabla 2. Contenido microbiológico de las muestras humedecidas con diferentes cantidades de agua
y tratadas con CO2 a diferentes temperaturas y 300 bar

Condiciones Análisis racrobiológk»
Recuento Esporas Esporas Esporas Esporas
Agua Ηempode
Temperatura BdadóndeOO^ total aerobias aerobias Entenobactαias tennorresistentes teπnorresisteπtes
UalUIIlclllO
aerobios mesólilas temófilas msófilas tprmήfilfls

CQ (%) (g COJbIg nuestra) (ran) (ufc/g) (ufc/g) (ufc/g) (ufc/g) (ufc/g) (ufc/g)

80 5 66 30 Ajsenda Ajsenda Aisenda Ajsenda Ajsenda Ajsenda

80 5 47 40 Ajsentia /kssθxia Ajsenda Ajsenda Ajsenda Aisenda

80 10 102 20 Ajsenda Ajsenάa Ajsenda Aisenda Ajsenda Ajsenda

80 10 62 35 Ajsenda Ajsenda Ajsenda Aisenda Ajsenda Ajsenda

80 10 48 40 Aisenda Ajsenda Aisenda Ajsenda Aisenda Ajsenda

65 5 98 22 Z104 94IO3 21IO3 Ajsenda 3*1CP 3*10?

65 5 82 25 no4 1*10* 6*1(f Aεenda Ϋ1& 3*1CP

65 5 63 30 Z104 2*1Cf no3 Aisenda 1*itf no3

65 5 50 35 4*10* 2"1O4 no3 Ajsenda 2"\& 2*1cf

65 10 100 20 Aisenda Ajsenda Ajsenda Aisenda Ajsenda Aisenda

65 10 63 30 Aisencia Ajsenda Ajsenda Ajsenda Ajsenda Ajsenda

65 10 48 40 Ajsenda Ajsenda Aisenda Ajsenda Ajsenda Aisenda

1.E. EFECTO EN EL CONTENIDO DE GRASA
Se ha observado que el producto tratado en las condiciones expuestas en Ia Tabla 2, quedaba libre de manteca en un nivel igual o superior al 99%. El proceso de desgrasado se ha simbolizado a través de las curvas que se obtienen al representar el rendimiento de Ia extracción en cada momento frente al consumo de CO2 o al tiempo de operación. A modo de ejemplo, en Ia Figura 3, se muestran las curvas obtenidas a 65 y 8O0C utilizando una relación de disolvente de 48 g CO2/h/g cacao y operando a 300 bar. Puesto que Ia capacidad de solvatación del CO2 disminuye al aumentar Ia temperatura, entonces Ia velocidad de extracción de Ia manteca, también es menor a 800C que a 650C.



Tiempo (h)

Figura 3. Efecto de Ia temperatura en Ia velocidad de extracción de Ia manteca de
cacao durante su proceso de esterilización

1.F. EFECTO EN EL PRINCIPIO ACTIVO
Se ha determinado el efecto del tratamiento de esterilización con CO2 supercrítico en el contenido de polifenoles totales así como en Ia suma de sus flavanoles; los monómeros catequina y epicatequina, y los dimeros de procianidina B1 y B2 ¡nicialmente presentes en el polvo de cacao tratado. Los análisis se realizaron sobre una muestra de cacao tratada bajo las condiciones más extremas y que más podrían incidir en el nivel de estos compuestos fenolicos. Las condiciones aplicadas sobre las muestras analizadas fueron de 8O0C, 300 bar de presión con un 10% de agua adicionada.
Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 3 y 4 y muestran que no se producen pérdidas significativas ni de polifenoles totales ni de Ia suma de los flavanoles (catequina, epicatequina y procianidinas B1 y B2) después del proceso de esterilización con CO2, incluso aplicando las condiciones más drásticas de las probadas para que se produzca Ia esterilización.



Análisis realizado por el método de Folin Ciocalteu (catequina como estándar);
2 g de compuesto/10Og de muestra de cacao medido en base húmeda
Tabla 3. Contenido de polifenoles totales1 de Ia muestra madre (no tratada) y de Ia
muestra tratada a 300 bar de presión y 8O0C

Compuesto Muestra no
tratada ímadre) Muestra tratada Perdidas
(mg/g) b.hz Valor Valor
medido esperado
Catequina 4,55 2,80 4.99
Epicatequina 19,22 22,14 21.10
B1 1 ,02 0,78 1 ,11
B2 11 ,42 15,86 12,53
Total
36.21 41.58 39.73
(monomeros+dimeros)
Análisis realizado por HPLC con Detector de Diodo Array; ¿ mg de compuesto/g de muestra de cacao medido en base húmeda Tabla 4. Cuantificación del contenido de flavonoles (catequina, epicatequina, procianidina B1 y B2)1 de Ia muestra no tratada (madre) y de Ia muestra a 300 bar de presión y 8O0C

EJEMPLO 2: DESACTIVACIÓN DE LAS ESPORAS DE HONGOS Aspergillus niger Y Aspergillus ochraceus EN POLVO DE CACAO
Hasta el momento se ha demostrado que el CO2 es capaz de desactivar Ia contaminación por esporas de bacterias, incluidas aquellas que son termorresistentes. Para corroborar Ia eficacia del método en otro tipo de microorganismos, se escogieron dos tipos diferentes de esporas de hongos, en concreto, de Aspergillus niger (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 2574) y de Aspergillus ochraceus (cepa aislada en el laboratorio del propio polvo de cacao). De tal forma que al polvo de cacao (se trata del mismo polvo de cacao que está descrito en el ejemplo 1) previamente esterilizado por métodos térmicos tradicionales, se Ie ha inoculado dichos microorganismos en sendas muestras. Los resultados de Ia contaminación originada se muestran en Ia Tabla 5. El recuento se realizó en el medio selectivo para recuento de mohos y levaduras, Saboraud Oxitetraciclina Agar (OGYE, Scharlab) después de cultivar las placas a 250C durante 5 días. A continuación, se sometieron a tratamiento con CO2 a 8O0C, previa adición de un 5% en peso de agua, utilizando una relación de 100 g CO2/h/ g cacao, por un tiempo de 20 minutos. Como se muestra en Ia Tabla 4, también se ha logrado Ia desactivación de estos microorganismos tan resistentes.

Recuento antes Recuento después
Tipo de inoculo
del tratamiento del tratamiento
(ufc/g) (ufc/g)
Aspergillus niger 2*10° Ausencia
Aspergillus ochraceus 1 *10e Ausencia

Tabla 5. Contenido microbiológico de las muestras contaminadas con esporas de
hongos, antes y después del tratamiento con CO2 a 8O0C y 300 bar