Traitement en cours

Veuillez attendre...

Paramétrages

Paramétrages

Aller à Demande

1. WO2019142773 - PROCÉDÉ DE FABRICATION DE PROTÉASE DE LA FAMILLE M23A

Document

明 細 書

発明の名称 M23Aファミリープロテアーゼの製造方法

技術分野

0001  

背景技術

0002   0003   0004   0005   0006   0007  

図面の簡単な説明

0008  

発明を実施するための形態

0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048  

実施例

0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092  

請求の範囲

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11  

図面

1   2   3   4   5  

明 細 書

発明の名称 : M23Aファミリープロテアーゼの製造方法

技術分野

[0001]
 本発明は、M23Aファミリープロテアーゼの製造方法に関する。

背景技術

[0002]
 プロテアーゼのM23ファミリーは、MEROPSデータベースにおいて、Gly-Gly結合を分解できるプロテアーゼとして定義されるプロテアーゼファミリーである。M23ファミリープロテアーゼはまた、エラスチンやバクテリア細胞壁のプロテオグリカンの分解活性を有し、溶菌酵素としても知られている。M23ファミリープロテアーゼは、M23AサブファミリーとM23Bサブファミリーの2つのサブファミリーに分類され、各サブファミリーは、それぞれいくつかのタイプの酵素を含む。
[0003]
 酵素等のタンパク質の商業的生産においては、一般に、目的タンパク質の遺伝子を導入した大腸菌等の宿主を培養して該タンパク質を発現させ、宿主により生産された成熟型タンパク質を回収する。多くのプロテアーゼでは、最初にプロタンパク質が発現し、これが自己プロセシングを経て成熟型タンパク質に変換され、細胞又は培養物中に蓄積し、目的物として回収される。しかしながら、M23Aサブファミリープロテアーゼは、自己プロセシングによる成熟体への変換が起こらず、大腸菌宿主からの成熟型タンパク質の回収は不可能である(非特許文献1、2)。そのため、M23Aサブファミリープロテアーゼの生産方法としては、天然のM23Aサブファミリープロテアーゼ生産菌株を培養する方法が検討されている。非特許文献1では、目的とするM23Aサブファミリープロテアーゼを天然に生産する野生型菌株に該M23Aサブファミリープロテアーゼを生産させる方法が記載されており、さらに生産コストの低下のため、プロテアーゼ生産効率が向上する培養条件が検討されている。また非特許文献3では、生産コストの低下のため、既存のM23Aサブファミリープロテアーゼ生産菌よりも高い生産性を示す菌株を天然から取得している。
[0004]
 一方、特許文献1には、アクロモバクター・リティカス(Achromobacter lyticus)から単離されたM23Aサブファミリーに属するβ-リティックプロテアーゼが記載され、また当該酵素を大腸菌やバチルス属菌などの宿主に発現させて製造することが記載されている。しかしながら、特許文献1には実際に異種宿主を用いて当該酵素を生産させたことは記載されていない。特許文献1では、β-リティックプロテアーゼが自己プロセシングする可能性が指摘されている。しかし、上述した非特許文献1、2に開示されるとおり、その後の研究でM23Aサブファミリープロテアーゼは自己プロセシングできないことが報告されていることから、特許文献1が上述した異種発現系におけるM23Aサブファミリープロテアーゼの自己プロセシング欠如の問題を解決していないことは明らかである。さらに非特許文献3に記載されているように、特許文献1の後、β-リティックプロテアーゼが枯草菌等のグラム陽性菌に対して強い溶菌活性を有していることが報告された。したがって、非特許文献1~3に示される知見は、特許文献1におけるβ-リティックプロテアーゼの大腸菌やバチルス属菌での異種発現の開示が現実的でなく、むしろそのような異種発現は困難であったことを示している。
[0005]
 以上のように、M23Aサブファミリープロテアーゼは、その優れた特徴があるにもかかわらず、自己プロセシング欠如や溶菌活性のために天然のM23Aサブファミリープロテアーゼ生産菌株を培養する方法でしか成熟型酵素を得られていない。実際にM23Aサブファミリープロテアーゼの成熟型での異種発現に成功した例はこれまで報告されていない。
[0006]
(特許文献1)特開平4-108387号公報
(非特許文献1)Molecules, 2014, 19:4779-4790
(非特許文献2)Journal of bacteriology, 1996, 178:6608-6617
(非特許文献3)Journal of bioscience and bioengineering, 2003, 95:27-34

発明の詳細な説明

[0007]
 本発明は、M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型M23Aファミリープロテアーゼを製造させることを含む、M23Aファミリープロテアーゼの製造方法を提供する。

図面の簡単な説明

[0008]
[図1] 組換え枯草菌の培養上清のFRET-GGGGG分解活性。
[図2] 組換え枯草菌の培養上清のSDS-PAGE像。
[図3] 組換え枯草菌168株及びDpr9株の培養上清のFRET-GGGGG分解活性。
[図4] 組換え枯草菌168株及びDpr9株の培養上清のウェスタンブロッティング像。
[図5] 各種M23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌の培養上清のFRET-GGGGG分解活性。

発明を実施するための形態

[0009]
 本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
[0010]
 本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも80%の同一性」とは、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、さらに好ましくは96%以上、さらに好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上の同一性をいう。
[0011]
 本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列(例えば、配列番号1のヌクレオチド配列)とを、各アミノ酸配列又はヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基又はヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列(アラインメント)させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Clustal Wマルチプルアラインメントプログラム(Nucleic Acids Res.,1994,22:4673-4680)をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Clustal Wの改訂版であるClustal W2やClustal omegaを使用することもできる。Clustal W、Clustal W2及びClustal omegaは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所(European Bioinformatics Institute:EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])や、国立遺伝学研究所が運営する日本DNAデータバンク(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の領域に対応してアラインされた目的配列の位置又は領域は、当該任意の領域に「相当する位置」又は「相当する領域」とみなされる。
[0012]
 本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
[0013]
 本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、DNAセンス鎖においてプロモーターの3’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、DNAセンス鎖における該遺伝子の5’側の領域を意味する。
[0014]
 本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来(すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド)であってもよい。
[0015]
 本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、JAFAN:Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis(BSORF DB)でインターネット公開([bacillus.genome.ad.jp/]、2006年1月18日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、BSORF DBに登録されている遺伝子番号を表す。
[0016]
 本発明は、M23Aファミリープロテアーゼの製造方法を提供する。
[0017]
 本発明者らは、M23Aサブファミリープロテアーゼが異種宿主中で成熟体に変換されないという従来の知見(例えば非特許文献1、2)に対して驚くべきことに、M23Aファミリープロテアーゼ遺伝子をバチルス属菌宿主に導入し、培養することで、培養物中から成熟型M23Aファミリープロテアーゼを効率よく回収可能であることを見出した。
[0018]
 M23Aサブファミリープロテアーゼは、エラスチンやバクテリア細胞壁の分解活性に加えて角質汚れの洗浄力も有しており、その優れた特徴から様々な産業上の応用が期待される(特願2018-005193)。本発明の方法によれば、バチルス属菌宿主を用いることにより、簡便な手順で成熟型M23Aファミリープロテアーゼを効率よく製造することができる。本発明によれば、天然に成熟型M23Aファミリープロテアーゼを発現する野生型菌株における生産性の低さや、大腸菌宿主における成熟体の欠如などの、従来のM23Aファミリープロテアーゼ生産における問題を打開することができる。
[0019]
 本発明のM23Aサブファミリープロテアーゼの製造方法は、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌(Bacillus)を培養することを含む。
[0020]
 本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼは、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する成熟体酵素である。本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼの好ましい例としては、β-リティックメタロプロテアーゼ(beta-lytic metallopeptidase;BLP)、LasAタンパク質(Las A protein;LasA、Staphylolysinとも呼ばれる)、及びアエロモナス・ハイドロフィラプロテイナーゼ(Aeromonas hydrophila proteinase;AhP、Mername-AA291 peptidaseとも呼ばれる)が挙げられる。これらは、MEROPSデータベース([http://merops.sanger.ac.uk])においてM23Aサブファミリーに属するプロテアーゼとして開示されている。BLP(MEROPS ID:M23.001)は、配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。LasA(MEROPS ID:M23.002)は、配列番号4のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。AhP(MEROPS ID:M23.003)は、配列番号7のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。BLP、LasA及びAhPは、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する酵素である。
[0021]
 本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼの別の好ましい例としては、上記BLP、LasA及びAhPと同等の機能を有するポリペプチドが挙げられる。該BLP、LasA及びAhPと同等の機能を有するポリペプチドの例としては、配列番号1、4及び7のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。BLPと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号1のアミノ酸配列の22位、121位及び123位に相当する位置にHis、36位に相当する位置にAspを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。LasAと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号4のアミノ酸配列の23位、120位及び122位に相当する位置にHis、36位に相当する位置にAspを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。AhPと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号7のアミノ酸配列の21位、118位及び120位に相当する位置にHis、34位に相当する位置にAspを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
[0022]
 本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼのさらに別の好ましい例としては、リゾバクター・グモサス(Lysobacter gummosus)由来のBLPホモログ(WP_057941690.1、以下の本明細書においてLgBLPという)、及びリゾバクター・アンティビオティカス(Lysobacter antibioticus)由来のBLPホモログ(WP_057970430.1、以下の本明細書においてLaBLPという)が挙げられる。LgBLPは、配列番号10のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。LaBLPは、配列番号13のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。LgBLP及びLaBLPは、ペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有する酵素である。
[0023]
 本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼのさらに別の好ましい例としては、上記LgBLP及びLaBLPと同等の機能を有するポリペプチドが挙げられる。LgBLPと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。LaBLPと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列であって、かつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
[0024]
 好ましくは、本発明により製造されるM23Aサブファミリープロテアーゼは、上記のBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、及びそれらと同等の機能を有するポリペプチドからなる群より選択される少なくとも1種である。
[0025]
 本発明で用いるバチルス属菌に導入される、M23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上述した本発明の方法で製造される目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と成熟型タンパク質をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである。M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域とは、プロタンパク質上で該プロ領域の下流に位置するM23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質領域の、立体構造の形成に寄与する領域をいう。当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例としては、BLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号2)、LasAのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号5)、AhPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号8)、LgBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号11)、及びLaBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号14)が挙げられる。当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの別の例としては、分泌シグナルを含むBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号3)、分泌シグナルを含むLasAのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号6)、分泌シグナルを含むAhPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号9)、分泌シグナルを含むLgBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号12)、及び分泌シグナルを含むLaBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号15)が挙げられる。
[0026]
 配列番号2のポリヌクレオチドでは、523~1062番ヌクレオチド領域がBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号3のポリヌクレオチドでは、595~1134番ヌクレオチド領域がBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。分泌シグナルをコードする領域は、SignalP(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)等のツールを用いて決定することができる。SignalPでの予測に基づく配列番号3のポリヌクレオチド上のBLPの分泌シグナルコード領域は、1~72番ヌクレオチド領域である。
 配列番号5のポリヌクレオチドでは、616~1164番ヌクレオチド領域がLasAの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号6のポリヌクレオチドでは、709~1257番ヌクレオチド領域がLasAの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号6のポリヌクレオチド上のLasAの分泌シグナルコード領域は、1~93番ヌクレオチド領域である。
 配列番号8のポリヌクレオチドでは、565~1104番ヌクレオチド領域がAhPの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号9のポリヌクレオチドでは、625~1164番ヌクレオチド領域がAhPの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号9のポリヌクレオチド上のAhPの分泌シグナルコード領域は、1~60番ヌクレオチド領域である。
 配列番号11のポリヌクレオチドは、529~1065番ヌクレオチド領域がLgBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号12のポリヌクレオチドでは、628~1164番ヌクレオチド領域がLgBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号12のポリヌクレオチド上のLgBLPの分泌シグナルコード領域は、1~99番ヌクレオチド領域である。
 配列番号14のポリヌクレオチドは、550~1086番ヌクレオチド領域がLaBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流がプロ領域をコードする。配列番号15のポリヌクレオチドでは、628~1164番ヌクレオチド領域がLaBLPの成熟型タンパク質をコードし、その上流にプロ領域のコード領域があり、さらにその上流が分泌シグナルをコードする。SignalPでの予測に基づく配列番号15のポリヌクレオチド上のLaBLPの分泌シグナルコード領域は、1~78番ヌクレオチド領域である。
 上記のポリヌクレオチドにコードされるプロ領域は、その下流に位置する成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する。
[0027]
 したがって、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたM23Aサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含むポリヌクレオチドが挙げられる。該M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドの例としては、配列番号2の1~522番ヌクレオチド領域の配列、配列番号5の1~615番ヌクレオチド領域の配列、配列番号8の1~564番ヌクレオチド領域の配列、配列番号11の1~528番ヌクレオチド領域の配列、配列番号14の1~549番ヌクレオチド領域の配列、又はこれらと少なくとも80%同一な配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。これらポリヌクレオチドにコードされるプロ領域は、その下流に位置するM23Aサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与する。該M23Aサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質をコードするポリヌクレオチドの例としては、上述したBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、及びそれらと同等の機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
[0028]
 目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドのさらなる例としては、以下が挙げられる:
 配列番号2のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号2の523~1062番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号2の1~522番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号3のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号3の595~1134番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号3の1~594番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号5の616~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLasA又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号5の1~615番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLasA又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号6のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号6の709~1257番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLasA又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号6の1~708番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLasA又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号8のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号8の565~1104番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはAhP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号8の1~564番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはAhP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号9のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号9の625~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはAhP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号9の1~624番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはAhP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号11のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号11の529~1065番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLgBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号11の1~528番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLgBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号12の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLgBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号12の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLgBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号14の550~1086番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLaBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号14の1~549番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLaBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号15のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号15の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域にBLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド(好ましくはLaBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;及び、
 配列番号15の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された、M23Aサブファミリープロテアーゼ成熟型タンパク質(BLP、LasA、AhP、LgBLP、LaBLP、又はそれらと同等の機能を有するポリペプチド、好ましくはLaBLP又はそれと同等の機能を有するポリペプチド)をコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
[0029]
 上記のポリヌクレオチドに含まれる、BLP、LasA、AhP、LgBLP及びLaBLP、ならびにそれらと同等の機能を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例としては、配列番号2の523~1062番の配列、配列番号5の616~1164番の配列、配列番号8の565~1104番の配列、配列番号11の529~1065番の配列、及び配列番号14の550~1086番の配列、ならびにそれらのいずれかと少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列が挙げられる。これらのヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドは、いずれもペプチド配列中のグリシン-グリシン結合分解活性を有する。
[0030]
 当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、常法に従って調製することができる。例えば、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼを本来生産する微生物から常法によりゲノムDNAを抽出するか、又はRNAを抽出し逆転写によりcDNAを合成することによって、調製することができる。例えば、BLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号2及び3)は、Lysobacter sp. (NBRC 12725又はNBRC 12726)、Achromobacter lyticus M497-1、Lysobacter sp. IB-9374、Lysobacter gummosus DSMZ 6980等から調製することができる。LasAのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号5及び6)は、Pseudomonas aeruginosa PA01、Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145、Pseudomonas aeruginosa FRD1等から調製することができる。AhPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号8及び9)は、Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966、Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier (ATCC 51307)等から調製することができる。LgBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号11及び12)は、Lysobacter gummosus等から調製することができる。LaBLPのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号14及び15)は、Lysobacter antibioticus等から調製することができる。上記微生物は、公的微生物保存機関より購入することができる。
[0031]
 上記の手順で得られたプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対して、さらに部位特異的変異導入を行うことにより、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製してもよい。あるいは、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該プロタンパク質のアミノ酸配列に基づいて化学合成してもよい。
[0032]
 当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、制御領域と作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、「制御領域」とは、その下流に配置された遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、該下流に配置された遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。より具体的には、遺伝子のコーディング領域の上流に存在し、RNAポリメラーゼが相互作用して該コーディング領域の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、本明細書における制御領域とは、遺伝子のコーディング領域の上流200~600ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、転写開始制御領域及び/又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するShine-Dalgarno(SD)配列に相当する部位である(Shine,J.,Dalgarno,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1974,71:1342-1346)。
[0033]
 当該制御領域の好ましい例としては、バチルス属菌で機能する制御領域、例えば、バチルス属細菌由来のα-アミラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、aprE遺伝子又はspoVG遺伝子の制御領域、バチルス・エスピーKSM-S237株のセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)の制御領域、バチルス・エスピーKSM-64株のセルラーゼ遺伝子(特開2011-10387公報)の制御領域、ならびに、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のカナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子の制御領域(いずれも、特開2009-089708号公報を参照)、などが挙げられるが、特に限定されない。該制御領域のより好ましい例として、バチルス・エスピーKSM-S237株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター(配列番号16)、バチルス・エスピーKSM-64株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター(配列番号17)が挙げられる。また、好ましい制御領域としては、配列番号16又は17と少なくとも80%の同一性を有し、かつ遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。
[0034]
 また当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させる機能を有する分泌シグナルをコードする配列(分泌シグナル配列と呼ぶ)と作動可能に連結されていてもよい。当該分泌シグナル配列の好ましい例としては、バチルス属菌で機能する分泌シグナル配列、例えばバチルス属菌由来の分泌シグナル配列が挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列の好ましい例としては、バチルス・エスピーKSM-S237株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列(配列番号18)、バチルス・エスピーKSM-64株のセルラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列(配列番号19)、枯草菌アミラーゼ遺伝子amyEの分泌シグナル配列(配列番号20)などが挙げられる。バチルス属菌由来の分泌シグナル配列のさらなる例としては、配列番号18~20のいずれかと少なくとも80%の同一性を有し、かつ発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させる機能を有するヌクレオチド配列が挙げられる。これらのバチルス属菌由来の分泌シグナル配列に連結される該プロタンパク質をコードする配列は、天然型M23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル配列(例えば、上述した配列番号3、6、9、12又は15に含まれる分泌シグナル配列)を含んでいてもいなくてもよい。
[0035]
 したがって、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム(ORF)に加えて、非翻訳領域(UTR)のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述したプロモーター、分泌シグナル配列、及びターミネーターを含んでいてもよい。
[0036]
 バチルス属菌への当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入は、定法に従って行うことができる。例えば、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターを宿主バチルス属菌細胞に導入して、該宿主細胞のゲノムに該ポリヌクレオチドを組み込むことができる。又は、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、宿主バチルス属菌細胞に導入してもよい。
[0037]
 宿主バチルス属菌細胞へのポリヌクレオチドやベクターの導入には、例えば、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、PEG法等の公知の形質転換技術を適用することができる。
[0038]
 当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び必要に応じて制御領域もしくは分泌シグナル配列を、常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより構築することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、YACベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、好ましくは、宿主細胞内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは発現ベクターである。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、pHA3040SP64、pHSP64R又はpASP64(特許第3492935号)、pHY300PLK(大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター;Jpn J Genet,1985,60:235-243)、pAC3(Nucleic Acids Res,1988,16:8732)等のシャトルベクター;pUB110(J Bacteriol,1978,134:318-329)、pTA10607(Plasmid,1987,18:8-15)等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド(例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC57、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)を用いることもできる。
[0039]
 当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入されるバチルス属菌としては、特に制限されないが、枯草菌又はその変異株が好ましい。好ましくは、該バチルス属菌は、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼ以外の他のプロテアーゼを、細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出(以下、この過程を単に「放出」と呼ぶ)する。当該他のプロテアーゼの例としては、aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。従来、これらの細胞外プロテアーゼは組換え酵素の生産性を低下させる要因であることが知られており、これらの細胞外プロテアーゼを欠損させた枯草菌株で組換え酵素の生産性が向上したことも報告されている(特開2006-174707号公報)。これに対し、本発明によるM23Aファミリープロテアーゼの製造方法では、これらの細胞外プロテアーゼを保持するバチルス属菌を酵素生産用の宿主としてむしろ好ましく利用する。
[0040]
 aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及びaprXは、枯草菌遺伝子である。これらの遺伝子の遺伝子番号とコードするタンパク質の機能を表1に示す。aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及びaprXに相当する遺伝子としては、それぞれ、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、及びaprXと、ヌクレオチド配列において少なくとも80%の同一性を有し、かつ(表1に記載される)同じ機能のタンパク質をコードするバチルス属菌由来の遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、上述したBSORF DBで検索することができる。
[0041]
[表1]


[0042]
 したがって、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入される当該バチルス属菌は、好ましくは細胞外プロテアーゼ活性を有する。微生物の細胞外プロテアーゼ活性は、該微生物の培養上清のアゾカゼイン分解活性を測定することで検出することができ、培養上清のアゾカゼイン分解活性は、後述する実施例5(5-2)に示す方法に従って測定することができる。培養上清がアゾカゼイン分解活性を有する微生物は、細胞外プロテアーゼ活性を有すると判断される。
[0043]
 好ましくは、当該プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入される当該バチルス属菌は、aprE又はこれに相当する遺伝子、epr又はこれに相当する遺伝子、wprA又はこれに相当する遺伝子、mpr又はこれに相当する遺伝子、nprB又はこれに相当する遺伝子、bpr又はこれに相当する遺伝子、nprE又はこれに相当する遺伝子、vpr又はこれに相当する遺伝子、及びaprX又はこれに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも1種の遺伝子を発現し、該遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は放出する枯草菌又はその変異株である。より好ましくは、該バチルス属菌は、aprE又はこれに相当する遺伝子、epr又はこれに相当する遺伝子、wprA又はこれに相当する遺伝子、mpr又はこれに相当する遺伝子、nprB又はこれに相当する遺伝子、bpr又はこれに相当する遺伝子、nprE又はこれに相当する遺伝子、vpr又はこれに相当する遺伝子、及びaprX又はこれに相当する遺伝子を発現し、該遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は放出する枯草菌又はその変異株である。
[0044]
 本発明の方法においては、上記のような手順で得られた、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換えバチルス属菌を培養する。該バチルス属菌は、一般的なバチルス属菌の培養方法に従って培養すればよい。例えば、バチルス属菌の培養のための培地は、菌の生育に必要な炭素源及び窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩(例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム)、ビタミン類、抗生物質(例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等)などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のpH及び培養時間等は、菌種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。
[0045]
 本発明の方法において、当該組換えバチルス属菌の培養により、目的のM23Aサブファミリープロテアーゼのプロタンパク質が発現される。発現したプロタンパク質は、細胞外に分泌又は放出され、そこで該バチルス属菌が分泌又は放出した他の細胞外プロテアーゼの作用によりプロセシングされ、酵素活性を有する成熟型M23Aサブファミリープロテアーゼへと変換される。したがって、本発明の方法では、成熟型M23Aファミリープロテアーゼが、該組換えバチルス属菌の細胞外に製造される。製造された成熟型M23Aサブファミリープロテアーゼは、培養物の細胞外成分中に蓄積する。
[0046]
 以上の手順で、本発明の方法により成熟型M23Aサブファミリープロテアーゼが製造される。製造されたM23Aサブファミリープロテアーゼは、常法に従って培養物中から回収することができる。本発明の方法では、製造されたM23Aサブファミリープロテアーゼは細胞外に蓄積するので、細胞を破壊することなく目的の酵素を回収することが可能である。例えば、培養物から遠心分離又はろ過などによって細胞を除去し、集めた上清又はろ液から、硫酸アンモニウム等の塩又はエタノール等の有機溶媒による沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、などの通常の方法により、酵素を回収することができる。
[0047]
 本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
[0048]
〔1〕M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型M23Aファミリープロテアーゼを製造させることを含む、M23Aファミリープロテアーゼの製造方法。
〔2〕好ましくは、前記M23Aファミリープロテアーゼが、配列番号1、4、7、10もしくは13のアミノ酸からなるポリペプチドであるか、又は、配列番号1、4、7、10及び13のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドである、〔1〕記載の方法。
〔3〕好ましくは、前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔2〕記載の方法:
 配列番号2、3、5、6、8、9、11、12、14、及び15のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;又は
 M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたM23Aサブファミリープロテアーゼをコードするポリヌクレオチドと、を含むポリヌクレオチド、
 好ましくは、該M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドが、配列番号2の1~522番ヌクレオチド領域の配列、配列番号5の1~615番ヌクレオチド領域の配列、配列番号8の1~564番ヌクレオチド領域の配列、配列番号11の1~528番ヌクレオチド領域の配列、配列番号14の1~549番ヌクレオチド領域の配列、又はこれらと少なくとも80%同一な配列からなりかつその下流に位置するM23Aサブファミリープロテアーゼの成熟型タンパク質領域の立体構造の形成に寄与するポリヌクレオチドである。
〔4〕好ましくは、前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、〔2〕記載の方法:
 配列番号2のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号2の523~1062番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号2の1~522番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号3のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号3の595~1134番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号3の1~594番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号5の616~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号5の1~615番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号6のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号6の709~1257番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号6の1~708番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号8のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号8の565~1104番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号8の1~564番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号9のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号9の625~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号9の1~624番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号11のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号11の529~1065番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号11の1~528番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号12の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号12の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号14の550~1086番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号14の1~549番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号15のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号15の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
又は、
 配列番号15の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
〔5〕好ましくは、前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが分泌シグナル領域をさらに含む、〔1〕~〔4〕のいずれか1項記載の方法。
〔6〕好ましくは、前記分泌シグナル領域がバチルス属菌由来の分泌シグナル領域である、〔5〕記載の方法。
〔7〕好ましくは、前記バチルス属菌が、プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出する菌である、〔1〕~〔6〕のいずれか1項記載の方法。
〔8〕好ましくは、前記バチルス属菌が細胞外プロテアーゼ活性を有する、〔7〕記載の方法。
〔9〕好ましくは、前記プロテアーゼがaprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、〔7〕又は〔8〕記載の方法。
〔10〕好ましくは、前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、〔1〕~〔9〕のいずれか1項記載の方法。
〔11〕好ましくは、得られた培養物からM23Aファミリープロテアーゼを回収することをさらに含む、〔1〕~〔10〕のいずれか1項記載の方法。
実施例
[0049]
 以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
[0050]
 以下の実施例で用いたプライマーの配列を表2に示す。
[0051]
[表2]


[0052]
実施例1 組換え枯草菌によるBLP生産
(1-1)BLP発現プラスミドの構築
 BLP遺伝子(配列番号3)をプラスミドpUC57に挿入したもの(BLP/pUC57)を、GenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。BLP/pUC57を鋳型としてプライマーペアBLP_S237signal_F/BLP_S237signal_R(配列番号21及び22)及びPrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)を使用してPCRを行った。WO2006/068148A1の実施例7に記載のプラスミドpHY-S237を鋳型とし、プライマーペアvector-F/vector-sig-R(配列番号23及び24)を使用して、同様にPCRを行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理した。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。In-Fusion反応液をECOS TM Competent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310-06236)に形質転換してプラスミド(pHY-BLP)を構築した。
[0053]
(A)pHY-BLP2
 pHY-BLPを鋳型としてプライマーペアΔBLPsig_F/ΔBLPsig_R(配列番号25及び26)を用いてPCRを行った。PCR産物をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-BLP2)を構築した。pHY-BLP2は、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、BLPプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0054]
(B)pHY-BLP3
 pHY-BLPを鋳型としてプライマーペアBLPsig_F/BLPsig_R(配列番号27及び28)を用いてPCRを行った。PCR産物をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-BLP3)を構築した。pHY-BLP3は、S237プロモーター配列(配列番号16)、BLPプレプロタンパク質(分泌シグナル+プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0055]
(C)pHY-BLP4
 pHY-BLP2を鋳型としてプライマーペアΔpro_F/Δpro_R(配列番号29及び30)を用いてPCRを行った。PCR産物をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-BLP4)を構築した。pHY-BLP4は、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、BLP成熟タンパク質をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0056]
(D)pHY-BLP5
 pHY-BLPを鋳型としてプライマーペアΔBLPsig2_F/BLPsig_R(配列番号31及び28)を用いてPCRを行った。枯草菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株:Nature,1997,390,p.249)ゲノムDNAを鋳型とし、プライマーペアamyEsig(BLP)_F/amyEsig(BLP)_R(配列番号32及び33)を使用して、同様にPCRを行った。得られた断片を用いてIn-Fusion反応を行い、プラスミド(pHY-BLP5)を構築した。pHY-BLP5は、S237プロモーター配列(配列番号16)、amyE分泌シグナル配列(配列番号20)、BLPプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0057]
(1-2)組換え枯草菌の作製
 宿主には、枯草菌168株を使用した。(1-1)で得たBLP発現プラスミドpHY-BLP2~5及び空ベクターpHY300PLK(タカラバイオ)のそれぞれを、以下の方法によって宿主に導入した。1mLのLB培地に枯草菌168株を植菌し、30℃、200spmで一晩振盪培養した。得られた培養液10μLを1mLの新たなLB培地に植菌して37℃、200spmで3時間培養した。培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに4mg/mLのリゾチーム(SIGMA)を含むSMMP(0.5Mシュークロース、20mMマレイン酸二ナトリウム、20mM塩化マグネシウム6水塩、35%(w/v)Antibiotic medium 3(Difco))を500μL添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、400μLのSMMPに懸濁した。懸濁液33μL、各プラスミド20ngを混合し、さらに100μLの40%(w/v)PEGを加え攪拌し、さらにSMMPを350μL加えた後、30℃で1時間振盪した。得られた液200μLをテトラサイクリン(15μg/mL、SIGMA)を含むDM3再生寒天培地(0.8%寒天(和光純薬)、0.5%コハク酸2ナトリウム6水塩、0.5%カザミノ酸テクニカル(Difco)、0.5%酵母エキス、0.35%リン酸1カリウム、0.15%リン酸2カリウム、0.5%グルコース、0.4%塩化マグネシウム6水塩、0.01%牛血清アルブミン(SIGMA)、0.5%カルボキメチルセルロース、0.005%トリパンブルー(Merck)及びアミノ酸混液(トリプトファン、リジン、メチオニン各10μg/mL);%は(w/v)%)に塗抹して30℃で3日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
[0058]
(1-3)組換え枯草菌の培養及び培養上清の取得
 終濃度15ppmとなるようにテトラサイクリンを添加したLB培地1mLに(1-2)で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、30℃、150spmで一晩培養した。翌日、培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、21μM ZnSO 4、15ppmテトラサイクリン;%は(w/v)%)5mLに植菌し、30℃、150spmで2日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
[0059]
(1-4)培養上清における酵素活性の測定
 基質として、蛍光基Nmaと消光基Lys(Dpn)の間がペンタグリシンであるFRET基質[以下FRET-GGGGG](ピーエイチジャパンにて受注生産)を用いた。ここでNmaとは2-(N-メチルアミノ)ベンゾイル(Nma)を指す。またLys(Dpn)とは2,4-ジニトロフェニル(Dnp)をリシン(Lys)の側鎖に有するものを指す。96穴のアッセイプレ-ト(AGCテクノグラス、3881-096)に(1-3)で得た培養上清(適宣希釈)を2μL、20mM Tris-HCl(pH7.5)を200μL添加し、さらにFRET-GGGGG溶液(1mM FRET-GGGGG、100mM Tris-HCl(pH7.5))を10μL添加して反応液を調製した。infinite M200(TECAN)を用いて温度30℃、励起波長340nm、測定波長440nmにて反応液の蛍光強度を経時で測定した。同じ反応条件で、酵素溶液の代わりに20mM Tris-HCl(pH7.5)、FRET-GGGGGの代わりにFRETS-25-STD1及びFRETS-25-STD2(株式会社ペプチド研究所)の等モル溶液を用いた反応液の蛍光強度を測定し、検量線を作成した。1ユニット(U)の活性は、1μmol FRETS-25-STD1及び1μmol FRETS-25-STD2を含む溶液の蛍光強度をXとしたとき、X/minの蛍光強度の変化を示すのに必要な酵素量とした。培養上清のFRET-GGGGG分解活性(U/mL)を求めた。
[0060]
 測定の結果を図1に示す。空ベクターを導入した組換え株の培養上清ではFRET-GGGGG分解活性は検出されなかったが、BLPプロタンパク質をコードするプラスミド(pHY-BLP2、3、5)を導入した組換え株の培養上清では、FRET-GGGGG分解活性が検出された。このことから、BLPプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え枯草菌の培養上清中に、グリシン-グリシン結合の分解活性を有する酵素が存在することが示された。また、BLPの本来の分泌シグナルを含むプラスミド(pHY-BLP3)を導入した組換え株と比較して、S237分泌シグナルを含むプラスミド(pHY-BLP2)及びamyE分泌シグナルを含むプラスミド(pHY-BLP5)を導入した組換え株では、培養上清のFRET-GGGGG分解活性は高かった。このことから、枯草菌で効率的に働く分泌シグナルをプロタンパク質に連結することで、BLPの生産性が向上することが示された。また、BLPのプロ領域を含まないプラスミド(pHY-BLP4)を導入した組換え株の培養上清ではFRET-GGGGG分解活性が検出されなかったことから、BLP成熟体の生産にはプロ領域が必須であることが示された。
[0061]
(1-5)SDS-PAGE
 (1-3)で得た培養上清に終濃度2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(ナカライテスク)を混合した。この混合液を25mMのジチオトレイトール(Thermo Fisher Scientific)を添加した2×Laemmli Sample Buffer(Bio-Rad)と1:1で混合し、100℃で5分間加熱した。得られた溶液をサンプルとして、Any kD TMミニプロティアンTGX TMステインフリーゲル(Bio-Rad)を用いてSDS-PAGEを行った。マーカーにはプレシジョンPlusプロテイン TM未着色スタンダード(Bio-Rad)を使用した。
[0062]
 SDS-PAGEの結果、BLPプロタンパク質をコードするプラスミド(pHY-BLP2、3)を導入した組換え枯草菌の培養上清では、BLP成熟体(19.3kDa)の位置にバンドが検出された(図2)。
[0063]
実施例2 細胞外プロテアーゼが成熟BLP生産に与える影響
(2-1)BLP-FLAG発現プラスミドの構築
 (1-1)で得たプラスミドpHY-BLP2を鋳型としてプライマーペアBLP_FLAG_F/BLP_FLAG_R(配列番号34及び35)及びPrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)を使用してPCRを行った。PCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行い、反応液をECOS TM Competent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310-06236)に形質転換してプラスミド(pHY-BLP-FLAG)を構築した。プラスミドHY-BLP-FLAGは、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、C末端にFLAG(登録商標)タグ(DYKDDDDKのアミノ酸配列)を付加したBLPプロタンパク質をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したBLP-FLAG遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0064]
(2-2)組換え枯草菌の作製及び培養上清の取得
 宿主には、枯草菌168株、及び9種の細胞外プロテアーゼ遺伝子(aprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr及びaprX)を欠損した枯草菌Dpr9株(特開2006-174707号公報の実施例1~5において作製されたKao9株)を使用した。(2-1)で得たプラスミドpHY-BLP-FLAG及び空ベクターpHY300PLK(タカラバイオ)のそれぞれを、(1-2)と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。得られた組換え枯草菌コロニーを(1-3)と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
[0065]
(2-3)培養上清における酵素活性の測定及びウェスタンブロッティング
 (2-2)で得た培養上清の酵素活性を(1-4)と同様の手順で測定した。また(2-2)で得た培養上清を用いて、(1-5)と同様の手順でSDS-PAGEを行った。SDS-PAGE後のゲルを、トランスブロットTurbo TMシステム(Bio-Rad)とトランスブロットTurboTMミニPVDF転写パック(Bio-Rad)を使用してPVDF膜へ転写した。転写後のメンブレンをiBind Western System(Life Technologies)を用いてHRP標識抗DYKDDDDK抗体(CST)と反応させた後、イムノスター TMゼータ(富士フイルム和光純薬)を用いて目的タンパク質を検出した。
[0066]
 酵素活性の測定の結果、168株の組換え体ではFRET-GGGGG分解活性が検出されたが、細胞外プロテアーゼを欠損したDpr9株の組換え体ではFRET-GGGGG分解活性が検出されなかった(図3)。またウェスタンブロットの結果、168株の組換え体ではBLP成熟体(19.3kDa)の位置にバンドが検出されたが、Dpr9株の組換え体ではBLPプロタンパク質(38.1kDa)の位置にバンドが検出された(図4)。これらの結果から、培養物中の細胞外プロテアーゼが、活性型BLP成熟体の生産において重要な役割を担っており、とりわけ、BLPの成熟化に働いていることが示された。
[0067]
 一方、9株のプロテアーゼ欠損株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及びΔaprX株)については、全て株の組換え体の培養上清からFRET-GGGGG分解活性が測定された。そのうち8株の活性は168株に対して80%以上であった。残り1株も168株に対して50%以上のFRET-GGGGG分解活性を有していた。これら及び上記のDpr9株での結果から、細胞外プロテアーゼが活性型BLP成熟体の生産に寄与していることが示唆された。
[0068]
実施例3 組換え枯草菌による各種M23Aサブファミリープロテアーゼの生産-1
(3-1)LasA発現プラスミドの構築
 LasA遺伝子(配列番号6)をプラスミドpUC57に挿入したもの(LasA/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。LasA/pUC57を鋳型とし、プライマーペアLasA_F/LasA_CR(配列番号36及び37)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCRを行った。pHY-S237(WO2006/068148A1)を鋳型とし、プライマーペアpHY_just_F/pHY_just_R_NEW(配列番号38及び39)を使用して、同様にPCRを行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理した。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。反応液をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換してプラスミド(pHY-LasA)を構築した。pHY-LasAを鋳型として、プライマーペアpHY_just_F/LasA_Chis_n_R(配列番号38及び40)、及びKOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO)を使用して、PCR、DpnI消化、及びライゲーションを行った。反応液をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-LasA2)を構築した。pHY-LasA2は、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、LasAプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したLasA遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0069]
(3-2)AhP発現プラスミドの構築
 AhP遺伝子(配列番号9)をプラスミドpUC57に挿入したもの(AhP/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。AhP/pUC57を鋳型とし、プライマーペアAhP_F/AhP_R(配列番号41及び42)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCRを行った。pHY-S237(WO2006/068148A1)を鋳型とし、プライマーペアvector-F/vector-R(配列番号23及び43)を使用して、同様にPCRを行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理した。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。反応液をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-AhP)を構築した。pHY-AhPは、S237プロモーター配列(配列番号16)、AhP分泌シグナル配列、AhPプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したAhP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0070]
(3-3)LgBLP発現プラスミドの構築
 Lysobacter gummosus由来のBLPホモログ(WP_057941690.1、以下LgBLPという)の遺伝子(LgBLP遺伝子、配列番号11)をプラスミドpUC57に挿入したもの(LgBLP/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。LgBLP/pUC57を鋳型とし、プライマーペアLgBLP_F/LgBLP_R(配列番号44及び45)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCRを行った。pHY-S237(WO2006/068148A1)を鋳型とし、プライマーペアpHY_just_F/pHY_just_R_NEW(配列番号38及び39)を使用して、同様にPCRを行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理した。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。反応液をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-LgBLP)を構築した。pHY-LgBLPは、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、LgBLPプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したLgBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0071]
(3-4)LaBLP発現プラスミドの構築
 Lysobacter antibioticus由来のBLPホモログ(WP_057970430.1、以下LaBLPという)の遺伝子(LaBLP遺伝子、配列番号14)をプラスミドpUC57に挿入したもの(LaBLP/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。LaBLP/pUC57を鋳型とし、プライマーペアLaBLP_F/LaBLP_R(配列番号46及び47)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCRを行った。pHY-S237(WO2006/068148A1)を鋳型とし、プライマーペアpHY_just_F/pHY_just_R_NEW(配列番号38及び39)を使用して、同様にPCRを行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理した。得られた断片を用いて、In-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。反応液をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換して、プラスミド(pHY-LaBLP)を構築した。pHY-LaBLPは、S237プロモーター配列(配列番号16)、S237分泌シグナル配列(配列番号18)、LaBLPプロタンパク質(プロ領域+成熟体)をコードする配列、S237ターミネーター配列の順に連結したLaBLP遺伝子発現用配列と、pHY300PLKベクター配列からなる。
[0072]
(3-5)組換え枯草菌の作製
 宿主には、枯草菌168株を使用した。(3-1)~(3-4)で得た各プラスミド及び空ベクターpHY300PLK(タカラバイオ)のそれぞれを、(1-2)と同様の手順によって宿主に導入し、組換え枯草菌のコロニーを取得した。
[0073]
(3-6)組換え枯草菌の培養及び培養上清の取得
 (3-5)で得た組換え枯草菌コロニーを(1-3)と同様の手順で培養し、培養上清を得た。
[0074]
(3-7)培養上清の酵素活性測定
 (3-6)で得た培養上清の酵素活性を(1-4)と同様の手順で測定した。なおLasA活性の測定においては、空ベクター導入株及びLasA発現プラスミド導入株の培養上清をアミコンウルトラ10K(Merck Millipore)により20倍に濃縮したものを使用した。測定の結果、全てのM23Aサブファミリープロテアーゼについて、プロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した組換え枯草菌の培養上清では、空ベクター導入枯草菌の培養上清よりも高いFRET-GGGGG分解活性が検出された(図5)。 
[0075]
実施例4 組換え枯草菌による各種M23Aサブファミリープロテアーゼの生産-2
(4-1)BLPを含む培養上清の調製
(4-1-1)発現ベクターの作製
 BLP遺伝子(配列番号3)をプラスミドpUC57に挿入したもの(BLP/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。BLP/pUC57を鋳型としてプライマーペアBLP_S237signal_F/BLP_S237signal_R(配列番号21及び22)及びPrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)を使用してPCR反応を行った。WO2006/068148 A1の実施例7に記載のプラスミドpHY-S237を鋳型とし、プライマーペアvector-F/vector-sig-R(配列番号23及び24)を使用して、同様にPCR反応を行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行った。続いてIn-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行った。
[0076]
 In-Fusion反応液を用いてECOS TMCompetent E.coli DH5α(ニッポンジーン、310-06236)を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するLBプレートに塗抹し、37℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むLB培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してHigh Pure Plasmid Isolation Kit(Roche)を使用してプラスミド(BLP/pHY)を抽出した。抽出したBLP/pHYを鋳型としてプライマーペアΔS237N_fw/ΔS237N_rv(配列番号48及び49)を用いてPCR反応を行った。このPCR産物をE.coli HST08 Premium Competent Cells(タカラバイオ)に形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するLBプレートに塗抹し、37℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むLB培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収してHigh Pure Plasmid Isolation Kit(Roche)を使用してプラスミド(BLP2/pHY)を抽出した。
[0077]
(4-1-2)酵素生産形質転換株の作製
 1mLのLB培地に枯草菌168株(Bacillus subtilis Marburg No.168株:Nature,390,1997,p.249)を植菌し、30℃、200rpmで一晩振盪培養した。1mLの新たなLB培地にこの培養液を10μL植菌して37℃、200rpmで3時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに4mg/mLのリゾチーム(SIGMA)を含むSMMP[0.5Mシュークロース、20mMマレイン酸二ナトリウム、20mM塩化マグネシウム6水塩、35%(w/v)Antibiotic Medium 3(Difco)]を500μL添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、400μLのSMMPに懸濁した。懸濁液13μL、(4-1-1)で得たプラスミドBLP2/pHY溶液(10mM Tris-HCl pH8.5、34.2ng/μL)2μL、SMMP20μLを混合し、さらに100μLの40%PEGを加え攪拌し、さらにSMMPを350μL加えた後、30℃で1時間振盪した。この液200μLをテトラサイクリン(15μg/mL、SIGMA)を含むDM3再生寒天培地[0.8%寒天(和光純薬)、0.5%コハク酸2ナトリウム6水塩、0.5%カザミノ酸テクニカル(Difco)、0.5%酵母エキス、0.35%リン酸1カリウム、0.15%リン酸2カリウム、0.5%グルコース、0.4%塩化マグネシウム6水塩、0.01%牛血清アルブミン(SIGMA)、0.5%カルボキメチルセルロース、0.005%トリパンブルー(Merck)及びアミノ酸混液(トリプトファン、リジン、メチオニン各10μg/mL);%は(w/v)%]に塗抹して30℃で3日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
[0078]
(4-1-3)形質転換株による酵素製造
 LB培地に終濃度15ppmとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地5mLに(4-1-2)で得た枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、30℃、250rpmで一晩培養した。翌日この培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、15ppmテトラサイクリン、6ppm硫酸亜鉛七水和物;%は(w/v)%)20mLに植菌し、32℃、230rpmで2日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
[0079]
(4-2)LasAを含む培養上清の調製
 LasA遺伝子(配列番号6)をプラスミドpUC57に挿入したもの(LasA/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。LasA/pUC57を鋳型とし、プライマーペアLasA_F/LasA_CR(配列番号36及び37)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCR反応を行った。WO2006/068148 A1の実施例7に記載のプラスミドpHY-S237を鋳型とし、プライマーペアpHY_just_F/pHY_just_R_NEW(配列番号38及び39)を使用して、同様にPCR反応を行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行った。続いてIn-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行うことでプラスミド(LasA/pHY)溶液を得た。
[0080]
 得られたプラスミド(LasA/pHY)溶液を用いて、上記(4-1-2)と同様の手順で枯草菌prsA遺伝子発現強化株(特開2007-49986号公報の実施例1において作製されたprsA-Kc株)の形質転換を行い、枯草菌形質転換体コロニーを取得した。2×L液体培地に終濃度15ppmとなるようにテトラサイクリンを添加した。この培地5mLに枯草菌形質転換体コロニーを植菌した後、30℃、250rpmで一晩培養した。培養液からペレットを回収し、ペレットからプラスミドLasA/pHYを抽出した。抽出したプラスミドLasA/pHYを鋳型として、プライマーペアpHY_just_F/LasA_Chis_n_R(配列番号38及び40)、ならびにKOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO)を使用して、PCR反応、Dpn Iによるプラスミドの消化、及びライゲーションを行い、プラスミド(LasA2/pHY)を得た。
[0081]
 得られたプラスミド(LasA2/pHY)を使用して、上記(4-1-2)と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌prsA遺伝子発現強化株(特開2007-49986号公報の実施例1において作製されたprsA-Kc株)を使用した。次いで、得られた形質転換株を(4-1-3)と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。
[0082]
(4-3)AhPを含む培養上清の調製
 AhP遺伝子(配列番号9)をプラスミドpUC57に挿入したもの(AhP/pUC57)をGenScript社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。AhP/pUC57を鋳型とし、プライマーペアAhP_F/2R_bacillus-Chis(配列番号41及び50)を使用して、PrimeSTAR Max Premix(タカラバイオ)のプロトコルに従いPCR反応を行った。WO2006/068148 A1の実施例7に記載のプラスミドpHY-S237を鋳型とし、プライマーペアvector-F/vector-R(配列番号23及び43)を使用して、同様にPCR反応を行った。それぞれのPCR産物をDpnI(New England Biolabs)にてDpnI処理を行った。続いてIn-Fusion,HD Cloning kit(Clontech)のプロトコルに従ってIn-Fusion反応を行うことでプラスミド(AhP/pHY)溶液を得た。
[0083]
 得られたプラスミド(AhP/pHY)を使用して、上記(4-1-2)と同様の方法で形質転換を行った。このとき宿主として枯草菌168株を使用した。次いで、得られた形質転換株を(4-1-3)と同様の手順で培養し、菌体から産生された酵素を含む培養上清を回収した。
[0084]
(4-4)培養上清からのプロテアーゼの調製
 (4-1)~(4-3)で得た培養上清から目的のプロテアーゼを調製した。培養上清をアミコンウルトラ 分画分子量10K(メルクミリポア)を用いてBufferAでバッファー交換した。バッファー交換後の液から、AKTA explorer 10S(GEヘルスケア)を用いて酵素を調製した。まず該バッファー交換で得られた液をカラム1に通し、次いでBufferBを使用してカラム1の吸着成分を溶出させた。溶出分画のうちFRET-GGGGGの分解活性が認められる分画液を回収した。続いて、回収した分画液を、20mM Tris-HCl(pH7.5)、200mM NaClの溶液で平衡化したカラム2を用いてSize Exclusion Chromatographyにかけ、FRET-GGGGGの分解活性が認められる分画液を回収した。回収した分画液をアミコンウルトラ 分画分子量10Kを用いて20mM Tris-HCl(pH7.5)溶液でバッファー交換し、目的のプロテアーゼを含む酵素溶液を得た。各培養上清に使用したBufferA、BufferB、カラム1、及びカラム2は、表3のとおりとした。
[0085]
[表3]


[0086]
実施例5 枯草菌細胞外プロテアーゼ活性の測定
(5-1)枯草菌の培養及び培養上清の取得
 枯草菌168株、9株の細胞外プロテアーゼ欠損株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及びΔaprX株)及びDpr9株をLB培地1mLにそれぞれ植菌した後、30℃、150spmで一晩培養した。翌日、培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、21μM ZnSO 4;%は(w/v)%)5mLに植菌し、30℃、150spmで2日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
[0087]
(5-2)培養上清のアゾカゼイン分解活性測定
 培養上清中に含まれるプロテアーゼの活性を測定する基質として、アゾカゼイン(SIGMA)を用いた。基質溶液(1%(w/v)アゾカゼイン、50mM Tris-HCl(pH7.5))に(5-1)で得た培養上清を50μL添加して37℃で18時間反応させた。5%トリクロロ酢酸水溶液2mLを添加して反応を停止し、15000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を適宣希釈して光路長1cmのキュベットを用いて340nmの吸光度を測定した。培養上清と5%トリクロロ酢酸水溶液の添加順を逆にしたものを対照とした。対照と比較して統計学的に有意(t検定、p<0.05)な吸光度の増加が検出された培養上清を、アゾカゼイン分解活性ありと判定した。測定の結果、168株及び9株の細胞外プロテアーゼ欠損株(Δepr株、ΔwprA株、Δmpr株、ΔnprB株、Δbpr株、ΔnprE株、Δvpr株、ΔaprE株、及びΔaprX株)の培養上清ではアゾカゼイン分解活性が検出され、一方、Dpr9株の培養上清では検出されなかった(検出限界以下)。これらの結果は、それぞれの株の活性型BLP生産能と一致した(表4)。
[0088]
[表4]


[0089]
実施例6 天然のBLP生産菌とのBLP生産性比較
(6-1)BLP生産菌の培養及び培養上清の取得
 これまで、活性型のBLPを生産する方法としては、単離された天然のBLP生産菌を培養する方法のみが実証されている。本実施例では、天然のBLP生産菌にBLPを生産させ、その生産性を実施例1のBLP生産性組換え枯草菌と比較した。
[0090]
 天然のBLP生産菌であるAchromobacter lyticus M497-1株をLB培地1mLに植菌した後、30℃、150spmで一晩培養した。翌日、培養液400μLを2×L-マルトース培地(2%トリプトン、1%酵母エキス、1%NaCl、7.5%マルトース、7.5ppm硫酸マンガン五水和物、21μM ZnSO 4;%は(w/v)%)5mLに植菌し、30℃、150spmで2日間培養した後、培養上清を遠心分離により回収した。
[0091]
(6-2)培養上清の酵素活性測定
 (6-1)で得た培養上清の酵素活性を(1-4)と同様の手順で測定した。測定の結果、Achromobacter lyticus M497-1株の培養上清からは14U/mLのFRET-GGGGG分解活性が検出された。これは実施例1の成熟BLP発現組換え枯草菌による活性(図1、それぞれ43、594及び613U/mL)と比較して大幅に小さい値であった。なお、これまでの報告で最も効率的にBLPを生産する菌株は、非特許文献3に記載のLysobacter sp. IB-9374株である。しかし、その生産性はAchromobacter lyticus M497-1株の2.4倍とされており、実施例1の組換え枯草菌によるBLP生産性には遠く及ばないものと思われる。以上のことから、本発明は、異種発現というだけでなくその生産性においても既存技術に対して大きく優位性を持つ技術である。
[0092]
 以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

請求の範囲

[請求項1]
 M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入したバチルス属菌を培養し、該バチルス属菌の細胞外に成熟型M23Aファミリープロテアーゼを製造させることを含む、M23Aファミリープロテアーゼの製造方法。
[請求項2]
 前記M23Aファミリープロテアーゼが、配列番号1、4、7、10もしくは13のアミノ酸からなるポリペプチドであるか、又は、配列番号1、4、7、10及び13のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列からなりかつペプチド配列中のグリシン-グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドである、請求項1記載の方法。
[請求項3]
 前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、請求項2記載の方法:
 配列番号2、3、5、6、8、9、11、12、14、及び15のいずれかのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;又は
 M23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードするポリヌクレオチドと、その下流に連結されたM23Aサブファミリープロテアーゼをコードするポリヌクレオチドと、を含むポリヌクレオチド。
[請求項4]
 前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下である、請求項2記載の方法:
 配列番号2のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号2の523~1062番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号2の1~522番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号3のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号3の595~1134番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号3の1~594番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号5の616~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号5の1~615番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号6のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号6の709~1257番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号6の1~708番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号8のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号8の565~1104番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号8の1~564番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号9のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号9の625~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号9の1~624番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号11のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号11の529~1065番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号11の1~528番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号12のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号12の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号12の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号14のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号14の550~1086番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
 配列番号14の1~549番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼのプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド;
 配列番号15のヌクレオチド配列と少なくとも80%同一なヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号15の628~1164番ヌクレオチド領域に相当する領域に前記M23Aファミリープロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、ポリヌクレオチド;
又は、
 配列番号15の1~627番ヌクレオチド領域の配列又はこれと少なくとも80%同一でありかつM23Aサブファミリープロテアーゼの分泌シグナル及びプロ領域をコードする配列と、その下流に連結された前記M23Aファミリープロテアーゼをコードする配列と、を有するポリヌクレオチド。
[請求項5]
 前記M23Aファミリープロテアーゼのプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが分泌シグナル領域をさらに含む、請求項1~4のいずれか1項記載の方法。
[請求項6]
 前記分泌シグナル領域がバチルス属菌由来の分泌シグナル領域である、請求項5記載の方法。
[請求項7]
 前記バチルス属菌が、プロテアーゼを細胞外に分泌するか又は溶菌に伴って放出する菌である、請求項1~6のいずれか1項記載の方法。
[請求項8]
 前記バチルス属菌が細胞外プロテアーゼ活性を有する、請求項7記載の方法。
[請求項9]
 前記プロテアーゼがaprE、epr、wprA、mpr、nprB、bpr、nprE、vpr、aprX、及びこれらに相当する遺伝子にコードされる細胞外プロテアーゼからなる群より選択される少なくとも1種である、請求項7又は8記載の方法。
[請求項10]
 前記バチルス属菌が枯草菌又はその変異株である、請求項1~9のいずれか1項記載の方法。
[請求項11]
 得られた培養物からM23Aファミリープロテアーゼを回収することをさらに含む、請求項1~10のいずれか1項記載の方法。

図面

[ 図 1]

[ 図 2]

[ 図 3]

[ 図 4]

[ 図 5]