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1. WO2020159314 - COMPLEXE ENZYME-PORTEUSE

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명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4   5  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

6   7  

과제 해결 수단

8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18  

발명의 효과

19   20  

도면의 간단한 설명

21   22   23   24  

발명의 실시를 위한 최선의 형태

25   26   27   28   29   30   31   32   33   34  

발명의 실시를 위한 형태

35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11  

도면

1   2   3   4   5  

명세서

발명의 명칭 : 효소-담체 복합체

기술분야

[1]
본 발명은 효소-담체 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 담체 표면에서의 효소의 흡착 및 안정화에 관한 것이며, 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 고정된 효소가 장시간 효소활성이 발현되도록 효소 안정성을 확보한 효소-담체 복합체에 관한 것이다.

배경기술

[2]
효소는 고도의 초정밀성, 특이성, 선택성 및 고효율성의 특성을 가져서 인간이 영위하고 있는 다양한 산업에 이용이 확대되고 있을 뿐 아니라, 기능면에서는 산화환원, 전이, 가수분해, 이탈 및 부가, 이성화와 합성 반응을 촉매하는 일반적인 기능은 물론이고 고온, 고압, 유기용매하의 반응 등 특수한 상황에서도 반응하는 특성으로 산업적 적용범위가 무한하기 때문에 미래 산업용제제로 활용가치가 매우 높다.
[3]
그러나 효소는 열, pH 등의 외부환경 의해 쉽게 구조적 변성됨에 따라서 효소활성의 불안정성 문제로 응용에 제한이 많은 문제가 있다. 이를 해결하고자 최근에는 효소의 안정성을 향상시키기 위한 목적으로 유전자 재조합 기술이나 효소 고정화 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
[4]
효소를 고정화 시키는 기술과 관련하여, 담체 표면을 효소와 결합할 수 있는 작용기로 개질시킨 뒤 상기 작용기를 매개하여 효소를 담체에 공유결합을 통해 고정시키는 기술이 많이 연구되고 있는데, 이 방법으로는 안정적 결합을 담보할 수 있으나, 공유결합을 위한 반응 시 효소의 구조적 변성을 통해서 고정화 되는 효소의 활성이 저하되거나 잃는 문제가 있다. 또한, 담체 표면에 작용기가 구비되도록 개질시키는 추가적인 기능화 과정을 도입해야 하는 단점이 있고, 이러한 기능화 과정에서 담체의 고유 특성을 변동 또는 저하시키는 문제가 발생할 수 있다.
[5]
이에 효소 활성의 저하를 최소화하며 효소를 담체에 고정시킬 수 있고, 장시간 효소활성을 유지할 수 있으며, 담체의 개질화로 인한 고유 특성 저하를 최소화할 수 있는 효소 고정화 기술이 시급한 실정이다.

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[6]
본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출한 것으로, 효소활성의 저하를 최소화하면서 효소를 담체에 고정시키고, 장시간 효소활성이 발현되도록 효소 안정성을 확보하며, 담체의 고유 특성 저하를 최소화할 수 있는 효소-담체 복합체를 제공하는데 목적이 있다.
[7]
또한, 본 발명은 수용액 상에 분산성을 확보할 수 효소-담체 복합체를 제공하는데 다른 목적이 있다.

과제 해결 수단

[8]
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 소수성 담체, 및 상기 소수성 담체 표면에 흡착된 효소를 포함하는 효소-담체 복합체를 제공한다.
[9]
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 효소는 아실레이즈, 트립신, 키모트립신, 펩신, 라이페이즈, 글루코즈 옥시데이즈, 피라노스 옥시데이즈, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈, 티록시네이즈, 카보닉 앤하이드레이즈, 포름알데히드 디하이드로게네이즈, 포름산 디하이드로게네이즈, 알코올 디하이드로게네이즈, 콜레스테롤 디하이드로게네이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이즈, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈 및 메탈로엔도펩티데이즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 포함할 수 있다.
[10]
또한, 상기 소수성 담체는 탄소나노튜브, 풀러렌, 그래핀, 다공성 탄소, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리스티렌, 폴리디메틸실록세인 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재질 포함할 수 있다.
[11]
또한, 상기 소수성 담체는 상기 효소와의 소수성 상호작용을 유도하기 위하여 표면에 제1작용기를 더 포함할 수 있다.
[12]
또한, 상기 효소는 상기 제1작용기와 소수성 상호작용을 유도하기 위한 제2작용기를 더 포함할 수 있다.
[13]
이때, 소수성 상호작용을 유도하기 위한 작용기는 할로겐화 알킬기, 유기규소기, 알킬기, 비닐기, 알릴기 및 아릴기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다.
[14]
또한, 상기 효소-담체 복합체는 아실레이즈-탄소나노튜브 복합체, 트립신-탄소나노튜브 복합체, 라이페이즈-탄소나노튜브 복합체, 글루코즈 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 피라노스 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 티록시네이즈-탄소나노튜브 복합체, 카보닉 앤하이드레이즈-탄소나노튜브 복합체 및 포름알데히드 디하이드로게네이즈-탄소나노튜브 복합체로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종일 수 있다.
[15]
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 바이오 연료전지용 전극을 제공한다.
[16]
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 바이오센서용 전극을 제공한다.
[17]
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 이산화탄소 전환 시스템을 포함한다.
[18]
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 안티파울링 시스템을 포함한다.

발명의 효과

[19]
본 발명에 의한 효소-담체 복합체는 효소 활성부위의 변성 없이 담체에 안정적으로 고정될 수 있으며, 고정된 후 장기간 효소활성을 발현할 수 있다. 또한, 효소 고정화에도 담체의 고유 특성의 저하를 최소화시킬 수 있어서 담체 본연의 고유 특성을 온전히 발현시키기에 유리하다. 나아가 담체가 소수성 특성을 가지는 경우에도 수용액 상에서 분산성을 확보할 수 있어서 장시간 안정적인 효소 성능을 요구하는 다양한 응용에 적합하게 사용할 수 있다. 더불어 종래의 효소 안정화 기술에 응용되던 가교결합제와 같은 생체 적합성이 문제되는 성분을 사용하지 않고 효소를 고정화, 안정화함에 따라서 사용이 제한되던 의료분야에도 사용이 확대될 수 있다.
[20]
이에 따라서 효소-담체 복합체를 포도당을 기반으로 하는 바이오 연료전지 및 혈당 측정을 목적으로 하는 바이오센서의 전극 제작을 목적으로 당산화효소, 피라노스 산화효소 등의 관련 효소를 고정화에 활용할 경우 매우 높은 안정화 효과를 달성할 수 있다. 또한, 이산화탄소를 중탄산염으로 전환할 수 있는 탄산무수화효소 및 중탄산염으로부터 포름산 전환이 가능한 포름산 탈수소효소 등의 관련 효소를 고정화에 활용될 경우, 종래의 가교결합제를 이용한 고정화 방식에 비해 효소의 변성 없이도 활성을 장시간 안정적으로 유지하는 것이 가능하여 이산화탄소 전환 및 활용 시스템의 촉매 소재로 활용할 수 있다. 또한, 정족수 감지(quorum sensing) 역할을 수행하는 신호 분자(signaling molecule)를 분해하여 생물막(biofilm) 형성을 억제할 수 있는 아실레이즈 등의 관련 효소를 고정화 하는데 활용될 경우, 종래의 가교결합제를 이용한 고정화 방식에 비해 효소의 변성 없이도 활성을 안정적으로 유지할 수 있어서 멤브레인 표면의 바이오필름 형성을 억제하기 위한 목적으로 안티파울링(antifouling) 시스템 내의 촉매 소재로 활용할 수 있다. 또한, 이러한 일례 이외의 전기화학, 제약산업 등 다양한 응용에 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

[21]
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소-담체 복합체에 대한 모식도이다.
[22]
도 2 및 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 효소-담체 복합체를 유리 상태의 효소 및 비교예에 따른 효소-담체 복합체 각각과 대비한 효소 안정성 평가 그래프이다.
[23]
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 효소-담체 복합체를 물에 분산시킨 상태의 사진과 모식도이다.
[24]
도 5는 도 4의 복합체에서 담체로 사용된 탄소나노튜브 단독으로 물에 분산 시킨 상태의 사진과 모식도이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

[25]
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[26]
도 1을 참고하여 설명하면 본 발명에 따른 효소-담체 복합체는 소수성 담체 및 상기 소수성 담체 표면에 흡착된 효소를 포함하여 구현되며, 일예로 상기 흡착은 효소의 소수성 부분과 상기 소수성 담체 표면 간의 소수성 상호작용에 의한 것일 수 있다.
[27]
상기 소수성 담체는 통상적으로 당업계에서 소수성을 나타내는 것으로 통칭되는 불용성 재질인 경우 제한없이 사용될 수 있다. 다만, 본 발명에서 상기 소수성 담체는 소수성 담체는 효소의 표면과 맞닿을 수 있는 담체의 표면에서 효소의 표면과 비공유결합 중 반데르발스 상호작용, 또는 파이-파이 상호작용이 가능한 담체를 의미한다. 또한, 상기 소수성 담체는 이러한 정의에 부합되는 재질의 경우 제한없이 사용할 수 있으며, 일예로 탄소나노튜브, 풀러렌, 그래핀, 나노 세공성 탄소나 활성탄 같은 다공성 탄소, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리스티렌, 폴리디메틸실록세인 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재질을 포함할 수 있다.
[28]
상기 소수성 담체는 그 형상에 있어서 제한이 없으며, 일예로 구형, 판형, 로드형, 관형 및 비정형으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형상일 수 있다. 또한, 소수성 담체는 표면에 나노크기의 세공을 더 구비한 것일 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다.
[29]
또한, 상기 소수성 담체 크기는 나노 스케일부터 마이크로 스케일까지 다양할 수 있으며 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
[30]
또한, 상기 소수성 담체는 표면에 효소와 소수성 상호작용을 유도하거나, 이를 더 향상시키기 위하여 제1작용기를 더 포함할 수 있다. 상기 소수성 상호작용은 공유결합에 대비해 효소의 입체구조에 미치는 영향이 최소화 또는 방지됨에 따라서 종래 공유결합을 통해 지지체에 효소를 고정화시키거나 공유결합을 통해 효소와 효소의 가교결합 시킬 때 발생하는 강한 결합력에 따른 효소의 입체구조 변형의 문제와 이로 인한 효소활성의 저하 또는 상실의 문제를 방지하거나 최소화할 수 있는 이점이 있다. 이때, 소수성 담체에 구비되는 제1작용기는 소수성 상호작용을 유도할 수 있는 작용기의 경우 제한 없이 채용될 수 있는데, 일예로, 상기 제1작용기는 할로겐화알킬기, 유기규소기, 알킬기, 비닐기, 알릴기 및 아릴기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다.
[31]
또한, 상기 제1작용기는 소수성 담체 표면에 공지된 기술을 통해 도입할 수 있으며, 본 발명은 이에 대해 특별히 한정하지 않는다.
[32]
상기 효소는 공지된 효소의 경우 제한 없이 채용될 수 있으며, 일예로 아실레이즈, 트립신, 키모트립신, 펩신, 라이페이즈, 글루코즈 옥시데이즈, 피라노스 옥시데이즈, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈, 티록시네이즈, 카보닉 앤하이드레이즈, 포름알데히드 디하이드로게네이즈, 포름산 디하이드로게네이즈, 알코올 디하이드로게네이즈, 콜레스테롤 디하이드로게네이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이즈, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈 및 메탈로엔도펩티데이즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 아실레이즈, 트립신, 라이페이즈, 글루코즈 옥시데이즈, 피라노스 옥시데이즈, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈, 티록시네이즈, 카보닉 앤하이드레이즈, 포름알데히드 디하이드로게네이즈로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 아실레이즈 일 수 있다.
[33]
또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 효소는 소수성 담체와 소수성 상호작용을 증진시키기 위한 제2작용기를 더 구비할 수 있다. 상기 제2작용기는 효소의 입체구조에 영향을 최소화하면서도 소수성 담체에서 탈리를 최소화하고, 안정적으로 효소활성이 발현되도록 기능할 수 있다. 상기 제2작용기는 할로겐화알킬기, 유기규소기, 알킬기, 비닐기, 알릴기 및 아릴기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제2작용기는 소수성 담체에 구비될 수 있는 제1작용기와 동종 또는 이종의 것이 선택될 수 있으며, 본 발명은 이에 대해 특별히 제한하지 않는다.
[34]
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상술한 효소-담체 복합체에서 효소와 소수성 담체는 각각 아실레이즈-탄소나노튜브 복합체, 트립신-탄소나노튜브 복합체, 라이페이즈-탄소나노튜브 복합체, 글루코즈 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 피라노스 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 티록시네이즈-탄소나노튜브 복합체, 카보닉 앤하이드레이즈-탄소나노튜브 복합체 및 포름알데히드 디하이드로게네이즈-탄소나노튜브 복합체 중 어느 하나의 조합일 수 있으며, 이러한 조합에서 보다 향상된 효소와 담체 표면 간 상호작용에 따라서 효소가 안정적으로 고정될 수 있고, 장기간 효소활성이 발현될 수 있는 이점이 있다.

발명의 실시를 위한 형태

[35]
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 다만 본 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
[36]
<실시예1> - 아실레이즈와 탄소나노튜브를 이용한 효소-담체 복합체 제조 (ADS-AC/CNTs)
[37]
인산 완충액(100 mM pH 7.0)을 용매로 이용해 준비된 탄소나노튜브(carbon nanotubes, CNTs) 용액 (8mg/mL)과 아실레이즈(Acylase, AC) 용액(40 mg/mL)을 동일 부피비로 혼합한 후, 1시간 200 rpm으로 교반하여 탄소나노튜브 표면에 아실레이즈를 흡착시켰다. 이후 인산완충액을 이용하여 탄소나노튜브에 미부착된 아실레이즈를 제거하고 트리스 완충액(100 mM, pH 7.4)으로 30분 동안 200 rpm으로 교반하여 반응하지 않은 작용기를 캡핑(capping)하였다. 이후 제조된 효소-담체 복합체를 원심분리 후 상등액을 제거하고 인산완충액으로 세척 후 4℃에 보관하였다.
[38]
[39]
<비교예1> - 유리된 아실레이즈 용액 (Free AC)
[40]
인산 완충액 (100 mM pH 7.0)에 용해된 아실레이즈 용액을 준비하였다.
[41]
[42]
<실험예1> 아실레이즈와 탄소나노튜브를 이용한 효소-담체 복합체의 효소활성 및 안정성 측정
[43]
효소로써 세균의 정족수 감지 신호물질을 분해하는 아실라아제(Acylase, AC)를 사용하였다. AC 활성은 N-아세틸-L-메티오닌의 가수분해로 생성되는 L-메티오닌이 o-프탈알데히드(OPA)와 반응하여 나타나는 형광을 이용하여 측정하였다.
[44]
효소 안정성(stability)은 인산 완충액상에 샘플을 분산시킨 후, 200rpm 교반을 계속하면서 효소활성 감소를 측정하여 평가하였다. 구체적으로는 아실레이즈와 탄소나노튜브를 이용한 효소-담체 복합체인 실시예1 및 유리된 아실레이즈 용액인 비교예1의 초기 활성(initial activity) 대비 상대 활성(relative activity)을 200일 간 대비하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[45]
도 2를 통해 확인 할 수 있듯이, 비교예1은 19일 이내에 효소가 비활성화 되는 반면, 실시예1은 200일 경과 시점에서 20%의 상대 활성을 유지하였다. 구체적으로는 실시예1은 초기 40일 동안 상대활성이 23% 수준으로 저하된 이 후, 200일 경과 시까지 상대 활성을 22% 수준으로 안정적으로 유지하였다.
[46]
[47]
<실험예2>
[48]
실시예1과 비교예2에 따른 효소-담체 복합체에 대한 효소활성 및 안정성을 실험예1과 동일하게 수행하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[49]
도 3을 통해서 확인할 수 있듯이, 실시예1은 200일 경과 시점에서 20%의 상대 활성을 유지하는 반면에, 비교예2는 고정화 후 효소의 활성이 없는 것으로 측정되었다.
[50]
[51]
<비교예3> - 탄소나노튜브 용액 (CNTs)
[52]
인산 완충액 (100 mM pH 7.0)에 탄소나노튜브 (8mg/mL)를 추가한 용액을 준비하였다.
[53]
[54]
<실험예3>
[55]
물이 포함된 용기에 실시예1에 따른 효소-담체 복합체 및 비교예3에 따른 탄소나노튜브를 각각 투입한 후 1시간 200 rpm으로 교반한 뒤에, 테이블 위에 각각의 용기를 1분 간 방치 한 뒤 사진을 촬영하여 각각 도 4와 도 5에 나타내었다.
[56]
도 4를 통해 확인할 수 있듯이 아실레이즈가 탄소나노튜브 표면에 흡착된 실시예1의 효소-담체 복합체는 물에 균일하게 분산된 것을 확인할 수 있고, 효소-담체 복합체가 응집되지 않은 것을 알 수 있다.
[57]
반면에 도 5와 같이 탄소나노튜브만 물에 분산시킨 경우 대부분이 바닥에 가라앉았고, 가라앉지 않은 경우에도 탄소나노튜브 간 응집된 알갱이 상태로 존재하는 것을 확인할 수 있다.

청구범위

[청구항 1]
소수성 담체; 및 상기 소수성 담체 표면에 흡착된 효소;를 포함하는 효소-담체 복합체.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 효소는 아실레이즈, 트립신, 키모트립신, 펩신, 라이페이즈, 글루코즈 옥시데이즈, 피라노스 옥시데이즈, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈, 티록시네이즈, 카보닉 앤하이드레이즈, 포름알데히드 디하이드로게네이즈, 포름산 디하이드로게네이즈, 알코올 디하이드로게네이즈, 콜레스테롤 디하이드로게네이즈, 락토네이즈, 프로테이즈, 퍼옥시데이즈, 아미노펩티데이즈, 포스파테이즈, 트렌스아미네이즈, 세린-엔도펩티데이즈, 시스테인-엔도펩티데이즈 및 메탈로엔도펩티데이즈로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 3]
제1항에 있어서, 상기 소수성 담체는 탄소나노튜브, 풀러렌, 그래핀, 다공성 탄소, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리스티렌, 폴리디메틸실록세인 및 폴리에틸렌 테레프탈레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 재질을 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 소수성 담체는 상기 효소와의 소수성 상호작용을 유도하기 위하여 표면에 제1작용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 5]
제4항에 있어서, 상기 효소는 상기 제1작용기와 소수성 상호작용을 유도하기 위한 제2작용기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 6]
제4항 또는 제5항에 있어서, 소수성 상호작용을 유도하기 위한 작용기는 할로겐화알킬기, 유기규소기, 알킬기, 비닐기, 알릴기 및 아릴기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 7]
제1항에 있어서, 상기 효소-담체 복합체는 아실레이즈-탄소나노튜브 복합체, 트립신-탄소나노튜브 복합체, 라이페이즈-탄소나노튜브 복합체, 글루코즈 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 피라노스 옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 홀스레디쉬 퍼옥시데이즈-탄소나노튜브 복합체, 티록시네이즈-탄소나노튜브 복합체, 카보닉 앤하이드레이즈-탄소나노튜브 복합체 및 포름알데히드 디하이드로게네이즈-탄소나노튜브 복합체로 이루어진 군에서 선택된 어느 1종인 것을 특징으로 하는 효소-담체 복합체.
[청구항 8]
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 바이오 연료전지용 전극.
[청구항 9]
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 바이오센서용 전극.
[청구항 10]
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 이산화탄소 전환 시스템.
[청구항 11]
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 효소-담체 복합체를 포함하는 안티파울링(antifouling) 시스템.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]