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1. WO2019109980 - PROTÉINE CHIMÈRE, ET CELLULE EFFECTRICE IMMUNITAIRE L'EXPRIMANT ET APPLICATION ASSOCIÉE

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32  

附图

1 (R26)   2A (R26)   2B (R26)   2C (R26)   3 (R26)   4A (R26)   4B (R26)   5 (R26)   6 (R26)   7 (R26)   8 (R26)  

说明书

发明名称 : 嵌合蛋白、表达嵌合蛋白的免疫效应细胞及其应用

技术领域

[0001]
本发明属于过继性细胞治疗领域;具体地说,本发明涉及一种嵌合蛋白及基因工程化的免疫效应细胞,该免疫细胞可以显著增强免疫细胞增殖和存活能力,且能够增强其细胞杀伤能力。

背景技术

[0002]
近年来,过继性细胞治疗如CAR-T治疗、TCR-T治疗等在血液瘤领域展现了良好的效果,然而对于实体瘤的治疗却乏善可陈,这是因为实体瘤中的癌细胞能够在其周围形成肿瘤微环境以支持癌细胞的生长和转移。肿瘤微环境中大量表达的免疫抑制性细胞因子如IL-4、IL-10、TGF-β等,抑制了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。并且,TGF-β的存在,还会诱导T细胞分化为调节性T细胞(Treg),调节性T细胞会进一步抑制T细胞杀伤作用。
[0003]
有研究人员尝试采用抑制TGF-β的信号,以阻断了TGF-β对T细胞的抑制。如Foster等人(“Antitumor Activity of EBV-specific T Lymphocytes Transduced With a Dominant Negative TGF-βReceptor”,J Immunother,2008)报道了转染表达dominant negative的TGF-β受体,以阻断TGF-β信号的转导,但该方法仅仅是阻断了TGF-β对T细胞的抑制。Wang等人(“Augmented anti-tumor activity of NK-92 cells expressing chimeric receptors of TGF-βR II and NKG2D”,Cancer Immunol Immunother,2017)报道了TGF-β受体II胞外区与NKG2D胞内区的嵌合,该嵌合受体可增强NK-92细胞分泌IFNγ和对靶细胞的杀伤,但其疗效增强不显著。
[0004]
现有技术中缺乏能够有效促进免疫细胞增殖和存活的免疫效应细胞,是本领域长期以来一直研究的课题。
[0005]
发明内容
[0006]
本发明的目的在于显著增强免疫细胞增殖和存活能力,且能够增强其细胞杀伤能力,本发明的目的通过一种特定的嵌合蛋白及基因工程化的免疫效应细胞得以实现。
[0007]
在第一方面,本发明提供一种表达嵌合蛋白的免疫效应细胞,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体的胞外域以及IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域。
[0008]
在具体的实施方式中,所述的免疫效应细胞还表达能够识别靶抗原的嵌合受体;优选地,所述嵌合受体为嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、或T细胞抗原耦合器(TAC);更优选地,所述嵌合受体为嵌合抗原受体(CAR)。
[0009]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域包含TGF-β受体I的胞外域和/或TGF-β受体II的胞外域;优选TGF-β受体II的胞外域。
[0010]
在具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域选自IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-15受体、IL-21受体中任一受体的胞内信号域或至少两种的组 合;
[0011]
优选地,选自IL-2受体、IL-7受体、和IL-21受体中任一受体的胞内信号域;
[0012]
更优选地,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域为IL-7受体的胞内信号域或IL-21受体的胞内信号域。
[0013]
在具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2RG的胞内域。
[0014]
在具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2Rβ、IL-7R或IL-21R的胞内域。
[0015]
在具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2RG的胞内域,以及IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R的胞内域。
[0016]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白包含TGF-β受体II的胞外域及任一项IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域;
[0017]
优选地,所述IL-2家族蛋白的受体的α亚基选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R;更优选为IL-7R或IL-21R。
[0018]
在具体的实施方式中,所述胞外域和所述胞内信号域之间具有跨膜域;优选地,所述的跨膜域为IL-2家族蛋白的受体的跨膜域。
[0019]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白包含第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白,
[0020]
所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域;和
[0021]
所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域。
[0022]
在具体的实施方式中,所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域;
[0023]
所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域及IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[0024]
在具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R的胞内信号域。
[0025]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域和所述的IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域为野生型或突变型。
[0026]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体I的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0027]
所述的TGF-β受体II的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0028]
所述的IL-2RG的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0029]
在具体的实施方式中,所述的IL-2Rβ的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0030]
所述的IL-7R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0031]
所述的IL-21R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0032]
在具体的实施方式中,所述的第一嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;所述的第二嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:28、29、或30任一项所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0033]
在具体的实施方式中,所述的免疫效应细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞中的任意一种,或其组合;优选地,所述的免疫效应细胞选自T细胞。
[0034]
在具体的实施方式中,所述的靶抗原为肿瘤抗原或病原微生物抗原。
[0035]
在优选的实施方式中,所述的靶抗原为病原微生物抗原,所述病原微生物包括病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫;更佳地,所述病原微生物为病毒;或者更佳地,所述病原体微生物选自巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒及流感病毒;
[0036]
在优选的实施方式中,所述的靶抗原为肿瘤抗原,优选的,所述的肿瘤抗原包括:
[0037]
前列腺特异性膜抗原(PSMA)、癌胚抗原(CEA)、IL13Ralpha、HER-2、CD19、NY-ESO-1、HIV-1Gag、Lewis Y、MART-1、gp100、酪氨酸酶、WT-I、hTERT、间皮素、EGFR、EGFRvIII、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、EphA2、HER3、EpCAM、MUC1、MUC16、CLDN18.2、叶酸受体、CLDN6、CD30、CD138、ASGPR1、CDH16、GD2、5T4、8H9、αvβ6整合素、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD20、CD22、κ轻链(kappa light chain)、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD171、CSPG4、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、FAP、FAR、FBP、胚胎型AchR、GD2、GD3、HLA-AI MAGE A1、MAGE3、HLA-A2、IL11Ra、KDR、Lambda、MCSP、NCAM、NKG2D配体、PRAME、PSCA、PSC1、ROR1、Sp17、SURVIVIN、TAG72、TEM1、TEM8、VEGRR2、HMW-MAA、VEGF受体、纤连蛋白、腱生蛋白或肿瘤坏死区的癌胚变体;更优选的,所述的肿瘤抗原为磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
[0038]
在具体的实施方式中,所述的靶抗原为实体瘤的抗原。
[0039]
在具体的实施方式中,所述的嵌合抗原受体的胞外抗原识别域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31-35任一所示的序列具有至少90%的同源性。
[0040]
在第二方面,本发明提供一种药物组合物,所述药物组合物包含第一方面所述的免疫效应细胞。
[0041]
在第三方面,本发明提供第一方面所述的免疫效应细胞或者第二方面所述的药物组合物在制备预防或治疗肿瘤或病原微生物感染的药物中的用途。
[0042]
在第四方面,本发明提供一种嵌合蛋白,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体的胞外域和IL-2 家族蛋白的受体的胞内信号域。
[0043]
在优选的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域包含TGF-β受体I的胞外域和/或TGF-β受体II的胞外域,优选TGF-β受体II的胞外域;
[0044]
在优选的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域选自IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-15受体、IL-21受体中的任一受体的胞内信号域或至少两种的组合;优选地,选自IL-2受体、IL-7受体、和IL-21受体中的任一受体的胞内信号域;更优选地,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域为IL-7受体的胞内信号域或IL-21受体的胞内信号域。
[0045]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白包含TGF-β受体II的胞外域及任一项IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[0046]
在优选的实施方式中,所述IL-2家族蛋白的受体的α亚基选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R;优选地,为IL-7R或IL-21R。
[0047]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域。
[0048]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域和所述的IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域为野生型或突变型。
[0049]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体I的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0050]
所述的TGF-β受体II的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0051]
在具体的实施方式中,所述的IL-2RG的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0052]
在具体的实施方式中,所述的IL-2Rβ的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0053]
所述的IL-7R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0054]
所述的IL-21R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[0055]
在具体的实施方式中,所述胞外域和所述胞内信号域之间具有跨膜域;
[0056]
优选的,所述的跨膜域为IL-2家族蛋白的受体的跨膜域。
[0057]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:27、28、29、或30任一所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;
[0058]
优选地,所述嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、28、29、或30任一所示。
[0059]
在具体的实施方式中,所述嵌合蛋白包含第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白,
[0060]
所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域;和
[0061]
所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域。
[0062]
在优选的实施方式中,所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域;
[0063]
所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域及IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[0064]
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

附图说明

[0065]
图1为嵌合蛋白结构示意图。
[0066]
图2A为表达第一嵌合蛋白和IL-2Rβ的质粒1的质粒图,图2B为表达第一嵌合蛋白和IL-7RA的质粒2的质粒图,图2C为表达第一嵌合蛋白和IL-21R的质粒3的质粒图。
[0067]
图3显示了Western blot检测STAT3/5磷酸化水平变化结果。
[0068]
图4A为CD4+CD25+群体中Foxp3流式结果,图4B是Foxp3+群体比例的柱状图表示。
[0069]
图5显示了chTR7/21细胞在TGF-β刺激下对肿瘤细胞的持续杀伤能力。
[0070]
图6为Huh7-TGFβ制备的流式图。
[0071]
图7显示了当靶细胞是Huh7和SK-hep1-GPC3细胞时的体外杀伤结果。
[0072]
图8显示了当靶细胞是Huh7-TGFβ和SK-hep1-GPC3-TGFβ的体外杀伤结果。

具体实施方式

[0073]
发明人经过广泛而深入的研究,发现将含有TGF-β受体的胞外域和IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域的嵌合蛋白和识别靶抗原的受体共表达在免疫效应细胞上,不仅能够抑制肿瘤微环境中的TGF-β,还能够提高免疫细胞的增殖和存活水平,在此基础上完成了本发明。
[0074]
为了便于理解本文提供的技术方案,下面对方法和/或术语在本文中的定义进行说明。
[0075]
术语
[0076]
术语“免疫效应细胞(也称免疫细胞)”,是指参与免疫应答,例如,促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、DNT细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。例如,T细胞可以是直接来自外周血的T细胞、也可以是T细胞的亚型,如CD8+的T细胞,CD4+的T细胞,α/β的T细胞、γ/δT细胞等。
[0077]
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽,当其在免疫效应细胞中时,给所述的细胞提供针对靶细胞靶抗原(例如肿瘤抗原)的特异性,并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域(也称跨膜区)和细胞质信号传导结构域(本文中 也称为“胞内域”)。
[0078]
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分,用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
[0079]
术语“T细胞受体(T cell receptor,TCR)”,为所有T细胞表面的特征性标志,以非共价键与CD3结合,形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体,由α、β两条肽链组成,每条肽链又可分为可变区(V区),恒定区(C区),跨膜区和胞质区等几部分;其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族,其抗原特异性存在于V区;V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3,其中以CDR3变异最大,直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时,CDR1,CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁,而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类:TCR1和TCR2;TCR1由γ和δ两条链组成,TCR2由α和β两条链组成。
[0080]
术语“T细胞融合蛋白(T Cell Fusion Protein,TFP)”,包括构成TCR的各种多肽衍生的重组多肽,其能够i)结合到靶细胞上的表面抗原,和ii)与完整的TCR复合物的其他多肽相互作用,通常同定位在T细胞表面。TFP由一个TCR亚基与人或人源化抗体结构域组成的一个抗原结合结构域组成,其中,TCR亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜结构域、TCR胞内结构域的胞内信号结构域的刺激结构域;该TCR亚基和该抗体结构域有效链接,其中,TCR亚基的胞外、跨膜、胞内信号结构域来源于CD3ε或CD3γ,并且,该TFP整合进T细胞上表达的TCR。
[0081]
所述的“有效链接”指的是一个调控序列和异源核酸序列之间的功能联系,其能导致异源核酸序列的表达。例如,当第一核酸序列位于第二核酸序列功能调控区时,第一核酸序列可操作地与第二核酸序列连接。例如,如果需要启动子影响编码序列的转录和表达,那么这个启动子可有效地与该编码序列连接。
[0082]
术语“T细胞抗原耦合器(T Cell Antigen Coupler,TAC)”,包括三个功能结构域:1肿瘤靶向结构域,包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein,DARPin)或其他靶向基团;2胞外区结构域,是与CD3结合的单链抗体,从而使得TAC受体与TCR受体靠近;3跨膜区和CD4共受体的胞内区,其中,胞内区连接蛋白激酶LCK,催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。
[0083]
术语“肿瘤”是指所有赘生细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,以及所有癌前和癌性细胞和组织。
[0084]
术语“肿瘤微环境”是指肿瘤环境的任何和所有元素,包括为恶性过程产生结构和/或功能环境以存活和/或扩张和/或扩散的元素。
[0085]
术语“TGF-β”和“TGFb”在本文中具有相同含义,术语“TGF-β受体的胞外域”包括天然的TGF-β受体的胞外域以及突变型TGF-β受体的胞外域。本文使用的“天然的”或“野生型”TGF-β受体的胞外域的序列主要是指人的TGF-β受体的胞外域序列,不管是从天然来源纯化还是使用重组技术制得。
[0086]
应当理解的是,根据本公开内容的TGF-β受体的胞外域包括可以比天然的TGF-β受体的胞外域蛋白短或长的片段,只要TGF-β受体的胞外域蛋白片段保持结合TGF-β的能力。还应当理解的是,本公开内容涵盖编码本文所述的或者本领域已知的TGF-β受体的核酸分子,包括但不限于与本文所述的DNA序列对应的RNA序列。
[0087]
TGF-β的信号转导模式是由TGF-β受体II(在本文中也称TGFbRII)结合TGF-β,进而招募TGF-β受体I(在本文中也称TGFbRI)结合,启动胞内区对Smad2/3的募集和磷酸化。
[0088]
术语“IL-2家族蛋白”包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等,所述的“IL-2家族蛋白的受体”为含有γ链(IL-2RG,在本文中也称IL2RG,其序列如SEQ ID NO:43所示)作为其受体亚基的细胞因子,由各自特异的Rα(如IL-2和IL-15还共用IL-2Rβ(在本文中也称IL2RB)、IL-7R(在本文中也称IL7R)、IL-21R(在本文中也称IL21R)等)以及共用的γ链亚基(IL-2RG)组成,Rα识别胞外细胞因子,募集IL-2RG结合并启动胞内对STAT1/3/4/5等的磷酸化。
[0089]
术语“抗原”或“Ag”指可以激起免疫反应的分子。免疫反应可以涉及抗体的产生、或特定的免疫活性细胞的激活、或两者。本领域技术人员明了,任何大分子,包括基本上所有的蛋白或肽,均可以充当抗原。此外,抗原可以源自重组DNA或基因组DNA。本领域技术人员明了,包含编码可以引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA,因此编码“抗原”(正如该术语在本文所用的)。此外,本领域技术人员明了,抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易明了的,本发明包括,但不限于,使用一个以上基因的部分核苷酸序列,这些核苷酸序列可以以各种组合方式排列以编码可以引起期望免疫反应的多肽。此外,本领域技术人员明了,抗原无需由“基因”编码。容易明了的,抗原可以合成产生、或可以源自生物样品、或可以是除多肽之外的大分子。所述生物样品可以包括,但不限于,组织样品、肿瘤样品、细胞或液体以及其它生物学成分。
[0090]
术语“表达”指启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
[0091]
术语“慢病毒”指慢病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的,能够感染非分裂细胞;它们能将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中,由此它们是最为有效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
[0092]
术语“同源性”或“相似性”指两个聚合物分子之间,例如两个核酸分子之间、例如两个DNA分子或两个RNA分子之间、或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当一个亚单位位置在两个分子中被相同单体亚单位占据时,例如当两个DNA分子在一个位置上都被腺苷占据时,则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性是匹配的或同源的位置数的直接函数;例如,当两个序列中半数位置(例如在长10个亚单位的聚合物中5个位置)是同源的,则这两个序列50%同源;如果90%的位置(例如,10个中9个)是匹配的或同源的,则这两个序列90%同源。
[0093]
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指,将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染了、转化了或转导了外源核酸的细胞。该细胞包括原代受试细胞和其后代。
[0094]
本发明的嵌合蛋白
[0095]
本发明提供这样一种嵌合蛋白,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体的胞外域和IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域。将这种嵌合蛋白和识别靶抗原的受体共表达在免疫效应细胞上可以抑制肿瘤微环境中的TGF-β并提高免疫细胞的增殖和存活水平。
[0096]
在具体的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域是TGF-β受体I的胞外域和/或TGF-β受体II的胞外域。在另一具体的实施方式中,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域选自IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-15受体、IL-21受体中的任一受体的胞内信号域或至少两种的组合;优选地,选自IL-2受体、IL-7受体、和IL-21受体中的任一受体的胞内信号域;更优选地,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域为IL-7受体的胞内信号域或IL-21受体的胞内信号域。
[0097]
在进一步优选的实施方式中,所述的TGF-β受体的胞外域优选TGF-β受体II的胞外域,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域是IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。在具体的实施方式中,所述IL-2家族蛋白的受体的α亚基选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R;优选IL-7R或IL-21R。
[0098]
本领域技术人员知晓,与上述的胞外域或胞内域具有一定氨基酸序列相同性或同源性的多肽也可以具备相同或相似的功能。因此,在一些实施方式中,所述的TGF-β受体I的胞外域、所述的TGF-β受体II的胞外域、所述的IL-2RG的胞内域、所述的IL-2Rβ的胞内域、所述的IL-7R的胞内域、所述的IL-21R的胞内域的氨基酸序列分别与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性;而本发明的嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:27、28、29、或30任一所示的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
[0099]
本发明的嵌合蛋白在所述胞外域和所述胞内信号域之间还具有跨膜域。所述“跨膜域”可包括多种天然受体蛋白的跨膜结构域,只要起到连接受体胞外、胞内区并锚定于细胞膜上的作用即可,因此,本发明的嵌合蛋白中的跨膜域不局限于任何特定的跨膜域,包括但不限于TGF-β受体、IL-2家族蛋白的受体的跨膜区;优选地,所述的跨膜域为IL-2家族蛋白的受体的跨膜域。
[0100]
进一步地,本发明人发现当本发明的嵌合蛋白包含第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白时,可以具备更加优异的技术效果。在具体的实施方式中,所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域;所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域。例如,所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域;所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域及IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[0101]
嵌合抗原受体
[0102]
“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)”指一种融合到细胞内信号转导域的肿瘤抗原结合结构域,能激活T细胞。常见地,CAR的胞外结合结构域来源于小鼠或人源化或人的单克隆抗体。
[0103]
嵌合抗原受体通常包含(细)胞外抗原结合区。在一些实施方案中,胞外抗原结合区可以是完全人的。在其他情况下,胞外抗原结合区域可以被人源化。在其他情况下,胞外抗原结合区可以是鼠源的,或者所述胞外抗原结合区中的嵌合体由来自至少两种不同动物的氨基酸序列组成。在一些实施方案中,所述胞外抗原结合区可以是非人的。
[0104]
在一些情况下,细胞外抗原结合区域包括铰链或间隔区。术语铰链和间隔区可以互换使用。铰链可以被认为是用于向细胞外抗原结合区提供柔性的CAR的一部分。在一些情况下,铰链可用于检测细胞的细胞表面上的CAR,特别是当检测细胞外抗原结合区的抗体不起作用或可用时。例如,衍生自免疫球蛋白的铰链的长度可能需要优化,这取决于细胞外抗原结合区域靶向靶上的表位的位置。
[0105]
CAR的跨膜域可以将CAR锚定在细胞的质膜上,如CD8的跨膜域、CD28的跨膜域等均可使用。技术人员可以根据已知的跨膜域进行替换。
[0106]
CAR的胞内信号域可以负责活化CAR已经置于其中的免疫应答细胞的效应子功能中的至少一种。CAR可以诱导T细胞的效应子功能,例如,所述效应子功能是细胞溶解活性或辅助活性,包括细胞因子的分泌。因此,术语“细胞内信号域”是指转导效应子功能信号并引导细胞进行特异功能的蛋白质部分。虽然通常可以使用整个细胞内信号传导区域,但是在许多情况下,不必使用信号结构域的整个链。在一些情况下,使用细胞内信号传导区的截短部分。在一些情况下,术语“细胞内信号域”包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导区的任何截短部分。
[0107]
CAR的细胞内信号传导结构域可以选自表1的任何一个结构域。CAR的细胞内信号传导区可以进一步包含一个或多个共刺激结构域。细胞内信号传导区可以包含单个共刺激结构域,例如ζ链(第一代CAR)或其与CD28或4-1BB(第二代CAR)。在其他实例中,细胞内信号传导区可以包含两个共刺激结构域,例如CD28/OX40或CD28/4-1BB(第三代)。在某些情况下,通过CAR产生的信号可能与辅助或共刺激信号相结合。对于共刺激信号结构域,嵌合抗原受体样复合物可被设计成包含若干可能的共刺激信号结构域。已经报道对T细胞活化提供共刺激的几种受体,包括但不限于CD28、OX40、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BBL、MyD88和4-1BB。这些共刺激分子使用的信号传导途径均能与主T细胞受体激活信号协同作用。这些共刺激信号传导区域提供的信号可以与源自一个或多个ITAM基序(例如CD3zeta信号转导域)的主效应激活信号协同作用,并且可以完成T细胞激活的要求。
[0108]
表1.共刺激结构域
[0109]
[0110]
[0111]
分析
[0112]
可以使用本领域已知的或者本文描述的标准方法对嵌合蛋白或者表达嵌合蛋白的免疫效应细胞进行分析。
[0113]
应用
[0114]
包含如本文所述的嵌合蛋白及识别靶抗原的受体的免疫效应细胞可以被用于各种治疗用途。一般来说,本文所述的免疫效应细胞可以被用于涉及表达TGF-β的细胞以及将受益于对细胞增殖的抑制或者细胞死亡的促进的任意疾病、紊乱或者病症的治疗或者预防。在一些实施方式中,可以被用来诱导凋亡或者细胞死亡、或者用来治疗与异常凋亡或者细胞增殖相关联的紊乱例如癌症。
[0115]
本文使用的术语“癌症”、“癌”、“过度增生”或者“肿瘤”是指具有自动生长的能力的细胞(例如,以正在增殖的细胞生长激增为特征的异常状态或者情况)。过度增生性或者赘生性疾病状态可以被分类为病理性类型(例如,因为偏离正常状态但是与疾病状态不相关)。因此,“癌症”或者“肿瘤”是指细胞的没有生理学功能的任何不需要的生长。术语癌症包括从技术上来说是良性的但是可能存在变成恶性的风险的细胞生长。“恶性”是指任何细胞类型或者组织的异常生长。术语“恶性”包括从技术上来说是良性的但是存在变成恶性的风险的细胞生长。该术语还包括任何癌症、癌、赘生物、肿瘤形成或者肿瘤。因此,这些术语是指包括所有类型的癌生长或者肿瘤发生过程、转移性组织或者恶性转化细胞、组织或者器官,不管是组织病理学类型或者侵袭阶段。
[0116]
大多数癌症分为三个大的组织学类别:癌,其是占多数的癌症以及表皮细胞或者覆盖在器官、腺体、或者其他身体结构(例如,皮肤、子宫、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃、肠) 的外部或者内部表面上的细胞的癌症,并且往往会发生转移;肉瘤,其衍生于结缔组织或者支撑组织(例如,骨、软骨、肌腱、韧带、脂肪,肌肉);和血液肿瘤,其衍生自骨髓和淋巴组织。癌症的示例包括但不限于:癌、肉瘤和血液肿瘤形成紊乱例如白血病。
[0117]
癌可以是腺癌(其一般在能够分泌的器官或腺体中,如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱),或者可以是鳞状细胞癌(其衍生自鳞状上皮并且一般在身体的大部分区域形成)。
[0118]
肉瘤可以是骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌(骨骼肌),间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜质内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤血管)、脂肪肉瘤(脂肪)、神经胶质瘤或星形细胞瘤(见于大脑的神经源性结缔组织)、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)或间叶细胞肿瘤或中胚叶混合瘤(混合结缔组织类型)。
[0119]
造血肿瘤形成性紊乱包括涉及造血起源的增生性/赘生性细胞,例如源自于髓系、淋巴系或红细胞系或其前体细胞。优选的是,所述疾病源自于分化不良的急性白血病(例如,成红细胞性白血病和急性成巨核细胞性白血病)。另外的例示性髓性紊乱包括但不是限于急性前髓细胞性白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML);淋巴恶性疾病包括但不是限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL),其包括B系急性成淋巴细胞性白血病和T系急性成淋巴细胞性白血病,慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)。
[0120]
其他形式的恶性淋巴瘤包括但不是限于非霍奇金淋巴瘤及其变体,外周T细胞淋巴瘤,成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯疾病。
[0121]
还可以根据癌症所源自的器官即“原发位点”而对这些癌症进行命名,例如乳腺、大脑、肺、肝、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、子宫颈、子宫等。即使癌症转移到身体的另外部分即不同于原发位点也坚持这种命名。根据原发位点进行命名的癌症可以与组织学分类相关联。例如,肺癌一般是小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其可能是鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌;皮肤癌通常是基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑色素瘤。淋巴瘤可能出现在与头部、颈部和胸部相关联的淋巴结中以及腹部淋巴结或腋窝淋巴结或腹股沟淋巴结中。
[0122]
“实体瘤”指除淋巴癌之外的肿瘤和/或转移灶(无论在何处),例如脑或其它中枢神经系统肿瘤(如脑膜瘤、脑瘤、脊髓瘤、颅神经瘤和中枢神经系统其它部分的肿瘤,如恶性胶质瘤或髓胚细胞瘤);头和/或颈部癌;乳房肿瘤;循环系统肿瘤(例如心脏、纵隔和胸膜、以及胸廓内其它器官的肿瘤、血管瘤和与血管组织有关的肿瘤);排泄系统肿瘤(例如肾、肾盂、输尿管、膀胱、其它和未特别指出的泌尿器官);胃肠道肿瘤(例如食道、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠结合点、直肠、肛门、肛管),涉及肝及肝内输胆管、胆囊、胆道的其它和未特别指出部分、胰腺及其它消化器官的肿瘤;头和颈;口腔(嘴唇、舌头、牙龈、口腔底部、腭和口腔的其它部分、腮腺和唾液腺其它部分、扁桃体、口咽、鼻咽、梨形窦、咽下部和嘴唇、口腔及咽的其它部位);生殖系统肿瘤(例如外阴、阴道、子宫颈、子宫体、子宫、卵巢和女性生殖器官的其它部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸和男性生殖器官的其它部位);呼吸道肿瘤(例如鼻腔和中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺,例如小细胞肺癌或 非小细胞肺癌);骨骼系统肿瘤(例如四肢的骨和关节软骨、骨关节软骨和其它部位);皮肤肿瘤(例如皮肤恶性黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、间皮瘤、Kaposi’s肉瘤);和涉及其它组织、包括外周神经和植物神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼及附件、甲状腺、肾上腺和其它内分泌腺及有关结构的肿瘤、继发性和未特别指出的恶性淋巴结瘤、呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤和其它部位的继发性恶性肿瘤。
[0123]
在以上和以下提到肿瘤、肿瘤疾病、癌或恶性肿瘤时,还单独或同时暗指原发器官或组织和/或其它任一部位的转移瘤,不管肿瘤和/或转移瘤是在何处。
[0124]
药物组合物
[0125]
根据本公开内容的药物组合物可以包含本申请提供的免疫效应细胞和一种或多种非毒性的药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂。这些组合物可以适合在本文所述的治疗性适应症的治疗中使用。
[0126]
如果需要,可以将其它活性成分包含在所述组合物中。因此,在一些实施方式中,所述的免疫效应细胞可以以治疗有效量治疗一种或多种癌症或与其他疗法联合施用。可以在使用抗肿瘤或者其他疗法进行治疗之前、期间或之后施用所述免疫效应细胞。“抗癌治疗”是预防或者延迟癌症细胞的生长和/或转移的化合物,组合物或处置(例如,手术)。这种抗癌治疗包括但并不仅限于手术(例如,切除所有或部分肿瘤)、化疗药物治疗、辐射、基因疗法、激素控制、免疫疗法(例如,治疗性抗体和癌症疫苗)和反义或RNAi寡核苷酸治疗。有用的化疗药物的例子包括但不是限于:羟基脲、白消安(busulphan)、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、马法兰、环磷酰胺、异环磷酰胺,道诺霉素(danorubicin)、阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、胞嘧啶、阿糖胞苷、博莱霉素、新制癌菌素(neocarcinostatin)、苏拉明、泰素、丝裂霉素C、阿伐斯汀、氟尿嘧啶、替莫唑胺(temozolamide)等。所述的免疫效应细胞还适合通过采用两种或更多种的化疗药物的标准组合疗法使用。应当理解的是,抗癌治疗包括未来开发的新化合物或治疗方法。
[0127]
还可以与辐射敏化剂如放射性治疗敏化剂结合使用所述免疫效应细胞。一般而言,敏化剂是能够增加所述免疫效应细胞的活性的任何试剂。例如,敏化剂将增加融合蛋白抑制癌细胞生长或杀死癌细胞的能力。例示性的敏化剂包括抗IL-10的抗体、骨形态发生蛋白和HDAC抑制剂(参见例如Sakariassen et al.,Neoplasia 9(11):882-92,2007)。
[0128]
所述免疫效应细胞可能用作新辅助治疗(到初级治疗)的一部分、作为辅助治疗方案的一部分,其中目的是为了治愈受试者中的癌症。所述免疫效应细胞也可以在肿瘤发生和发展的不同阶段施用,包括在晚期和/或侵袭性赘生物(例如受试者中通过局部治疗形式(例如手术或者放射性治疗不能治愈的显性疾病)、转移性疾病。局部晚期疾病和/或难治性肿瘤(例如,对治疗不反应的癌症或肿瘤)的治疗中的各个阶段施用。“初级疗法”是指受试者中癌症的初次诊断后的一线治疗。例示性的初级疗法可能涉及手术、大范围的化学治疗和放射性治疗。“辅 助治疗”是指这样的一种疗法,其跟随一种初级疗法之后以及在存在复发风险时施用于受试者。辅助系统性治疗在初级疗法之后很快开始,例如在最后一次的初级疗法治疗之后2、3、4、5、或6周开始以延迟复发,延长存活时间或治愈所述受试者。如此处讨论的那样,考虑到了所述免疫效应细胞可以单独使用或作为辅助疗法的一部分与一种或多种其他化疗药物结合使用。所述免疫效应细胞与标准化疗试剂的组合可以起到提高化疗疗效的作用,因此,可以用来改善标准癌症疗法。
[0129]
“受试者”可以是需要治疗的哺乳动物,如人类或兽医学患者(例如,啮齿类动物,如小鼠或者大鼠、猫、狗、奶牛、马、绵羊、山羊,或其他牲畜)。在一些实施方式中,“受试者”可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物等等。所述受试者可能被怀疑患有以细胞增殖为特征的疾病或者具有患上以细胞增殖为特征的疾病、被诊断为患有以细胞增殖为特征的疾病、或者是被证实不患有以细胞增殖为特征的疾病的对照受试者,如本文所述,用于以细胞增殖为特征的疾病的诊断方法和这种诊断的临床划分对于本领域技术人员是已知的。
[0130]
所述组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂或粉末,并且可以和药学上可接受的载体配制。所述组合物可以使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯配制成栓剂。“药学上可接受的载体”是指不会干扰活性成分的生物活性的有效性并且不对所述宿主或者受试者产生毒性的载体基质或者媒介物(vehicle)。
[0131]
所述的免疫效应细胞可以和药学上可接受的媒介物一起输送。在一个实施例中,媒介物可以增强稳定性和/或输送性质。媒介物如人造膜囊泡(包括脂质体、非离子表面活性剂泡囊(noisome)、纳米微脂囊等)、微粒或者微胶囊、或者包含药学可接受的聚合物的胶体制剂。
[0132]
包含一种或者多种免疫效应细胞的药物组合物可以根据本领域已知的方法并且使用适当的一种或者多种分散试剂或润湿试剂和/或悬浮试剂配制成无菌可注射水性或者油质悬浮液。所述无菌可注射制剂可以是在非毒性的亲本可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液。
[0133]
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社,2002)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0134]
实施例1.表达嵌合蛋白的载体的构建
[0135]
按照如下步骤操作,构建包含图1所示结构的表达嵌合蛋白的质粒。
[0136]
(1)将人TGF-β受体I信号肽(SEQ ID NO:2)、TGF-β受体I的胞外域(SEQ ID NO:4)与人IL-2RG跨膜区(SEQ ID NO:6)、IL-2RG胞内域(SEQ ID NO:8)的编码核苷酸序列连接,构建第一嵌合蛋白chIL2RG的核苷酸序列(SEQ ID NO:37,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)。
[0137]
(2)将人TGF-β受体II信号肽(SEQ ID NO:10)、TGF-β受体II胞外域(SEQ ID NO:12)与人IL-2Rβ跨膜区(SEQ ID NO:14)、IL-2Rβ胞内区(SEQ ID NO:16)的编码核苷酸序列连接,构建第二嵌合蛋白TGFβRII-IL2Rβ的核苷酸序列(SEQ ID NO:38,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)。
[0138]
(3)将人TGF-β受体II信号肽(SEQ ID NO:10)、TGF-β受体II胞外域(SEQ ID NO:12)与人IL-7RA跨膜区(SEQ ID NO:18)、IL-7RA胞内区(SEQ ID NO:20)的编码序列连接,构建第二嵌合蛋白TGFβRII-IL7RA的核苷酸序列(SEQ ID NO:39,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示)。
[0139]
(4)将人TGF-β受体II信号肽(SEQ ID NO:10)、TGF-β受体II胞外域(SEQ ID NO:12)与人IL-21R跨膜区(SEQ ID NO:22)、IL-21R胞内域(SEQ ID NO:24)的编码序列连接,构建第二嵌合蛋白TGFβRII-IL21R的核苷酸序列(SEQ ID NO:40,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示)。
[0140]
(5)将上述第一嵌合蛋白chIL2RG(SEQ ID NO:27)分别与上述第二嵌合蛋白TGFβRII-IL2Rβ(SEQ ID NO:28)、第二嵌合蛋白TGFβRII-IL7RA(SEQ ID NO:29)、第二嵌合蛋白TGFβRII-IL21R(SEQ ID NO:30)以自剪切肽F2A(SEQ ID NO:26)的编码序列连接,插入pWPT慢病毒表达载体(购自Addgene)。分别得到表达第一嵌合蛋白和IL-2RB的质粒1(质粒图如图2A所示)、表达第一嵌合蛋白和IL-7RA的质粒2(质粒图如图2B所示)、表达第一嵌合蛋白和IL-21R的质粒3(质粒图如图2C所示)。
[0141]
实施例2.T细胞磷酸化水平测定
[0142]
以构建好的慢病毒质粒1、慢病毒质粒2、慢病毒质粒3分别同慢病毒包装质粒共转染HEK-293T细胞,制备相应的慢病毒,以下分别记为慢病毒1、慢病毒2、慢病毒3。
[0143]
取人PBMC培养于AIM-V培养基,添加2%人AB型血清,500U/mL重组人IL-2,并加入CD3/CD28抗体结合磁珠活化48h,得到活化后的T细胞。T细胞经活化后,分别感染慢病毒1、慢病毒2、慢病毒3,得到表达嵌合蛋白的T细胞chTR2、chTR7、chTR21。
[0144]
去血清静息24h,以空白T细胞UTD(未感染的T细胞,Untransfected)为空白对照,采用UTD、chTR2、chTR7、chTR21细胞,分为TGF-β1阳性组(+)和阴性组(-)进行培养,阴性组培养中不采用TGF-β1刺激,阳性组培养中以重组人TGF-β1(5ng/mL)刺激30min。收集细胞提取蛋白进行Western blot检测,分析STAT3/5磷酸化水平变化。
[0145]
Western blot检测结果如图3所示,其中,Y705和Y694分别是STAT3和STAT5上的酪氨酸磷酸化位点,此磷酸化位点的磷酸化水平增强表明STAT3/5被激活。相比于未感染组(UTD),chTR2/7/21的STAT3/5磷酸化水平在TGF-β1刺激下发生显著上调,且符合IL-2、IL-7和IL-21信号的模式,说明该嵌合受体能够将TGF-β1刺激转变为IL-2、IL-7或IL-21的信号。本实验从分子水平证明所提供的三种嵌合受体功能的有效性。
[0146]
实施例3.表达嵌合蛋白的T细胞在重组人TGF-β1的刺激下对Treg分化水平的影响
[0147]
取人PBMC培养于AIM-V培养基,添加2%人AB型血清和500U/mL重组人IL-2,得到相应的细胞培养液。将实施例2所获得的T细胞chTR7、chTR21及空对照T细胞UTD在上述细胞培养液中培养,以重组人TGF-β1(5ng/mL)处理培养4天,收集细胞以抗体标记Treg标志物CD4、CD25、Foxp3,进行流式检测,并将未经重组人TGF-β1处理的试验组作为对照(CTRL)。结果如图4A和4B所示,UTD细胞在TGF-β1的刺激下Foxp3 +占CD4 +CD25 +群体的比例上升,说明TGF-β1诱导了Treg分化,而嵌合受体组细胞的Foxp3 +比例维持在较低水平,说明嵌合受体可抑制TGF-β1诱导的Treg分化。
[0148]
实施例4.TGF-β1刺激下的细胞杀伤能力测定
[0149]
在本实施例中,选择的CAR为靶向GPC3的CAR,具有SEQ ID NO:31所示的scFv,CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示。
[0150]
采用本领域常规的分子生物学方法进行慢病毒的包装,将包含有CAR的基因(SEQ ID NO:44)的质粒感染293T细胞,得到包含靶向GPC3的二代GPC3-28z-CAR的慢病毒。
[0151]
T细胞活化:取人PBMC培养于AIM-V培养基,添加2%人AB型血清和500U/mL重组人IL-2,并加入CD3/CD28抗体结合磁珠活化48h。
[0152]
T细胞经活化,感染慢病毒2和靶向GPC3的二代GPC3-28z-CAR的慢病毒,得到表达chTR7和CAR的T细胞,记为chTR7-CAR;感染慢病毒3和靶向GPC3的二代GPC3-28z-CAR的慢病毒,得到表达chTR21和CAR的T细胞,记为chTR21-CAR,感染靶向GPC3的二代GPC3-28z-CAR(其氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示)的慢病毒,得到只表达CAR的T细胞(GPC3-CAR-T)。
[0153]
将chTR7-CAR、chTR21-CAR及GPC3-CAR-T分为对照组(CTRL)和rTGF-β1组,CTRL组以正常条件培养,rTGF-β1组另加入重组人TGF-β1(5ng/mL)处理培养。4天后,以效靶比1:1与靶细胞Huh7共孵育48h,第一轮靶细胞全杀伤后,收集T细胞继续以效靶比1:1与靶细胞Huh7进行第二轮共孵育48h,PBS冲洗去死细胞,镜下观察靶细胞杀伤情况。结果如图5所示,对照组GPC3-CAR-T在TGF-β1处理下细胞持续杀伤能力明显降低,而chTR7-CAR细胞毒性降低的程度有所减弱,chTR21-CAR则更显著地保留了细胞毒性。上述结果表明:表达嵌合受体的CAR-T细胞在TGF-β1存在的抑制性环境中具有更强的耐受能力,嵌合受体可降低TGF-β1对细胞杀伤能力的影响,能更好保留细胞毒性。
[0154]
实施例5.细胞体外增殖情况比较
[0155]
选择实施例4制备的chTR7-CAR和GPC3-CAR-T分别在不同的情况下进行体外培养:
[0156]
(1)、在AMIV培养基+2%人AB型血清的培养条件下培养chTR7-CAR和GPC3-CAR-T,不外加IL2及不与肿瘤细胞共孵育,结果显示chTR7-CAR与GPC3-CAR-T细胞相比,增殖能力并未有显著差异。
[0157]
(2)、在AIMV培养基+2%人AB型血清的培养条件下,chTR7-CAR和GPC3-CAR-T细胞与过表达TGFβ1的肝癌细胞系(Huh7-TGFβ)按照1:3的比例共培养,在第五天时, chTR7-CAR的数量已增加至初始数量的1.5倍,而GPC3-CAR-T的数量与初始数量基本没有差别。
[0158]
其中,Huh7-TGFβ的制备方法为:将携带有TGFβ1(核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示,氨基酸序列如SEO ID NO:41所示)的慢病毒表达载体质粒pWPT-EGFP-F2A-hTGFb1、Rev包装质粒、RRE包装质粒和VSV-G包膜蛋白质粒与转染试剂聚乙烯亚胺(PEI,Polysciences)混合后转染到HEK-293T细胞中,转染得到重组慢病毒溶液。用浓缩后的病毒感染肝癌细胞系huh7细胞扩增后用流式分选GFP阳性细胞即为Huh7-TGFβ,流式图如图6所示。
[0159]
实施例6.细胞体外杀伤情况比较
[0160]
参照实施例4的操作,以肝癌细胞系Huh7和SK-hep1-GPC3细胞为靶细胞,在效靶比为3:1时,检测不同培养条件下chTR7-CAR和GPC3-CAR-T的体外杀伤情况,采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行,具体方法参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
[0161]
结果显示,在RPMI-1640培养基+10%胎牛血清培养18小时后,杀伤结果如图7所示,GPC3-CAR-T和chTR7对SK-hep1-GPC3和Huh7肝癌细胞的杀伤作用均无显著差异;而在RPMI-1640培养基+10%胎牛血清+TGFβ(10ng/ml)培养18小时后,杀伤结果如图8所示,chTR7对SK-hep1-GPC3和Huh7肝癌细胞的杀伤作用均显著强于GPC3-CAR-T,说明在存在TGFβ的环境中,chTR7-CAR的杀伤能力显著提高。
[0162]
实施例7.体内移植瘤实验
[0163]
使用过表达TGFβ1的肝癌细胞系(PLC/PRF/5-TGFβ1)构建小鼠皮下瘤模型。
[0164]
PLC/PRF/5-TGFβ1的制备方法与实施例5的Huh7-TGFβ的制备方法类似。采用携带有TGFβ1基因的HEK-293T细胞转染PLC/PRF/5细胞系(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心),得到PLC/PRF/5-TGFβ1细胞。
[0165]
当肿瘤体积约450mm 2时给与chTR7-CAR和GPC3-CAR-T,结果显示,对于超大负荷的肿瘤,与GPC3-CAR-T细胞相比,chTR7对肿瘤的生长具有更好的抑制作用,治疗21天后,chTR7组小鼠的肿瘤平均体积较GPC3-CAR-T组小约24%。
[0166]
在本发明的实施例中,示例性的,采用了靶向GPC3的CAR-T细胞,本领域技术人员可以依据本申请的教导,采用靶向其他靶点的CAR-T细胞,如靶向EGFR的CAR-T细胞(示例性的,靶向EGFR的CAR-T细胞的胞外的scFv的序列如SEQ ID NO:32所示),如靶向CLD18A2的CAR-T细胞(示例性的,靶向CLD18A2的CAR-T细胞的胞外的scFv的序列如SEQ ID NO:33所示),如靶向CD19的CAR-T细胞(示例性的,靶向CD19的CAR-T细胞的胞外的scFv的序列如SEQ ID NO:34所示),如靶向BCMA的CAR-T细胞(示例性的,靶向BCMA的CAR-T细胞的胞外的scFv的序列如SEQ ID NO:35所示)。
[0167]
本发明涉及的序列总结如下:
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求书

[权利要求 1]
一种表达嵌合蛋白的免疫效应细胞,其特征在于,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体的胞外域以及IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的免疫效应细胞还表达能够识别靶抗原的嵌合受体;优选地,所述嵌合受体为嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞融合蛋白(TFP)、或T细胞抗原耦合器(TAC);更优选地,所述嵌合受体为嵌合抗原受体(CAR)。
[权利要求 3]
根据权利要求1或2所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的TGF-β受体的胞外域包含TGF-β受体I的胞外域和/或TGF-β受体II的胞外域;优选TGF-β受体II的胞外域。
[权利要求 4]
根据权利要求1或2所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域选自IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-15受体、IL-21受体中任一受体的胞内信号域或至少两种的组合; 优选地,选自IL-2受体、IL-7受体、和IL-21受体中任一受体的胞内信号域; 更优选地,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域为IL-7受体的胞内信号域或IL-21受体的胞内信号域。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2RG的胞内域。
[权利要求 6]
根据权利要求4所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2Rβ、IL-7R或IL-21R的胞内域。
[权利要求 7]
根据权利要求4所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的IL-2家族蛋白的受体胞内信号域包含IL-2RG的胞内域,以及IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R的胞内域。
[权利要求 8]
根据权利要求1-7任一所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述嵌合蛋白包含TGF-β受体II的胞外域及任一项IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域; 优选地,所述IL-2家族蛋白的受体的α亚基选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R;更优选为IL-7R或IL-21R。
[权利要求 9]
根据权利要求1或2所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述胞外域和所述胞内信号域之间具有跨膜域;优选地,所述的跨膜域为IL-2家族蛋白的受体的跨膜域。
[权利要求 10]
根据权利要求1-9任一所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述嵌合蛋白包含第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白, 所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域;和 所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域。
[权利要求 11]
根据权利要求10所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域; 所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域及IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[权利要求 12]
根据权利要求11所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域选自IL-2Rβ、IL-7R、或IL-21R的胞内信号域。
[权利要求 13]
根据权利要求1-12任一所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的TGF-β受体的胞外域和所述的IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域为野生型或突变型。
[权利要求 14]
根据权利要求10-13任一所述的免疫效应细胞,其特征在于, 所述的TGF-β受体I的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的TGF-β受体II的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的IL-2RG的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 15]
根据权利要求12或13所述的免疫效应细胞,其特征在于, 所述的IL-2Rβ的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的IL-7R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的IL-21R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 16]
根据权利要求10-13任一所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的第一嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性;所述的第二嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:28、29、或30任一项所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 17]
根据权利要求1-16任一所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的免疫效应细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、DNT细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞中的任意一种,或其组合;优选地,所述的免疫效应细胞选自T细胞。
[权利要求 18]
根据权利要求2所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的靶抗原为肿瘤抗原或病原微生物抗原。
[权利要求 19]
根据权利要求18所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的靶抗原为实体瘤的抗原。
[权利要求 20]
根据权利要求2所述的免疫效应细胞,其特征在于,所述的嵌合抗原受体的胞外抗原识别域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31-35任一所示的序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 21]
一种药物组合物,所述药物组合物包含权利要求1-20中任一项所述的免疫效应细胞。
[权利要求 22]
权利要求1-20中任一项所述的免疫效应细胞或者权利要求21所述的药物组合物在 制备预防或治疗肿瘤或病原微生物感染的药物中的用途。
[权利要求 23]
一种嵌合蛋白,其特征在于,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体的胞外域和IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域。
[权利要求 24]
根据权利要求23所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述嵌合蛋白包含TGF-β受体II的胞外域及任一项IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域。
[权利要求 25]
根据权利要求23所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域及IL-2RG的胞内信号域。
[权利要求 26]
根据权利要求23-25任一所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述的TGF-β受体的胞外域和所述的IL-2家族蛋白的受体的胞内信号域为野生型或突变型。
[权利要求 27]
根据权利要求23所述的嵌合蛋白,其特征在于, 所述的TGF-β受体I的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的TGF-β受体II的胞外域的氨基酸序列与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 28]
根据权利要求25所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述的IL-2RG的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 29]
根据权利要求24所述的嵌合蛋白,其特征在于, 所述的IL-2Rβ的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的IL-7R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 所述的IL-21R的胞内域的氨基酸序列与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性。
[权利要求 30]
根据权利要求23-29所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述胞外域和所述胞内信号域之间具有跨膜域; 优选的,所述的跨膜域为IL-2家族蛋白的受体的跨膜域。
[权利要求 31]
根据权利要求23-29所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述嵌合蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:27、28、29、或30任一所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性; 优选地,所述嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:27、28、29、或30任一所示。
[权利要求 32]
根据权利要求23所述的嵌合蛋白,其特征在于,所述嵌合蛋白包含第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白, 所述第一嵌合蛋白含有TGF-β受体I的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域;和 所述第二嵌合蛋白含有TGF-β受体II的胞外域和选自IL-2RG的胞内信号域或IL-2家族蛋白的受体的α亚基的胞内信号域的胞内域。

附图

[ 图 1]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 2A]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 2B]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 2C]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 3]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 4A]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 4B]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 5]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 6]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 7]   [根据细则26改正 18.02.2019] 
[ 图 8]   [根据细则26改正 18.02.2019]