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1. (WO2019004809) MEZCLA, COMBINACIÓN, RESINA FOTOPOLIMÉRICA Y MÉTODO, PARA OBTENER UN MATERIAL BIOCOMPOSITO
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CAMPO TECNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con los campos técnicos de la Biomimética, más específicamente en la Ciencia de Materiales; y la Medicina Ortopédica; ya que proporciona una mezcla, combinación, resina fotpolimérica y método, para la obtención ele un material biocomposito, útil en la medicina ortopédica, Dicha invención, también proporciona el material biocomposito en sí.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El emergente campo de la Biomimética permite imitar la biología o la naturaleza para el desarrollo de nuevas tecnologías o procesos, debido a que las propiedades de los materiales biológicos son el resultado de una compleja interacción entre la morfología de la superficie y sus propiedades físicas y químicas. Una de las mayores áreas de estudio y de aplicación de la Biomimética en ¡a actualidad se encuentra en ¡a ciencia de materiales, considerándola un pilar de suma importancia para la generación de nuevas tecnologías.

Las estructuras jerárquicas son extremadamente comunes en la naturaleza para proporcionar propiedades de interés. Así, dispositivos a escala molecular, auto-limpieza, conversión y conservación de energía, alta adhesión, materiales y fibras con alta resistencia mecánica, aislamiento técnico y auto-regeneración, son algunos ejemplos de los mecanismos con interés comercial que se encuentran en la naturaleza (Jacobsen y col., 2012), Un material apropiado y diseñado para una aplicación específica resulta en mayor eficiencia y menor costo a la hora de llevar un producto nuevo al mercado. En este sentido, se busca diseñar un material con propiedades biocompatibles y resistencia mecánica similar a la del tejido óseo.

Actualmente, se utilizan dos alternativas para e! trasplante de tejido óseo; la primera se conoce como trasplante autóiogo, que consiste en obtener tejido del mismo paciente. Este tipo de técnica se utiliza con mayor frecuencia debido a que se ha estudiado que es un método seguro dada la ausencia de reacción inmunológica y la transmisión de enfermedades, pero con la desventaja de la limitada cantidad de tejido que se puede obtener (Wakitani y col., 2007). La segunda alternativa se trata del implante cadavérico, que consiste en tomar tejido de donantes a corazón parado o de donantes multi-orgánicos en muerte encefálica, pero se considera poco viable debido a la dificultad para conseguir el tejido y su alta propensión a reacciones autoinmunes, las cuales pueden causar enfermedades como la hepatitis C (Dutra Reos y col., 2014).

La ingeniería de tejidos es un método que replica el tejido natural del cuerpo utilizando principios de la ingeniería, medicina y ciencias físicas. Recientemente, esta área ha sido investigada con interés particular para su aplicación en el tejido óseo. El hueso tiene ia habilidad para repararse por sf mismo, sin embargo, la velocidad y calidad de esta auto-regeneración depende del tamaño de la fractura o del defecto que se presente. Por lo tanto, hay ciertos defectos que no pueden ser reparados sin ayuda de una intervención quirúrgica, es por esto que las investigaciones actuales se han enfocado en diseñar materiales sintéticos para andamies en la regeneración de tejidos (Killion y col., 2011). La ingeniería de tejidos óseos es un proceso complejo y dinámico que inicia con la migración y conexión de células osteoprogeniforas, seguido por su proliferación, diferenciación y formación de una matriz para la regeneración del hueso (Bose y col., 2012). Los andamies para la regeneración de hueso normalmente se construyen con materiales porosos biodegradables provistos de propiedades mecánicas de soporte (Bose y col., 2012). En este sentido, polímeros sintéticos como la poli-caprolactona y poli-hidroxiácidos son materiales fáciles de procesar y con alta resistencia mecánica, pero en aplicaciones médicas han presentado respuesta inflamatoria (Puppi y col., 2010). Actualmente existe una alta demanda e interés para producir andamies con alta permeabilidad ai oxigeno y nutrientes, que favorezcan el crecimiento celular y al mismo tiempo brinden una alta resistencia mecánica.

Los hidrogeles son un grupo de materiales que se han estudiado desde hace algunas décadas y actualmente se encuentran en el primer plano de ¡as investigaciones en ingeniería de tejidos. Estos se han utilizado como soporte y reparación asistida de diversos tejidos, tales como e! hueso (Liu y col., 2013), cartílago (Puppi y col., 2010), nervios (Georgiou y col., 2013) y piel (Xingang y col., 2012). Muchos hidrogeles son biológicamente compatibles, lo que resulta en mínima o nula respuesta inflamatoria y daño de tejido. Sin embargo, algunos análisis toxicológicos han demostrado que dichos hidrogeles requieren numerosas etapas previas para asegurar la compatibilidad celular de tos andamios, principalmente debido al monómero que se encuentra sin reaccionar después de la foto-polimerización (Geever y col., 2008).

Por otra parte, un andamio para la regeneración ósea debe poseer propiedades mecánicas adecuadas para resistir el proceso de manipulación e implantación y los esfuerzos de tensión, flexión y compresión propios del organismo (Wu y col,, 2014). A pesar de ello, esto se ha visto como un requerimiento secundario y se han basado las investigaciones en las propiedades biológicas del material (Killion y col. , 2011). Sin embargo, en años recientes se ha estudiado que ¡as propiedades mecánicas de todos los dispositivos biomédicos son de suma importancia para su rendimiento, es por esto que se ha trabajado en encontrar materiales que funcionen como refuerzo de estos hidrogeles, tales como metales, otros polímeros o cerámicas (Kane y col., 2015).

La actividad celular es afectada por diferentes causas tales como las propiedades químicas, topográficas y mecánicas, siendo estas últimas ignoradas a la hora de realizar el biomaterial. Uno de los beneficios de los hidrogeles es que se pueden variar las propiedades mecánicas de éstos variando su peso molecular, lo que permite crear materiales más acordes a las necesidades deseadas de la aplicación (Silva y col., 2014).

Se han reportado diversos polímeros para la formación de hidrogeles con aplicaciones en la medicina regenerativa del tejido óseo, entre ¡os que

destacan el poü-etilengíico! (PEG), poli-vinil alcohol (PVA), poü-hidroxsetH metacrilato (PHEMA) y el poli-etiíenglicof dimetacrilato (PEGDfvIA), este último es un poliéter que ha sido utilizado exitosamente en pruebas in vitro e in vivo, demostrando tener poca o nula toxicidad y aita biocompatibilidad (Annabi y col., 2014). Una de las aplicaciones menos estudiadas de este tipo de hidrogeles es su uso para reemplazo de hueso debido a que aún con bajos pesos moleculares las propiedades de este hidrogel no logran alcanzar las requeridas para aplicaciones ortopédicas (Meinel y col., 2012). Una forma de solucionar esto es la adición de un relleno que cumpla con las propiedades de biocompatibilidad y funcione como refuerzo mejorando las propiedades mecánicas del hidrogel (Kane y col., 2015).

Los materiales sintéticos diseñados para el refuerzo o sustitución de hueso basados en fosfatos de calcio han sido utilizados ampliamente debido a que cumplen con las propiedades mecánicas y el grado de seguridad biológica necesario (Butscher y col., 2011). Dentro de ellos, la hidroxiapatita es el principal mineral reconstituyente de! hueso, y su compatibilidad con este tejido biológico ha sido probado en materiales artificiales, lo que la hace un biomateriai por excelencia. La hidroxiapatita es un cristal biocompatible que ha incursionado en la biomedicina como restaurador, se utiliza en ortopedia, odontología y en oftalmología principalmente (Pires y col., 2014). Los estudios que se han llevado a cabo en los últimos años consisten en investigación para dilucidar los mejores mecanismos de obtención y combinación con otros elementos. Sin embargo, a la hora de su aplicación, se deben considerar aspectos físicos y químicos importantes, tales como resistencia, dureza, porosidad, disolución, adhesividad, entre otros (Bose y col., 2013; Wu y col., 2014), sin dejar de lado la versatilidad ósea o la intención de su utilización, ya que el medio donde se va a colocar presenta características específicas y deben considerarse sus propiedades como relleno, como soporte o como sustituto (Bose y col., 2013).

En años recientes, la impresión 3D se ha estudiado como una opción competitiva en el prototipado rápido de materiales biomiméticos para la

regeneración de tejido óseo (Derby, 2012). Básicamente, la impresión 3D es un proceso de manufactura aditiva, es decir, de fabricación capa por capa, permite crear estructuras con alto grado de complejidad semejantes a las encontradas en la naturaleza, ¡as cuates tienen funciones específicas que pueden ser utilizadas y ajustadas para diferentes aplicaciones, tanto biomédicas como industriales. Combinar las propiedades de los hidrogeles con refuerzos cerámicos con la manufactura aditiva representa gran herramienta para producir estructuras complejas de un material altamente bíocompatible para una gama de aplicaciones biomédicas (Murphy y Atala, 2014; Kane y col., 2015).

El polietiíenglícof diacrilato es un hldrogel obtenido del poíietilenglicol (PEG) incorporando dos grupos acrilatos. Este material gelifica rápidamente a temperatura ambiente en presencia de un fotoinicador y luz ultravioleta (UV). Es hidrofllico, elástico y puede combinarse con variedad de moléculas biológicas debido a su citocompatibilidad, baja o nula toxicidad y facilidad de uso (Patteí y col,, 2005, Han y col, 2009), Algunas de estas aplicaciones incluyen hidrogeles desarrollados para administración de fármacos, ingeniería de tejidos, cicatrización de heridas y procesos de electrospínning para las bloaplicaciones (Bikram y col., 2005). Más allá de la biocompatibilidad, los atributos mecánicos de una matriz polimérica son igualmente importantes y deben ser diseñados para abordar las propiedades del material final a obtener. El módulo de compresión y otros atributos mecánicos de materiales de hidroge! reticulados pueden variar grandemente (Guoxin y col., 2008).

En la elección de materiales que tienen propiedades mecánicas intrínsecas deseables, se pueden alterar las condiciones de procesamiento durante la polimerización o combinar diversos polímeros y otros materiales tales como cerámicos para conseguir un biomaterial final con características mecánicas y de biocompatibilidad deseadas. Aunque se ha trabajado en la resistencia mecánica de los hidrogeles PEGDA, existe poca información; además de que se han realizado pocos trabajos sobre la resistencia a la compresión, la

viabilidad celular y obtención de materiales compuestos asociados con mezclas de hidrogel de PEGDA ya sea de bajo y/o alto peso molecular.

La hidroxiapatita es un mineral de fórmula Caio(P0 )6{OH)2 presente en la naturaleza de forma natural y sintética. Entre las primeras fuentes reportadas están las naturales, tales como corales y animales (Padilla y col., 2004) comúnmente procesados por el método hidrotermal, que consiste en la transformación química mediante una reacción de intercambio hidrotermal en un reactor a presión y temperatura controlada, en presencia de precursores de calcio como el nitrato de calcio Ca(N03)2, carbonato de calcio CaCOa, hidróxido de calcio Ca(OH)2, cloruro de calcio CaCI2 o sulfato de calcio CaS04 y de fósforo como el fosfato diamónico (NH4)2HP04, ácido fosfórico H3PO4 , fosfato dipotásico K2HPO4 (Rodríguez y col., 1999). En la actualidad se han reportado diversas técnicas para la síntesis de hidroxiapatita partiendo de reactivos químicos, entre las que sobresalen las técnicas de precipitación, sol-gel, hidrólisis, sonoqulmicas e hidrotermales (Villora y col., 2002).

Utilizando las técnicas anteriormente mencionadas se obtiene Hidroxiapatita en polvo, que posibilita su transformación tanto en formas densas como porosas y da lugar a diversas aplicaciones de biomateriales de que superen la etapa de que sólo se utilicen como relleno, La hidroxiapatita de diferentes orígenes (bovina, porcina, sintética, coralina, etc.) no se puede utilizar en todo tipo de restauración, ni en las diferentes edades, ya que cambia la respuesta fisiológica ante la dinámica de respuesta en los diferentes sujetos. De tal manera que la HAP coralina no es un buen material en odontología, sin embargo, es útil en oftalmología (Duailibi y col., 2004). También da buenos resultados en prótesis oculares con movimientos conjugados. La hidroxiapatita de bovinos es útil para reparaciones óseas, aunque no da buenos resultados como rellenos dentales. En todo caso se debe tomar en cuenta la extensión de la reparación, ya que en huesos como la cabeza del fémur da mejores resultados en la reparación con metales como el acero o el titanio, en cambio en la implantación de HAP en prótesis metálicas no da buenos resultados, como tampoco en prótesis de huesos, ni en los implantes dentales. Sin

embargo, se deben considerar aspectos físicos y químicos importantes dei comportamiento de la HAP en su aplicación como biomateria!, tales como resistencia, dureza, porosidad, disolución, adhesividad, etc. No se debe dejar de lado la versatilidad ósea o la intención de su utilización, ya que el medio donde se va a colocar presenta características específicas, considerando que no es lo mismo la utilización como relleno, como soporte o como sustituto (García y Reyes., 2006).

La hidroxiapatita es un biocerámico de tipo tres, es bioactiva, su superficie es reactiva y se enlaza directamente al hueso; es una de las más utilizadas en los quirófanos como implante óseo, como recubrimiento de metates bioinertes para mejorar su biocompatibilidad y como liberador controlado de fármacos. Anteriormente sólo se usaba hidroxiapatita no porosa para la sustitución parciai de huesos, sin la posibilidad de crecimiento de estructuras dentro del mismo. En los últimos años, el desarrollo y uso de estas estructuras porosas dio un giro en el área de implantes óseos para permitir así la remodelación y reparación fisiológica del hueso. Sus aplicaciones incluyen implantes dentales, sistemas percutáneos, tratamientos periodentales, aumento de la cresta alveolar, ortopedia, cirugía maxilofaciaí, otorrinolaringología, cirugía plástica y cirugía espinal. Una de las aplicaciones más importantes es el recubrimiento de superficies metálicas para la fijación de prótesis ortopédicas y dentales, la técnica más empleada es la proyección por plasma del polvo de hidroxiapatita. (Suchanek y Yoshimura., 1999).

Por lo tanto, para superar los inconvenientes antes mencionados, se desarrolló una mezcla y un método, para la formación de un material biocomposito (polímero/cerámico), el cual puede ser utilizado como refuerzo o sustituto de estructuras óseas, o como soporte para su regeneración debido a que sus propiedades mecánicas son muy similares a las del hueso humano,

Las características y ventajas adicionales de la presente invención, se comprenden más claramente en la siguiente descripción detallada de las

realizaciones preferidas de la misma, dadas por medio de ejemplos no limitativos y con referencia a las figuras adjuntas, en ¡a qué:

La figura 1 es la estructura química del polietilenglicol diacrilato.

La figura 2 es la estructura química del 1-Vinil~2-pirrolidona.

La figura 3 es la estructura química del fotoiniciador BAPO (óxido de bis-alquil fosfina).

La figura 4 es un espectro infrarrojo, del comportamiento de las muestras de hidroxiapatifa sintética.

La figura 5 corresponde a la regresión lineal para la curva de calibración con solución estándar de cloruro de amonio.

La figura 6 ilustra la disposición de monocapas de N1H-3T3 expuestas a muestra de biocompositos A-F); la tonalidad azul son los cristales de formazan que indican células viables; el valor de la barra de escala es de 100 pm.

La figura 7 ilustra la disposición de monocapas de ΝΙΗ-3Ϊ3 de los cultivos expuestos a las muestras etiquetadas por inlvlateriis como G, H, l J, K y L; la tonalidad azul son los cristales de formazan que indican células viables. El valor de la barra de escala es de 100 μηι.

La figura 8 ilustra la disposición de monocapas de NIH-3T3 expuestas a muestra de biocompositos; IWL N, O P Q y R con gránulos de diferente tamaño de partícula en suspensión. La tonalidad azul son los cristales de formazan que indican células viables. El valor de la barra de escala es de 100 pm,

La figura 9 ilustra la disposición de monocapas de NIH-3T3 de las muestras: S expuesta al blanco PEGDA575; y T expuesta al blanco PEGDA700. La tonalidad azul son los cristales de formazan que indican células viables. El valor de la barra de escala es de 100 pm.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los detalles característicos de la presente invención, se muestran claramente en la siguiente descripción, cuya finalidad es exponer algunas de las

rea izaciones preferentes de la invención, con la ayuda de las figuras y ejemplos incluidos; por lo que esta descripción no debe considerarse como limitativa a los alcances de la presente invención.

En primera instancia, la presente invención se refiere a una mezcla de: poli-etileng!icol diacriiato, 1-vini!-2-pirrolidona, y un agente fotoiniciador. Con el término "mezcla" se pretende decir que ios ingredientes, poli-etijenglicol diacriiato, 1-vinil~2-pirrolidona, y el agente fotoiniciador, no necesariamente estén combinados, sino que pudieran estar cada uno en compartimentos por separados, listos o no, para ser combinados.

Una realización de la mezcla en cuestión, es cuando el poli-efilenglicol diacriiato tiene un peso molecular de 575, 700 Daltons, y/o su combinación; y el agente fotoiniciador es óxido de bis-alquií fosfina.

Un objeto más de la presente invención es una combinación para preparar una resina fotopolimerica, para ello, basta combinar los ingredientes: poH-etilenglicol diacriiato, l-vlni!-2-pirrolidona, y el agente fotoiniciador. Una realización preferente de esta combinación, es cuando e! polí-etilengl col diacriiato está en una cantidad de un 95.54 %, la 1-viníl~2-pirrolidona en un 4.46 %, y el agente fotoiniciador en un 0.08 %, con respecto al volumen total de la mezcla.

Por lo tanto, la invención en cuestión, comprende también una resina fotopolimerica útil para impresiones en tercera dimensión; donde dicha resina se obtiene con la combinación de la mezcla de: pols-etilenglicol diacnlato, 1-vinil-2-pirrol!dona, y el agente fotoiniciador.

Un objeto más de la presente invención es una mezcla de poli-etilenglicol diacriiato, 1~vinii-2-pírrolidona, y agente fotosniciador; que comprende además, un agente de refuerzo; el cual puede ser un agente de refuerzo cerámico; tal como hidroxiapatita; específicamente bidroxiapatta sintética; más específicamente hidroxiapatita sintética que comprende: nitrato de calcio

íetra idratado, fosfato de amonio dibásico, hidróxido de amonio, y agua destilada desionizada.

Otro objeto de esta invención es una combinación para preparar un material biocomposito, la cual comprende combinar: una resina fotopolimérica útil para impresiones en tercera dimensión, como la resina fotopolimérica de la presente invención, que constituye una matriz; y un agente de refuerzo, que constituye una fase dispersa. Donde el agente de refuerzo, es un agente de refuerzo cerámico; por ejemplo hidroxiapatita; específicamente hidroxiapatita sintética; más específicamente la hidroxiapatita sintética comprende: nitrato de calcio tetrahidratado, fosfato de amonio dibásico, hidróxido de amonio, y agua destilada desionizada.

La presente invención también tiene como objeto, un material biocomposito, e! cual se obtiene al combinar: una resina fotopolimérica útil para impresiones en tercera dimensión, como la resina fotopolimérica de la presente invención, que constituye una matriz; y un agente de refuerzo, que constituye una fase dispersa. Donde el agente de refuerzo, es un agente de refuerzo cerámico; por ejemplo hidroxiapatita; específicamente hidroxiapatita sintética; más específicamente la hidroxiapatita sintética se conforma de: nitrato de calcio tetrahidratado, fosfato de amonio dibásico, hidróxido de amonio, y agua destilada desionizada.

La presente invención tiene como objeto también, un método para preparar una resina fotopolimérica, donde dicho método comprende las etapas de: primero asegurar un espacio de trabajo libre de rayos ultravioleta; combinar poli-eti englicol diacrilato y 1~vini¡~2-pirrolidona, agitando alrededor de 1000 rmp por 2 min; y agregar un agente fotoiniciador, agitando a 1000 rpm, durante 6 min. Donde una modalidad de dicho método, es cuando el poii-etílengiicol diacrilato tiene un peso molecular de: 575, 700 Daltons, y/o su combinación; y el agente fotoiniciador es óxido de bis-alquií fosfina.

Una modalidad más del método para preparar una resina fotopolimérica es cuando comprende una etapa adicional de proteger contra la luz, la mezcla de poli-etilenglicol diacrilato y 1 ~¥snrl-2~pirrolidona, una vez que se agrega el agente fotoiniciador, cuando el contenedor donde se realiza la combinación es transparente. Por ejemplo se puede cubrir el contenedor con un material que impida e\ paso de luz, como e! papel aluminio.

Por lo tanto, la presente invención también aporta como un objeto más, a un método para preparar un material biocomposito, dicho método comprende las siguientes etapas:

i) combinar una resina fotopolimérica útil para impresiones en tercera dimensión, como la resina fotopolimérica descrita en ¡a presente invención, con un agente de refuerzo; con una agitación de 1000 rpm, durante 10 mín;

ii) formar probetas, colocando la mezcla anterior sobre un objeto transparente;

iii) aplicar luz ultravioleta por debajo del objeto transparente, para llevar acabo un ersírecruzamiento entre tos ingredientes de la mezcla, durante un tiempo de 2 a 4 min, para lograr un entrecruzamiento aproximado de

80 %;

iv) sumergir ¡a pieza obtenida en etanol ai 70 %; y

v) exponer la pieza a luz ultravioleta de 28 W, durante 8 h, dentro de una campana de flujo laminar,

Una realización del método para preparar un material biocomposito es cuando el agente de refuerzo, es un agente de refuerzo cerámico; como por ejemplo hidroxiapatita; espefíciamente hidroxiapatita sintética; y más específicamente cuando la hidroxiapatita sintética comprende; nitrato de calcio tetrahidratado, fosfato de amonio dibásico, hidróxido de amonio, y agua destilada des onizada. Una modalidad más del método en cuestión, es cuando el objeto transparente es un portamuestras de vidrio.

Una realización preferente del método en cuestión, es cuando la luz ultravioleta para llevar acabo un entrecruzamiento entre los ingredientes de la combinación, tiene una intensidad continua mayor a 1400 mW/cm2, y una longitud de onda de 405 nm; y el tiempo suficiente para lograr dicho entrecruzamiento de alrededor de un 80 %, es de 1 min de exposición a ía luz ultravioleta.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se anexan sólo con la finalidad de ilustrar algunas de las realizaciones de la presente invención, por lo tanto, no deben ser considerados como una limitante para el alcance de dicha invención.

Para obtener el material biocomposito fue necesario primero elaborar una resina fotopolimerizable como matriz y mezclarla con hidroxiapatita artificial, que constituye la fase dispersa del material compuesto, Los materiales y métodos necesario para llevar a cabo estos procedimientos se presentan a continuación.

Ejemplo 1. Elaboración de dos resinas fotopolirnéricas.

Para la elaboración de dos resinas fotopolirnéricas para impresión 3D, se utilizaron: poiietilengíicoi diacriiato (PEGDA) de pesos moleculares 575 y 700 Daltons, para cada una, como polímero base en ia mezcla de resinas fotopolimerizable. Su estructura se muestra en la figura 1. También se usó el monómero 1~Vinil-2-pirrolidona (NVP) (ver figura 2), para seguir la metodología reportada por Devine (2005). LA NVP, además de actuar como agente dispersante del refuerzo en la matriz, mejoró significativamente las propiedades de solubilidad del fotoiniciador en la resina.

La polimerización de las resinas fotosensibles se lleva a cabo mediante una reacción de entrecruzamiento promovida por la presencia de un haz de luz láser a una longitud de onda de 405 nm.

Para este fin, se utilizan catalizadores de la reacción de fotopoiimerizacfón conocidos como fotoiniciadores. En este trabajo se utilizó un fotoiniciador BAPO (óxido de bis-aiquil fosfína), cuya estructura se muestra en la figura 3.

La manera de elaborar la resina fotopolimérica, en cuestión, fue necesario que antes de realizar la mezcla de la resina, se aseguró que el lugar de trabajo no tuviera exposición a rayos UV. Como la solución PEGDA y NVP se hizo en un vaso de vidrio, este se cubrió totalmente con papel aluminio inmediatamente después de agregar e! fotoiniciador a fin de evitar la reacción de entrecruzamiento.

Se mezclaron 150 mL de PEGDA y 7 mL de NVP, agitando a 1000 rpm, durante 2 min. Después se agregó el 0.08% (volumen total de la mezcla) del fotoiniciador BAPO (óxido de bis-alquil fosfina). Se agitó a 1000 rpm, en una parrilla agitadora durante 8 min, hasta que el polvo del fotoiniciador fue totalmente disuelto.

Ejemplo 2. Elaboración de un refuerzo cerámico.

Para la síntesis del refuerzo cerámico, llamado hidroxiapatita sintética (HAP) se llevó a cabo utilizando: nitrato de calcio tetrahidratado, fosfato de amonio dibásico, hidróxido de amonio, y agua destilada desionizada.

La manera de cómo se elaboró, fue según el procedimiento para la síntesis de hidroxiapatita por precipitación acuosa y sinterizado a alta temperatura propuesto por LeGeros (1991), el cual indica que una vez obtenido el precipitado, éste debe centrifugarse y secarse en una estufa de vacío a 70 °C y 0.08 MPa durante 48 h. Inmediatamente después, ei polvo obtenido se lleva a sinterízación en una mufla de alta temperatura a 1300 °C, durante 1 hora.

Debe tomarse en cuenta que después de las 48 h de secado, la sintetizarán se hizo inmediatamente, para evitar que ésta absorbiera humedad rápidamente, lo que puede formar cristales dentro de la cerámica.

Posteriormente, la HAP se molió en un molino de bolas RETSCH MM 400 utilizando una frecuencia 30 1/s y un tiempo de 2 min, para obtener un polvo con una distribución de tamaño de partícula de 20 a 400 mieras.

Para separar los distintos tamaños de partícula, se tamizó la HAP en un tamiz ROTAP durante 15 min, utilizando mallas 40, 50, 100, 230 y 835 MESH.

De acuerdo a lo reportado por la Medical Materials Datábase (ASM), para la formación de los biocompositos se utilizó un tamaño de partícula 60 mieras, correspondiente a la malla 230 MESH.

Ejemplo 3. Caracterización de la HAP, obtenida en el ejemplo anterior.

Es ectrosco ia de Infrarrojo por Transformada d® Fouror (FTIR)

Los métodos y parámetros tecnológicos para la síntesis de productos Calcio-Fosfato (CaP) pueden tener un impacto significativo en la estequiometrfa del producto final, su grado de cristalización, tamaño de partícula, composición de la fase biocerámlca, estabilidad térmica, mlcroestructura y propiedades mecánicas.

La espectroscopia de infrarrojo por transformadas de Fourier (FTIR) es uno de los métodos que monitorea sistemáticamente las variaciones de la estructura de los grupos y enlaces característicos de estos compuestos, dando indirectamente una evaluación de la sinferización de materiales CaP obtenidos, desde TCP hasta HA y biocerámicas.

Se llevó a cabo un análisis de FTIR de la hidroxiapatita sintética obtenida por el método de LeGeros (1990) para conocer su composición química y compararla con la reportada en la literatura. Se utilizó un espectrofotómetro Spectrum One de Perkin Elmer y se analizaron las dos muestras que se describen a continuación:

Sin acondicionamiento: se refiere a la HAP sintetizada realizando sólo los lavados sugeridos por la literatura.

Acondicionada; HAP sintetizada realizando 3 ciclos de lavado. La figura 4 representa los espectros correspondientes a ambas muestras de HAP.

De acuerdo a este análisis, ambos espectros muestran los picos característicos de la hidroxiapatita (Berzina y Borodajenko, 1996), en 3570 cnf1 se observa estiramiento del enlace O-H (a) y los picos en 1190 crrf1 (b) y 660 crrf1 (c) corresponden a los grupos fosfato.

Por otra parte, el espectro de la muestra sin acondicionamiento (negro) muestra dos picos adicionales, uno a 3100 cm" , correspondiente al estiramiento de N-H y otro a 1450 cm"1, correspondiente a la deformación de tos enlaces N-H de aminas primarias. Ambos picos sugieren la presencia del ion amonio en las muestras de HA, lo cual puede resultar perjudicial para los ensayos de biocompatibilidad.

A pesar de la información obtenida con el análisis por FTI , estos datos son sólo de carácter cualitativo, por lo que se sugirió el uso de una técnica cuantitativa para la determinación del nivel del ion amonio en la HAP.

Determinación de niveles de amonio {NH4-N en los biocomposiío

Para este análisis se utilizaron 9 probetas del biocomposito de 6 x 2 x 2 nm. Siguiendo la metodología para la determinación del nitrógeno amoniacal por colorimetría semi-automática (O'Dell, 1993), se obtuvieron las concentraciones del ion amonio en ambas muestras de los biocompositos (muestras que incluyen HAP con 3 ciclos de lavado y muestras con HAP sin ciclos de lavado). Se preparó una solución estándar de cloruro de amonio de la cual se hicieron diluciones que fueron leídas a una longitud de onda de 860 nm en un espectrofotómetro UV-Vis Thermo Scientific GENESYS 10S para construir la curva de calibración que se muestra en la figura 5.

-10- La extracción del NH4~ se realizó sumergiendo las probetas 24 h en una solución de cloruro de potasio 2 N, de donde se tomó una muestra de 250 μΐ y se leyó a la misma longitud de onda. Los datos obtenidos sugieren un comportamiento lineal, por lo que se utilizaron los valores dados por la regresión de la curva de calibración y las ecuaciones 1 , 2, y 3.

y = m * x - b »——»—-- Ecuación (1)

—.„..„„„„„„„_„„„_„_.„„„„„„„„__„..._..„ Ecuación (2)

„ Abs-b

Ecuación (3) m

Donde:

A™ absorbancia

C ~ concentración de NH4-N en la muestra

m - pendiente dada por el ajuste de regresión lineal

b = intercepto

Los resultados de Sos cálculos para el contenido de NH4-N en cada lote de muestras se describen a continuación,

La tabla 1 muestra los valores de absorbancia y la concentración de NH4-N calculada utilizando la ecuación 3 en la muestra de biocomposito sin acondicionamiento. El experimento se realizó por triplicado. Para esta muestra se obtiene un valor promedio de 280.887 mg/dL. Esta concentración fue utilizada como 100 % de contenido de NH4-N para los estudios de viabilidad celular.

Según lo indicado en reportes preliminares de biocompatibiíidad, un cultivo de fibroblastos de ratón de la línea celular L929 se sometieron a diferentes tratamientos con NH4-N por 24 h. Partiendo de un medio completo (100 %) se realizaron diluciones a 12.5, 25 y 50 %. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Tabla 1. Valores de concentración de NH4-N para las muestras sin acondicionamiento.


y SC í = de sviación estándar.

Los resu tac los d< 3 via bilidad m ostr aror i que para fas COÍ icentraciones de 12.5 y

25 % no se ' obs* arva n efectos cití DtÓX COS ) / genotóxicc s para tos fil íroblastos» mies ítras qi e al 10C % prese 3nt« tn d años en la membrana, el tas T año y el número de célul as p >or campe 3, S ÍS¡ c orno efectos de genotoxicida ü. Para la con< ;entr ack jn de > 50 % se m! 3str 6 un 74.·* i- % de viat ¡ilsdad celular y efectos ligeros de genotoxicidad, considerado como un valor aceptable para la HAP según lo reportado en ¡a literatura (Rajab y col., 2004).

Con base en estos resu tados, la síntesis de la HAP fue modificada realizando más ciclos de lavado de los sugeridos en la literatura. De este lote se imprimieron 9 probetas de¡ biocomposito y se analizaron siguiendo el procedimiento ya descrito. Los experimentos se realizaron por triplicado y sus resultados se muestran en la tabla 2.

El valor promedio de NH4-N para la muestra acondicionada fue de 81.24 mg/dL, correspondiente a un 28.92 % del valor para las muestras sin acondicionamiento.

Tabla 2. Valores de concentración de NH4~N para las muestras acondicionadas.


y SD = desviación estándar.

Ejemplo 4. Formación del material biocomposito.

Una vez obtenida la resina y la HAP, se llevó a cabo ¡a siguiente metodología para formar el biocomposito.

Para este procedimiento fue de suma importancia proteger la resina fotopolimérica de los rayos UV a lo largo de todo el procedimiento.

Se mezcló un 70 % de HAP en 150 mL de ¡a resina fotopolimérica descrita anteriormente en el Ejemplo 1 , formando una pasta. Se agregó 1/3 de la HAP a 1/3 de la resina, se agitó y se repitió este procedimiento hasta completar e¡ total de la HAP y la resina. Se mantuvo en agitación por aproximadamente 10 min. Se formaron 10 probetas con la mezcla HAP/resina fotopolimérica, colocando la mezcla en un porta-muestras de vidrio, dirigiendo el rayo de UV desde abajo de la muestra.

Para el enf ecruzamiento se aplicó a la muestra anterior, un rayo UV con intensidad continua mayor a 1400 mW/cm2, una longitud de onda de 405 nm y un tiempo de exposición de 1 min. Por último, la pieza obtenida se sumergió en etanol al 70 % y se sometió a la exposición de rayo UV de 28 W durante 8 h dentro de una campana de flujo laminar.

Ejemplo 5. Ensayo de citocompatibilidad del material biocompossto y

granulados de HAP.

Generalmente, para ¡os nuevos materiales con aplicaciones médicas se evalúa su adhesión, proliferación, viabilidad y diferenciación celular, con intención de mejorar su diseño y así pasar a un modelo más complejo.

Con la expectación del mejoramiento continuo y desarrollo de materiales para sustituto de hueso maxilofacial por parte de inMateriis, se hizo un estudio de viabilidad celular, Este ensayo tiene como objetivo cuantificar e! daño y alteraciones celulares que ocasiona la presencia de un material biocomposito hecho de poíietiíenglicol diacrilato (PEGDA) e hidroxiapatita sintética (HAP) entrecruzado por medio de foto-polimerización. Aunado a ello, se busca analizar el daño que puede causar a un tejido el granulado de HAP con diferentes tamaño de partícula.

El análisis de la respuesta celular se llevó a cabo por medio de un ensayo de reducción del Bromuro de 3(4,5 d i metil-2-tiazoi l)-2 , 5-d ifen i Itetrazóf seo (MTT). Este bioensayo permite la cuantifícación sencilla de la viabilidad celular.

La capacidad de las células para reducir el MTT es un indicador de su integridad mitocondrial, lo que de manera directa expone su viabilidad celular (qué tan capaz es de sobrevivir en el ambiente contaminado expuesto). Por ende, este ensayo es utilizado para obtener un margen cuantitativo de la toxicidad del material a un ambiente celular,

® Metodología de ensayo de citocompatibilidad

Para el ensayo se fabricaron 12 series de 20 materiales biocompositos de 2 mm de ancho, 1 rnm largo y 3 mm de alto de PEGDA575, PEGDA700 y con

diferente grado de granulado de HAP (A,B,C,D,E,F). Además de 16 probetas de PEGDA575 y PEGDA700 sin HAP (blancos). Se pesaron 10 g de HAP con 6 diferentes grados de granulado (A, B, C, D, E, F). Todas las muestras se esterilizaron durante 95 min, a 120° C y 1.5 atm. Posterior a la esterilización, se sumergió cada uno de los materiales biocompositos y los blancos en 300 pL de "medio completo" (formado por medio de cultivo celular con tripsina y antibiótico/antimicótíco) a 37 °C durante 24 h. Por otro lado, se obtuvieron 6 suspensiones de 100 pg/mL de "medio completo" con el granulado de HAP.

Se incubó cada uno de estos medios por 24 h, a 37 °C, en las placas de cultivo se removió el medio anterior, añadiendo 100 pL del medio contaminando (sobrenadante) a diferentes concentraciones (100, 50, 25 y 12.5 %) por triplicado con pocilios con células confluentes af 100 %, respectivamente. Por otro lado, los medios fueron resuspendidos utilizando una placa vértex e inmediatamente añadidos en 4 pocilios usando las mismas concentraciones del estudio anterior (100, 50, 25 y 12.5 %). Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado.

Validación celular por visualizac ón

Posterior a las 24 h de exposición de estas muestras a los sobrenadantes obtenidos del medio que sumergía a los materiales biocompositos y de las suspensiones de los gránulos de HAP e inmediatamente después de la síntesis de formazan de las células vivas, se tomaron diferentes fotografías para la validación visual de! daño celular generado por las muestras en estudio.

Se seleccionaron los pocilios expuestos a la concentración del 100 % de sobrenadante y de suspensión. Con ello se generó una serie de imágenes (Figuras 6 a la 9) que ayudaron a la calificación cualitativa del daño celular, basadas las calificaciones en la ISO 10993-5-2009. Cada muestra representa un tipo de material biocomposito o tamaño de granulo diferente. La exposición de los cultivos a las muestras A, B, C, D, E y F muestra un daño severo (daño casi completo de la monocapa celular, según ¡SO 10993-5-2009), los campos visuales obtenidos en las diferentes fotografías señalan la ausencia de células viables, ver Figura 6,

En los cultivos expuestos a las muestras etiquetadas por InMateriis como G, H, I J, K y L (Figura 7), existen discrepancias en el daño de la monocapa que va desde moderado (no más del 70 % del daño de la monocapa, ISO 10993-5-2009) (muestras G, H, J) pasando por daño medio (no más del 50 % del daño de la monocapa, ISO 10993-5-2009) (muestra K) y finalmente sin daño en la monocapa (muestra L).

En las células expuestas a los granos de diferente dimensión no se aprecia ningún daño a la monocapa (Figura 8), cualificando todas esas muestras como no citotóxicas. Finalmente, con la muestra S expuestas al blanco PEGDA575 (Figura 9) muestra un daño severo; sin embargo, la muestra T con el PEGDA700 (Figura 9) no se muestra ningún daño.

® Conclusiones

Se realizó una validación cualitativa por observación bajo microscopio después de formación de formazan a medios de cultivos expuestos por 24 h a sobrenadante de 12 tipos diferente de muestras, 2 tipos de PEGDA y suspensiones de 8 tamaños de grano de HAP. Este ensayo ayuda a inferir que el tamaño de ia partícula de HAP no tiene influencia relevante (que pueda apreciarse a simple vista) sobre una monocapa de N1H-3T3.

Como se mencionó con anterioridad, se utilizó PEGDA con distintos pesos moleculares, Al final fueron seleccionados sólo los pesos moleculares de 575 y 700, ya que en pruebas previas a ia impresión 3D, el PEGDA con un peso molecular de 250 mostró un incremento importante en ia temperatura al momento de ser sometida ai haz de luz UV (de 25°C a 80°C), lo cual representaría un problema grave al momento del procesamiento.

BIBLIOGRAFIA

Annabi, N., Tamayol, A., Uqui!las, J. A., Akbari, M., Bertassoni, L, E,, Cha, C, Camci-unal, G,, Dokmeci, M. R., Peppas, N. A., Khademhosseini, A. Rational Design and Applications of Hydrogels in Regenerative Medicine. Advanced Materials. 2014 26, 85-124.

Berzina, L, and Borodajenko, N. 'Research of Caicium Phosphates Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Materials Science. Engineering and Technology, 1996; 124.

Bikram M, Fouletier-Dilüng C, Gobin AM, Davss AR, Olmsted-Davis EA, West JL Hydrogel encapsulation of adenovírus-transduced cells expressing B P2 for local osteoinducíion. Molecular Therapy Journal. 2005; 1 1 :263- 264.

Bose, S., and Tarafder, S. Caicium phosphate ceramic systems in growth factor and drug deíivery for bone tíssue engineering : A review. Acta Biomaterialia 2012; 8(4), 1401-1421.

Bose, S., Vahabzadeh, S., and Bandyopadhyay, A. Bone tíssue engineering using 3D prinfing. Biochemical Pharmacology. 2013; 16(12), 496-504.

Butscher, A., Bohner, M., Hofmann, S., Gauckler, L, and Müller, R. Structural and material approaches to bone tissue engineering in powder-based three- dimensional printing. Acta Biomaterialia. 201 1 ; 7(3), 907-920.

Derby, B. Printing and Prototyping of Tissues and Scaffolds. Biomaterials.

2012; November, 921-927.

Devine, D, M., & Higginbotham, C. L. Synthesis and characterisation of chemically crosslinked N-vinyf pyrrolidinone (NVP) based hydrogels. European Polymer Journal. 2005: 41 (6), 1272-1279.

Duailibi M.T., Duailibi S.E, Young C.S., Bart!ett J.D., Vacanti J.P., Yelick P.C.

Bioengineered Teeth from cultured rat tooth bud cells. Journal Dental Research. 2004;83(1):523-528.

Dutra Roos B, Vaidomíro Roos M, Camisa Júnior A, Moreno Ungaretti Lima E, Noshang Pereira R, Luciano Zangirofami M, et al. Prevaléncia de marcadores microbiológicos em tecido ósseo de doadores e cadáveres do

Banco de Tecsdos Muscu-loesqueléticos de Passo Fundo. Rev Bras Ortop. 2014;49:386-390.

García-Garduño M., Reyes-Gasga J., La hidroxiapatita, su importancia en los tejidos mineralizados y su aplicación biomédica. Revista especializada en ciencia Químico-Biológicas, 2006; 9(2);90-95.

Geever, L.M., Cooney, C.C., Lyons, J.G., Kennedy, J.E., Nugent, M.J.D.,

Devery, S., Higginbotham, C.L, 2008. Characterisatíon and controlled drug reléase from novel drug-ioaded hydrogeis. European Journal of

Pharmaceutics and Biopharmaceutics 69, 1 147-1 159,

Georgiou, M., Bunting, S. C. J., Davies, H. A., Loughlin, A. J., Golding, J. P., and Phillips, J, B. Biomaterials Engineered neural tissue for peripheral nerve repair. Biomaterials. 2013; 34(30), 7335-7343.

Guoxin T, Yingjun W, Guang Y. Synthesis and properties oí polyethylene glycol diacrylate 2-hydroxyethyl methacrylate hydrogeis. Key Engineering ateríais. 2008;368: 1175-1 177.

Hahn M, il!er JS, West JL. Three-dimensional bíochemical and biomechanical patterning of hydrogeis for guiding cellular behavior, Advance Materials.

2008;18:2679-2885.

Kane, R. J., Weiss-bilka, H. E., Meagher, M. J., üu, Y., Gargac, J. A., Niebur, G. L, Wagner, D. R., Roeder, R. K. (2015). Acta Biomaterialia

Hydroxyapatite reinforced colfagen scaffolds with improved architecture and mechanical properties. Acta Biomaterialia, 17, 16-25.

Jacobsen P; Mousavi A K; Leseman ZC; Systems M. Bacterial Eléctrica! Conduction. 2012.

Killion, J. a., Geever, L. M., Devine, D. M., Kennedy, J. E., and Higginbotham, C. L. Mechanical properties and thermal behaviour of PEGDMA hydrogeis for potential bone regeneration application. Journal of the Mechanical Behavior of Biomédica! Materials. 201 1 ; 4(7), 1219-1227.

LeGeros RZ. Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine. Karger, Basel, Switzerland, 1991.

Liu, Y., Lim, J., and Teoh, S. Review : Development of clinicaily relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering. Biotechnoiog Advances, 2013; 31(5), 688-705.

yeinel, L, & Kaplan, D, L. (2012). Si!k constructs fbr delivery of musculoske!efal therapeutics, Advanced Drug Delivery Reviews, 64(12), 1111-1122.

yurphy, S. V, and Atala, A, (2014). 3D bloprinting of tissues and organs. Na! Biotech, 32(8), 773-785.

O'Del!, J. W. Determination Of Ammonia Nitrogen By Semi-Automated

Colorimetry. 1993. (August), 1-15.

Padilla S, García-Carrodeguas R, Vallet-Regí M. Hydroxyapaíite suspensions as precursors of pieces obtained by gelcasting method. Journal of the European Ceramic Socieíy. 2004; 24(8):2223-2232.

Patel P, Smith CK. R eological and recovery properties of po y(ethylene glycol) diacrylate hydroge s and human adipose tissue. Journal of Biomededical

Material Research. 2005;73(1):313-319,

Pires, !., Gouveia, B., Rodrigues, J., & Fonte, R. (2014). Charactertzaíion of Sintered Hydroxyapaíite samples produced by 3D prinfing, Rapíd

Proíoíyping Journal, 20, 9.

Puppi, D., Chiellini, F., Piras, A. M., and Chiellini, E. Progress in Polymer

Science Polymeric maíeriafs for bone and cartilage repair. Progress in

Polymer Science. 2010; 35(4), 403-^ 40,

Rajab, or Fadilah, et al. "D A damage evaluation of hydroxyapaíiíe on fibroblasí cell L929 using the single cell gel electrophoresis assay." The

Medical joumal of Malaysía 59. 2004: 170-171.

Ramay HR, Zhang M. Preparation of porous hydroxyapaíite scaffolds by combination of íhe gel-casting and polymer sponge methods. Biomaterials. 2003; 24(19): 3293-32302.

Rodríguez Maclas RJ, Gómez Morales J, Rodríguez Clemente R, Blardoni Folá

F. Biomaterial de restauración ósea. Revisla Cubana de Investigación

Biomédica. 1999; 18(3):203-207.

Silva, R., Fabry, B., and Boccaccini, A. R. Biomaterials Fibrous protein-based hydrogels for cell encapsulation. Biomaterials. 2014; 35(25), 6727-6738. Süchanek W. and Yoshimura M. Processing and Properties of Hydroxyapaíite

Based Biomaterials for Use as Hard Tissue Replacement Implants. Journal of Materials Research. 1998;13(1):94-117.

Vil!ora JM, Callejas P, Barba MF. Métodos de síntesis y comportamiento térmico del idroxiapatito. Boletín de la Sociedad Española Cerámica y

Wakitani S, Nawata M, Tensho K, Okabe T, Machida H, Ohgushi H. Repair of articular cartilage defects in the patello-femoral joint with autotogous bone marrow mesenchymal cell transplantation: three case reports involving nine defects in five knees. J Tissue Eng Regen Med. 2007; 1{1}:74— 9.

S., Liu, X., Yeung, K. W. K., Lius C, and Yang, X. Biomimetic porous scaffolds for bone tissue engineering. Materials Science & Engineering R. 2014; 80, 1-36.

ngang, W., Qiyin, L, Xinleí, H., Lie, M., Chuangang, Y,, and Yurong, Z. (2012). Fabrication and characterization of poly (L~lactide-co~glyco!ide) knitted mesh-reinforced collagen - chitosan hybrid scaffolds for dermal tissue engineering, Journal of the Mechanical Behavior of Biomediea! Materials. 2012; 8, 204-215.