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1. (WO2018221820) METHOD FOR ASSESSING IMMUNITY AND PROVIDING INFORMATION ON WHETHER OR NOT THE ONSET OF CANCER HAS BEGUN BY UTILIZING DIFFERENCE IN IMMUNE CELL DISTRIBUTION BETWEEN PERIPHERAL BLOOD OF COLORECTAL CANCER PATIENT AND NORMAL PERSON, AND DIAGNOSTIC KIT USING SAME
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4   5  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

6   7  

과제 해결 수단

8   9   10  

발명의 효과

11  

도면의 간단한 설명

12   13   14   15   16   17   18   19   20   21  

발명의 실시를 위한 최선의 형태

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청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23  

도면

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명세서

발명의 명칭 : 대장 직장암 환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포 차이를 이용하여 면역력을 평가하고 암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법 및 이를 이용한 진단키트

기술분야

[1]
본 발병은 대장 직장암을 포함한 암 환자와 정상인의 말초혈액 면역력을 측정 평가하고 두 그룹 사이에서 현저히 차이가 나는 마커를 찾아내고 이들의 조합에 의한 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 생성, 적용함으로써 대장 직장암 환자를 진단하고 면역 치료에 관한 기준을 제공한다.

배경기술

[2]
면역력(Immunity)은 암의 발병과 진행 및 전이 과정에 이르는 모든 과정에서 매우 밀접한 관계를 가지고 있다. 실제로 지금까지 연구된 많은 문헌을 통해 정도의 차이는 있지만 대부분 암 환자의 면역력이 현저하게 저하(Low) 또는 손상(Impaired)되어 있다고 보고되어 있는데(Olivera J. Finn, Cancer Immunology, N Engl J Med, 2008:358:2704-15) 이러한 연구 결과는 기존의 전통적인 암 치료 방법 (수술 및 항암요법)에서 탈피하여 새로운 치료 방법을 모색하는 계기가 되었으며 면역치료법(Immunotherapy)이라는 신개념 치료 방법의 등장을 이끌어 내게 되었다. 이에 따라 다양한 형태의 면역 치료법이 연구 개발되어 임상에서 실제 환자에 적용되고 있으며, 일부 면역 치료법은 가시적인 성과를 보이기도 한다.
[3]
면역력이라고 하는 것은 하나의 요소에 의해 결정되는 것이 아니고 면역 시스템(Immune system)을 이루고 있는 다양한 세포나 단백질(Immune cells and proteins) 등과 같은 여러 요인의 합(Net effect)에 의해 결정된다. 따라서 개인 면역력(Personal immunity)은 서로 다를 수밖에 없으며 시시각각 변화하게 된다. 이것은 면역치료에 있어 개인마다 서로 다른 면역력에 근거한 맞춤형 치료(Tailored personal immunotherapy)가 필요하다는 것을 의미한다. 일반적으로 치료(Treatment or Therapy)라고 하는 것은 어떠한 질병의 진단(Diagnosis)이 선행된 다음 그에 맞는 치료법이 결정되는 과정을 거치게 된다. 면역치료 역시 면역진단이(Immune diagnosis) 선행되어야만 그에 맞는 치료가 가능한데 대부분의 면역치료는 정확한 면역진단 없이 시행되고 있는 것이 현실이다. 이것은 앞서 언급한 바와 같이 개인의 면역력이 굉장히 복잡하여 면역력을 평가하고 진단하는 방법론적인 기준이나 근거가 정립되어 있지 않기 때문이다.
[4]
암을 진단하고 또한 예방하는 차원에서 가장 보편화된 방법은 영상의학적인 모니터링과 조직학적인 분석에 기초하는 것이다. 암을 예방하기 위한 정밀 검진은 매우 중요하지만 이는 시간과 비용을 요하는 과정으로 바쁜 현대인의 일상생활을 고려할 때 보편화되기 어렵다. 때문에 보다 간편하고 정확한 예방법을 찾아내기 위한 다양한 진단법이 연구되고 있다. 일반적으로 가장 손쉬운 방법은 주로 ELISA와 같은 방법을 이용하여 혈액의 종양 표지 마커(Cancer marker)를 찾아내어 암을 예측하는 것이다. 이는 혈액 샘플의 채취가 간단하고 ELISA 기법이 어렵지 않기 때문에 많이 시도되고 있는 방법 가운데 하나이다.
[5]
또한, 혈액시료(Blood sample) 안에는 단백질 이외에도 거의 대부분의 면역세포군(Immune cells)과 그의 아형 세포들(Immune cell subtypes)이 존재한다. 이러한 면역세포의 분석은 주로 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용하여 이루어진다. 유세포분석기를 이용하면 원하는 면역세포의 마커(Marker)를 형광 염색하고 유세포분석기법(FACS; Fluorescence-Activated Cell Sorting)을 이용하여 매우 간단하고 재현성 있게 면역세포 분석이 수행될 수 있다.

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[6]
본 발명의 목적은 암 면역력 진단을 위해 말초혈액 면역력(Peripheral blood immunity)을 구성하는 면역세포 가운데 대장 직장암 환자와 정상인에 있어 차이를 보이는 마커를 찾아내는 것이다.
[7]
또한, 본 발명의 목적은 이들의 조합을 통한 통계학적인 알고리즘을 정립하고 이를 기반으로 세포 계수기를 이용한 자연살해 세포(NK cell)의 세포수 계수 없이도 간편하고 손쉽게 자연살해 세포의 세포활성도를 측정하여 개체의 면역 활성을 진단하고 그에 맞는 면역 치료법을 제공하는 것이다.

과제 해결 수단

[8]
본 발명에 의하면 대장 직장암 환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포 차이를 이용하여 말초혈액의 면역력을 평가하고 이를 이용해 대장 직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액 면역세포의 중 세포 크기 및 주름진 정도를 분석해 림프구세포(lymphocytes), 단핵구세포(monocytes), 및 과립구(granulocytes)를 분류하는 단계; (B) 적어도 하나의 항체 조합으로 상기 세 종류의 면역세포의 표지 마커를 염색하여 암환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포를 분석하는 단계; (C) 암환자와 정상인 사이에서 암 발생 유무를 판별할 수 있도록 암환자와 정상인 두 집단에서 유의미한 표지 마커의 결과 값이 통계적 유의성을 보이면서 차이가 나는 조합을 판별하는 단계; 및 (D) 상기 표지 마커를 이용해 유세포분석기나 세포 계수기 등을 이용한 자연살해 세포의 계수 없이도 단위 혈액당 면역력을 측정하여 대장 직장암 발병 유무를 진단하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
[9]
또한, 본 발명에 의하면 상기 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체가 제공된다.
[10]
또한, 본 발명에 의하면 상기 방법에 의해 대장 직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 진단키트가 제공된다.

발명의 효과

[11]
본 발명에 의하면 혈액시료(Blood sample) 내 함유된 면역세포들 중 유의미한 표지 마커를 선정할 수 있고, 이를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 회귀분석 알고리즘을 통해 암 면역력을 진단할 수 있다. 이것은 예방적인 차원에서 정밀검사를 받는 것과 비교하여 매우 간단하고 검사 방법도 빠르며 상당한 비용을 절감할 수 있으며 충분한 정확성을 제공한다는 장점이 있다. 또한, 기존에 알려진 혈액 내 종양 표지자(Cancer biomarker)를 측정하여 진단하는 ELISA에 비해 재현성(Reproducibility)과 안정성(Stability)을 높여 검사의 신뢰도를 높일 수 있다는 장점이 있다.

도면의 간단한 설명

[12]
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 NKC분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[13]
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Th1/Th2 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[14]
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 분석을 위한 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[15]
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Regulatory T cells(Tregs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[16]
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Cytotoxic T cells(CTLs) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[17]
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Exhausted T cells(ETc) 분석을 위해 CD279+TIGIT+ in CTLs 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[18]
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Immune checkpoint(ICP) 분석을 위해 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[19]
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Gamma-delta T cells(GDT) 분석을 위해 CD3-γδTCR+ 세포 표현형을 설명하기 위한 도면.
[20]
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 E score를 이용하여 만든 Receiver operating characteristic curve.
[21]
도 10은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 2개의 E score cut value를 이용하여 암 면역력을 E1 E2 E3의 3단계로 제공하는 모형을 도시한 도면.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

[22]
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예의 예시로서 도시되는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 실시예는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소나 단계의 위치, 순서 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.
[23]
이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
[24]
본 발명에서의 세포 분석은 기본적으로 유세포분석기(Flow cytometer)를 이용하였으며, White blood cell subtype(WBCS)에 포함되는 하기와 같은 6종의 면역세포(WBC, Lymphocytes, Neutrophils, Monocytes, Basophils, Eosinophils)는 자동혈구분석기(Automatic hematology analyzer)를 이용하여 분석하였다.
[25]
본 발명은 대장 직장암 수술 전 환자와 정상인의 혈액에서 다음과 같이 9가지로 분류되는 면역 세포군에서 발현되는 표지 마커를 토대로 각각의 표지 마커에 대한 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포 수(cells/μL) 및 그 비율(Ratio)로 표현하였으며, 이것은 면역세포의 기능 및 분석 방법적으로 다음과 같은 카테고리로 분류될 수 있다.
[26]
1) NK cells(NKC)
[27]
2) Th1Th2(TH)
[28]
3) Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs)
[29]
4) Regulatory T cells(Tregs)
[30]
5) Cytotoxic T cells(CTLs)
[31]
6) Exhausted T cells(ETc)
[32]
7) Immune checkpoint(ICP)
[33]
8) Gamma-delta T cells(GDT)
[34]
9) White blood cell subtype(WBCS)
[35]
상기 9가지 면역 세포군은 무수히 많은 세포막(Cell surface) 및 세포질(Intracellular) 수용체 또는 신호 전달 물질을 지니고 있는데 이러한 세포 물질을 세포의 마커라 볼 수 있으며 이는 면역세포 고유의 기능을 결정짓는 역할을 하게 된다. 또한, 세포의 마커 가운데 일부는 그 기능과 발현 정도가 암의 발병 및 진행 과정과 매우 밀접한 관계를 가지고 있다. 실제로도 현재 면역치료의 주가 되는 것 가운데 하나는 면역세포의 마커를 통한 신호 전달을 증폭시키거나 차단함으로써 암세포의 증식을 억제하는 것이다(Katheleen M. Mahoney, Combination cancer immunotherapy and new immunomodulatory targets, 2015, Nat Rev Drug Discov).
[36]
본 발명은 이러한 점에 착안하여 주요한 세포 면역 표지 마커를 유의미한 군으로 분류하고 정리하여 선별하였다. 또한, 선별된 마커가 실제로 말초혈액 면역력 단위에서도 대장 직장암 환자와 정상인 두 그룹 사이에서 의미 있는 발현 정도의 차이를 나타내며 진단 마커로서 유용성이 있는지를 직접 테스트하였다. 통계적으로 유의성이 확인된 마커들이 본 발병자들에 의해 실제 확인되었지만 이러한 마커들은 단일 항목으로서 대장 직장암 환자와 정상인을 진단하거나 구분 지을 수 있을 만큼의 충분한 민감도(Sensitivity)와 특이도(Specificity)를 나타내지는 않았다. 이에 대장 직장암 환자와 정상인의 두 그룹에 있어 통계적인 유의성을 보이는 마커들이 유의미한 정보를 제공할 수 있도록 이를 조합하고 두 그룹의 차이점을 수식으로 구분 지을 수 있는 알고리즘을 발명하게 되었다. 본 발명에 이용된 수식 모형은 이분형 로지스틱 회귀분석에 기초한 것이다. 본 발명을 통해 다양한 조합의 마커를 이용하여 다양한 회귀분석 모형을 얻을 수 있었으며, 대장 직장암 환자와 정상인을 진단하는데 80% 이상의 민감도와 특이도를 나타내어 말초혈액 면역력을 평가하고 암을 조기에 진단하는 기술이 가능하다는 것을 확인하게 되었다. 임상진단에 있어 어떠한 진단법이 유용하게 받아들여지기 위해서는 80% 이상의 민감도와 특이도를 가질 것이 통상적으로 요구된다.
[37]
이하에서는 다양한 조합의 마커를 이용하여 80% 이상의 민감도와 특이도를 가지도록 대장 직장암 환자와 정상인을 진단할 수 있는 방법에 대하여 실시예와 이로부터 도출된 데이터를 기반으로 보다 상세히 설명한다.
[38]
말초혈액 면역세포의 형광염색을 통한 유세포분석
[39]
대장 직장암 환자 98명 및 정상인 132명으로부터 각각 말초혈액 5 cc(5 ㎖)를 채혈하여 혈액 응고를 방지하기 위한 헤파린-EDTA 튜브(Heparin-EDTA tube)에 담아 실온 상태에서 분석실로 운반해 즉시 분석을 진행하였다.
[40]
각각의 면역세포 마커를 분석하기 위해 다음과 같은 8가지 면역세포 카테고리로 분류하였으며, 8개의 폴리스티렌 튜브(12x75mm Polystyrene tube)를 준비하였다. 각각의 8개 튜브에서는 다음과 같은 항체조합이 사용되었고 각 항체의 볼륨은 아래 표 1 내지 8과 같다. 표 1 내지 표 8은 각각 NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Exhausted T cells(ETc), Immune checkpoint(ICP), Gamma-delta T cells(GDT)의 마커를 분석하기 위한 항체로서 모든 항체는 항-인간 마우스 이뮤노글로불린(mouse anti-human IgGs)에 형광 물질(fluorescence dye)이 부착되어 있는 형태이며 본 발명에서 사용된 형광의 종류는 FITC, Alexa Fluor 488, PE, PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP, 및 APC의 7종이다. 각 표의 상단 항목에서 Channel은 유세포분석기의 디텍터 채널 종류를, Tandem-dye는 항체에 부착된 형광의 종류를, Marker는 표지 마커의 종류를, Marker location은 각 마커의 위치를 의미하여 각 마커의 위치에 따라 하기 설명하는 바와 같이 실험방법에 차이가 있을 수 있다.
[41]
[표1] NK cells(NKC)
Channel Tandem-dye Marker Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 surface BD 555339 6125658 0.5
FL2 PE CD56 surface BD 555516 6054620 2.5
FL3 PE-Cy7 CD314 surface BD 562365 6140911 2.5
FL4 APC CD158b surface BioLegend 312612 B210467 0.5

[42]
[표2] Th1Th2(TH)
Channel Tandem-dye Target Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 Alexa Fluor488 CD183 surface BD 558047 6155849 0.5
FL2 PE CD194 surface BD 551120 5107877 0.5
FL3 PE-Cy5 CD4 surface BD 555348 5037589 0.5
FL4 APC CD196 surface BD 560619 5135834 0.15

[43]
[표3] Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs)
Channel Tandem-dye Target Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 surface BD 555339 6125658 0.5
FL1 FITC CD19 surface BD 555412 5097663 0.5
FL1 FITC CD56 surface BD 340410 6141554 2.5
FL2 PE CD11b surface BD 555388 4314750 0.1
FL3 PE-Cy5 HLA-DR surface BD 555813 6132725 2.5
FL4 APC CD33 surface BD 551378 4288542 0.1

[44]
[표4] Regulatory T cells(Tregs)
Channel Tandem-dye Target Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD4 surface BD 555346 5097644 0.5
FL2 PE CD25 surface BD 555432 6040885 2.5
FL3 PE-Cy7 CD152 intra BD 555854 5142830 2.5
FL4 APC CD279 surface BD 558694 6154800 2.5

[45]
[표5] Cytotoxic T cells(CTLs)
Channel Tandem-dye Target Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 surface BD 555339 6125658 0.5
FL2 PE CD25 surface BD 555432 6040885 2.5
FL3 PE-Cy7 CD152 intra BD 555854 5142830 2.5
FL4 APC CD279 surface BD 558694 6154800 2.5

[46]
[표6] Exhausted T cells(ETc)
Channel Tandem-dye Target Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 surface BD 555339 6125658 0.5
FL2 PE TIGIT Surface eBioseience 12-9500-42 4310012 2.5
FL3 PerCP CD8 Surface eBioseience 46-0087-41 E10832-1634 2.5
FL4 APC CD279 Surface BD 558694 6154800 2.5

[47]
[표7] Immune checkpoint(ICP)
Channel Tandem-dye marker Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 Surface BD 555339 6125658 0.5
FL2 PE CD366 Intra BD 563422 5082811 1
FL3 PerCP CD272 Intra R&D systems FAB3354C ABCC212071 1
FL4 APC CD223 intra R&D systems FAB23193A ADXM0116041 2.5

[48]
[표8] Gamma-delta T cells(GDT)
Channel Tandem-dye marker Marker location Distributor Catalog# Lot# Volume/test
FL1 FITC CD3 Surface BD 555339 6125658 0.5
FL2 PE γδTCR surface BD 555717 5267944 1

[49]
기본적인 염색 방법은 다음과 같은 과정으로 진행 되었다.
[50]
① 염색하고자 하는 각 항체의 테스트당 볼륨(volume/test)을 마이크로피펫(micro pipette)으로 1.8mL 볼륨의 미세원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 분주한다. 각 항체의 조합 볼륨은 테스트당 10μL가 되도록 준비한다. 또한, 항체 조합은 염색하고자 하는 마커의 부위(marker location)가 모두 세포막(surface)인지 또는 세포막(surface)과 세포질(intra)의 조합인지에 따라 준비가 달라지는데 기본적인 염색은 먼저 세포막(surface) 마커만 염색하기 위한 항체를 조합하여 세포를 염색하고 세포를 고정한 다음(Fixation) 세포질(intra) 마커를 준비하여 염색하는 방식으로 이루어진다.
[51]
예를 들어 마커의 부위가 세포막(surface)의 조합으로만 구성된 NK cell(NKC)을 10 tests(10명)로 분석하고자 할 경우에는, FITC mouse anti-human CD3 IgGs의 5μL(0.5μL x 10 tests), PE mouse anti-human CD56 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), PE-Cy7 mouse anti-human CD314 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), APC mouse anti-human CD158b IgG의 5μL(0.5 μL x 10 tests)을 각각 미세원심분리 튜브에 넣어 60μL를 준비한다. 그런 다음 40μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
[52]
다른 예로 마커의 부위가 세포막(surface)과 세포질(intra) 조합으로 구성된 Tregs을 10 tests(10명)로 분석하고자 할 경우에는, 항체 조합 튜브를 2개 준비한다.
[53]
먼저, 첫 번째 튜브에 세포막(surface) 염색 항체인 FITC mouse anti-human CD4 IgGs의 5μL(0.5μL x 10 tests), PE mouse anti-human CD25 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests), APC mouse anti-human CD279 IgG의 5μL(0.5μL x 10 tests)을 각각 미세원심분리튜브에 넣어 35μL를 준비한다. 그런 다음 65μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
[54]
그런 다음 두번째 튜브에 세포질(intra) 염색 항체인 PE-Cy5 mouse anti-human CD152 IgGs의 25μL(2.5μL x 10 tests)을 준비하고 75μL의 PBS(Phosphate-buffered saline)를 튜브에 넣어 최종적으로 100μL의 항체조합 볼륨을 만든다.
[55]
이와 같은 방법으로 마커의 부위가 세포막의 조합으로 구성된 NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Exhausted T cells(ETc), Gamma-delta T cells(GDT)의 염색 항체를 준비하고, 마커의 부위가 세포막과 세포질의 조합으로 구성된 Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Immune checkpoint(ICP)의 염색 항체를 세포막과 세포질 염색용으로 각각 준비한다. 각 항체의 구성 부피비는 표 1 내지 표 8의 volume/test비를 통해 적시한 바와 같으므로 위 예시와 같은 방법으로 항체조합 볼륨을 준비할 수 있다.
[56]
② 염색을 위한 모든 항체조합 튜브가 준비되면 각각의 8개 폴리스티렌 튜브에 50μL의 전혈(whole blood)을 분주한다.
[57]
③ 미리 준비된 항체 조합이 담겨 있는 튜브(세포막(surface)용 항체조합)에서 혈액에 들어 있는 테스트 튜브로 항체 조합을 10μL씩 분주하고 마이크로피펫으로 잘 섞어준다. 그런 다음 빛을 차단한 상태의 실온에서 20분간 염색한다.
[58]
④ 세포 염색이 끝나면 혈액의 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 450μL의 lysing solution(BD FACS Lysing solution, DB Biosciences)을 각각의 8개 폴리스티렌 튜브에 분주하고 vortex로 잘 섞어서 20분간 빛을 차단한 실온에서 반응시킨다.
[59]
⑤ 2mL의 PBS를 각각 튜브에 분주하고 원심분리기에 넣어 5분간 250 중력가속도(G force)로 돌린다. 그런 다음 상층액을 버리고 한 번 더 2mL의 PBS로 동일하게 원심분리기로 세포를 세척한다.
[60]
⑥ 세포막(surface)만의 조합 항체로 염색이 되었으면 200μL의 PBS를 튜브에 넣고 잘 섞어준 다음 유세포분석기를 이용해 분석을 진행한다.
[61]
⑦ 세포막(surface) 및 세포질(intra) 염색 조합의 항체인 경우에는 상기 ⑤ 과정이 끝난 이후 0.05% saponine 함유 Distilled water 40μL을 미리 준비된 세포질(intra) 염색용 항체 10μL와 동시에 튜브에 넣어주고 잘 섞어준 다음 실온에서 빛을 차단한 상태에서 20분간 2차 염색을 진행한다. 그런 다음 ⑤ 과정을 거쳐 200μL의 PBS를 튜브에 넣고 유세포분석기로 분석을 진행한다.
[62]
유세포분석을 통해 얻게 되는 결과 값은 모두 분포도(%)로 얻어지게 되는데 각 분포도에 따른 세포 수(cells/μL)는 자동혈구 분석기를 이용해 얻은 백혈구 세포의 차등(differential)을 이용하여 분포도에 곱하는 방식으로 계산될 수 있다.
[63]
예를 들어, CD3-CD56+ NK cells = 15% 일 경우, 그 세포 수는 림프구 세포 3000 cells/μL을 이용하여 3000 x 0.15 = 450cells/μL로 계산된다.
[64]
위와 같은 실험 과정을 통해 유세포분석기를 이용한 면역세포의 각 마커 분석 결과를 도 1 내지 8에 나타내었으며, 대장 직장암 환자와 정상인을 분석한 통계 처리 결과 값을 표 9 내지 18에 표시하였다. 참고로 도 1 내지 도 8, 도 10은 반시계방향으로 90도 회전되어 있으므로 이하에서는 위 도면들은 시계 방향으로 90도 회전시킨 것을 기준으로 설명함을 밝혀둔다.
[65]
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 NKC분석을 위해 ① CD3-CD56+, ② CD3+CD56+, ③ CD314+CD158b- in CD3-CD56+ cells (NK cells), ④ CD314-CD158b+ in NK cells, ⑤ CD314-CD158b+ in NK cells, ⑥ CD158b+ in CD3+CD56- (T cells)와 같이 6가지 세포 표현형을 제공한다.
[66]
보다 상세히, 도 1의 왼쪽 상단 그래프의 경우 유세포분석기로 혈액을 분석하면 X축을 FSC-H(세포의 상대적 크기)로 Y축을 SSC-H(세포의 주름진 정도)로 세포들을 분류할 수 있는데, 말초혈액 면역세포를 세포 크기 및 주름진 정도에 따라 림프구세포(lymphocytes), 단핵구세포(monocytes), 및 과립구(granulocytes)로 분류할 수 있다. 이중 그래프 중심부근의 림포사이트(Lymphocytes)를 중심으로 분석을 진행하였으며, 이 부분을 각 마커에 부착되는 항체를 이용해 염색을 진행한 결과이다. 오른쪽 상단 그래프의 경우 X축은 CD3의 염색 유무를 Y축은 CD56의 염색 유무를 나타내는데 그래프 내부의 십자 모양의 실선을 중심으로 왼쪽은 CD3- 오른쪽은 CD3+, 아래쪽은 CD56- 위쪽은 CD56+로 볼 수 있다. 이 경우 CD3-CD56+ 부분을 Q1, CD3+CD56+ 부분을 Q2, CD3+CD56- 부분을 Q3, CD3-CD56- 부분을 Q4로 지정하였다. 왼쪽 하단의 그래프의 경우 Q1 지역의 세포들을 다시 항체를 이용해 CD314, CD158 마커의 염색 유무에 따라 분류한 것으로서 그래프의 표현방법은 앞서 설명한 바와 같다. 오른쪽 하단 그래프의 경우 오른쪽 상단 그래프의 Q3 지역의 세포들을 다시 항체를 이용해 CD314, CD158 마커의 염색 유무에 따라 분류한 것으로서 그래프의 표현방법은 앞서 설명한 바와 같다.
[67]
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Th1/Th2 분석을 위해 ① Th1, ② Th2, ③ Th17, ④Th1/Th2와 같이 4가지 세포 표현형을 제공한다.
[68]
보다 상세히, 도 2 역시 도 1의 림포사이트 부분의 세포를 이용해 분석한 결과로서 항체를 순차적으로 또는 동시에 넣어 각 마커 CD4, CD183, CD194, CD196의 염색 유무를 분류하여 분석한 결과를 도시하였으며, 그래프의 X축과 Y축에 넣은 항체와의 반응 유무를 수치로 표현하였으며, 그래프 내에 실선을 통해 각 구역을 세분화하였다. 상세한 방법은 도 1을 통하여 설명한 바와 같다. 한편, Th1, Th2, Th17의 분포도는 아래와 같은 수학식 1에 의해 구해진다.
[69]
[수식1]


[70]


[71]


[72]


[73]
도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 분석을 위한 세포 표현형을 제공한다.
[74]
보다 상세히, 그래프의 표현 방법은 도 1을 통하여 설명한 바와 같고, 도면에서와 같이 HLA-DR 및 Lineage 계열(CD3CD19CD56) 모두 음성(negative)인 세포 집단(Q4) 안에서 CD33+과 CD11b+를 발현하는 세포를 표현형으로 하며 MDSCs는 다음 수학식 2와 같이 구해질 수 있다.
[75]
[수식2]


[76]
도 4는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Regulatory T cells(Tregs) 분석을 위해 ① CD4+CD279+, ② CD4+CD25+, ③ CD4+CD152+와 같이 3가지 세포 표현형을 제공한다. 도 4 내지 도 8을 통하여 나타낸 그래프의 표현은 도 1을 통하여 설명한 바와 같으므로 자세한 설명은 생략한다.
[77]
도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Cytotoxic T cells(CTLs) 분석을 위해 ① CD152+ in CTLs, ② CD279+ in CTLs와 같이 2가지 세포 표현형을 제공한다.
[78]
도 6은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Exhausted T cells(ETc) 분석을 위해 CD279+TIGIT+ in CTLs 세포 표현형을 제공한다.
[79]
도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Immune checkpoint(ICP) 분석을 위해 ① CD3+CD366+, ② CD3-CD366+, ③ CD366+ in lymphocytes, ④ CD3+CD272+, ⑤ CD3-CD272+, ⑥ CD272+ in lymphocytes, ⑦ CD3+CD223+, ⑧ CD3-CD223+, ⑨ CD223+ in lymphocytes와 같이 9가지 세포 표현형을 제공한다.
[80]
도 8은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 Gamma-delta T cells(GDT) 분석을 위해 CD3-γδTCR+ 세포 표현형을 제공한다.
[81]
한편, 표 9는 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 NKC의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 10은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 TH의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 11은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 MDSCs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 12는 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 Tregs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 13은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 CTLs의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 14는 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 ETc의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 15는 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 ICP의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 16은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 GDT의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 17은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 WBCS의 평균 분포도 및 세포 수를 나타낸 표이다. 표 18은 대장 직장암 환자 및 정상인의 말초혈액 면역세포의 비(Ratio)를 나타낸 표이다.
[82]
상기 각 표의 상단 항목에서 N은 실험군의 숫자, Mean은 평균값, S.D.는 표준편차, S.E.는 표준에러, 95% Mean은 오차율을 줄이기 위해 집단의 양 말단의 결과치 2.5%씩을 버리고 95%만을 이용해 계산한 평균값, Median은 중앙값을 의미한다.
[83]
[표9]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
NKC CD3-CD56+(NK) % Control 132 16.50 8.08 0.70 16.00 14.82 0.183
Patients 98 17.79 10.05 1.28 17.20 16.21
NKC CD3+CD56+ % Control 132 5.00 4.17 0.36 4.45 3.77 0.065
Patients 98 3.67 2.50 0.32 3.49 3.00
NKC CD3-CD56+ cells/μL Control 132 342 198 17 325 313 0.284
Patients 98 345 206 26 330 304
NKC CD3+CD56+(NKT) cells/μL Control 132 108 109 10 93 76 0.129
Patients 98 76 64 8 70 56
NKC CD314+ CD158b - % in NK cells Control 132 56.19 16.45 1.48 56.60 57.14 0.030
Patients 98 47.04 18.02 2.29 47.12 49.41
NKC CD314+CD158b- cells/μL in NK cells Control 132 181 151 13 178 155 0.084
Patients 98 162 114 14 152 133
NKC CD314- CD158b + % in NK cells Control 132 1.82 2.51 0.23 1.47 1.11 0.000
Patients 98 6.46 5.67 0.72 6.00 5.08
NKC CD314- CD158b + cells/ μL in NK cells Control 132 6 9 1 5 3 0.000
Patients 98 20 19 2 19 13
NKC CD314+ % in CD3+CD56-(T cells) Control 132 41.98 9.53 0.86 41.93 41.31 0.007
Patients 98 33.13 10.40 1.32 32.73 33.11
NKC CD314+ cells/μL in T cells Control 132 541 292 25 561 524 0.543
Patients 98 449 222 28 436 428
NKC CD158b+ % in T cells Control 132 5.84 10.28 0.93 4.32 3.51 0.578
Patients 98 5.79 5.19 0.66 5.06 4.12
NKC CD158b+ cells/μL in T cells Control 132 76 134 12 60 48 0.477
Patients 98 79 83 11 68 53

[84]
[표10]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
TH CD4+ % control 132 38.02 7.90 0.69 38.11 38.00 0.000
Patients 98 43.08 10.01 1.27 43.12 42.32
TH CD4+ cells/ μL control 132 780 249 22 774 771 0.002
Patients 98 905 413 52 885 865
TH Th1 % control 132 14.21 5.17 0.45 14.05 13.51 0.009
Patients 98 13.93 5.22 0.66 13.68 13.52
TH Th1 cells/μL control 132 109 50 4 108 101 0.757
Patients 98 123 72 9 116 109
TH Th2 % control 132 13.36 3.57 0.31 13.18 12.83 0.001
Patients 98 16.45 4.60 0.58 16.42 15.74
TH Th2 cells/ μL control 132 102 37 3 100 97 0.000
Patients 98 143 66 8 141 144
TH Th17 % control 132 9.50 3.15 0.27 9.43 9.16 0.633
Patients 98 9.54 3.90 0.49 9.32 8.58
TH Th17 cells/ μL control 132 72 28 2 71 70 0.003
Patients 98 85 57 7 79 78

[85]
[표11]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
MDSCs MDSCs % control 132 35.70 13.40 1.17 35.51 34.96 0.274
Patients 98 44.13 16.19 2.06 44.75 47.21
MDSCs MDSCs cells/ μL control 132 2212 1227 107 2111 1938 0.005
Patients 98 3333 1815 231 3231 3132

[86]
[표12]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
Tregs CD4+CD279+(PD-1) % control 132 7.07 2.42 0.21 6.92 7.00 0.000
Patients 98 12.59 4.84 0.61 12.30 12.07
Tregs CD4+CD279+ cells/ μL control 132 146 62 5 142 132 0.000
Patients 98 256 131 17 248 224
Tregs CD4+CD25+ % control 132 15.54 4.36 0.38 15.38 15.85 0.000
Patients 98 21.17 5.92 0.75 21.31 21.31
Tregs CD4+CD25+ cells/ μL control 132 317 119 10 310 295 0.003
Patients 98 445 230 29 427 402
Tregs CD4+CD152+( CTLA -4) % control 132 5.07 1.72 0.15 4.93 4.76 0.000
Patients 98 8.51 4.75 0.60 8.01 7.32
Tregs CD4+CD152+ cells/ μL control 132 103 40 3 100 99 0.000
Patients 98 169 92 12 163 145

[87]
[표13]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
CTLs CD3+ % control 132 65.37 8.88 0.77 65.71 65.82 0.116
Patients 98 65.37 10.45 1.33 65.45 67.05
CTLs CD3+ cells/μL control 132 1353 426 37 1339 1309 0.149
Patients 98 1371 553 70 1355 1379
CTLs CD3+CD8+ % control 132 27.37 7.96 0.69 26.92 26.28 0.014
Patients 98 22.30 7.09 0.90 22.10 21.41
CTLs CD3+CD8 cells/μL control 132 574 268 23 550 514 0.282
Patients 98 466 228 29 451 426
CTLs CD279+ % in CTLs control 132 21.55 12.63 1.10 20.13 19.31 0.000
Patients 98 33.82 10.79 1.37 33.54 32.25
CTLs CD279+ cells/μL in CTLs control 132 122 88 8 111 90 0.069
Patients 98 147 68 9 141 140
CTLs CD152+ % in CTLs control 132 19.13 12.17 1.06 17.29 16.79 0.000
Patients 98 24.30 9.92 1.26 23.62 22.16
CTLs CD152+ cells/μL in CTLs control 132 104 67 6 95 89 0.010
Patients 98 108 59 8 103 105

[88]
[표14]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
ETc CD279+TIGIT+ % in CTLs control 132 15.09 8.99 0.82 14.32 12.54 0.000
Patients 98 26.50 9.68 1.71 26.99 26.02

[89]
[표15]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
ICP CD3-CD366+ (TIM3) % Control 132 14.81 7.26 0.63 14.44 13.74 0.609
Patients 98 17.00 8.84 1.14 16.18 15.94
ICP CD3-CD366+ cells/μL Control 132 307 180 16 293 277 0.358
Patients 98 315 183 23 308 301
ICP CD3+CD366+ % Control 132 5.78 2.67 0.23 5.62 5.37 0.295
Patients 98 6.20 3.14 0.41 5.98 5.43
ICP CD3+CD366+ cells/μL Control 132 119 65 6 114 100 0.436
Patients 98 123 84 11 120 108
ICP CD366+ % in Lymphocytes Control 132 20.61 7.02 0.61 20.29 19.64 0.892
Patients 98 23.20 8.47 1.09 22.46 22.85
ICP CD366+ cells/μL in Lymphocytes Control 132 427 195 17 413 384 0.574
Patients 98 438 203 26 436 422
ICP CD3-CD272+ (BTLA) % Control 132 4.94 2.40 0.21 4.70 4.53 0.889
Patients 98 5.33 2.91 0.38 4.98 4.51
ICP CD3-CD272+cells/μL Control 132 99 54 5 94 90 0.427
Patients 98 96 48 6 94 90
ICP CD3+CD272+ % Control 132 5.81 2.58 0.22 5.64 5.28 0.019
Patients 98 7.04 3.37 0.43 6.71 6.04
ICP CD3+CD272+cells/μL Control 132 120 69 6 114 111 0.099
Patients 98 137 79 10 135 122
ICP CD272+ % in Lymphocytes Control 132 10.73 3.82 0.33 10.52 10.42 0.134
Patients 98 12.37 5.15 0.66 11.94 10.63
ICP CD272+ cells/μL in Lymphocytes Control 132 219 106 9 210 207 0.460
Patients 98 233 111 14 235 232
ICP CD3-CD223+ (LAG3) % Control 132 4.67 3.67 0.32 4.17 3.94 0.344
Patients 98 6.42 4.50 0.59 5.95 5.15
ICP CD3-CD223+ cells/μL Control 132 93 64 6 86 73 0.374
Patients 98 117 89 11 114 108
ICP CD3+CD223+ (LAG3) % Control 132 4.29 2.46 0.21 4.07 3.93 0.000
Patients 98 6.91 4.32 0.56 6.54 6.01
ICP CD3+CD223+ cells/μL Control 132 90 65 6 83 73 0.001
Patients 98 135 101 13 133 129
ICP CD223+ % in Lymphocytes Control 132 9.00 4.70 0.41 8.63 8.00 0.003
Patients 98 13.34 7.42 0.97 12.75 11.60
ICP CD223+ cells/μL in Lymphocytes Control 132 183 105 9 175 161 0.013
Patients 98 252 166 21 252 232

[90]
[표16]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
GDT TCR γδ % control 132 6.86 5.74 0.50 6.13 5.10 0.825
Patients 98 4.58 3.98 0.51 4.10 3.03
GDT TCR γδ cells/μL control 132 142 128 11 125 108 0.593
Patients 98 95 94 12 83 70

[91]
[표17]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
WBCs WBC cells/μL control 132 5973 1565 136 5887 5750 0.000
Patients 98 7369 2221 282 7206 7100
WBCs Lymphocytes % control 132 35.43 8.51 0.74 35.40 35.90 0.005
Patients 98 29.11 9.67 1.23 28.99 30.35
WBCs Neutrophils % control 132 54.41 9.91 0.86 54.52 53.95 0.010
Patients 98 61.24 10.78 1.37 61.04 59.65
WBCs Neutrophils cells/μL control 132 3311 1275 111 3217 3099 0.000
Patients 98 4623 2081 264 4401 4145
WBCs Neutrophils/Lymphocytes control 132 1.72 0.88 0.08 1.63 1.52 0.007
Patients 98 2.58 1.66 0.21 2.38 1.93
WBCs Lymphocytes cells/μL control 132 2066 574 50 2050 2009 0.485
Patients 98 2056 702 89 2032 2085
WBCs RBC control 132 4.63 0.41 0.04 4.63 4.67 0.066
Patients 98 4.28 0.59 0.08 4.27 4.24
WBCs Hemoglobin control 132 13.83 1.31 0.13 13.83 13.60 0.071
Patients 98 12.83 2.49 0.32 12.77 12.80
WBCs monocytes % control 132 6.81 1.86 0.18 6.77 6.60 0.042
Patients 98 6.11 2.62 0.33 5.96 5.90
WBCs eosinophil % control 132 2.63 2.21 0.21 2.40 2.10 0.004
Patients 98 1.26 1.34 0.17 1.05 0.90
WBCs basophil % control 132 0.46 0.31 0.03 0.43 0.40 0.000
Patients 98 0.28 0.18 0.02 0.26 0.20

[92]
[표18]
Group Statistics
Category Parameter State N Mean S.D. S.E. 95% Mean Median P value
Ratio CD4/CD8 ratio control 132 1.53 0.63 0.05 1.49 1.42 0.001
Patients 98 2.20 1.09 0.14 2.10 2.06
Ratio CD3+CD8+/CD3-CD56+(CTNR) control 132 2.27 1.96 0.17 2.06 2.00 0.253
Patients 98 1.92 1.63 0.21 1.74 1.39
Ratio CTLs/Treg control 132 1.97 1.06 0.09 1.87 1.71 0.019
Patients 98 1.21 0.75 0.10 1.12 1.05
Ratio Th17/Treg control 132 0.69 0.40 0.04 0.68 0.69 0.220
Patients 98 0.50 0.28 0.04 0.47 0.44
Ratio TH1/TH2 ratio control 132 1.15 0.55 0.05 1.13 1.00 0.000
Patients 98 0.91 0.43 0.05 0.89 0.92

[93]
이분형 로지스틱 회귀분석 모형을 통한 대장 직장암 진단 방법
[94]
상기 표 9 내지 18 에서 표시한 바와 같이 전체 정상인 132명 및 환자 98명의 말초혈액 면역세포를 분석한 결과, 유의수준 P value < 0.05 에서 두 그룹 간 차이를 보이는 면역세포의 마커가 존재함을 확인할 수 있었으며 표에서 볼드체 및 이탤릭 체로 표시한 부분이 유의미한 면역세포의 마커라 할 수 있다. 두 그룹 간 평균값의 차이는 통계프로그램 SPSS를 이용하여 분석하였다. 모집단이 정규분포를 따르고 등 분산 조건을 만족함으로 평균값의 통계적 차이는 T 검정 student's t -test를 사용하였다.
[95]
이를 통해 말초혈액 내의 각 면역세포의 분포도와 세포 수를 측정하고 암 면역력 특이적 면역세포 마커를 이용하여 대장 직장암 환자와 정상인을 정확하게 분류할 수 있으며, 면역력 검사를 통한 암 진단 역시 가능할 수 있다. 이와 같이 신뢰성 있는 암 진단을 위해 대장 직장암 환자와 정상인의 말초혈액 면역력 차이를 보다 극명하게 나타낼 수 있도록 수식화된 이분형 로지스틱 회귀분석 모형을 암 진단에 적용하게 되었다.
[96]
알고리즘을 완성하기 위해 대장 직장암 환자와 정상인을 종속 변수로 하여 각각 1과 0으로 변환하였으며 독립 변수로는 상기 표 9 내지 18에서 보는 바와 같이 면역세포 마커 결과 값을 사용하였다. 그러면서 정상인 132명과 대장 직장암 환자 98명의 두 그룹을 가장 잘 구분 지을 수 있는 항목을 선별하였다.
[97]
[표19]
Variables in the Equation
B S.E. Wald df Sig. Exp(B) 95%C.I.for Exp(B)
Lower Upper
Step 1a CD4+% -.403 .183 4.841 1 .028 .668 .467 .957
Step 1a CD3+CD8+% -.468 .175 7.183 1 .007 .626 .445 .882
Step 1a CD4+CD279+% .961 .380 6.400 1 .011 2.613 1.242 5.500
Step 1a CD4+CD25+% .646 .248 6.803 1 .009 1.908 1.174 3.102
Step 1a CD4+CD152+% .001 .359 .000 1 .997 1.001 .496 2.023
Step 1a CD279+% in CTLs -.093 .061 2.328 1 .127 .911 .809 1.027
Step 1a CD152+% in CTLs .131 .063 4.371 1 .037 1.140 1.008 1.290
Step 1a CD3+CD272+% .623 .246 6.425 1 .011 1.865 1.152 3.020
Step 1a CD3+CD223+ .479 .265 3.265 1 .071 1.614 .960 2.714
Step 1a Lymphocytes% -.221 .152 2.114 1 .146 .801 .595 1.080
Step 1a Neutrophils% -.174 .103 2.863 1 .091 .840 .687 1.028
Step 1a NLR -1.056 1.043 1.025 1 .311 .348 .045 2.687
Step 1a CTLs/Treg 4.576 1.669 7.518 1 .006 97.096 3.687 2556.975
Step 1a CD314+CD158b-% in NK cells -.011 .025 .203 1 .652 .989 .942 1.038
Step 1a CD314-CD158b+% in NK cells .739 .254 8.427 1 .004 2.093 1.271 3.447
Step 1a CD314+ in T cells -.140 .113 1.541 1 .215 .870 .698 1.084
Step 1a Th1% .450 .272 2.734 1 .098 1.568 .920 2.673
Step 1a Th2% .074 .196 .141 1 .707 1.076 .733 1.582
Step 1a TH1/TH2 -7.516 3.871 3.769 1 .052 .001 .000 1.075
Step 1a MDSCs cells/μL -.001 .000 2.133 1 .144 .999 .998 1.000
Step 1a monocytes% .495 .284 3.033 1 .082 1.640 .940 2.861
Step 1a eosinophil% -1.866 .681 7.502 1 .006 .155 .041 .588
Step 1a basophil% -13.906 4.758 8.543 1 .003 .000 .000 .010
Step 1a Constant 23.317 16.399 2.022 1 .155

[98]
위 표 19는 23가지 면역세포 마커를 이용한 회귀분석 모형에서의 계수(B)와 상수(Constant)를 표시한 것이며, 표 상단의 항목에서 B는 B 추정값으로 회귀수식 모형에서 계수 값에 해당하고, S.E는 B 추정값에 대한 표준 오차 값, Wald는 (B 추정값/B 추정값의 표준 오차 값)의 제곱 값이다. 즉 (B/S.E.) 2 를 의미하는 것으로 각 독립 변수의 유의성 검정을 위한 통계량을 의미한다. Df는 자유도, Sig.는 significance 유의확률을 의미하며 각 항목이 모형에서 차지하는 유의성을 의미하고, Exp(B)는 B값에 자연로그를 취한 e B를 의미하며, 각 독립변수가 1만큼 증가하면 내부값이 0인 집단에 속할 확률보다 내부 값이 1인 집단에 속할 확률이 몇 배인가를 나타내는 통계량이다.
[99]
위 상수(Constant)와 계수(B)를 이용한 로지스틱 회귀분석 수식은 다음과 같다.
[100]
= 23.317-0.403(CD4+ %)-0.468(CD3+CD8+ %)+0.961(CD4+CD279+ %)+0.646(CD4+CD25+ %)+0.001(CD4+CD152+ %)-0.093(CD279+ % in CTLs)+0.131(CD152+ % in CTLs)+0.623(CD3+CD272+ %)+0.479(CD3+CD223+)-0.221(Lymphocytes %)-0.174(Neutrophils %)-1.056(NLR)+4.576(CTLs/Treg)-0.011(CD314+CD158b- % in NK cells)+0.739(CD314-CD158b+ % in NK cells)-0.140(CD314+ in T cells)+0.450(Th1 %)+0.074(Th2 %)-7.516(TH1/TH2) -0.001(MDSCs cells/μL)+0.495(monocytes %)-1.866(eosinophil %)-13.906(basophil %)
[101]
다만, 23가지 항목을 이용해 만든 알고리즘의 경우 실제 전향적으로 암 환자와 정상인을 블라인드 테스트로 검증하였을 때 민감도와 특이도가 떨어지는 경향이 있을 수 있다. 그리고 로지스틱 회귀분석 함수를 구성하는 항목이 23가지로 너무 많다 보니 실제로는 23가지 항목 가운데서도 가중치가 더 높은 항목에 의해 결과 값이 크게 좌우될 수 있고, 더 많은 인자에 대한 데이터가 요구되기 때문에 신속한 검사에 저해요소로 작용할 수 있다. 따라서 보다 바람직하게는 11가지 인자의 조합으로 구성되는 아래와 같은 로지스틱 회귀함수를 사용할 수 있다.
[102]
= -17.461+0.039(CD3 %)+0.141(NK %)+0.320(CD4CD279 %)+0.196(CD4+CD25+ %)-0.105(CD4+CD152+ %)+0.157(CD3+CD366+ %)+0.243(CD3+CD272+ %)+0.006(CD3+CD223+ %)+0.350(CD158b+CD314-CD3-CD56+ %)+0.143(Th2 %)+0.001(MDSCs cells/μL)
[103]
위와 같이 면역세포를 유세포분석하여 결과 값을 얻게 되면 각각의 결과 값과 계수 값을 곱하여 상수 값과 함께 합산하고 Logit(P) 값을 구하게 된다. 이때 대장 직장암 환자와 정상인을 1과 0으로 치환한 바와 같이 회귀분석 수식을 이용하여 암을 진단하는 것이 목적이므로 어떠한 임의의 신규 테스트 결과 값을 알고리즘에 입력하여 1과 0 사이 어떠한 값이 관측되는지를 파악하고 대장 직장암 환자인지 정상인인지 예측하는 것이 필요하다. 따라서 선형 방정식 모델 값인 Logit(P)를 지수함수를 이용하여 1과 0의 값에 수렴하도록 변환할 수 있다. 이때 지수 함수를 이용하여 대장 직장암 환자(1의 값을 나타냄)와 정상인(0의 값을 나타냄)으로 분류 되는 예측 수식은 다음 수학식 3과 같다.
[104]
[수식3]


[105]
수학식 3에서와같이 대장 직장암 환자와 정상인의 에측 Y 값은 e P 를 분자로 1-e P를 분모로 하여 구하는데 확률 Y 값을 본 발명에서 E score라고 명명한다.
[106]
도 9는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 E score를 이용하여 만든 Receiver operating characteristic curve이다.
[107]
도 9에서 보는 바와 같이 E score에 대한 Receiver operating characteristic (ROC) curve를 그리게 되면 AUC 값이 0.98이 되는 것을 알 수 있고, 이는 말초혈액 면역력을 바탕으로 한 대장 직장암 진단이 가능하다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.
[108]
[표20]
cut value sensitivity( % ) specificity( % ) Youden's index
0.098 100 78.4 1.784
0.548 88.1 96.9 1.851
0.684 83.1 100 1.831

[109]
표 20은 상기 E score 결과 값에 따른 민감도, 특이도 및 유덴 인덱스(Youden index) 값을 나타낸 것으로, 상기 표 20에서 보는 바와 같이 E score 결과 값의 민감도와 특이도에 대한 cut value를 임의 조정할 수 있는데 cut value를 0.098로 잡게 되면 민감도는 100%이면서 특이도는 78.4%가 되고, cut value를 0.684로 잡게 되면 민감도는 83.1%이면서 특이도는 100%인 것을 알 수 있다. 이것은 E score < 0.098 에서는 모두 정상인이라 할 수 있으며 마찬가지로 0.684 < E score 에서는 모두 대장 직장암 환자라고 진단할 수 있음을 보여 주는 것이다.
[110]
즉, 상기 선형 방정식의 값을 이용하여 암환자와 정상인의 값이 각각 1과 0으로 수렴하는 지수함수를 설계하고 ROC curve 상에서 Youden index를 통하여 0과 1 사이의 최적의 cut value를 구한 다음 이를 기준으로 암 발병 유무를 진단할 수 있는 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 설계할 수 있다.
[111]
또한, 후향적으로(retrospective) 설계된 상기 알고리즘을 통해 계산된 값을 이용하여 신규 정상인과 암 환자를 무작위로 블라인드 테스트(blind test)하여 전향적으로 말초혈액의 면역력을 평가하고 암을 진단할 수 있게 된다.
[112]
도 10은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 2개의 E score cut value를 이용하여 암 면역력을 E1 E2 E3의 3단계로 제공하는 모형을 도시한 도면이다.
[113]
도 10을 참조하면, 말초혈액 면역력을 이용한 로지스틱 회귀분석 진단에 있어 반드시 cut value를 하나로 규정지을 필요는 없다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면 E score의 cut value를 0.098과 0.684를 기준으로 세 구간으로 구분하고 E score 결과에 따른 암 면역력을 3단계로 구분하여 진단할 수 있다. E socre ≤ 0.098 구간은 정상인이면서 E1으로 명명하고 0.098 < E score ≤ 0.684 구간은 암 고위험군으로서 E2라 명명하며 0.684 < E score 구간은 대장 직장암 환자로 E3라고 명명하고 진단할 수 있다.
[114]
본 발명에서는 대장 직장암 수술 전 환자를 예를 들어 말초혈액 면역력을 이용하여 정상인(E1)과 암 고위험군(E2) 및 대장 직장암 환자(E3)로 진단을 하였지만 방법론적으로 대장 직장암에만 한정되지 않고 다른 암 종에서도 적용될 수 있음은 물론이다. 또한, 23가지 또는 11가지 면역세포 마커를 이용하여 만든 회귀모형은 향후 새롭게 발굴되는 마커를 이용하여 민감도와 특이도를 높여 암 진단의 유용성을 극대화 할 수 있으며, 본 발명에서 제시한 23가지 또는 11가지 항목이 아닌 새로운 조합에 의해서도 회귀 모형이 만들어지고 암 진단에 사용될 수 있을 것이다.
[115]
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있을 것이다.
[116]
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

청구범위

[청구항 1]
대장 직장암 환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포 차이를 이용하여 말초혈액의 면역력을 평가하고 이를 이용해 대장 직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, (A) 말초혈액 면역세포의 중 세포 크기 및 주름진 정도를 분석해 림프구세포(lymphocytes), 단핵구세포(monocytes), 및 과립구(granulocytes)를 분류하는 단계; (B) 적어도 하나의 항체 조합으로 상기 세 종류의 면역세포의 표지 마커를 염색하여 암환자와 정상인의 말초혈액 내 면역세포의 분포를 분석하는 단계; (C) 암환자와 정상인 사이에서 암 발생 유무를 판별할 수 있도록 암환자와 정상인 두 집단에서 유의미한 표지 마커의 결과 값이 통계적 유의성을 보이면서 차이가 나는 조합을 판별하는 단계; 및 (D) 상기 표지 마커를 이용해 유세포분석기나 세포 계수기 등을 이용한 자연살해 세포의 계수 없이도 단위 혈액당 면역력을 측정하여 대장 직장암 발병 유무를 진단하는 단계를 포함하는 방법.
[청구항 2]
제 1항에 있어서, 상기 (A) 단계에서 면역세포를 1) NK cells(NKC) 2) Th1Th2(TH) 3) Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs) 4) Regulatory T cells(Tregs) 5) Cytotoxic T cells(CTLs) 6) Exhausted T cells(ETc) 7) Immune checkpoint(ICP) 8) Gamma-delta T cells(GDT) 9) White blood cell subtype(WBCS) 와 같이 9가지 군으로 분류하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 3]
제 2항에 있어서, 상기 (B) 단계에서, NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Exhausted T cells(ETc), Immune checkpoint(ICP), 또는 Gamma-delta T cells(GDT) 세포 분석은 유세포분석기를 이용하여 이루어지고, White blood cell subtype(WBCS)에 포함되는 WBC, Lymphocytes, Neutrophils, Monocytes, Basophils, 또는 Eosinophils 세포 분석은 자동혈구분석기를 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 4]
제 2항에 있어서, 상기 (B) 단계에서, NK cells(NKC), Th1Th2(TH), Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs), Exhausted T cells(ETc), Gamma-delta T cells(GDT) 면역세포는 세포막(Cell surface) 표지 마커를 형광 염색하고, Regulatory T cells(Tregs), Cytotoxic T cells(CTLs), Immune checkpoint(ICP) 면역세포는 세포 표면(Cell surface) 또는 세포 안(Intracellular) 표지 마커를 형광 염색하여 유세포분석기를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 5]
제 1항에 있어서, 상기 (B) 단계에서 면역세포에서 발현되는 표지 마커를 토대로 각각의 마커에 대한 면역세포의 표현형을 분포도(%)와 세포수 및 그 비율로 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 6]
제 1항에 있어서, 상기 (C) 단계에서, 암환자와 정상인을 분류할 수 있는 유의미한 표지 마커의 조합으로 통계학적 방법으로 P 값을 도출하고 상기 P 값이 소정기준을 충족시키는지 여부를 판별하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 7]
제 6항에 있어서, NK cells(NKC)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD314-CD158b- % in NK cells, CD314-CD158b+ % in NK cells, CD314-CD158b+ cells/μL in NK cells, CD314+ in CD3+CD56- (T cells)에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 8]
제 6항에 있어서, Th1Th2(TH)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD4+ %, CD4+ cells/μL, Th1 %, Th2 %, Th2 cells/μL, Th17 cells/μL에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 9]
제 6항에 있어서, Myeloid Derived Stem Cells(MDSCs)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 MDSCs cells/μL에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 10]
제 6항에 있어서, Regulatory T cells(Tregs)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD4+CD279+(PD-1) %, CD4+CD279+ cells/μL, CD4+CD25+ %, CD4+CD25+ cells/μL, CD4+CD152+(CTLA-4)%, CD4+CD152+ cells/μL에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 11]
제 6항에 있어서, Cytotoxic T cells(CTLs)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD3+CD8+ %, CD279+ % in CTLs, CD152+ % in CTLs, CD152+ cells/μL in CTLs에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 12]
제 6항에 있어서, Exhausted T cells(ETc)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD279+TIGIT+ % in CTLs에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 13]
제 6항에 있어서, Immune checkpoint(ICP)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 CD3+CD272+ %, CD3+CD223+ (LAG3)%, CD3+CD223+cells/μL, CD223+ % in Lymphocytes, CD223+ cells/μL in Lymphocytes에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 14]
제 6항에 있어서, White blood cell subtype(WBCS)을 평균 분포도 및 세포수를 기준으로 WBC cells/μL, Lymphocytes %, Neutrophils %, Neutrophils cells/μL, Neutrophils/Lymphocytes, monocytes %, eosinophil %, basophil %에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 15]
제 6항에 있어서, 암환자 및 정상인의 말초혈액 면역세포의 비(ratio)를 기준으로 CD4/CD8 ratio, TH1/TH2 ratio에서 상기 P 값이 소정 기준을 충족시키는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 16]
제 6항에 있어서, 상기 P 값은 23.317-0.403(CD4+ %)-0.468(CD3+CD8+ %)+0.961(CD4+CD279+ %)+0.646(CD4+CD25+ %)+0.001(CD4+CD152+ %)-0.093(CD279+ % in CTLs)+0.131(CD152+ % in CTLs)+0.623(CD3+CD272+ %)+0.479(CD3+CD223+)-0.221(Lymphocytes %)-0.174(Neutrophils %)-1.056(NLR)+4.576(CTLs/Treg)-0.011(CD314+CD158b- % in NK cells)+0.739(CD314-CD158b+ % in NK cells)-0.140(CD314+ in T cells)+0.450(Th1 %)+0.074(Th2 %)-7.516(TH1/TH2) -0.001(MDSCs cells/μL)+0.495(monocytes %)-1.866(eosinophil %)-13.906(basophil %)으로 표현되는 선형방정식에 의하여 구해지는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 17]
제 6항에 있어서, 상기 P 값은 -17.461+0.039(CD3 %)+0.141(NK %)+0.320(CD4CD279 %)+0.196(CD4+CD25+ %)-0.105(CD4+CD152+ %)+0.157(CD3+CD366+ %)+0.243(CD3+CD272+ %)+0.006(CD3+CD223+ %)+0.350(CD158b+CD314-CD3-CD56+ %)+0.143(Th2 %)+0.001(MDSCs cells/μL)으로 표현되는 선형방정식에 의하여 구해지는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 18]
제 1항에 있어서, 상기 (D) 단계에서, (D-1) 암 환자와 정상인을 분류할 수 있는 적어도 하나의 유의미한 표지 마커의 조합값을 계수로 하는 선형 방정식을 설계하는 단계; (D-2) 상기 선형 방정식의 값을 이용하여 암환자와 정상인의 값이 각각 1과 0으로 수렴하는 지수함수를 설계하고 ROC curve 상에서 Youden index를 통하여 0과 1 사이의 최적의 cut value를 구한 다음 이를 기준으로 암 발병 유무를 진단할 수 있는 이분형 로지스틱 회귀분석 알고리즘을 설계하는 단계; 및 (D-3) 후향적으로(retrospective) 설계된 상기 알고리즘을 통해 계산된 값을 이용하여 신규 정상인과 암 환자를 무작위로 블라인드 테스트(blind test)하여 전향적으로 말초혈액의 면역력을 평가하고 암을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 19]
제 18항에 있어서, 상기 유의미한 표지 마커의 조합 값은 CD4+ %, CD3+CD8+ %, CD4+CD279+ %, CD4+CD25+ %, CD4+CD152+ %, CD279+ % in CTLs, CD152+ % in CTLs, CD3+CD272+ %, CD3+CD223+, Lymphocytes %, Neutrophils %, NLR, CTLs/Treg, CD314+CD158b- % in NK cells. CD314-CD158b+ % in NK cells, CD4314+ in T cells, Th1 %, Th2 %, TH1/TH2, MDSCs cells/μL, monocytes %, eosinophil %, 내지 basophil % 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 20]
제 18항에 있어서, 상기 유의미한 표지 마커의 조합 값은 CD3, NK, CD4CD279, CD4+CD25+, CD4+CD152, CD3+CD366+, CD3+CD272, CD3+CD223+, CD158b+CD314-CD3-CD56+, Th2, 내지 MDSCs cells/μL 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 21]
제 18항에 있어서, 상기 (D-3) 단계에서, 민감도 및 특이도를 기준으로 민감도가 소정 설정 값인 지점의 상기 이분형 로지스트 회귀분석 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제1 cut value 값으로 특이도가 소정 설정 값인 지점의 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값을 제2 cut value 값으로 설정하여 상기 알고리즘을 통하여 계산된 값이 상기 제1 cut value 값 이하인 그룹을 정상, 제1 cut value 값과 제2 cut value 값 사이인 그룹을 암 발생 고위험군, 제2 cut value 값 이상인 그룹을 암환자로 진단하는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 22]
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독 가능한 기록 매체.
[청구항 23]
제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 대장 직장암 발병 유무에 대한 정보를 제공하는 진단키트.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]