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1. WO2014096488 - EXTRACTOS FENÓLICOS DE UNCARIA TOMENTOSA L. (UÑA DE GATO) QUE CONTIENEN PROCIANIDINAS, PROPELARGONIDINAS Y FLAVANOLIGNANOS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES

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EXTRACTOS FENÓLICOS DE Uncaria tomentosa L. (UÑA DE GATO) QUE CONTIENEN PROCIANIDINAS, PROPELARGONIDINAS Y FLAVANOLIGNANOS, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES

DESCRIPCIÓN

SECTOR DE LA TÉCNICA

Extractos fenólicos bioactivos de aplicación en la industria alimentaria, dietética, cosmética y farmacéutica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las proantocianidinas o taninos condensados son oligómeros y polímeros de flavan-3-ol, que se encuentran entre los polifenoles más abundantes en nuestra dieta. Las proantocianidinas presentan una gran diversidad estructural, atendiendo a los siguientes factores: a) patrón de hidroxilación del anillo B; b) estereoquímica de las posiciones C2, C3 y C4 del anillo C (anillo central); c) tipo de enlace interflavánico; y d) grado de polimerización (DP) (Aron, P. M., y Kennedy, J. A. (2008). Flavan-3-ols: Nature, occurrence and biological activity. Molecular Nutrition and Food Research, 52(1), 79-104). Las unidades estructurales más comúnmente encontradas en las proantocianidinas de la dieta son (+)-afzelequina, (+)-catequina y (+)-galocatequina (formas 2R:3S) y sus diastereoisómeros (-)-epiafzelequina, (-)-epicatequina y (-)-epigalocatequina (formas 2R:3R), respectivamente. Algunas de las unidades constitutivas del polímero también pueden encontrarse esterificadas con el ácido gálico. Las proantocianidinas exclusivamente formadas por (epi)catequina se denominan procianidinas. Las propelargonidinas y prodelfinidinas contienen (epi)afzelequina y (epi)galocatequina, respectivamente, y por lo general, se encuentran combinadas con unidades de (epi)catequina en forma de heteropolímeros. En relación a la naturaleza del enlace interflavanánico, pueden existir diferentes regio- y estéreo-isómeros. Las proantocianidinas de tipo B son aquellas en que las unidades monoméricas se encuentran enlazadas a través de la posición C4 de la unidad superior y de las posiciones C6 o C8 de la unidad terminal, siendo los isómeros C4-C8 más abundantes que los C4-C6, y adoptando usualmente la estereoquímica 3,4-trans. Adicionalmente, los flavan-3-oles también pueden estar combinados con otras moléculas como los fenilpropanoides constituyendo derivados denominados flavanolignanos. Entre estos compuestos, cabe citar el grupo de las cinchonainas (la, Ib, le, Id), derivadas de la (-)- epicatequina (Tang, W., at al. (2007). Antioxidant phenylpropanoid-substituted epicatechins from Trichilia catigua. Journal of Natural Products, 70(12), 2010-2013).


Flavan-3-ol «i R2 C-2 C -3

(+ ) -Afzelequina H H R S

(+ ) -Catequina H OH R s

(+) -Galocatequina OH OH R s

( - ) - Epiafzelequina H H R R

( - ) - Epicatequina H OH R R

( - ) - Epigalocatequina OH OH R R


Cinchonaina la Cinchonaina Ib

inchonaina Ic, C-9 {R)

inchonaina Id, C-9 (5)


Considerando la abundancia de estos compuestos, las procianidinas de tipo B son las proantocianidinas más abundantes en el reino vegetal, encontrándose en frutas (uvas,

manzanas, peras), legumbres, cacao y bebidas como el vino, sidra, té y cerveza; por otro lado las fuentes de propelargonidinas (i.e. fresa, frambuesa, piel de almendra, canela y algunas legumbres) y prodelfinidinas (grosella negra, uvas, avellana, pacana y pistacho) son más escasas (Gu, L, et al. (2003). Screening of Foods Containing Proanthocyanidins and Their Structural Characterization Using LC-MS/MS and Thiolytic Degradation. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51 (25), 7513-7521). De igual forma, la presencia de flavanolignanos en la naturaleza se limita a algunas plantas de uso medicinal (Qa'dan, F., at al. (2009). Cinchonain Ib isolated from Eriobotrya japónica induces insulin secretion in vitro and in vivo. Journal of Ethnopharmacology, 124(2), 224-227).

Las proantocianidinas presentan efectos potencialmente beneficiosos para la salud debido a sus propiedades antioxidantes, anti-carcinogénicas, cardioprotectoras, antimicrobianas y neuroprotectoras, (Aron, P. M. y J. A. Kennedy (2008). Flavan-3-ols: Nature, occurrence and biological activity. Molecular Nutrition and Food Research 52(1), 79-104) por lo que se emplean ampliamente como ingredientes funcionales en suplementos nutricionales. Los productos ricos en proantocianidinas más comercializados actualmente se obtienen de fuentes como la semilla de uva, manzana, cacao, corteza de pino, etc., las cuales contienen mayoritariamente procianidinas de tipo B.

En particular, las propelargonidinas presentan propiedades/actividades potencialmente beneficiosas para la salud humana, tales como resistencia frente a nemátodos (Collingborn, F. M. B., et al. (2000). Investigations into the biochemical basis for nematode resistance in roots of three Musa cultivars in response to Radopholus similis infection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(1 1), 5297-5301) y actividad fitoestrogénica (Eun, J. C, et al. (2003). Proliferative effects of flavan-3-ols and propelargonidins from rhizomes of Drynaria fortunei on MCF-7 and osteoblastic cells. Archives of Pharmacal Research, 26(8), 620-630), jugando esta última un papel fisiológico importante en la prevención de enfermedades hormonales como la osteoporosis postmenopáusica.

Por otra parte, los flavanolignanos presentan propiedades antioxidantes superiores a algunos de sus precursores ((+)-catequina)(Tang, W., at al. (2007). Antioxidant phenylpropanoid-substituted epicatechins from Trichilia catigua. Journal of Natural Products, 70(12), 2010-2013). También poseen efectos insulinotrópicos sugiriendo su posible uso para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (Qa'dan, F., at al. (2009). Cinchonain Ib isolated from Eriobotrya japónica induces insulin secretion in vitro and in vivo. Journal of Ethnopharmacology, 124(2), 224-227), así como actividad anti bacteriana frente a bacterias patógenas (Pizzolatti, M. G., et al. (2002).

Two epimeric flavalignans from Trichilia catigua (Meliaceae) with antimicrobial activity. Zeitschrift fur Naturforschung - Section C Journal of Biosciences, 57(5-6), 483-488). Por otra parte, se destacan sus efectos protectores frente a la citotoxicidad inducida por hidroperóxido (Uchino, T., et al. (2004). Potent protecting effects of Catuaba (Anemopaegma mirandum) extracts against hydroperoxide-induced cytotoxicity. Toxicology In Vitro, 18(3), 255-263).

Ahora bien, la invención y desarrollo de productos ricos en compuestos potencialmente activos, requiere la búsqueda de fuentes naturales alternativas a las existentes que resulten sostenibles.

Linearía tomentosa L, conocida como uña de gato, rangayo o bejuco de agua, es una liana propia del bosque tropical lluvioso perteneciente a la familia Rubiaceae, y que se distribuye de forma natural desde Perú hasta Belice. El interés científico en esta planta se incrementó con la comprobación de sus propiedades estimulantes del sistema inmunológico, atribuida principalmente a su contenido en alcaloides (Steinberg, P. N. (1995). Cat's Claw: an herb from the Peruvian Amazon. Una de Gato: una hierba prodigiosa de la selva húmeda Peruana., 35-36). En la actualidad existe evidencia científica derivada de numerosos estudios farmacológicos que demuestran un gran rango de actividades incluyendo: anticancerígena, antimutagénica, anti-inflamatoria, antiviral, inmunomodulatoria y antioxidante, así como sus efectos a nivel del sistema cardiovascular, nervioso central y locomotor (Heitzman, M. E., et al. (2005). Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Linearía (Rubiaceae). Phytochemistry, 66(1), 5-29).

Estudios recientes sugieren que los compuestos fenólicos de la planta podrían ser responsables de algunos de los efectos farmacológicos de Linearía tomentosa, aunque los mismos han recibido muy poca atención (Desmarchelier, C, et al. (1997). Evaluation of the in vitro antioxidant activity in extracts of Linearía tomentosa (Willd.) DC. Phytotherapy Research, 1 1 (3), 254-256; Sandoval, M., et al. (2002). Anti-inflammatory and antioxidant activities of cat's claw (Linearía tomentosa and Linearía guianensis) are independent of their alkaloid contení. Phytomedicine, 9(4), 325-337). Entre los compuestos no-flavonoideos figuran mayoritariamente ácidos hidroxicinámicos (ácido cafeico y clorogénico) (Sekiya, N., et al. (2002). Inhibitory effects of Choto-san (Diao-teng-san), and hooks and stems of Linearía sinensis on free radical-induced lysis of rat red blood cells. Phytomedicine, 9(7), 636-640). Los compuestos flavonoideos incluyen flavonoles (derivados de quercetina y miricetina) y flavan-3-oles (Desmarchelier, C, et al. (1997). Evaluation of the in vitro antioxidant activity in extracts of Linearía tomentosa (Willd.) DC. Phytotherapy Research, 1 1 (3), 254-256; Sekiya, N., et al. (2002). Inhibitory effects of Choto-san (Diao-teng-san), and hooks and stems of Uncaria sinensis on free radical-induced lysis of rat red blood cells. Phytomedicine, 9(7), 636-640). En Uncaria tomentosa solamente se han descrito la presencia de monómeros de (+)-catequina y (-)-epicatequina, y las procianidinas diméricas B1 , B2 y B4 (Goncalves, C, et al. (2005). Antioxidant properties of proanthocyanidins of Uncaria tomentosa bark decoction: a mechanism for anti-inflammatory activity. Phytochemistry, 66 (1), 89-98; Sekiya, N., et al. (2002). Inhibitory effects of Choto-san (Diao-teng-san), and hooks and stems of Uncaria sinensis on free radical-induced lysis of rat red blood cells. Phytomedicine, 9(7), 636-640). De particular interés es también la presencia de flavanolignanos (i.e. epicatequinas substituidas con fenilpropanoides), como las cinchonainas la y Ib (Wirth, C, y Wagner, H. (1997). Pharmacologically active procyanidines from the bark of Uncaria tomentosa. Phytomedicine, 4(3), 265-266). Estos compuestos se consideran muy interesantes en Uncaria tomentosa ya que son poco comunes en la naturaleza, aunque se encuentran también presentes en otras plantas medicinales como la Eriobotrya japónica (Ito, H., et al. (2000). Polyphenols from Eriobotrya japónica and their cytotoxicity against human oral tumor cell lines. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 48(5), 687-693).

Considerando lo anteriormente expuesto, existe un interés en encontrar nuevas fuentes naturales de proantocianidinas susceptibles de emplearse para la elaboración de productos ricos en procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos. Algunas patentes previas relacionadas con la obtención de extractos de Uncaria tomentosa conteniendo proantocianidinas son las siguientes:

- WO 2004/033448 A2: Isolation, purification and synthesis of procyanidin B2 and uses thereof. Castillo, G.M.; Nguyen, B.P.; Choi, P.Y.; Larsen, L; Lorimer, S.D.

Esta patente se refiere a metodologías para la síntesis, aislamiento y purificación de la procianidina B2, la cual se emplea para tratar la enfermedad de Alzheimer y Parkinson.

-WO 02/42429 A2: Methods of isolating amyloid-inhibiting compounds and use of compounds isolated from Uncaria tomentosa and related plants, Castillo, G.; Choi, P.Y.; Nguyen, B.; Snow, A.D.

Esta patente se refiere a la metodología de fraccionamiento y cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa (HPLC) para aislar, testar y caracterizar los compuestos solubles en agua más activos de Linearía tomentosa, presentando actividad inhibitoria de amiloide o Αβ fibrilogénesis.

-WO 02/076381 A2: Proanthocyanidins for the treatment of amyloid and alpha-synuclein diseases. Snow, A.D.; Castillo, G.M.; Choi, P.Y.; Nguyen, B.P.

La patente se refiere a un método para tratar la enfermedad amiloide, enfermedad caracterizada por la α-sinucleina o la fibrilogéneis NAC, en mamíferos. El método incluye la administración de cantidades efectivas de varias proantocianidinas protegidas o proantocianidinas caracterizadas por una formula general protegida.

-NZ554517 (A): Flavonoid composition for treating oral diseases. Qi, J.; Yuan, Z.

Se protege una composición farmacéutica compuesta de una mezcla de al menos un flavonoide libre de anillo B, y al menos un flavano, donde el flavonoide libre de anillo B se aisla de una planta o plantas del género Scutellaria y el flavano se aisla de una planta o plantas del género Acacia o Linearía. La composición es útil para la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento de enfermedades y condiciones de la boca, encías y dientes.

-US 006039949A: Method of preparation and composition of a water soluble extract of plant species Linearía. Pero, R. W.

La invención se basa en un método de preparación y composición de un extracto acuoso soluble de la planta del género Linearía, dirigido al uso farmacéutico de la composición para el mejoramiento del sistema inmune, anti-inflamatorio, anti-tumorogénico y reparación del ADN de las células rojas en animales.

-US 2012/0076849 A1 : Plant composition for the treatment or prevention of viral blood-borne diseases such as diseases caused by the human immunodeficieney virus (HIV) or hepatitis C. El Kettany, S.; Mikael, Z.

La invención se refiere a una composición basada en plantas para el tratamiento o prevención de enfermedades virales de la sangre, tales como enfermedades causadas por el virus de la inmunodeficiencia (HIV) o la hepatitis C. La composición incluye la flor del azufre, una planta conteniendo catequinas o agente tánico, y un vehículo farmacéutico aceptable, que se selecciona de Agrimonia Eupatoría y Linearía gambir.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

El problema a resolver es la obtención de extractos conteniendo proantocianidinas y sus derivados flavanolignanos con propiedades/actividades potencialmente beneficiosas para la salud humana. Además, se buscan materias primas alternativas a las existentes, y procesos de producción sencillos y rentables.

La invención se refiere a extractos fenólicos conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos, -obtenidos de la planta Linearía tomentosa L. y a su procedimiento de obtención.

Debido a su contenido en propelargonidinas y flavanolignanos, es de esperar que estos extractos presenten propiedades diferentes, cuando no mejoradas, con respecto a los productos de otras fuentes comercializados actualmente y que contienen mayoritariamente procianidinas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en la observación de que es posible obtener, a partir de la planta Linearía tomentosa L., un extracto fenólico que comprende un amplio abanico de proantocianidinas, concretamente de procianidinas y de propelargonidinas, y también de derivados flavanolignanos, no descritos anteriormente. En la actualidad los productos derivados de Linearía tomentosa L. se comercializan debido a su contenido en alcaloides, no considerándose su contenido en este tipo de compuestos fenólicos. Estos compuestos bioactivos se encuentran presentes en diferentes partes de la planta (externas e internas) en distintas combinaciones de porcentajes de monómeros de flavan-3-ol, procianidinas, propelargonidinas y de flavanolignanos (ver Ejemplos 1 al 4), representando una fuente alternativa y sostenible para la obtención de extractos fenólicos de alto valor añadido ricos en proantocianidinas. Esto es así tanto en el conjunto de la planta, como en cada una de las partes aéreas y la madera interna, por separado o en mezclas de las mismas.

Por otro lado, las cantidades mínimas de cada compuesto existentes en las distintas partes de la planta, permiten identificar un extracto de esta planta con una mínima cantidad de cada uno de los compuestos descritos.

La heterogeneidad estructural de las proantocianidinas de estos extractos, constituidos por procianidinas (i.e. polímeros formados únicamente por (+)-catequina y/o (-)-epicatequina), propelargonidinas (polímeros conteniendo al menos una unidad de (+)-afzelequina y/o (-)-epiafzelequina) y flavanolignanos (derivados fenilpropanoides de los flavan-3-oles, en particular de la (-)-epicatequina) justificarían posibles peculiaridades en las propiedades/actividades fisiológicas de los mismos. Es de esperar, por tanto, que los extractos conteniendo combinaciones de estos tres tipos de compuestos presenten propiedades diferentes, cuando no mejoradas, con respecto a los productos comercializados actualmente y que contienen únicamente procianidinas.

Los extractos obtenidos de las diferentes partes de las plantas de Linearía tomentosa L., siguiendo el proceso que a continuación se detalla, presentan un contenido fenólico total mínimo de 356; 286; 283 y 80,7 mg ácido gálico/g para los extractos de hoja, tallo, corteza y madera interna, respectivamente.

Los extractos obtenidos de las diferentes partes de las plantas de Linearía tomentosa L, siguiendo los procesos que a continuación se detallan, presentan un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 221 ; 299; 247 y 11 ,3 mg de cloruro de cianidina/g para los extractos de hoja, tallo, corteza y madera interna, respectivamente.

La sumatoria total de compuestos fenólicos individualizados (∑ monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos), expresados como mg/g de extracto, fue de un mínimo de: 11 , 1 mg/g para hojas, 11 ,9 mg/g para tallos, 3,3 mg/g para corteza, y 0,88 mg/g para madera interna de Linearía tomentosa L.

Para evitar posibles interferencias de los compuestos menos polares presentes en las partes de la planta, principalmente lípidos, incluyendo grasas, terpenos, esferoides, así como compuestos básicos (i.e., alcaloides), se ha procedido a obtener un extracto purificado, empleando diferentes disolventes orgánicos mediante el procedimiento de extracción que se describe a continuación.

Además, se ha observado que el extracto de la invención presenta también un amplio abanico de actividades como antioxidante, antimicrobiana, citotóxica y antiproliferativa (ver ejemplo 4).

Adicionalmente, debido a la heterogeneidad estructural de estos extractos, conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos, estos extractos pueden presentar otras actividades/propiedades descritas para las propelargonidinas y flavanolignanos, incluyendo por ejemplo actividad neuroprotectora, anticancerígena, anti-inflamatoria, cardioprotectora, fitoestrogénica e insulinotrópica. Por tanto, estos extractos se podrían emplear como ingredientes en alimentos, para la elaboración de suplementos dietéticos, y de composiciones cosméticas y farmacéuticas.

Así, un aspecto de la invención lo constituye un extracto de la planta Linearía tomentosa L. obtenido a partir de cualquier parte aérea o de la madera interna de la misma, en adelante extracto de la invención, que presenta capacidad/actividad antioxidante, antimicrobiana, citotóxica y antiproliferativa, y que comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 80,7 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 1 1 ,3 mg de cloruro de cianidina/g, c) un contenido mínimo de 0,88 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y d) un porcentaje mínimo de monómeros del 2,2%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 5,7%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 1 , 1 % y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 1 ,9%.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el extracto de la invención que se obtiene de las hojas y que comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 356 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 221 mg de cloruro de cianidina/g, c) un contenido mínimo de 1 1 , 1 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y d) un porcentaje mínimo de monómeros del 9,3%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 1 1 ,6%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 31 ,4% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 1 ,9%.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el extracto de la invención que se obtiene de los tallos y que comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 286 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 299 mg de cloruro de cianidina/g, c) un contenido mínimo de 11 ,9 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y d) un porcentaje mínimo de monómeros del 6,4%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 57,9%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 18,0% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 9, 1 %.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el extracto de la invención que se obtiene de la corteza y que comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 283 mg de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 247 mg de cloruro de cianidina/g, c) un contenido mínimo de 3,3 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y d) un porcentaje mínimo de monómeros del 5,9%, un porcentaje de procianidinas del 57,9%, un porcentaje de propelargonidinas del 6,0% y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del

1 1 ,0%.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el extracto de la invención que se obtiene de la madera interna y que comprende:

a) un contenido fenólico total mínimo de 80,7 de ácido gálico/g,

b) un contenido mínimo de proantocianidinas totales de 11 ,3 de cloruro de cianidina/g, c) un contenido mínimo 0,88 mg/g para la sumatoria total de monómeros, dímeros de procianidinas, dímeros de propelargonidinas, trímeros de procianidinas y flavanolignanos, y d) un porcentaje mínimo de monómeros del 2,2%, un porcentaje mínimo de procianidinas del 5,7%, un porcentaje mínimo de propelargonidinas del 1 ,1 % y un porcentaje mínimo de flavanolignanos del 33, 1 %.

Otro aspecto de la invención es el procedimiento de obtención del extracto de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que implica un fraccionamiento que permite obtener tres extractos diferenciados: un primer extracto no polar, un segundo extracto alcalóidico y tres extractos polifenólicos que provienen de extracciones de los anteriores extractos o de sus marcos y que en su conjunto constituyen un tercer extracto polifenólico enriquecido total de Linearía tomentosa L, y que comprende las siguientes etapas:

a) una etapa de preparación del material vegetal que comprende la separación de las distintas partes aéreas y de la madera interna, una fase de secado y una fase de molienda de las mismas;

b) una etapa de maceración-extracción del material vegetal que comprende las siguientes fases:

b.1.- obtención del extracto no polar empleando una extracción sólido-líquido y disolventes orgánicos, preferentemente éter metil-ter-butílico, hexano, cloroformo y metanol, tanto puros como mezclados; a una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; durante un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas; y que es llevado a sequedad a una temperatura inferior a 40°C;

b.2.- obtención del extracto polar polifenólico empleando una extracción sólido-líquido y disolventes orgánicos, preferentemente metanol; con una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; y con un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas; y

b.3.- obtención del extracto alcalóidico empleando una extracción sólido-líquido y siguiendo los siguientes pasos:

b.3.1. -empleo de disolventes orgánicos, preferentemente éter metil-ter-butílico y metanol, tanto solos como en combinación con amoniaco; a una temperatura entre 5°C y 60°C, preferentemente entre 25°C y 30°C; y durante un tiempo de extracción comprendido entre 8 y 72 horas,

b.3.2.- empleo de disolventes acidulados con ácidos de tipo inorgánico como HCI, H2S04, H3P04, o con cualquier ácido orgánico como ácido acético, cítrico o tartárico,

b.3.3.- empleo de disolventes basificados con bases de tipo inorgánico, como carbonato de sodio o de tipo orgánico como amoniaco, hasta alcanzar un pH de 10,

b.3.4.- empleo de disolventes orgánicos como éter metil-ter-butílico, y

b.3.5.- secado del extracto alcalóidico con agentes desecantes como sulfato de sodio y posteriormente llevado a sequedad utilizando temperaturas inferiores a 40°C; conservándolo para su tratamiento;

b.4.- obtención del extracto polifenólico total, constituido por el extracto obtenido en la fase de obtención del extracto polar polifenólico (b.2) y los extractos obtenidos mediante los siguientes pasos:

b.4.1.- después de la fase de obtención del extracto no polar (b.1), el extracto no polar obtenido se somete a extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, preferentemente metanol, para obtener un extracto polifenólico con los polifenoles remanentes,

b.4.2.- después de la fase de obtención del extracto alcalóidico (b.3), el marco alcalóidico se somete a extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, preferentemente metanol, para obtener un extracto polifenólico con los polifenoles remanentes;

b.5.- secado del extracto polifenólico total (b.4) a temperatura inferior a 40°C.

c) una etapa de purificación del extracto polifenólico total (b.4) sea mediante extracción sólido-líquido con solventes orgánicos, como éter metil-ter-butílico y cloroformo, y/o mediante cromatografía de fase reversa (RP) con polímeros no polares de adsorción-desorción tal como Diaion HP20 y/o mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) o filtración en gel con medios tal como Sephadex LH-20; y

d) una etapa de secado del extracto polifenólico total purificado (c) a temperatura inferior a 40°C.

Un aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde la fase de secado perteneciente a la etapa de preparación del material vegetal (a), se lleva a cabo colocando inicialmente el material vegetal en una superficie plana en un cuarto con ventilación durante 120 horas y, posteriormente, en una estufa a 40°C durante 72 horas.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde la extracción sólido-líquido de la etapa de maceración-extracción (b) se realiza utilizando un sistema elegido a título ilustrativo y no limitativo, de entre los siguientes: incubador, reflujo o baño de ultrasonidos.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde en la fase de obtención del extracto no polar (b.1) se utiliza una mezcla MTBE:MeOH (90:10 v/v).

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención donde en el paso de obtención del extracto alcalóidico empleando disolventes orgánicos (b.3.1) se utiliza una mezcla de amoniaco al 20% en MeOH.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención, donde para la obtención del extracto alcalóidico de la etapa de maceración-extracción en la que utilizan disolventes acidulados(b.3.2), los alcaloides se extraen con ácido tartárico al 20%, y en el paso de empleo de disolventes basificados (b.3.3.), las fases acuosas se basifican hasta pH 10 con carbonato de sodio.

Otro aspecto particular de la invención que optimiza la etapa de maceración-extracción del material vegetal (b) y reduce la pérdida de los compuestos polifenólicos, es la extracción sólido-líquido de los extractos menos polares secos (b.4.1) y del marco alcalóidico (b.4.2) con solventes polares como metanol, de forma a extraer los polifenoles remanentes en dichas

fases, así como realizar varias extracciones sólido-líquido con metanol de la muestra de planta inicial, filtrando el solvente y extrayendo con metanol fresco cada vez.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención, en el que en la etapa de purificación del extracto total polifenólico seco (c), se utiliza un procedimiento de extracción sólido-líquido con empleo de disolventes orgánicos como MTBE y/o cloroformo.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que en la etapa de purificación del extracto total polifenólico seco (c), se utiliza una técnica seleccionada, a título ilustrativo y no limitativo, de entre las siguientes: purificación por extracción sólido-líquido; cromatografía de adsorción sobre resinas tipo Diaion HP20; cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), sobre geles de filtración tipo Sephadex LH-20, por elución en gradiente de solventes de distinta polaridad, incluyendo agua y solventes orgánicos, como acetato de etilo, acetona, metanol, o sus mezclas en distintos porcentajes.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que en la etapa de secado del extracto polifenólico purificado (d), se utiliza una técnica seleccionada, a título ilustrativo y no limitativo, de entre las siguientes: liofilización, concentración y/o secado a vacío, secado con aire, concentración y secado con rotavapor, y atomización.

Otro aspecto de la invención lo constituye un producto alimentario funcional que comprende un extracto de la invención, útil para la prevención y tratamiento de procesos de envejecimiento fisiológico, procesos patológicos relacionados con la edad o con el estrés oxidativo.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el mismo producto alimentario funcional con capacidad, a título ilustrativo y no limitativo, antioxidante, fitoestrogénica, insulinotrópica, antimutagénica, neuroprotectora, anticancerígena, anti-inflamatoria, antiviral y cardioprotectora.

Otro aspecto de la invención lo constituye una composición cosmética que comprende un extracto de la invención, útil para la prevención y tratamiento de procesos de envejecimiento fisiológico, procesos patológicos relacionados con la edad o con el estrés oxidativo.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye la misma composición cosmética con capacidad, a título ilustrativo y no limitativo, antioxidante, anticancerígena y anti-inflamatoria.

Otro aspecto de la invención lo constituye una composición farmacéutica que comprende un extracto de la invención, útil para la prevención y tratamiento de tumores e infecciones y cardioprotectora.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye la misma composición farmaceútica con capacidad, a título ilustrativo y no limitativo, antioxidante, fitoestrogénica, insulinotrópica, antimutagénica, neuroprotectora, anticancerígena, anti-inflamatoria y antiviral.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. Cromatograma MRM obtenido por UPLC-DAD-ESI-TQ MS de los monómeros (+)-catequina y (-)-epicatequina (m/z 289/245), dimeros de procianidinas (m/z 577/289), dimeros de propelargonidinas (m/z 561/289), y flavanolignanos tipo cinchonaina (m/z 451/341) correspondientes al extracto n° 1.

FIGURA 2A. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 3-4 correspondientes al extracto n° 1.

FIGURA 2B. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 5-6 correspondientes al extracto n° 1.

FIGURA 2C. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 7-8 correspondientes al extracto n° 1.

FIGURA 3. Cromatograma MRM obtenido por UPLC-DAD-ESI-TQ MS de los monómeros (+)-catequina y (-)-epicatequina (m/z 289/245), dimeros de procianidinas (m/z 577/289), dimeros de propelargonidinas (m/z 561/289), y flavanolignanos tipo cinchonaina (m/z 451/341) correspondientes al extracto n° 2.

FIGURA 4A. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 3-4 correspondientes al extracto n° 2.

FIGURA 4B. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 5-6 correspondientes al extracto n° 2.

FIGURA 4C. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 7-8 correspondientes al extracto n° 2.

FIGURA 5. Cromatograma MRM obtenido por UPLC-DAD-ESI-TQ MS de los monómeros (+)-catequina y (-)-epicatequina (m/z 289/245), dimeros de procianidinas (m/z 577/289), dimeros de propelargonidinas (m/z 561/289), y flavanolignanos tipo cinchonaina (m/z 451/341) correspondientes al extracto n° 3.

FIGURA 6A. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 3-4 correspondientes al extracto n° 3.

FIGURA 6B. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 5-6 correspondientes al extracto n° 3.

FIGURA 6C. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 7-8 correspondientes al extracto n° 3.

FIGURA 7. Cromatograma MRM obtenido por UPLC-DAD-ESI-TQ MS de los monómeros (+)-catequina y (-)-epicatequina (m/z 289/245), dimeros de procianidinas (m/z 577/289), dimeros de propelargonidinas (m/z 561/289), y flavanolignanos tipo cinchonaina (m/z 451/341) correspondientes al extracto n° 4.

FIGURA 8A. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 3-4 correspondientes al extracto n° 4.

FIGURA 8B. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 5-6 correspondientes al extracto n° 4.

FIGURA 8C. Espectro de masas obtenido por HPLC-ESI-qTOF MS de las proantocianidinas con DP 7-8 correspondientes al extracto n° 4.

FIGURA 9A. Representación del espectro MS/MS de los dimeros de procianidinas y dimeros de propelargonidinas.

FIGURA 9B. Representación del espectro MS/MS flavanolignanos de tipo cinchonaina.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN

Para una mejor comprensión de la invención se adjuntan cuatro ejemplos que no son limitantes en cuanto a su aplicación.

Ejemplo 1 : Extracto de hoja de Linearía tomentosa L. conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos.

En general, para la preparación del material vegetal utilizado en los ejemplos de esta invención se ha trabajado con las partes aéreas de planta fresca húmeda, así como con la madera interna de la misma, obtenida directamente de la recolección de la planta en los lugares de siembra.

Se utilizaron muestras de hojas de Linearía tomentosa L. desprendidas de los tallos, después de la recolección de las partes aéreas de la planta y se cortaron en piezas más pequeñas con un cuchillo o machete para facilitar el secado, y se pusieron a secar por separado sobre papel en una superficie plana en un cuarto con ventilación adecuada durante cinco días. El secado se terminó en una estufa a 40°C durante 3 días. Las muestras secas de las hojas se molieron por separado con un molino de bolas para obtener en cada caso un polvo fino, el cual se almacenó en recipientes plásticos individuales debidamente rotulados para su posterior uso.

La muestra molida se colocó en una mezcla de MTBE:MeOH (90: 10 v/v) y se mantuvo con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min. Se dejó reposar un día, y posteriormente se filtró. El líquido filtrado, que constituye la primera parte del extracto no polar, se retiró para su posterior tratamiento. El marco de hojas que quedó después de la filtración, se extrajo nuevamente repitiéndose la operación con la mezcla de MTBE:MeOH (90: 10 v/v), con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min y dejándose reposar un día, luego de lo cual se filtró y el líquido filtrado, que constituye la segunda parte del extracto no polar, se retiró y se combinó con el anterior filtrado no polar, llevándose a sequedad a baja presión en un rotavapor a una temperatura inferior a 40 °C, obteniéndose un extracto no polar que se guarda para su posterior tratamiento.

Al marco de hojas se le agregó MeOH y se mantuvo con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min. Se dejó reposar un día y se procedió a su filtración. El líquido filtrado, que constituye la primera parte del extracto polar polifenólico, se retiró para su posterior tratamiento. El marco de hojas que quedó tras la filtración, se extrajo nuevamente repitiéndose la operación con MeOH, manteniéndose con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min. Posteriormente se dejó reposar un día y se filtró. Se retiró el líquido filtrado, que constituye la segunda parte del extracto polar polifenólico, que se guardó para su posterior tratamiento. Se repitió la extracción del marco de hojas una tercera vez con MeOH, manteniéndose con agitación en un baño de ultrasonidos a 25°C durante 30 min, para posteriormente dejar reposar un día y proceder a filtrar, obteniéndose un líquido que constituye la tercera parte del extracto polar polifenólico, el que se combinó con los dos anteriores líquidos filtrados polares polifenólicos, guardándose para su posterior tratamiento.

Al marco de hojas resultante del extracto polar polifenólico se le agregó una mezcla de amoniaco al 20% en MeOH y se mantuvo con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min. Se dejó reposar un día y se procedió a su filtración. El líquido filtrado, que constituye la primera parte del extracto alcalóidico, se guardó para su posterior tratamiento. El marco de hojas que quedó después de la filtración, se extrajo con MTBE, manteniéndose con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min, para posteriormente dejar reposar un día y filtrar, obteniéndose un líquido que constituye la segunda parte del extracto alcalóidico. El marco de hojas que quedó después de la filtración, se extrajo nuevamente con MTBE, manteniéndose con agitación en un baño de ultrasonidos a 25 °C durante 30 min, para posteriormente dejar reposar un día y filtrar, obteniéndose un líquido que constituye la tercera parte del extracto alcalóidico; el que se combinó con los dos anteriores líquidos filtrados alcalóidicos, concentrándose en rotavapor y pasándose a un embudo separador. Se extrajeron los alcaloides tres veces con una disolución previamente preparada de ácido tartárico al 20%, retirándose las fases orgánicas. Las fases acuosas se basificaron hasta un pH 10 con una disolución saturada de carbonato de sodio (Na2C03). Las disoluciones basificadas se extrajeron tres veces con MTBE, retirándose las fases acuosas. Se eliminó el agua de las fases orgánicas de MTBE, secándolas con sulfato de sodio anhidro (Na2S04) y tras eliminar este desecante por filtración, se llevaron a sequedad a baja presión en un rotavapor a una temperatura inferior a 40 °C, obteniéndose el extracto de alcaloides que se guarda para su posterior tratamiento y purificación.

Al extracto no polar se le agregó una pequeña cantidad de MeOH para extraer los polifenoles remanentes, se separó el líquido y se repitió dos veces más la extracción del extracto no polar con MeOH. Se combinaron las fases líquidas de extracción conteniendo los polifenoles remanentes en el extracto no polar, las cuales constituyen la cuarta parte del extracto polar polifenólico.

Al marco alcaloidico también se le agregó una pequeña cantidad de MeOH para extraer los polifenoles remanentes, se separó el líquido y se repitió dos veces más la extracción del marco alcaloidico con MeOH. Se combinaron las fases líquidas de extracción conteniendo los polifenoles remanentes en el marco alcaloidico, las que constituyen la quinta parte del extracto polar polifenólico.

Se unen estas dos fases líquidas conteniendo los polifenoles remanentes en el extracto no polar y en el marco alcaloidico, con el líquido conteniendo las tres primeras fases líquidas polares polifenólicas, constituyendo estas cinco fases líquidas combinadas el extracto polar polifenólico total, el que se lleva a sequedad a baja presión en un rotavapor a una temperatura inferior a 40 °C, de forma a obtenerse el extracto total polifenólico seco para su posterior purificación.

La purificación del extracto total polifenólico se llevó a cabo agregando una pequeña cantidad de hexano para eliminar grasas y pigmentos. Se retiró el líquido y al extracto polifenólico se le agregó una pequeña cantidad de MTBE para extraer compuestos no polares remanentes. Se retiró el líquido y al extracto polifenólico se le agregó una pequeña cantidad de cloroformo para extraer compuestos de mediana polaridad remanentes. Posteriormente, el extracto polifenólico se llevó a sequedad a baja presión en rotavapor a una temperatura inferior a 40 °C, para obtener un extracto rico en polifenoles purificado y seco, constituyendo el extracto n° 1.

El contenido en polifenoles de este extracto n° 1 fue de 364.0 ±8.0 mg/g (media ± DE, n= 3 plantas de diferentes localidades). Igualmente, el contenido en proantocianidinas fue de 339.7±109.6 mg/g. El rendimiento del proceso fue de 11-21 %.

La concentración de polifenoles individualizados del extracto n° 1 , utilizando la técnica de UPLC-DAD-ESI-TQ MS descrita en el apartado de métodos de análisis, se recoge en la tabla 1 (ver Figura 1). La distribución porcentual de los diferentes grupos de compuestos fue la siguiente: 15,0 % de monómeros de flavan-3-ol; 27,3 % de procianidinas (dímeros + trímeros); 40,5% de propelargonidinas y 17,2% de flavanolignanos.

Tabla 1.- Extracto n° 1 : Composición fenólica individualizada

No. Concentración glg extracto) media DE

Monómeros

1 (+)-Catequina 1004,2 600,4

2 (-)-Epicatequina 1718,0 653,9

TOTAL 2722,2 1052,3

Dimeros de procianidinas

3 Procianidina B3 1217,4 975, 1

4 Procianidina B1 467,6 315,4

5 Procianidina B4 1922,7 1 194,0

6 Procianidina B2 722, 1 328, 1

7 Procianidina B (Rt=5,47 min) 88,3 53, 1

8 Procianidina B7 109,3 73,8

9 Procianidina B5 220,7 137,6

10 Procianidina B (Rt=9,27 min) 132,9 83,4

TOTAL 4881 ,0 311 1 ,0

Dimeros de propelargonidinas

Dímero properlagonidina

1 1 3291 , 1 1948,0

(Rt=4,43 min)

Dimero propelargonidina

12 2407,7 874,7

(Rt=5,01 min)

Dímero propelargonidina

13 1005, 1 494,6

(Rt=5,65 min)

Dímero propelargonidina

14 621 ,3 320,2

(Rt=9,27 min)

TOTAL 7325,2 2658,8

Trímeros de procianidinas

15 Trímero T2 2,0 3,4

16 Procianidina C1 12,7 1 1 ,4

17 Trímero B (Rt=4,78 min) 38,7 33,8

TOTAL 53,4 46,4

Flavanolignanos

18 Cinchonaina (Rt=7,37 min) 558,4 463,0

19 Cinchonaina (Rt=9,05 min) 855,0 961,5

20 Cinchonaina (Rt=9,30 min) 1074,4 1104,9

21 Cinchonaina (Rt=12,27 min) 635,0 521,7

TOTAL 3122,9 2994,7

TOTAL DE FLAVAN-3-OLES 18104,7 9863,3

A continuación se indican las señales m/z correspondientes a los iones [M-H]" de las proantocianidinas detectadas (Tabla 2) utilizando la técnica de HPLC-ESI-qTOF MS descrita en el apartado de métodos de análisis. Algunas ampliaciones del espectro de masas resultante se presentan en las Figuras 2A, 2B y 2C.

Tabla 2.- Extracto n° 1. Caracterización de proantocianidinas

m/z teórico m/z experimental

DP (epi)cat (epi)afz M [M-H]" [M-H]"

DP3 3 0 866,206 865,198 865,183

2 1 850,211 849,203 849,188

1 2 834,216 833,208 833,193

0 3 818,221 817,213 817,196

DP4 4 0 1154,269 1153,261 1153,245

3 1 1138,274 1137,266 1137,249

2 2 1122,279 1121,272 1121,255

1 3 1106,284 1105,277 1105,260

0 4 1090,290 1089,282 1089,264

DP5 5 0 1442,333 1441,325 1441,308

4 1 1426,338 1425,330 1425,311

3 2 1410,343 1409,335 1409,316

2 3 1394,348 1393,340 1393,321

1 4 1378,353 1377,345 1377,326

0 5 1362,358 1361,350 1361,331

DP6 6 0 1730,396 1729,388 1729,373

5 1 1714,401 1713,393 1713,375

4 2 1698,406 1697,398 1697,378

3 3 1682,411 1681 ,403 1681 ,383

2 4 1666,416 1665,409 1665,387

1 5 1650,421 1649,414 1649,393

0 6 1634,427 1633,419 1633,396

DP7 7 0 2018,459 2017,452 2017,435

6 1 2002,464 2001 ,457 2001 ,438

5 2 1986,470 1985,462 1985,443

4 3 1970,475 1969,467 1969,445

3 4 1954,480 1953,472 1953,452

2 5 1938,485 1937,477 1937,452

1 6 1922,490 1921 ,482 1921 ,460

0 7 1906,495 1905,487 1905,457

DP8 8 0 2306,523 2305,515 2305,505

7 1 2290,528 2289,520 2289,516

6 2 2274,533 2273,525 2273,507

5 3 2258,538 2257,530 2257,515

4 4 2242,543 2241 ,535 2241 ,514

3 5 2226,548 2225,540 2225,520

2 6 2210,553 2209,545 2209,521

1 7 2194,558 2193,551 2193,522

0 8 2178,563 2177,556 2177,515

DP9 9 0 2594,586 2593,578 2593,596

8 1 2578,591 2577,583 2577,579

7 2 2562,596 2561 ,589 2561 ,578

6 3 2546,601 2545,594 2545,586

5 4 2530,607 2529,599 2529,582

4 5 2514,612 2513,604 2513,587

3 6 2498,617 2497,609 2497,585

2 7 2482,622 2481 ,614 2481 ,588

1 8 2466,627 2465,619 2465,579

0 9 2450,632 2449,624

DP10 10 0 2882,650 2881 ,642

9 1 2866,655 2865,647

8 2 2850,660 2849,652

7 3 2834,665 2833,657 2833,696

6 4 2818,670 2817,662 2817,626

5 5 2802,675 2801 ,667 2801 ,656

4 6 2786,680 2785,672 2785,670

3 7 2770,685 2769,677 2769,657

2 8 2754,690 2753,682 2753,680

1 9 2738,695 2737,687 2737,666

0 10 2722,700 2721 ,693

DP, grado de polimerización

(epi)cat, unidades de (epi)catequina

(epi)afz, unidades de (epi)afzelequina

M, masa molecular monoisotópica

El extracto n° 1 está compuesto por proantocianidinas homogéneas constituidas exclusivamente por unidades de (epi)catequinas (i.e., procianidinas) o por unidades de (epi)afzelequinas (i.e., propelargonidinas) hasta un grado de polimerización (DP) de 10 unidades (decámeros). Igualmente se detectan señales correspondientes a proantocianidinas heterogéneas formadas por (epi)catequinas y (epi)afzelequinas conteniendo de 1 hasta DP-1 unidades unidades de (epi)afzelequinas, para cada DP.

Ejemplo 2: Extracto de tallo de Linearía tomentosa L. conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos.

Se utilizaron muestras de tallos de Linearía tomentosa L, una vez desprendidas las hojas, después de la recolección de las partes aéreas de la planta, que se secaron y molieron, según se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Para la fase de extracción se utilizó exactamente el mismo método que se describe para el Ejemplo 1.

El contenido en polifenoles de este extracto n° 2 fue de 373.7±86.5 mg/g (media±DE, n=3 plantas de diferentes localidades). Igualmente, el contenido en proantociandinas fue de 355.3±50.9 mg/g. El rendimiento del proceso fue de 2-3%.

La concentración de polifenoles individualizados del extracto n° 2, utilizando la misma técnica empleada en el Ejemplo 1 , se recoge en la Tabla 3 (ver Figura 3). La distribución porcentual de los diferentes grupos de compuestos fue la siguiente: 7,5 % de monómeros de flavan-3-ol; 59,6 % de procianidinas (dímeros + trímeros); 20, 1 % de propelargonidinas y 12.8% de flavanolignanos.

Tabla 3.- Extracto n° 2: Composición fenólica individualizada

No. Concentración glg extracto)

Media DE

Monómeros

1 (+)-Catequina 181 ,7 50,2

2 (-)-Epicatequina 974,2 147,4

TOTAL 1 155,9 106, 1

Dímeros de procianidinas

3 Procianidina B3 1022,5 159,4

4 Procianidina B1 355,0 44,6

5 Procianidina B4 4407, 1 990,3

6 Procianidina B2 1694,7 466,0

7 Procianidina B (Rt=5,47 min) 162,4 43,2

8 Procianidina B7 148, 1 22, 1

9 Procianidina B5 390,8 167,2

10 Procianidina B (Rt=9,27 min) 24,2 21 ,5

TOTAL 8204,7 1449,7

Dímeros de propelargonidinas

1 1 Dímero properlagonidina (Rt=4,43 min) 599,9 178,8

12 Dimero propelargonidina (Rt=5,01 min) 1857,5 50,4

13 Dímero propelargonidina (Rt=5,65 min) 394,4 492,5

14 Dímero propelargonidina (Rt=9,27 min) 234,6 44,2

TOTAL 3086,3 330,9

Trímeros de procianidinas

15 Trímero T2 40,9 55, 1

16 Procianidina C1 468,3 547,4

17 Trímero B (Rt=4,78 min) 440,6 476,3

TOTAL 949,8 1078,6

Flavanolignanos

18 Cinchonaina (Rt=7,37 min) 812,3 320,0

19 Cinchonaina (Rt=9,05 min) 252,4 102,7

20 Cinchonaina (Rt=9,30 min) 223,0 107,7

21 Cinchonaina (Rt=12,27 min) 684,8 336,0

TOTAL 1972,5 865,0

TOTAL DE FLAVAN-3-OLES 15369,2 3830,3

Para la caracterización de la fracción de proantocianidinas con un DP≥ 3, se empleó la misma técnica que para el ejemplo 1. Algunas ampliaciones del espectro de masas resultante se presentan en las Figuras 4A, 4B y 4C. A continuación (Tabla 4) se indican las señales m/z correspondientes a los iones [M-H]" de las proantocianidinas detectadas.

Tabla 4.- Extracto n° 2. Caracterización de proantocianidinas

m/z teórico m/z experimental

DP (epi)cat (epi)afz M [M-H]" [M-H]"

DP3 3 0 866,206 865,198 865,082

2 1 850,211 849,203 849,086

1 2 834,216 833,208 833,092

0 3 818,221 817,213

DP4 4 0 1154,269 1153,261 1153,105

3 1 1138,274 1137,266 1137,111

2 2 1122,279 1121,272 1121,117

1 3 1106,284 1105,277 1105,130

0 4 1090,290 1089,282

DP5 5 0 1442,333 1441,325 1441,129

4 1 1426,338 1425,330 1425,136

3 2 1410,343 1409,335 1409,142

2 3 1394,348 1393,340 1393,151

1 4 1378,353 1377,345

0 5 1362,358 1361,350

DP6 6 0 1730,396 1729,388 1729,154

5 1 1714,401 1713,393 1713,161

4 2 1698,406 1697,398 1697,168

3 3 1682,411 1681 ,403 1681 ,175

2 4 1666,416 1665,409 1665,178

1 5 1650,421 1649,414

0 6 1634,427 1633,419

DP7 7 0 2018,459 2017,452 2017,179

6 1 2002,464 2001 ,457 2001 ,187

5 2 1986,470 1985,462 1985,194

4 3 1970,475 1969,467 1969,202

3 4 1954,480 1953,472 1953,201

2 5 1938,485 1937,477

1 6 1922,490 1921 ,482

0 7 1906,495 1905,487

DP8 8 0 2306,523 2305,515 2305,206

7 1 2290,528 2289,520 2289,213

6 2 2274,533 2273,525 2273,217

5 3 2258,538 2257,530 2257,224

4 4 2242,543 2241 ,535 2241 ,231

3 5 2226,548 2225,540

2 6 2210,553 2209,545

1 7 2194,558 2193,551

0 8 2178,563 2177,556

DP9 9 0 2594,586 2593,578 2593,231

8 1 2578,591 2577,583 2577,242

7 2 2562,596 2561 ,589 2561 ,242

6 3 2546,601 2545,594 2545,245

5 4 2530,607 2529,599 2530,257

4 5 2514,612 2513,604

3 6 2498,617 2497,609

2 7 2482,622 2481 ,614

1 8 2466,627 2465,619

0 9 2450,632 2449,624

DP10 10 0 2882,650 2881 ,642 2881 ,264

9 1 2866,655 2865,647 2865,274

8 2 2850,660 2849,652 2849,272

7 3 2834,665 2833,657 2833,274

6 4 2818,670 2817,662

5 5 2802,675 2801 ,667

4 6 2786,680 2785,672

3 7 2770,685 2769,677

2 8 2754,690 2753,682

1 9 2738,695 2737,687

0 10 2722,700 2721 ,693

DP, grado de polimerización

(epi)cat, unidades de (epi)catequina

(epi)afz, unidades de (epi)afzelequina

M, masa molecular monoisotópica

El extracto n° 2 está compuesto por proantocianidinas homogéneas constituidas exclusivamente por unidades de (epi)catequinas (i.e., procianidinas) hasta un grado de polimerización (DP) de 10 unidades (decámeros), así como por proantocianidinas heterogéneas formadas por (epi)catequinas y (epi)afzelequinas conteniendo de 1 hasta DP-1 unidades unidades de (epi)afzelequinas, hasta DP6 (hexámeros). Para polímeros con un DP ≥ 7, se detectan un menor número de unidades de (epi)afzlequinas a medida que aumenta el DP, variando entre: 1 y DP-2 unidades de (epi)afzelequinas para DP7; 1 y DP-3 unidades para DP8; 1 y DP-5 para DP9, y entre 1 y DP-7 unidades para DP10.

Ejemplo 3: Extracto de corteza de Uncaria tomentosa L. conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos.

Se utilizaron muestras de corteza de Uncaria tomentosa L. desprendidas de la madera interna con un cuchillo o machete, después de la recolección de las partes aéreas de la planta, que se secaron y se molieron con un molino de bolas para obtener un polvo fino, el cual se almacenó en recipientes plásticos separados debidamente rotulados para su uso posterior como se ha descrito anteriormente. Para la fase de extracción se utilizó exactamente el mismo método que se describe para los ejemplos 1 y 2.

El contenido en polifenoles de este extracto n° 3 fue de 373,7±86,5 mg/g (media±DE, n=3 plantas de diferentes localidades). Igualmente, el contenido en proantocianidinas fue de 355,3±50,9 mg/g. El rendimiento del proceso fue de 3-1 1 %.

La concentración de polifenoles individualizados del extracto n° 3, siguiendo la misma técnica descrita para los ejemplos 1 y 2, se recoge en la Tabla 5 (ver Figura 5). La distribución porcentual de los diferentes grupos de compuestos fue la siguiente: 1 1 ,2 % de monómeros de flavan-3-ol; 56,4 % de procianidinas (dímeros + trímeros); 18,8% de propelargonidinas y 13,6% de flavanolignanos.

Tabla 5.- Extracto n° 3: Composición fenólica individualizada

No. Concentración (Mg/g extracto)

Media DE

Monómeros

1 (+)-Catequina 120,5 106,9

2 (-)-Epicatequina 893,2 610,2

TOTAL 1013,7 716,7

Dímeros de procianidinas

3 Procianidina B3 181 ,7 170,6

4 Procianidina B1 172, 1 133,8

5 Procianidina B4 2266,2 1652, 1

6 Procianidina B2 1554,8 683,8

7 Procianidina B (Rt=5,47 min) 100,3 99,9

8 Procianidina B7 61 ,2 55,5

9 Procianidina B5 325,4 219,7

10 Procianidina B (Rt=9,27 min) 21 ,6 24,4

TOTAL 4683,3 3022,4

Dímeros de propelargonidinas

1 1 Dímero properlagonidina (Rt=4,43 min) 139,3 150,2

12 Dimero propelargonidina (Rt=5,01 min) 651 ,4 734,8

13 Dímero propelargonidina (Rt=5,65 min) 82,8 84,0

14 Dímero propelargonidina (Rt=9,27 min) 165,3 185,8

TOTAL 1038,8 1058,9

Trímeros de procianidinas

15 Trímero T2 0,3 0,5

16 Procianidina 01 260,6 157,5

17 Trímero B (Rt=4,78 min) 35,5 43,0

TOTAL 296,5 139,6

Flavanolignanos

18 Cinchonaina (Rt=7,37 min) 557,2 394,7

19 Cinchonaina (Rt=9,05 min) 63,8 59,5

20 Cinchonaina (Rt=9,30 min) 64,3 59,6

21 Cinchonaina (Rt=12,27 min) 545, 1 357, 1

TOTAL 1972,5 865,0

TOTAL DE FLAVAN-3-0LES 9729,7 9388,0

Para la caracterización de la fracción de proantocianidinas con un DP≥ 3, se empleó idéntico procedimiento al indicado para los ejemplos 1 y 2. Algunas ampliaciones del espectro de masas resultante se presentan en las Figuras 6A, 6B y 6C. A continuación se indican las señales m/z correspondientes a los iones [M-H]" de las proantocianidinas detectadas (Tabla 6).

Tabla 6.- Extracto n° 3. Caracterización de proantocianidinas

m/z teórico m/z experimental

DP (epi)cat (epi)afz M [M-H]" [M-H]"

DP3 3 0 866,206 865, 198 865, 185

2 1 850,21 1 849,203 849, 189

1 2 834,216 833,208 833, 192

0 3 818,221 817,213

DP4 4 0 1 154,269 1 153,261 1 153,245

3 1 1 138,274 1 137,266 1 137,249

2 2 1 122,279 1 121 ,272

1 3 1 106,284 1 105,277

0 4 1090,290 1089,282

DP5 5 0 1442,333 1441 ,325 1441 ,305

4 1 1426,338 1425,330 1425,310

3 2 1410,343 1409,335 1409,314

2 3 1394,348 1393,340

1 4 1378,353 1377,345

0 5 1362,358 1361 ,350

DP6 6 0 1730,396 1729,388 1729,366

5 1 1714,401 1713,393 1713,370

4 2 1698,406 1697,398 1697,373

3 3 1682,411 1681 ,403 1681 ,381

2 4 1666,416 1665,409

1 5 1650,421 1649,414

0 6 1634,427 1633,419

DP7 7 0 2018,459 2017,452 2017,425

6 1 2002,464 2001 ,457 2001 ,430

5 2 1986,470 1985,462 1985,437

4 3 1970,475 1969,467 1969,438

3 4 1954,480 1953,472

2 5 1938,485 1937,477

1 6 1922,490 1921 ,482

0 7 1906,495 1905,487

DP8 8 0 2306,523 2305,515 2305,487

7 1 2290,528 2289,520 2289,494

6 2 2274,533 2273,525 2273,496

5 3 2258,538 2257,530 2257,487

4 4 2242,543 2241 ,535 2241 ,489

3 5 2226,548 2225,540

2 6 2210,553 2209,545

1 7 2194,558 2193,551

0 8 2178,563 2177,556

DP9 9 0 2594,586 2593,578 2593,547

8 1 2578,591 2577,583 2577,547

7 2 2562,596 2561 ,589 2561 ,553

6 3 2546,601 2545,594 2545,560 5 4 2530,607 2529,599

4 5 2514,612 2513,604

3 6 2498,617 2497,609

2 7 2482,622 2481 ,614

1 8 2466,627 2465,619

0 9 2450,632 2449,624

DP10 10 0 2882,650 2881 ,642 2881 ,618

9 1 2866,655 2865,647 2865,606

8 2 2850,660 2849,652 2849,642

7 3 2834,665 2833,657 2833,641

6 4 2818,670 2817,662

5 5 2802,675 2801 ,667

4 6 2786,680 2785,672

3 7 2770,685 2769,677

2 8 2754,690 2753,682

1 9 2738,695 2737,687

0 10 2722,700 2721 ,693

DP11 11 0 3170,713 3169,705 3169,693

10 1 3154,718 3153,710 3153,685

9 2 3138,723 3137,715 3136,719

DP, grado de polimerización

(epi)cat, unidades de (epi)catequina

(epi)afz, unidades de (epi)afzelequina

M, masa molecular monoisotópica

El extracto n° 3 está compuesto por proantocianidinas homogéneas constituidas exclusivamente por unidades de (epi)catequinas (i.e., procianidinas) hasta un grado de polimerización (DP) de 11 unidades (undecámeros), así como por proantocianidinas heterogéneas formadas por (epi)catequinas y (epi)afzelequinas conteniendo un número variable de unidades de (epi)afzelequinas (entre 1 y 4 cuatro) unidades, dependiendo del DP.

Ejemplo 4: Extracto de madera interna de Linearía tomentosa L. conteniendo procianidinas, propelargonidinas y flavanolignanos.

Se utilizaron muestras de madera interna de Linearía tomentosa L, una vez desprendida la corteza, después de la recolección de las partes aéreas de la planta, que se secaron y molieron, según se describió anteriormente para la corteza. Para la fase de extracción se utilizó exactamente el mismo método que se describe para los ejemplos 1 , 2 y 3.

El contenido en polifenoles de este extracto n° 4 fue de 115, 1 ±47,2 mg/g (media±DE, n=3 plantas de diferentes localidades). Igualmente, el contenido en proantocianidinas fue de 54,9±68,6 mg/g. El rendimiento del proceso fue de 2-6%.

La concentración de polifenoles individualizados del extracto n° 4, utilizando la misma técnica descrita para los ejemplos 1 ,2 y 3 se recoge en la Tabla 7 (ver Figura 7). La distribución porcentual de los diferentes grupos de compuestos fue la siguiente: 6,0% de monómeros de flavan-3-ol; 29,5% de procianidinas (dímeros + trímeros); 4,2% de propelargonidinas y 60,4% de flavanolignanos.

Tabla 7.- Extracto n° 4: Composición fenólica individualizada

No. Concentración (Mg/g extracto)

Media DE

Monómeros

1 (+)-Catequina 10, 1 10,2

2 (-)-Epicatequina 69,7 54,4

TOTAL 79,8 64,6

Dímeros de procianidinas

3 Procianidina B3 18,5 31 ,9

4 Procianidina B1 7,0 12,2

5 Procianidina B4 194,6 311 ,7

6 Procianidina B2 127,9 204,7

7 Procianidina B (Rt=5,47 min) 5,3 9,2

8 Procianidina B7 5,2 9,0

9 Procianidina B5 20, 1 30, 1

10 Procianidina B (Rt=9,27 min) 1 ,9 3,2

TOTAL 380,4 611 ,9

Dímeros de propelargonidinas

1 1 Dímero properlagonidina (Rt=4,43 min) 7, 1 12,3

12 Dimero propelargonidina (Rt=5,01 min) 39,0 61 ,6

13 Dímero propelargonidina (Rt=5,65 min) 0,0 0,0

14 Dímero propelargonidina (Rt=9,27 min) 9,4 13, 1

TOTAL 55,6 87,0

Trímeros de procianidinas

15 Trímero T2 0,0 0,0

16 Procianidina 01 1 1 ,3 19,5

17 Trímero B (Rt=4,78 min) 1 ,2 1 ,0

TOTAL 12,4 20,0

Flavanolignanos

18 Cinchonaina (Rt=7,37 min) 378,3 33,7

19 Cinchonaina (Rt=9,05 min) 23,2 6,6

20 Cinchonaina (Rt=9,30 min) 26,5 1 ,3

21 Cinchonaina (Rt=12,27 min) 377,3 50,8

TOTAL 805,2 85,8

TOTAL DE FLAVAN-3-0LES 1333,4 869,4

Para la caracterización de la fracción de proantocianidinas con un DP≥ 3, se empleó idéntico procedimiento al indicado para los ejemplos 1 ,2 y 3. Algunas ampliaciones del espectro de masas resultante se presentan en las Figuras 8A, 8B y 80. A continuación se indican las señales m/z correspondientes a los iones [M-H]" de las proantocianidinas detectadas (Tabla 8).

Tabla 8.- Extracto n° 4. Caracterización de proantocianidinas

m/z teórico m/z experimental

DP (epi)cat (epi)afz M [M-H]" [M-H]"

DP3 3 0 866,206 865, 198 865, 193

2 1 850,21 1 849,203 849,203

1 2 834,216 833,208

0 3 818,221 817,213

DP4 4 0 1154,269 1153,261 1153,255

3 1 1138,274 1137,266 1137,269

2 2 1122,279 1121 ,272

1 3 1106,284 1105,277

0 4 1090,290 1089,282

DP5 5 0 1442,333 1441 ,325 1441 ,318

4 1 1426,338 1425,330 1425,332

3 2 1410,343 1409,335

2 3 1394,348 1393,340

1 4 1378,353 1377,345

0 5 1362,358 1361 ,350

DP6 6 0 1730,396 1729,388 1729,382

5 1 1714,401 1713,393 1713,399

4 2 1698,406 1697,398 1697,446

3 3 1682,411 1681 ,403

2 4 1666,416 1665,409

1 5 1650,421 1649,414

0 6 1634,427 1633,419

DP7 7 0 2018,459 2017,452 2017,455

6 1 2002,464 2001 ,457 2001 ,464

5 2 1986,470 1985,462 1985,531

4 3 1970,475 1969,467

3 4 1954,480 1953,472

2 5 1938,485 1937,477

1 6 1922,490 1921 ,482

0 7 1906,495 1905,487

DP8 8 0 2306,523 2305,515

7 1 2290,528 2289,520

6 2 2274,533 2273,525

5 3 2258,538 2257,530

4 4 2242,543 2241 ,535

3 5 2226,548 2225,540

2 6 2210,553 2209,545

1 7 2194,558 2193,551

0 8 2178,563 2177,556

DP9 9 0 2594,586 2593,578

8 1 2578,591 2577,583

7 2 2562,596 2561 ,589

6 3 2546,601 2545,594

5 4 2530,607 2529,599

4 5 2514,612 2513,604

3 6 2498,617 2497,609

2 7 2482,622 2481 ,614

1 8 2466,627 2465,619

0 9 2450,632 2449,624

DP10 10 0 2882,650 2881 ,642

9 1 2866,655 2865,647

8 2 2850,660 2849,652

7 3 2834,665 2833,657

6 4 2818,670 2817,662

5 5 2802,675 2801 ,667

4 6 2786,680 2785,672

3 7 2770,685 2769,677

2 8 2754,690 2753,682

1 9 2738,695 2737,687

0 10 2722,700 2721 ,693

DP, grado de polimerización

(epi)cat, unidades de (epi)catequina

(epi)afz, unidades de (epi)afzelequina

M, masa molecular monoisotópica

El extracto n° 4 está compuesto por proantocianidinas homogéneas constituidas exclusivamente por unidades de (epi)catequinas (i.e., procianidinas) con un grado de polimerización (DP) entre 4 y 7 unidades, así como por proantocianidinas heterogéneas con un DP=5, formadas por (epi)catequinas y (epi)afzelequinas conteniendo un máximo de 2 unidades(epi)afzelequinas.

Ejemplo 5.- Determinación de las propiedades antioxidante, antimicrobiana, citotóxica y antiproliferativa del extracto de de la invención

La capacidad antioxidante de los extractos de la invención se ha evaluado in vitro por el método ORAC (capacidad de absorción de radicales de oxígeno) empleando fluoresceína como sustancia fluorescente. En esta técnica, los antioxidantes presentes en el extracto neutralizan los radicales peroxilo generados por la descomposición térmica de AAPH, evitando así su reacción con la fluoresceína (Prior, R. L, et al. (2005). Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(10), 4290-4302). Los resultados se expresan como mmoles de Trolox/g de extracto, siendo el Trolox un compuesto sintético, análogo hidrosoluble de la vitamina E. Uno de los extractos comerciales con mayor capacidad antioxidante es el de pepita de uva, que suele presentar un valor ORAC entre 2,71 - 26,4 mmol Trolox/g (n=16) (Monagas, M., et al. (2005). Quality assessment of commercial dietary antioxidant producís from Vitis vinifera L. grape seeds. Nutrition and Cáncer, 53(2), 244-254).

En la determinación de capacidad antimicrobiana se comprueba la inhibición del crecimiento de bacterias tales como Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis V583, y Pseudomonas aeruginosa PSP, las cuales son bacterias asociadas con la cavidad oral y el sistema respiratorio. El método se basa en la realización de incubaciones a 37 °C durante 20 h, tomando la absorbancia a 660 nm como medida de crecimiento para finalmente calcular la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento microbiano o valor IC50 ^g/mL) (Cueva, C, et al. (2010). Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Research in Microbiology, 161 (5), 372-382). Para extractos ricos en proantocianidinas procedentes de la pepita de uva, se han descrito valores de IC50 de 87.5 μg/mL para S. aureus, 184 μg/mL para E. faecalis y 583 μg/mL para P. aerugiosa (Cueva, C, et al. (2010). Antimicrobial activity of phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria. Research in Microbiology, 161 (5), 372-382). En el caso de compuestos puros como el ácido gálico valores IC50 encontrados fueron 18,4 μg/mL para S. aureus, 440 μg/mL para E. faecalis y 205 μg/mL para P. aeruginosa.

Para la determinación de la citotoxidad se empleó el método del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) y dos líneas celulares, una de células epiteliales de adenocarcinoma gástrico (AGS) y la otra de células epiteliales de adenocarcinoma colorectal (SW620). El método MTT se utiliza para determinar el posible efecto citotóxico de un agente sobre líneas celulares tumorales ó cultivos primarios de células normales. Este ensayo se basa en la reducción metabólica del MTT realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto coloreado de color azul (formazan), permitiendo determinar

la funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas. Los resultados se expresan como la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular o valor IC50 ^g/mL) (Diaz, G. , et al. (2007). Localization of MTT formazan in lipid droplets. An alternative hypothesis about the nature of formazan granules and aggregates. European Journal of Histochemistry, 51 (3), 213-218). En el caso de los extractos de pepita de uva se han reportado valores IC50 de 57,53 mg/L para células YAC-1 de linfoma de ratón (Zhang, X. Y. , Li, W. G. , Wu, Y. J. , Zheng, T. Z., Li, W. , Qu, S. Y. , & Liu, N . F. (2005). Proanthocyanidin from grape seeds potentiates anti-tumor activity of doxorubicin via immunomodulatory mechanism. International Immunopharmacology, 5(7-8), 1247-1257).

Para la determinación de proliferación celular se empleó el método de Hoechst 33342 y las líneas celulares de cáncer hormonal, incluyendo cáncer de próstata (LNCaP), cáncer de mama (MCF-7) y cáncer cervical (HeLa). Hoechst 33342 es un fluorocromo permeable a la membrana plasmática por lo que entra en todas las células. Tiene especificidad por los pares de bases A-T uniéndose y tiñendo el DNA, y por tanto permite cuantificar la cantidad de DNA y por consiguiente la proliferación celular (Shapiro, H. M . (1981 ). Flow cytometric estimation of DNA and RNA contení in intact cells stained with Hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry, 2(3), 143-150). Los resultados se expresan como la concentración necesaria para inhibir el 50% de la proliferación celular o valor IC50 ^g/mL). En el caso de extractos de pepitas de uva, se ha descrito una inhibición de la proliferación celular de un 40% para una concentración de 200 μg/mL en células de cáncer de vejiga BI U87 (Liu, J. , et al. (2009). Role of survivin in apoptosis induced by grape seed procyanidin extract in human bladder cáncer BIU87 cells. Chinese-German Journal of Clinical Oncology, 8(7), 420-425).

5.1.- Actividad biológica del extracto n° 1

En cuanto a la capacidad antioxidante, el extracto n° 1 presentó un valor ORAC de 16, 1 ±0,8 mmoles de Trolox/g de extracto (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades).

También se realizó la determinación de citotoxicidad en líneas de cáncer gástrico (AGS) y colónico (SW620), encontrándose valores IC50 de 172,7±30,0 y 170,7±29,0 g/mL, respectivamente (media±DE, n=3 plantas de diferentes localidades). Para la actividad antiproliferativa en líneas de cáncer de próstata (LNCaP), cáncer de mama (MCF-7) y cáncer cervical (HeLa), los valores IC50 fueron de 1 ,4; 68,2 y 98, 1 μg/mL, respectivamente (n=1 , planta de una sola localidad).

La actividad antimicrobiana de este extracto n° 1 frente a S. aureus ATCC 25923, E. faecalis V58, y P. aeruginosa PSP presentó valores IC50 de 559,6±61 ,6, 1769,5±460,3 y 498,0±32,8 μςΛτΐ-., respectivamente (media±DE, n=3 plantas de diferentes localidades).

5.2.- Actividad biológica del extracto n° 2

En cuanto a la capacidad antioxidante el extracto n° 2 presentó un valor ORAC de 12,2±3,7 mmoles de Trolox/g de extracto (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades).

También se realizó la determinación de la citotoxicidad en líneas de cáncer gástrico (AGS) y colónico (SW620), encontrándose valores IC50 de 187,8 y 179,8 μg/mL, respectivamente (n=1 planta de una sola localidad). Para la actividad antiproliferativa en líneas de cáncer de mama (MCF-7) y cáncer cervical (HeLa) los valores IC50 fueron de 54,3 y 53,6 μg/mL, respectivamente (n=1 planta de una sola localidad).

La actividad antimicrobiana de este extracto n° 2 frente a S. aureus ATCC 25923 y E. faecalis V58, presentó valores IC50 de 387,7±1 1 ,5 y 4107,0±3852,3 μg/mL, respectivamente (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades). Frente a P. aeruginosa PSP fue de 416,5 μg/mL (n=1 planta de una sola localidad).

5.3.- Actividad biológica del extracto n° 3

En cuanto a la capacidad antioxidante, el extracto n° 3 presentó un valor ORAC de 15, 1 ±5,2 mmoles de Trolox/g de extracto (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades).

También se realizó la determinación de la citotoxicidad en líneas de cáncer gástrico (AGS) y colónico (SW620), encontrándose valores IC50 de 162,7±51 ,9 y 129, 1 ±14,0 μg/mL, respectivamente (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades). Para la actividad antiproliferativa en línea de cáncer de próstata (LNCaP) el valor IC50 fue de 0,098 μg/mL (n=1 planta de una sola localidad).

La actividad antimicrobiana de este extracto n° 3 frente a S. aureus ATCC 25923 presentó valores IC50 de 311 ,5±253,1 μg/mL (media±DE, n=2 plantas de diferentes localidades). Frente a E. faecalis V58 y P. aeruginosa PSP fue de 395,3 y 151 ,8 μg/mL, respectivamente (n=1 planta de una sola localidad).

5.4.- Actividad biológica del extracto n° 4

En cuanto a la capacidad antioxidante el extracto n° 4 presentó un valor ORAC de 3, 1 ±2,3 mmoles de Trolox/g de extracto (media±DE, n= 2 plantas de diferentes localidades).

También se realizó la determinación de citotoxicidad en líneas de cáncer gástrico (AGS) y colónico (SW620), encontrándose valores IC50 de >500 μg/mL, para ambos casos (n= 1 planta de una sola localidad). Para la actividad antiproliferativa en líneas de cáncer de mama (MCF-7) y cervical (HeLa) el valor IC50 fue de 58,5 y 40,4 μg/mL, respectivamente (n=1 planta de una sola localidad).

La actividad antimicrobiana de este extracto n° 4 frente a S. aureus ATCC 25923 y P. aeruginosa PSP presentó valores IC50 de 2231 ,0±767,9 y 630, 1±256,3 g/mL, respectivamente (media ± DE, n=2 plantas de diferentes localidades). Frente a E. faecalis \/58 el valor IC50 fue de 1 112,0 μg/mL (n=1 planta de una sola localidad).

Métodos de análisis de los compuestos descritos de la invención

El contenido fenólico total del extracto se determina por el método colorimétrico de Singleton y Rossi (Singleton, V. L, y Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolibdicphosphotungstic acid reagent. American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158). Los resultados se expresan como mg de ácido gálico /g de extracto.

El contenido de proantocianidinas totales del extracto se determina por el método de Bathe-Smith (Ribéreau-Gayon, P., y Stonestreet, E. (1966). Dósage des tannins du vin rouges et determination du leur structure. Chem. Anal. 48, 188-196).

Para determinar la presencia de monómeros de flavan-3-oles, de procianidinas y propelargonidinas hasta un grado de polimerización (DP) de tres unidades (DP 3 o trímeros), y de flavanolignanos, se empleó un sistema de cromatografía líquida de utra alta eficacia (UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography) acoplado a un detector de fotodiodos alineados (DAD) y a un espectrómetro de masas con fuente de ionización a presión atmosférica por electronebulización y un analizador de triple quadrupolo (UPLC-DAD-ESI-TQ MS). La separación se llevó a cabo en una columna Waters BEH C18 (2.1 x 100 mm; 1.7 μηι) a 40°C. Se empleó un gradiente compuesto por: eluyente A- agua:ácido acético (98:2, v/v) y B-acetonitrilo:ácido acético (98:2, v/v) a un flujo de 0,5 mL/min de la siguiente forma: 0-1 ,5 min: 0,1 % B; 1 ,5-1 1 , 17 min: 0, 1-16,3% B; 1 1 , 17-1 1 ,5 min: 16,3-18,4% B; 1 1 ,5-14 min: 18,4% B; 14-14, 1 min: 18,4-99,9% B; 14, 1-15,5 min: 99,9% B; 15,5-15,6 min: 99,9-0, 1 % B; 15,6-18 min: 0, 1 % B.

Para la cuantificación mediante el detector de masas se empleó el modo de monitorización de reacciones múltiples (múltiple reaction monitoring o MRM) con las transiciones m/z 289/245 (monómeros de flavan-3-ol, (+)-catequina y (-)-epicatequina), 577/289 (dimeros de procianidinas), m/z 561/289 (dimeros de propelargonidinas), m/z 865/577 (trímeros de procianidinas), y m/z 451/341 (flavanolignanos de tipo cinchonaina). Se emplearon los patrones comerciales de la (+)-catequina, (-)-epicatequina, procianidinas B1 [(-)-epicatequina-^→8)-(+)-catequina], B2 [(-)-epicatequina-^→8)-(-)-epicatequina], y C1 [(-)-epicatequina-^→8)-(-)-epicatequina-^→8)-(-)-epicatequina] para las optimizaciones de los parámetros del detector de masas y elaboración de curvas de calibrado. La asignación de otras estructuras correspondientes a las procianidinas B3 [(+)-catequina-(4a→8)-(+)-catequina], B5 [(-)-epicatequina-^→6)-(-)-epicatequina], B7 [(-)-epicatequina-^→6)-(+)-catequina], y T2 [(-)-epicatequina-^→8)-(-)-epicatequina-^→8)-(+)-catequina], se llevó a cabo con patrones aislados de otras plantas y mediante confirmación del espectro MS/MS (Figuras 9A y 9B). Debido a la ausencia de patrones comerciales para las propelargonidinas y flavanolignanos, se realizó un espectro de MS/MS para los iones moleculares a m/z 561 y m/z 451 para confirmar la estructura de ambos tipos de compuestos, respectivamente. La cuantificación de las propelargonidinas y de los flavalignanos se efectúo sobre la curva de calibrado de la procianidina B1 y de la (-)-epicatequina, respectivamente.

A partir de la técnica anterior, se realizó la cuantificación de monómeros [(+)-catequina y (-)-epicatequina], dimeros de procianidina [procianidinas B3, B1 , B4, B2, B7, B5, y dos dimeros adicionales de estructura desconocida en tiempos de retención (Rt), Rt= 5,37 y 9,37 min], dimeros de propelargonidinas [Rt= 4,43; 5,01 ; 5,65; 9,27 mins], trímeros de procianidinas [trímeros T2, C1 y trímeros de estructura desconocida a Rt= 4,78 min] y flavanolignanos de tipo cichonaina [Rt= 7,37; 9,05; 9,30; 12,27 mins].

Para la fracción de proantocianidinas de alto peso molecular igual o superior a trímeros (DP 3), se empleó un cromatógrafo de líquidos acoplado a un espectrómetro de masas con fuente de ionización a presión atmosférica por electronebulización y analizador híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (HPLC-ESI-qTOF MS). Los análisis se realizaron sin separación cromatográfica previa (inyección directa), inyectando 20 en una corriente de 100 μίΛηίη de acetonitrilo:agua (75:25). Esta se hacía llegar a una fuente de electronebulización, trabajando

en modo negativo a un voltaje de 4500 V. El gas de nebulización (N2) se utilizó a una presión de 30 psi, y el de secado (N2) a un caudal de 6 L/min y una temperatura de 300 °C. En cuanto a los voltajes de transmisión iónica, se aplicaron 500 V al fragmentador, y 300 V al skimmer. Finalmente, el analizador trabajó en modo barrido de masas (Full Sean), registrando entre m/z 100 y 5000.

En la Tabla 9 se indican las masas monoisotópicas correspondientes a procianidinas y propelargonidinas de tipo B que se encontrarían en los extractos objeto de esta patente. La asignación de la estructura a la relación m/z observada [M-H]- se hace teniendo en cuenta el cálculo teórico: m/z = 290.0790*(CAT) + 274.0841 *(AFZ) - 2.0156*(B) -1.0078; donde CAT y AFZ corresponden, respectivamente, al número de unidades de (epi)catequina y (epi)afzelequina que componen la molécula de proantocianidina; y B corresponde al número de enlaces de tipo B entre las unidades constitutivas. La asignación de una estructura a la masa observada (m/z, [M-H]-) se hace por comparación con los valores teóricos de la masa molar monoisotópica (M).

Tabla 9.- Masas monoisotópicas correspondientes a procianidinas y propelargonidinas de tipo B.

m/z

DP (epi)cat (epi)afz enlaces M [M-H]"

DP2 2 0 1 578, 142 577, 135

1 1 1 562, 148 561 , 140

0 2 1 546, 153 545, 145

DP3 3 0 2 866,206 865, 198

2 1 2 850,21 1 849,203

1 2 2 834,216 833,208

0 3 2 818,221 817,213

DP4 4 0 3 1 154,269 1 153,261

3 1 3 1 138,274 1 137,266

2 2 3 1 122,279 1 121 ,272

1 3 3 1 106,284 1 105,277

0 4 3 1090,290 1089,282

DP5 5 0 4 1442,333 1441 ,325

4 1 4 1426,338 1425,330

3 2 4 1410,343 1409,335

2 3 4 1394,348 1393,340

1 4 4 1378,353 1377,345

0 5 4 1362,358 1361 ,350

DP6 6 0 5 1730,396 1729,388

5 1 5 1714,401 1713,393

4 2 5 1698,406 1697,398

3 3 5 1682,411 1681 ,403

2 4 5 1666,416 1665,409

1 5 5 1650,421 1649,414

0 6 5 1634,427 1633,419

DP7 7 0 6 2018,459 2017,452

6 1 6 2002,464 2001 ,457

5 2 6 1986,470 1985,462

4 3 6 1970,475 1969,467

3 4 6 1954,480 1953,472

2 5 6 1938,485 1937,477

1 6 6 1922,490 1921 ,482

0 7 6 1906,495 1905,487

DP8 8 0 7 2306,523 2305,515

7 1 7 2290,528 2289,520

6 2 7 2274,533 2273,525

5 3 7 2258,538 2257,530

4 4 7 2242,543 2241 ,535

3 5 7 2226,548 2225,540

2 6 7 2210,553 2209,545

1 7 7 2194,558 2193,551

0 8 7 2178,563 2177,556

DP9 9 0 8 2594,586 2593,578

8 1 8 2578,591 2577,583

7 2 8 2562,596 2561 ,589

6 3 8 2546,601 2545,594

5 4 8 2530,607 2529,599

4 5 8 2514,612 2513,604

3 6 8 2498,617 2497,609 2 7 8 2482,622 2481 ,614

1 8 8 2466,627 2465,619

0 9 8 2450,632 2449,624

DP10 10 0 9 2882,650 2881 ,642

9 1 9 2866,655 2865,647

8 2 9 2850,660 2849,652

7 3 9 2834,665 2833,657

6 4 9 2818,670 2817,662

5 5 9 2802,675 2801 ,667

4 6 9 2786,680 2785,672

3 7 9 2770,685 2769,677

2 8 9 2754,690 2753,682

1 9 9 2738,695 2737,687

0 10 9 2722,700 2721 ,693

DP11 11 0 10 3170,713 3169,705

10 1 10 3154,718 3153,710

9 2 10 3138,723 3137,715

8 3 10 3122,728 3121 ,720

7 4 10 3106,733 3105,725

6 5 10 3090,738 3089,731

5 6 10 3074,743 3073,736

4 7 10 3058,749 3057,741

3 8 10 3042,754 3041 ,746

2 9 10 3026,759 3025,751

1 10 10 3010,764 3009,756

0 11 10 2994,769 2993,761

DP, grado de polimerización

(epi)cat, unidades de (epi)catequina

(epi)afz, unidades de (epi)afzelequina

M, masa molecular monoisotópica