Processing

Please wait...

Settings

Settings

Goto Application

1. WO2020220603 - COMPONENT AND METHOD FOR PROTECTING AND TREATING DRUG-INDUCED LIVER INJURY

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8  

附图

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10  

说明书

发明名称 : 保护和治疗药物性肝损伤的成分和方法

技术领域

[0001]
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种分子量≤3000的壳寡糖的在保护和治疗药物性肝损伤中的医药用途。

背景技术

[0002]
药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)是指人体暴露于常规剂量或高剂量药物后,因药物本身或其代谢产物对肝脏的直接毒性,或人体对药物或其代谢产物产生过敏或代谢特异质反应而导致的肝脏损伤。对乙酰氨基酚(APAP)是一种临床广泛使用的镇痛药,在治疗剂量(<4g/d)下,APAP可引起短暂的血清氨基转移酶升高,特别是在营养不良、肝功能不全、酗酒或服用某些CYP450诱导药物的人群中,当服用过量时(成人大于4g/d,未成年人大于50-75mg/kg·d),都可能发生严重的肝损伤,甚至急性肝功能衰竭(Acute liver failure,ALF)。据估计,在欧美国家每年约有2000人经历ALF,其中近50%是由APAP引起的药物性肝损伤。61%的病例似乎是使用中位剂量(34g/3d)引起的。研究人员发现,中国的药物性肝损伤的年发生率高达23.80/10万人。其中,急性药物性肝损伤占比为87%,13%的患者为慢性药物性肝损伤。在引发肝损伤的药物中,中国排名第一的药物类别为各类保健品和传统中药,占比高达26.81%,其次为抗结核药,占比为21.99%,由APAP引起的肝损伤虽然只占所有DILI的3.8%,但是占所有止痛药和抗炎药引发的DILI的50.8%。国内在应用止痛和抗炎方面依旧主要面临着对乙酰氨基酚带来的肝损伤,形势严峻。
[0003]
血液中的大多数APAP在肝脏中通过UDP-葡糖醛酸基转移酶(UGT)和磺基转移酶(SULT)作用使其与葡糖醛酸和硫酸盐结合,形成共轭代谢物以及少量已经羟基化和脱乙酰化的代谢物在尿液中排出。在正常情况下,约5-9%的APAP通过不同的途径经历肝脏代谢,即细胞色素P450酶(CYP450),主要是CYP2E1和较小程度的CYP1A2,CYP2A6和CYP3A4代谢,形成高活性的毒性中间代谢产物N-乙酰基-对苯醌亚胺(NAPQI)。然后,谷胱甘肽(GSH)的巯基将NAPQI转化为在尿液中排泄的无害代谢物。然而,当APAP过量后II期代谢酶饱和时,过量的NAPQI耗尽GSH,导致NAPQI与细胞蛋白中巯基的共价结合,特别是线粒体蛋白。这导致线粒体氧化应激和功能障碍,最终导致肝细胞坏死。NAPQI还干扰线粒体电子传递链(ETC)的复杂的复合物I和II,导致电子从ETC泄漏与氧结合,从而形成大量超氧自由基(过氧化氢H2O2和过氧硝酸盐ONOO-)等活性氧(ROS)和活性氮(RNS),导致氧化应激和蛋白质硝基化,进而产生细胞毒性。
[0004]
乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是2011年被FDA批准用于治疗对乙酰氨基酚引起的固有型DILI的唯一解毒药物。然而,乙酰半胱氨酸的半衰期短,仅早期治疗有效,,主要不良反应为皮瘆、恶心、呕吐、发热,其治疗效果并不理想,另一个主要原因是在于对乙酰氨基酚引起肝损伤的机理十分复杂。鉴于此,研究开发具有良好治疗作用的药物性肝损伤药物是非常迫切而必要的。
[0005]
甲壳素(几丁质),是继纤维素之后最丰富的生物质,常见于甲壳类动物的壳,昆虫表皮,和真菌细胞壁中。用碱溶液处理几丁质将其转化为壳聚糖:完全或部分脱乙酰形式的几丁质。壳聚糖可以定义为天然的无毒生物聚合物,线性多糖由β-1,4-GlcNAc和β-1,4-GlcN组成。壳聚糖含有相当不稳定的糖苷键,这使得它可被水解剂切割以产生具有可变聚合度(degree of polymerization,DP)的壳聚糖低聚物。DP小于20且平均MW小于3.9kDa的壳聚糖被称为壳寡糖(COS),COS具有广泛的生物活性,在医药,化妆品,食品和农业等多个领域具有广泛的应用前景,也有应用于护肝药物的报道,如CN201610639820.4公开了一种壳寡糖在制备用于醒酒护肝药物中的用途,所述药物为常用口服剂型,包括片剂、胶囊、颗粒、口服液、悬浮液。为壳寡糖增加了新的用途,有效解决了醉酒人员的醒酒护肝问题,尽可能的避免酒精对人体造成伤害。但存在疗效不确切等问题。
[0006]
发明内容
[0007]
本发明要解决的技术问题是提供一种保护和治疗药物性肝损伤的方法,给药物性肝损伤患者,尤其是对乙酰氨基酚引起的DILI患者多一种选择。
[0008]
为解决上述技术问题,本发明公开了一种特定分子量壳寡糖(分子量≤3000),简称为COSM的用途,用于制备保护和治疗药物性肝损伤的组合物,尤其用于制备保护和治疗药源性急性肝损伤的组合物,特别是用于制备保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤的组合物。所述的组合物用于:全身给药或肠胃外给药,优选静脉注射给药。
[0009]
COSM,来源于天然产物,制备步骤简便,成本低,污染小,利于大规模生产。本发明研究人员发现作为对人体无毒、无三致作用的具有良好的体内外抗氧化活性的COSM,可有效对抗对乙酰氨基酚所致的肝损伤作用,试验证实COSM可调节对乙酰氨基酚诱导的肝功能生化指标的异常,显著降低对乙酰氨基酚诱导的小鼠血清中ALT、AST的异常升高;改善对乙酰氨基酚诱导的肝组织损伤;提高对乙酰氨基酚诱导肝损伤的肝组织中体内解毒剂GSH含量;提高对乙酰氨基酚诱导的氧化性损伤肝脏的抗氧化能力;降低对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤中MDA含量。有望开发应用于临床治疗药物引起的肝损伤、为病人提供了更好的选择。其发挥保护和治疗的作用机制可能是壳寡糖可有效对抗对乙酰氨基酚的氧化性肝损伤 作用,并且降低AST和ALT活性,提高肝脏抗氧化能力,保护肝细胞免受氧化应激损伤和对抗对乙酰氨基酚中间代谢产物N-乙酰-对苯醌亚胺(NAPQI)的强大氧化作用,通过抗氧化应激作用影响对乙酰氨基酚产生的肝毒性从而发挥其对肝损伤的保护和治疗作用。
[0010]
本发明所公开的保护和治疗药物性肝损伤的方法,包括:给予肝损伤对象有效量的COSM,所述有效量为8~13mg/kg/日,优选11mg/kg/日。

附图说明

[0011]
图1为腹腔注射对乙酰氨基酚(APAP)后小鼠血清中ALT、AST变化情况;
[0012]
图2为给药24h后各组小鼠肝功能生化指标对比;
[0013]
图3为给药24h后各组小鼠的肝组织H&E染色病理结构图;
[0014]
图4为给药24h后各组小鼠肝脏内GSH含量对比;
[0015]
图5为给药24h后各组小鼠肝脏组织总抗氧化能力(T-AOC)对比;
[0016]
图6为给药24h后各组小鼠肝脏组织MDA含量对比;
[0017]
图7为给药24h后各组小鼠肝脏组织GSH-Px含量对比;
[0018]
图8为给药24h后各组小鼠肝脏组织SOD含量对比;
[0019]
图9为给药24h后各组小鼠肝脏组织CAT含量对比;
[0020]
图10为给药24h后各组肝脏L02细胞上清液中ALT、AST变化情况。

具体实施方式

[0021]
以下通过具体实施例再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下,根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更,均应包括在本发明的范围内。
[0022]
为阐述本发明,我们采用其发病过程与临床相似的BABL/C小鼠腹腔注射对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤模型以及体外APAP诱导人肝脏细胞L02损伤模型来对本发明所公开的方法作进一步的说明。
[0023]
1.对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤的病理过程的探索
[0024]
雄性BALB/C小鼠6-8周25只,适应性喂养3天,随机分为对乙酰氨基酚(APAP)作用0h组、2h组、4h组、6h组、8h组,每组各5只,实验给药前禁食12小时,腹腔注射对乙酰氨基酚300mg/kg,从0时刻开始每隔2h处死对应小组的小鼠,取血,室温静置1h,4500转/分钟离心15min,取上清即血清,进行ALT、AST检测,结果显示,对乙酰氨基酚诱导的小鼠血清中ALT、AST从给药2-4h开始显著升高,其中血清AST在给予对乙酰氨基酚2h出现明显的升高趋势(*p<0.05),ALT则是在4h出现较显著性差异(** p<0.01),且后续的AST和ALT持续升高。由此可以看出对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤的发病时间是在给药后2-4h。即造模给药后对乙酰氨基酚诱导急性肝损伤是从2-4h开始发病,具体结果见表1和附图1:
[0025]
表1
[0026]
[表0001]
Mean±SEM APAP-0h组 APAP-2h组 APAP-4h组 APAP-6h组
ALT(U/L) 15.7±2.3 59.2±7.7 236.9±62.1 565.7±72.7
AST(U/L) 25.6±1.5 98.9±19.1 123.3±30.1 231.3±21.3

[0027]
2.COSM调节对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝功能生化指标的异常
[0028]
BABL/C小鼠60只,实验前禁食12小时,随机分为正常对照组(CON)、模型组(APAP300mg/kg)、COSM高中低剂量(L-25mg/kg、M-50mg/kg和H-100mg/kg)给药组,乙酰半胱氨酸(NAC)300mg/kg阳性对照组,给予COSM和阳性药NAC前2个小时腹腔注射对乙酰氨基酚300mg/kg,给药24小时后处死,取血清及肝组织,ALT、AST检测结果显示,相较于模型组各个治疗组的AST、ALT均明显降低(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,vs APAP),并呈现出一定的浓度依赖性,随着COSM的给药浓度越高治疗效果越明显。与阳性药NAC相比,COSM(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)显示与其相当的治疗效果。即COSM可以显著降低对乙酰氨基酚诱导的小鼠血清中ALT、AST的异常升高,具体结果见表2和附图2:
[0029]
表2
[0030]
[0031]
3.COSM改善对乙酰氨基酚诱导的肝组织损伤
[0032]
取各组小鼠的肝组织于4%多聚甲醛中固定过夜,采用石蜡包埋后切片并进行H&E染色,采用显微镜于观察病理结构并拍照,实验结果显示,COSM治疗组削弱了对乙酰氨基分诱导的肝脏损伤(H&E染色),且呈现一定的剂量依赖性,100mg/kg的COSM治疗效果甚至较阳性药效果好。COSM可显著改善对乙酰氨基酚诱导的肝组织病变,具体结果见附图3。
[0033]
4.COSM提高对乙酰氨基酚诱导肝损伤的肝组织中体内解毒剂GSH含量
[0034]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入生理盐水后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织谷胱甘肽(GSH)的测定,结果显示,COSM组相较于APAP模型组显著增加了GSH的含量,并呈现一定的浓度依赖性。并且COSM高剂量组(COSM-H)与NAC效果相当(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs NAC)。相较于模型组COSM能显著提高肝脏GSH的含量,从而达到解毒的效果,具体结果见表3和附图4:
[0035]
表3
[0036]
[0037]
5.COSM提高对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤的抗氧化能力
[0038]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入提取液后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织总抗氧化能力(T-AOC)的测定,结果显示,COSM中剂量(COSM-M)和高剂量(COSM-H)组相较于APAP模型组总抗氧化能力(T-AOC)显著增强,并呈现一定的浓度依赖性。COSM高剂量组(COSM-H)和COSM中剂量(COSM-H)的抗氧化能力增加与NAC效果相当(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs NAC)。相较于模型组COSM-H和COSM-M能显著提高肝脏GSH的含量,从而达改善肝损伤的效果,具体结果见表4和附图5:
[0039]
表4
[0040]
[0041]
6.COSM降低对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤中MDA含量
[0042]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入提取液后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织丙二醛(MDA)含量的测定,结果显示COSM治疗显著降低了肝脏脂肪酸与ROS结合产物MDA,改善肝氧化损伤,COSM高中低剂量组相较于APAP模型组MDA均显著降低,并呈现一定的浓度依赖性,COSM降低了APAP诱导的肝脏氧化损伤(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;),高中给药组与阳性药NAC的效果相当,具体结果见表5和附图6:
[0043]
表5
[0044]
[0045]
7.COSM提高对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤中GSH-Px含量
[0046]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入提取液后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量的测定,结果显示COSM治疗显著提高了肝脏GSH-Px的含量,改善肝氧化损伤,COSM高中低剂量组相较于APAP模型组GSH-Px均显著升高,并呈现一定的浓度依赖性,COSM降低了APAP诱导的肝脏氧化损伤(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;)具体结果见表6和附图7:
[0047]
表6
[0048]
[0049]
8.COSM提高对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤中SOD含量
[0050]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入提取液后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定,结果显示COSM治疗显著提高了肝脏SOD的含量,改善肝氧化损伤,COSM高中低剂量组相较于APAP模型组SOD均显著升高,COSM降低了APAP诱导的肝脏氧化损伤(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;),高中低给药组与阳性药NAC的效果相当,具体结果见表7和附图8:
[0051]
表7
[0052]
[0053]
9.COSM提高对乙酰氨基酚诱导的肝氧化性损伤中SOD含量
[0054]
称取各组小鼠的肝组织50mg,按照1:9加入提取液后,进行匀浆处理,10000转/分钟离心取上清液,进行肝脏组织过氧化氢酶(CAT)含量的测定,结果显示COSM治疗显著提高了肝脏CAT的含量,改善肝氧化损伤,COSM高剂量组相较于APAP模型组CAT显著升高,COSM高剂量降低了APAP诱导的肝脏氧化损伤(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs APAP;),高给药组与阳性药NAC的效果相当,具体结果见表8和附图9:
[0055]
表8
[0056]
[0057]
10.COSM调节对乙酰氨基酚诱导的体外人肝脏细胞L02损伤的保护作用以及改善生化指标的异常
[0058]
体外培养人正常肝细胞LO2,细胞按照每孔15000-20000个细胞/孔铺于96孔板,继续培养8-12h;根据前期毒性实验分组为COSM高、中、低(1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL),正常组和模型组每组6个复孔,各组加入COS后培养12小时后加入8mM的APAP继续培养12h;显微镜下观察病理状态和治疗效果后,收集培养液,离心取上清,试剂盒测AST、ALT的释放量,剩下的细胞加入CCK-8试剂测细胞存活率。结果显示COSM能够显著抑制APAP诱导的肝脏细胞的损伤或是死亡,与模型组相比高中剂量的COSM显著增加了肝脏细胞的存活率以及改善了APAP诱导的AST、ALT肝损伤指标的异常(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,vs APAP),具体结果见表9、表10和附图10:
[0059]
表9
[0060]
[0061]
表10
[0062]

权利要求书

[权利要求 1]
一种分子量≤3000的壳寡糖(COSM)的用途,用于制备保护和治疗药物性肝损伤的组合物。
[权利要求 2]
如权利要求1所述的用途,其特征在于,用于制备保护和治疗药源性急性肝损伤的组合物。
[权利要求 3]
如权利要求1所述的用途,其特征在于,用于制备保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤的组合物。
[权利要求 4]
如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的组合物用于:全身给药或肠胃外给药。
[权利要求 5]
如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的组合物用于静脉注射给药。
[权利要求 6]
一种保护和治疗药物性肝损伤的方法,包括:给予肝损伤对象有效量COSM。
[权利要求 7]
如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述有效量为8~13mg/kg/日。
[权利要求 8]
如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述有效量为11mg/kg/日。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]  
[ 图 9]  
[ 图 10]