Processing

Please wait...

Settings

Settings

Goto Application

1. WO2020191508 - BIOPROTECTIVE BIOSTIMULANT, PRODUCTION PROCESS AND USES THEREOF IN AGRICULTURE

Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Please use the PDF version for legal matters

[ ES ]

TITULO

BIOESTI M ULANTE Y BIOPROTECTOR, PROCESO DE FABRICACIÓN Y SUS USOS EN AGRICU LTU RA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La creciente industria hortofruticola a nivel mundial debe controlar los aspectos productivos que limitan la producción de estos productos. Entre otros riego, nutrición vegetal, fitopatógenos , aspectos relacionados a cosecha y post cosecha.

A este crecimiento han contribuido, fundamentalmente, los numerosos estudios realizados sobre nutricionales y funcionales de los vegetales, que han demostrado la gran cantidad de efectos beneficiosos que tienen sobre la salud, los cuales se relacionan, principalmente, a la presencia de polifenoles, antocianinas y otros activos que les confieren propiedades anti inflamatorias, anticaricinogénicas y efectos protectores cerebro y cardiovasculares entre otros.

Cabe mencionar que compuestos como los antioxidantes presentes en berries, uvas y tomates, por ejemplo, disminuyen el riesgo de enfermedades coronarias, previenen la oxidación de colesterol, disminuyendo el riesgo de arterioesclerosis y evitan afecciones neurodegenerativas .

La producción de alimentos en ecosistemas agrarios implican normalmente el uso intensivo de fertilizantes y plaguicidas y en menor medida los productores más pioneros incorporan además bioestimulantes .

En el presente documento se definen como:

Bioestimulante : Microorganismos completos, partes o sustancias de los mismos diseñados para ser aplicados a plantas o suelos para incrementar el vigor de los cultivos, mejorar la calidad del producto resultante o aumentar la tolerancia de la planta ante los diferentes tipos de estrés abiótico (estrés hidrico, salino entre otros) .

Bioprotector : Microorganismos completos, partes o sustancias de los mismos diseñados para proteger e inducir la resistencia de las plantas ante diferentes tipos de estrés biótico , provocado por ejemplo por hongos o bacterias fitopatógenas .

En general, los bioestimulantes agrícolas promueven el crecimiento y desarrollo de las plantas, además de mejorar su metabolismo, mejorando parámetros de calidad de frutas y

verduras. Una mayor calidad significa mayores beneficios para los agricultores y alimentos más sanos y nutritivos para los consumidores .

Los bioestimulantes vegetales o fitoestimulantes no se califican por su contenido de nutrientes, sino por su uso funcional, cuando se aplican a las plantas o la rizosfera, implicando la mejora del desarrollo del cultivo, vigor, rendimiento y/o la calidad mediante la estimulación de procesos naturales que benefician el crecimiento y las respuestas a estrés biótico y/o abiótico .

Dentro de los parámetros de calidad en frutos podemos mencionar: calibre, firmeza del fruto, sólidos solubles totales, contenido de antioxidantes, propiedades de post cosecha. Parámetros que pueden cuantificarse respecto a un bioestimulante aplicado en distintas etapas fenológicas de las plantas.

WO2014020187 describe una composición bioestimulante y elicitora para uso en agricultura en base a extracto de algas presentada como una composición sólida en forma de partículas, gránulos y/o pellets .

WO2017089641 describe composiciones bioestimulantes de plantas que comprenden cepas de microorganismos, principalmente Pseudomonas fluorescens CECT 9015, y además puede comprender otros microorganismos seleccionados entre los géneros Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacterr Tríchoderma o una combinación de los mismos.

En los aspectos asociados a riesgos bióticos, en fitopatología es particularmente relevante la proliferación de hongos y bacterias fitopatógenos que causan pérdidas devastadoras en los cultivos hortofrutícolas , afectando el cultivo desde la floración a cosecha y manejo, transporte y almacenamiento post cosecha .

El manejo fitosanitario habitual emplea el uso intensivo de plaguicidas preventivos conteniendo ingredientes activos de base química, los cuales, si bien controlan eficazmente plagas y enfermedades, conllevan efectos nocivos sobre la producción, el ambiente, los mercados y los trabajadores de esta industria. A nivel de ecosistema se afectan principalmente suelos, cursos de agua y especies de insectos benéficos, normalmente encargados de la polinización.

Buenas prácticas productivas son indispensables hoy en día, incluyendo el uso de fertilizantes y plaguicidas de menor impacto ambiental, de máxima eficacia y con un mínimo o cero residuos a cosecha. En este contexto, una agricultura competitiva demanda elementos de innovación y diferenciación que se encuentren al alcance de cualquier productor. Es asi que la utilización de un producto biotecnológico asequible e integral, a base de microorganismos benéficos, entregará un valor agregado a cada huerto, dado que permitirá un control oportuno de plagas complejas, disminuirá el impacto ambiental producido por el constante uso de productos químicos, incrementando el volumen de producción y prolongando la durabilidad del fruto post cosecha permitiéndole llegar a destino con la calidad requerida y valor agregado de buenas prácticas productivas.

En general en frutales y varias hortalizas, el hongo fitopatógenos Botrytis cinérea produce pérdidas importantes afectando la producción desde floración hasta postcosecha. El control de B. cinérea se realiza normalmente con la aplicación de un programa de fungicidas de manera preventiva durante el desarrollo del cultivo.

B. cinérea es altamente polífago, causa pérdidas importantes en pre y post cosecha, el uso de fungicidas para su control preventivo está limitado por las normas de registro de los países importadores, reduciendo las posibilidades de alternancia de plaguicidas lo que favorece el fenómeno de resistencia de B. cinérea a fungicidas, fenómeno que viene dado por las características genéticas y fisiológicas del hongo. Este mecanismo de desarrollo de resistencia hace que la búsqueda de fungicidas contra Botrytis sea un objetivo importante para la industria de plaguicidas, industria que ha comenzado a colocar en el mercado plaguicidas en base a extractos naturales y/o microorganismos benéficos o biocontroladores .

Actualmente existen formulaciones naturales y/o biológicas aprobadas como fungicidas basadas principalmente en distintas especies de Bacillus spp. como B. subtilis , por ejemplo distintas formulaciones de Serenade ® de Bayer y diversas formulaciones declaradas como bioestimulantes que normalmente activan los mecanismos de defensa propios de las plantas "resistencia sistémica adquirida" (SAR) o "resistencia sistémica inducida" (ISR), basados en distintas especies de Bacillus spp, Trichodermas spp. , Azotobacter sp. , Pseudomonas spp. Y similares .

Además algunas patentes o solicitudes de patentes presentan fungicidas y/o formulaciones de control biológico para Botrytis cinérea. CL 201503783 se refiere a una cepa Bacillus subtilis nb (número de acceso pendiente) con actividad particularmente útil para el control de hongos filamentosos fitopatógenos, la cual demostró tener una potente actividad antifúngica contra el agente causante de la pudrición gris, Botrytis cinérea; KR 20120072585 describe una formulación que contiene cantidad suficiente de la nueva cepa de Bacillus subtilis GN38 y su propio medio de cultivo. Esta formulación tiene un efecto preventivo contra los patógenos Botrytis cinérea, Rhizoctoniasolani , Pythium sp. , Alternaría panax y Colletotrichum gloeosporiordes, específicamente en el cultivo del ginseng; KR20110037549 describe un agente para prevenir enfermedades vegetales utilizando una mezcla de las cepas Bacillus subtilis M27 y 5M34, que tienen un efecto inhibitorio del crecimiento los siguientes patógenos: Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium cepivorum, Sclerotinia minor, Sclerotium rolfisii , Esctonia solani, Botrytis cinérea, Fusarium oxysporum, Didymella bryoniae, Alternaría solani, Corynespora cassiicola, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum acutatum y Phytophotra capsici y CN 101993836 se refiere a un fungicida que comprende la cepa YB-81 de Bacillus subtilis, un método de preparación y aplicación del mismo. El fungicida se prepara utilizando una solución de la fermentación de la cepa YB-81 y tiene efecto inhibidor sobre Botrytis cinérea, Marssonina coronaria, Rhizoctonia sp. , Gaeumannomyces graminis, Fusarium oxysporum, Phytophthora melonis, entre otros patógenos de importancia agrícola.

En cuanto a bacterias fitopatogénicas existen varios géneros que causan daños en distintos cultivos afectándolos desde caída de hojas hasta post cosecha, Pseudomonas spp. y en especial Pseudomonas syringae es un importante género de bacterias que afecta diversos cultivos hortícolas .

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invención describe un bioestimulante y bioprotector, proceso de fabricación y usos del mismo en el área agrícola . El bioestimulante y bioprotector presenta mejora en parámetros productivos y acción antimicrobiana, además posee características como potenciadora del crecimiento y polinización para diversos vegetales, asegurando una mayor calidad y estabilidad postcosecha de los mismos. La formulación del bioestimulante y bioprotector se basa en bacterias de la familia Lactobacillaceae aislados de insectos polinizadores y entorno silvestre .

Las Bifidobacterias y lactobacilos son parte importante de la microbiota de abejas y abejorros, así como comensales de humanos, insectos y animales, siendo reconocidos como microorganismos de grado alimenticio, inocuos y empleados ampliamente como cepas probióticas. Bacterias ácido lácticas (BAL), han demostrado mejora de plantas y frutos, asociadas a desarrollo y rendimiento de estos últimos y actividad biocida contra fitopatógenos que afectan la producción agrícola, como Botrytys cinérea Pseudomonas syríngae y similares . Adicionalmente son productoras de ácido láctico como principal metabolito de fermentación, el cual es considerado un compuesto antimicrobiano y asociado con funciones de atracción de insectos pecoreadores y delimitación de la zona de trabajo de éstos, haciendo más eficiente el proceso de polinización. Debido a la importancia de la polinización en ecosistemas agrícolas, el contar con microorganismos que puedan incrementar la tasa de polinización en flores es un beneficio adicional importante del bioestimulante y bioprotector desarrollado.

Adicionalmente, BAL, debido a su capacidad de síntesis enzimática y generación de elementos de micronutrientes , pueden ser empleadas como microfertilizante, aportando trazas de calcio y aminoácidos, importantes para la cuaja, viabilidad, y posterior calidad de los frutos, otorgando además vigor a la planta .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en capas bacterianas de la familia Lactobacillaceae aisladas desde tubo digestivo de abejas, con estas cepas, solas o en mezcla se preparan formulaciones bioestimulantes y bioprotectoras utilizadas en cultivos hortofruticolas desde caída de hoja hasta post cosecha en frutales y desde siembra a post cosecha en hortalizas.

Identificación de cepas aisladas desde tubo digestivo de abejas.

Se procedió a la activación de las cepas en caldo MRS, a partir de las cuales, se realizó la extracción de ADN y posterior amplificación por PCR con cebadores específicos para identificar la pertenencia al género Lactobacillus spp. y Pediococcus spp. de cada una de las cepas. La detección molecular se realizó mediante la amplificación de ADN cromosomal bacteriano, utilizando los partidores R16-1(16S) ( 5 ' -CTTGTACACACCGCCCGTCA- 3") y LbLMAl-rev (ITS) ( 5 ' -CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3 ' ) . Para la visualización de los resultados, los productos PCR fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% pre teñido con GelRed® Nucleic Acid Stain (Biotium) durante 90 min a 80 volts .

Las cepas aisladas y que mostraron resultados positivos como bioestimulantes y bioprotectores corresponden a las cepas depositadas :

DSMZ 32954 Pediococcus acidilacti AB9USS

DSMZ 32669 Lactobacillus kunkeei AB1BUSS

Como medio de cultivo para la multiplicación bacteriana se utiliza un medio a base de derivados de suero de queso desarrollado en la patente CL 51722.

Formulación Bioestimulante y Bioprotectora

Como base de la formulación que se usa en campo, desde caída de hoja a post cosecha en frutales y desde siembra a post cosecha en hortalizas, los microorganismos seleccionados se estabilizan mediante deshidratación, donde alcanzan un estado de latencia al volverse más lento su metabolismo, logrando así una mejor estabilidad en el tiempo, siendo la concentración mínima de bacterias, sola o en mezcla, de 106 a 108 UFC/mL. Para lograr este estado de latencia, se utilizan los métodos de secado por atomización y secado por liofilización, en donde los microorganismos son protegidos de las condiciones de temperatura y presión durante el proceso de secado mediante la microencapsulación por adición de sólidos protectores y/o coformulantes a razón de 25 y 15 % p/v respectivamente, según sea el método de secado.

Los coformulantes tienen un rol principal en la estabilidad del formulado. La estabilidad de los microorganismos en el tiempo hace referencia a las condiciones de almacenamiento de los mismos a fin de evitar la pérdida de viabilidad significativa en el tiempo. Para ello se deben proteger de la luz, el oxígeno, la temperatura y la humedad.

• La temperatura durante el almacenamiento es inversamente proporcional a la viabilidad de los microorganismos.

La presencia de oxigeno influye directamente en la formación de radicales libres, los cuales pueden reaccionar oxidando ácidos grasos presentes en la membrana celular.

• La deshidratación o el secado de los microorganismos disminuye la posibilidad de agua dentro de las células, de tal manera que alcanzan un estado de latencia durante el cual se vuelve más lento el metabolismo, incluso llegando a detenerse.

Durante el proceso de secado por atomización, donde el medio de cultivo es expuesto a alta temperatura (~180°C), forman una película que protege el núcleo activo en la microcápsula formada.

De igual forma durante el proceso de secado por liofilización, los coformulantes o agentes crioprotectores tienen facilidad para atravesar la membrana celular y acumularse intracelularmente, facilitan el flujo de agua a través de la membrana celular y protegen estructuras moleculares y supra-moleculares a través de diferentes formas de acción. Además, sirven para compensar la diferencia de presión osmótica que se genera cuando empieza a congelarse la superficie de la célula, evitando una pérdida excesiva de agua que podría provocar la deshidratación y destrucción de las células.

Tabla 1: Coformulantes para secado por atomización, usando como base de cálculo 1L de medio de cultivo.



Tabla 2: Coformulantes para secado por liofilización, usando como base de cálculo 1L de medio de cultivo.



Usos como Bioestimulante y Bioprotector

Las distintas formulaciones presentaron efectos positivos en aspectos agronómicos de diversos cultivos hortofruticolas durante el desarrollo de los mismos, en estados fenológicos como siembra, trasplante, caída de hojas, floración, cosecha y en el almacenaje de post cosecha.

Las formulaciones de la presente invención, basadas en una cepa o la mezcla de éstas, deben ser suspendidas en agua para su posterior aplicación. La dosis corresponde a lg de producto suspendido en 1 L de agua, lo cual asegura una concentración final >106 UFC/mL, estando el moj amiento determinado por el nivel de desarrollo de las plantas (según estado fenológico, volumen de la canopia entre otros) . La administración es por aspersión, pulverización y/o nebulización, la frecuencia es cada 10 a 14 días con aplicaciones desde la caída de hoja a cosecha en frutales y desde siembra a post cosecha en hortalizas, no existe un máximo de aplicaciones ya que es un producto biológico libre de residuos y por tanto sin Límite Máximo de Residuos (LMR) . Por ser un producto biológico considerado probiótico en humanos puede aplicarse en post-cosecha, esto es una vez cosechada la fruta y/o verdura e incluso en las cajas de embalaje.

Las aplicaciones así realizadas mostraron mejoras en el desarrollo de los cultivos, firmeza, calibre, nivel de antioxidantes y color de los frutos a cosecha y mayor durabilidad a postcosecha.

Adicionalmente se evaluó la atracción de agentes polinizantes, los cuales fueron estadísticamente más atraídos a las plantas aplicadas con las distintas formulaciones.

Además, en laboratorio y pruebas de campo los estudios de eficacia mostraron efectos preventivos sobre patógenos tradicionales en cultivos hortofruticolas como Pseudomona syríngae, agente causal del tizón bacteriano en frutales y hortalizas y sobre los hongos de los géneros Botryosphaería spp. , Botrytis spp. , Fusarium spp. , Verticillium spp, Neofusiccocum spp. y Chondrostorium spp.

EJEMPLOS

A continuación se detallan una serie de ejemplos los cuales tienen por objetivo ilustrar el uso de las formulaciones descritas sin limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación y estabilización de cepas

Para la preparación y estabilización de las cepas para formular las composiciones bioestimulantes y bioprotectoras , estás fueron deshidratadas por secado spray y/o liofilización, previa microencapsulación con sólidos protectores para mantener la viabilidad de las mismas después de los procesos descritos.

Producción de las cepas AB1BUSS yAB9USS

1) Las cepas AB1B y AB9 fueron activadas desde el cepario en que son mantenidas :

a) Se traspasan 100 mL de cada cepa, almacenada a -20°C, por cada 4 mL de medio MRS estéril, incubando a 37 °C por 24 horas, en cultivo estático.

b) Después de la incubación se realiza un nuevo traspaso de 100 mL del tubo anterior a un nuevo tubo con 4 mL de medio MRS estéril, incubando a 37°C por 12 a 24 horas, en cultivo estático.

2) Preparación del medio de cultivo para generación de biomasa a) Se empleó un medio a base de derivados de suero de queso (Patente CL 51722)

b) Inicialmente el suero de queso es hidrolizado, agregando 2 mL/L de enzima MAXILACT L-2000 e incubando por 90 min a 42°C con agitación constante.

c) A continuación se agregan y disuelven los demás componentes propios del medio.

d) El medio es esterilizado en equipo autoclave a 121.5°C por 15 minutos.

3) Preparación del inoculo madre para generación de biomasa de las cepas seleccionadas

a) Los tubos con la cepa activada, obtenidos en el punto 1, se centrifugan a 5000 rpm por 10 minutos.

b) Se elimina el sobrenadante y el pellet obtenido es resuspendido en 500 mL de suero fisiológico.

c) De esta suspensión se toman aproximadamente 75 mL y se traspasan a un tubo con 4 mL de suero fisiológico estéril. d) A continuación se mide la densidad óptica a 625 nm, ajustando según corresponda, hasta obtener una absorbancia (A) entre 0,5 - 0,6.

4) Generación de biomasa de las cepas seleccionadas

a) El medio esterilizado, descrito en punto 2 es inoculado con 350 mL de inoculo (A : 0,5-0, 6) por cada 200 mL de medio de cultivo.

b) El medio de a) es incubado a 37°C con agitación contante por 15 horas.

c) Tras 15 horas de cultivo según (b) , las cepas AB1BUSS y AB9USS alcanzan una viabilidad >106 UFC/mL.

Obtención del preparado en polvo por microencapsulación

- Mediante secado por atomización o spray

i) Transcurrido el tiempo de crecimiento (punto 4 anterior) , se agrega al medio el material encapsulante o sólidos protectores, correspondientes a 25% p/v, constituido, por ejemplo por: Proteina de suero (85%), Glutamato monosódico (5%), Sorbitol (5%), Sacarosa (5%) y Estearato (0.01%) .

ii) La mezcla de i) se alimenta al secador spray, atomizando asi la cepa de interés.

iii) Al entrar en contacto el atomizado con el flujo de aire caliente, el liquido se evapora a baja temperatura, sin alterar la bacteria en su viabilidad y propiedades probióticas .

iv) Finalmente, el producto en polvo es separado del aire en un ciclón, con un rendimiento práctico de 30 a 40% p/p de cepas microencapsuladas , cuya viabilidad se mantiene > 106 UFC/g

Mediante liofilización

i) Trascurrido el tiempo de crecimiento (punto 4 anterior), las bacterias se concentran, por ejemplo mediante centrifugación del medio.

ii) El pellet obtenido en i) es resuspendido en agua destilada estéril, obteniéndose 150 mL de resuspendido por cada litro de biomasa.

iii) Se agrega 15% p/v crioprotector, por ejemplo leche descremada .

iv) El medio concentrado con crioprotector es liofilizado, siendo el tiempo de secado de entre 48 y 72 horas.

v) El rendimiento en liofilización para ambas cepas es del 100%, manteniéndose la viabilidad >106 UFC/g.

Ejemplo 2: Producción de ácido láctico

El ácido láctico o lactato, principal producto de fermentación de cepas ácido lácticas, es una reconocida sustancia antimicrobiana. Debido al potencial de control de microorganismos indeseables, se cuantificó este metabolito mediante HPLC en 16 horas de fermentación, para las cepas descritas en la presente solicitud, parámetro utilizado además como control de calidad de las mismas.

La propagación de las bacterias lácticas AB1BUSS y AB9USS se llevó a cabo en cultivo estático a 37 °C durante 10 -12 horas, luego de ello se inoculó en el biorreactor. El inoculo se preparó en dos matraces Erlenmeyer de 250 mL conteniendo en cada uno 100 mL de medio de cultivo MRS (52,2 g/L) . El biorreactor conteniendo dos litros de medio de cultivo se inoculó asépticamente con 200 mL de inoculo y 2000 mi de medio de cultivo. Las muestras se colectaron cada 2 horas, el volumen mínimo de muestra fue de 10 mi, las muestras se filtraron a 0,2 mieras. Se realizó el análisis por HPLC (HPLC Agilent 1100 Series), con detector de UV, columna Organic Acid Column "Aminex" HPX-87H, cromatografía de exclusión iónica, con fase móvil de ácido sulfúrico 0,005M y adquisición computacional de datos. Las concentraciones de lactato se calcularon en base a curvas de calibración (estándar ácido láctico SIGMA) .

La cepa AB1BUSS exhibió una producción de 12,52 mg/ml; en la cepa AB9USS se cuantificó un máximo de 15, 02 mg/ml ambas medidas a las 16 horas de cultivo de fermentación en medio MRS (figura 1) ·

Ejemplo 3: Evaluación parámetros de producción y calidad en frutos

Los parámetros productivos, por ejemplo de rendimiento y aquellos asociados a calidad de los frutos, por ejemplo peso, firmeza y calibre, son parámetros de importancia agronómica en huertos productivos de frutas y hortalizas en general. Además en el caso de los berries, uvas y tomates entre otros, como estos frutos son cotizados como nutracéuticos por su alto contenido de antioxidantes, el mayor contenido de estas sustancias mejora la aceptación, precio y demanda en mercados internacionales.

Los frutos y hortalizas en general son productos altamente perecederos llegándose a perder entre un 20 y un 50 % de la producción debido a deterioros microbiológicos y fisiológicos, pérdida de agua, daño mecánico durante la cosecha, envasado y transporte, o a las inadecuadas condiciones de traslado.

Por los factores señalados el uso de bioestimulantes y bioprotectores para mejorar los parámetros de calidad, producción y sanitarios de frutas y hortalizas, se hace relevante en cualquier huerto productivo.

Las formulaciones de bioestimulantes y bioprotectores de la presente invención mejoran significativamente los parámetros mencionados. A modo de ejemplo:

• Evaluación en polinización

La polinización de flores es directamente proporcional al rendimiento (por ejemplo en Ton/ha) de frutos. Si no se utilizan medios mecánicos y/o manuales de polinización cobra gran importancia la atracción de insectos pecoreadores y delimitación de la zona de trabajo de éstos en el huerto productivo.

Para determinar el efecto de las formulaciones de la presente invención sobre insectos pecoreadores se aplicaron sobre plantas de arándanos, hasta tres veces durante la floración, los siguientes Tratamientos:

Tratamiento 1: Formulación conteniendo AB9USS >106 UFC/ml

Tratamiento 2: Formulación conteniendo AB1BUSS >106 UFC/ml

Tratamiento 3: Agua

Tratamiento 4: Formulación conteniendo (AB1BUSS más AB9USS >106 UFC/ml)

Tratamiento 5: Químico comercial.

Las formulaciones de bioestimulantes y bioprotectores de la presente invención demostraron, a partir de una aplicación en floración un aumento de visitas de abejas y abejorros al cultivo, siendo este aumento significativo tanto para las formulaciones que contenían cada cepa como para la mezcla de estas, respecto al tratamiento testigo, aplicado sólo con agua, (figuras 2, 3 y 4)

• Evaluación de parámetros productivos en cosecha.

Se cosecharon muestras de frutos, según parámetros de color utilizados por los productores, los cuales hablan sido aplicados al menos dos veces en precosecha con los siguientes tratamientos :

T1 control agua

T2 Formulación cepa AB9USS en una concentración de 105 -106

UFC/ml .

T3 Formulación cepa AB1BUSS en una concentración de 105 -106

UFC/ml .

T4 Formulación cepa AB9USS más AB1BUSS en una concentración de 105 -106 UFC/ml

T5 Formulación antifúngica orgánica basada en quitina (0.45% v/v) .

Las evaluaciones de los frutos se realizaron siguiendo las directrices de Protocolos de Exportación: para el calibre se empleó un caliper Vernier manual; en el caso de la firmeza se empleó un penetrómetro manual y los sólidos solubles totales se determinaron con un refractómetro, durante la etapa de cosecha.

La medición de calibre y firmeza, demostró que todas las formulaciones basadas en cepas lácticas (cepas AB1BUSS y AB9USS) solas y en mezclas alcanzaron significativamente mayor calibre y firmeza que los frutos tratados con suspensión control, e incluso un calibre y firmeza significativamente mayor a los frutos tratados con fungicida orgánico basado en quitosano ( figura 5 ) .

• Evaluación de contenido de antioxidantes

Se analizaron muestras de frutos frescos de arándanos, los cuales en periodo de precosecha fueron aplicados al menos dos veces con los siguientes tratamientos:

T1 control agua

T2 Formulación cepa AB1BUSS en una concentración de 105 -106

UFC/ml .

T3 Formulación cepa AB9USS en una concentración de 105 -106

UFC/ml .

T4 Formulación antifúngica orgánica basada en quitina (0.45% v/v) .

Mediante pruebas colorimétricas se analizó el contenido de antioxidantes en frutos. Los resultados indican que los frutos tratados con la formulación con la cepa AB9USS presentan mayor producción de polifenoles totales en relación a los cultivos de arándano control tratados solo con agua (figura 6) .

La mayor producción de polifenoles totales en frutos tratados con la formulación basada en la cepa AB9USS, se relaciona con mayores aportes de antioxidantes en la dieta de los potenciales consumidores de estos frutos.

A continuación se presentan diversos ejemplos de la capacidad bioprotectora de las formulaciones de la presente invención, principalmente para hongos y bacterias fitopatógenos , los cuales normalmente afectan las producciones de frutas y hortalizas en diversos estados fenológicos como siembra, trasplante, calda de hojas, cosecha e incluso post cosecha.

EJEMPLO 4 : Estudios de Eficacia in vitro e in vivo contra hongos Y bacterias fitopatógenos

• Estudios in vitro

Se evaluó la capacidad antagonista de las cepas AB9USS (DSM32954) y AB1BUSS (DSM32669) sobre Pseudomona syringae pv. syríngae (Pss), agente causal del tizón bacteriano en diversos frutales y hortalizas y sobre los hongos de los géneros Botryosphaeria , Botrytis, Neofusicoccum, Chondrostorim. y Verticillium, asociados a pudrición de madera, brotes, flores y frutos en diversas especies vegetales.

Pseudomona syringae pv. syringae

Las cepas lácticas de la presente invención y el fitopatógeno Pseudomona syringae pv. syringae fueron incubadas durante 24 horas en caldo MRS y caldo KB, respectivamente. Un volumen de 400 mL del fitopatógeno P. syringae fueron sembrados por diseminación sobre placas Petri de 9 cm conteniendo medio APD, una vez seca la placa se sembraron alícuotas de las bacterias lácticas ( 106 UFC/mL) , 1 control negativo (agua) y 1 control positivo (ciclohexamida) en volumen de 10 mL . El tratamiento se repitió 3 veces. Después de 48 horas se evaluó la presencia de halos de inhibición alrededor de la colonia bacteriana colocada sobre el césped o tapiz de la bacteria fitopatógena .

Las cepas lácticas AB9USS y AB1BUSS presentaron marcada actividad antibiótica sobre P. syringae, ya que generaron halos de inhibición sobre el césped o tapiz bacteriano del fitopatógeno bacteriano. Los controles positivos y negativos corroboraron el correcto desarrollo del estudio, (figura 7)

Botrytis spp.

Para la observación de efectos de las cepas ácido lácticas de la presente invención sobre fitopatógenos fúngicos, se emplearon medios de cultivo PDA y aislados de Botrytis cinérea. Discos de 8 mm de medio PDA con micelio en crecimiento activo del hongo fueron puestos en el centro de la placa y las bacterias fueron dispuestas al costado de la placa, además se sembró un control positivo y un control negativo. Los tratamientos fueron sembrados equidistantes a una distancia de 3 cm del hongo. Se evaluó después de 5 dias la actividad de inhibición de las bacterias sobre el crecimiento micelial de los hongos, lo cual se evidenció por ausencia de crecimiento fúngico (halos de inhibición) (figura 8) .

Neofusiccocum spp.

Para realizar los ensayos las bacterias lácticas de la presente solicitud fueron incubadas durante 48 horas en caldo MRS . En el caso de los hongos, estos fueron crecidos en medio APD y utilizados durante su fase de crecimiento activo. La evaluación de antibiosis de las cepas lácticas sobre Neofusiccocum fue realizada sobre medio de cultivo APD-MRS . Discos de micelio en crecimiento activo del hongo fueron puestos en el centro de la placa y las bacterias lácticas fueron dispuestas al costado de esta a una distancia de 3 cm del hongo, además se colocó un control positivo que posee la capacidad de producir compuestos antimicrobiales con actividad sobre hongos, más un control negativo (Figura 9) . La evaluación de inhibición se realizó a los 5 dias de co-cultivo.

• Estudios ín vivo

Existen diversos hongos fitopatógenos , polífagos que afectan distintos tejidos de las plantas, por ejemplo Botrytis spp. afectando flores y frutos, Chondrostereum purpureum y Botryosphaerea spp. afectando la madera, Fusarium spp. y Verticillium spp. géneros que afecta raíces y tejidos vasculares. Las cepas de la presente invención fueron probadas contra algunos de estos géneros en estudios de eficacia en campo. Este tipo de ensayos tiene especial importancia cuando el producto plaguicida no solo tiene una acción directa sobre el patógeno sino que además activa los mecanismos de defensa propios de las plantas.

Chondrostereum purpureum

El ensayo se llevó a cabo en un huerto de arándanos (variedad Rabbiteye) , sin manejo agronómico, en el cual existe presencia del hongo Chondrostereum purpureum.

Se aplicaron las cepas AB1BUSS y AB9USS en concentración 109 UFC/g, de forma directa sobre las zonas lesionadas, con presencia de cancro y zonas subyacentes, se marcaron ramillas tratadas y controles. El efecto de las formulaciones sobre las lesiones se determinó mediante registro fotográfico y registro del tamaño de las zonas lesionadas. Se efectuó registro inicial y final de las lesiones marcadas en cada planta empleando un pie de metro.

Se compararon los registros de las lesiones obtenidas en el inicio del experimento y luego de transcurridas 12 semanas, encontrándose diferencias significativas en el tamaño de las lesiones al aplicar la formulación basada en la bacteria AB1BUSS en relación a todos los otros tratamientos. Esta formulación demostró disminuir significativemente las lesiones ocasionadas por el agente fúngico (figura 10) .

Los resultados de este ensayo demuestran un efecto curativo de lesiones causadas por el fitopatógeno de madera Chondrostereum purpureum en plantas de arándanos de la variedad Rabbiteye, al ser tratadas con una suspensión de la formulación basada en la cepa AB1BUSS .

Botrytis spp.

Se realizaron muéstreos de flores de arándanos aplicadas en dos ocasiones con los siguientes tratamientos:

T1: Agua

T2 : Formulación con Cepa AB9USS; 108 UFC/ml

T3 : Formulación con Cepa AB1BUSS; 108 UFC/ml

T4 : Formulación con mezcla de cepas AB9USS+AB1BUSS ; 108 UFC/ml

Las flores se evaluaron en cámara húmeda con el objetivo de estimular el crecimiento de los hongos presentes en la flor. Las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 10 días para luego ser evaluadas. Se evaluó la incidencia de hongos sobre las estructuras de la flor. El hongo más recurrente fue Botrytis cinérea, seguido de Alternaría spp. y Cladosporium spp. , estos últimos con incidencia muy baja y alta variabilidad por lo cual no pudieron ser analizados.

En las flores con al menos dos aplicaciones, el porcentaje de flores con B. cinérea presentó diferencias entre los tratamientos (Figura 11) . Los tratamientos basados en cepas de bacterias lácticas AB9USS (T4), AB1BUSS (T2) y mezclas de ellas (T3) fueron similares entre sí, y mostraron menos incidencia que el tratamiento control (T1), que correspondió al control absoluto .

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS FIGURAS

Figura 1: Cinética de ácido láctico producido por la cepas lácticas AB9USS (gráfico superior) y cepa AB1BUSS (gráfico inferior), durante 16 horas de fermentación en medio MRS .

Figura 2: Visitas de abejas, post una aplicación T1: Formulación conteniendo AB9USS >106 UFC/ml; T2 : Formulación conteniendo AB1BUSS >106 UFC/ml; T3: Agua; T4 : Formulación conteniendo (AB1BUSS más AB9USS >106 UFC/ml); T: Químico comercial ( fungicida) .

Figura 3: Visitas de abejorros, post una aplicación T1: Formulación conteniendo AB9USS >106 UFC/ml; T2 : Formulación conteniendo AB1BUSS >106 UFC/ml; T3: Agua; T4: Formulación conteniendo (AB1BUSS más AB9USS >106 UFC/ml); T: Químico comercial (fungicida) .

Figura 4: Visitas de abejas, post dos aplicaciones T1: Formulación conteniendo AB9USS >106 UFC/ml; T2 : Formulación conteniendo AB1BUSS >106 UFC/ml; T3: Agua; T4: Formulación conteniendo (AB1BUSS más AB9USS >106 UFC/ml); T: Químico comercial (fungicida) .

Figura 5: Evaluación de parámetros de calibre y firmeza después de aplicaciones Tlcontrol agua; T2 Formulación cepa AB1BUSS en una concentración de 105 -106 UFC/ml; T3 Formulación cepa AB9USS en una concentración de 105 -106 UFC/ml.; T4 Formulación antifúngica orgánica basada en quitina (0.45% v/v) .

Figura 6: Evaluación de polifenoles totales T1 control agua; T2 Formulación cepa AB9USS en una concentración de 105 -106 UFC/ml.; T3 Formulación cepa AB1BUSS en una concentración de 105 -106 UFC/ml.; T4 Formulación antifúngica

Figura 7 : Interacción en placa del fitopatógeno Pseudomona syríngae en medio APD contra bacterias ácido lácticas preseleccionadas .

Figura 8: Interacción en placa del hongo Botrytys cinérea, en medio APD. Derecha control crecimiento hongo

Figura 9: Interacción en medio APD-MRS de hongo de la madera (Neofusiccocum) con cepas lácticas AB9USS y AB1BUSS. A: control hongo; B: Interacción.

Figura 10: Disminución de lesiones causadas Chondrostereum purpureum por en plantas tratadas con los 5 tratamientos experimentales. Cepa AB5B no incluida en esta invención.

Figura 11: Incidencia de Botrytis cinérea en flores de arándano