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1. WO2020116989 - ANTI-CANCER COMPOSITION COMPRISING IN VIVO CELL INJECTION CHIP

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명세서

발명의 명칭

기술분야

1  

배경기술

2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

13   14  

과제 해결 수단

15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25  

발명의 효과

26  

도면의 간단한 설명

27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37  

발명의 실시를 위한 형태

38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96   97   98  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13  

도면

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11  

명세서

발명의 명칭 : 생체내 세포 투입칩을 포함하는 항암용 조성물

기술분야

[1]
본 발명은 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학조성물 또는 상기 항암용 약학 조성물을 유효한 양으로 개체에 투여되는 단계를 포함하는 고형암 및 혈액암을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.

배경기술

[2]
현재 기존의 항암치료는 주로 외과적 수술, 항암제 투여, 방사선 조사가 있다. 그러나 세포독성 등 심각한 부작용과 암의 전이·재발 등으로 인해 새로운 치료법 개발의 필요성이 증가하고 있다. 수술, 항암제 투여 및 방사선 조사는 체력의 약화와 면역력 저하를 초래한다. 또한 치료 후 몸속에 남아있는 암세포는 암의 재발 및 전이를 유발할 가능성이 있으며, 암으로 사망하는 환자들의 대부분의 사망 원인은 암의 재발이다. 따라서 최근 개발되는 암 치료제는 적은 부작용 선택적으로 암세포만을 파괴하는데 주목하고 있다. 현재 주목 받고 있는 항암치료법의 연구 방향은 우선 암을 기존 치료방법으로 최소화시킨 후, 잔존 암세포를 세포면역치료에 의해 완전히 제거하는 방향으로 진행되고 있다. 또한, 최근 잔존 암세포를 목표로 하는 세포면역치료인 암세포를 선택적으로 파괴하는 NK 세포, 세포독성 T세포, 수지상 세포가 주목받고 있다.
[3]
한편, NK 세포는 면역세포의 일종으로 암세포에 대해 선택적인 세포독성을 보이는 세포이다. NK 세포는 다른 면역세포와 달리 암세포를 즉각적으로 감지하여 바로 제거할 수 있는데, NK 세포 표면에 있는 다양한 면역 수용체를 통해 암세포와 정상세포를 구분할 수 있다. 암환자의 체내의 NK 세포는 그 수가 정상인에 비해 떨어지고 항암활성에도 결함이 있다. 그뿐 아니라, NK 세포의 기능 이상은 암의 발생과 밀접한 관련을 가지고 있다. 또한 NK 세포는 인터페론 감마(IFN-γ)나 티엔에프알파(TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine) 생성해 염증 및 면역반응을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. NK 세포는 수지상 세포, 대식세포, T세포와의 직접적 상호작용 및 사이토카인을 통한 간접적인 상호작용을 통해 면역반응을 조절하는데 핵심적인 역할을 한다. 염증질환, 자가 면역 질환 및 각종 난치성 질환의 발병에도 NK 세포가 중요한 역할을 하고 있음이 밝혀졌다(Front Immunol. 2017; 8:745).
[4]
한편, 암 줄기세포는 항암제와 방사선 치료에 강한 저항성이 있으며 암이 완치된 뒤에도 항암제의 공격에 살아남은 암 줄기세포가 잠복상태에 있다가 다시 활발히 증식, 분화하여 다른 부위로의 암이 전이·재발을 유발한다. 따라서 암 줄기세포를 제거한다면 암의 재발을 막고 효과적으로 치료할 수 있는 가능성이 크다. 이때, NK 세포는 암세포의 발생, 증식, 전이를 억제할 뿐만 아니라 암의 재발에 가장 중요한 암 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있다. 최근 연구결과에 따르면, 정상인으로부터 분리한 NK 세포를 환자에게 주입했을 때도 다른 면역세포들과 달리면역거부 반응이 극히 적어 면역세포치료제 개발에 안전성을 높일 수 있다.
[5]
NK 세포 이식은 이식된 NK 세포가 암 환자의 체내에 오랫동안 지속되지 않아서 이를 극복하기 위해 이식 후에 NK세포 증식을 유도할 수 있는 사이토카인 IL-2를 주기적으로 넣어주는 방법이 시도되었다. 그러나 IL-2는 NK 세포 외에도 항암면역 반응을 억제하는 조절 T세포(Treg)를 증가시키기 때문에 문제가 되고 있다.
[6]
녹십자랩 셀은 동종 NK (allogeneic NK) 세포를 활용해 대량 생산이 가능한 항암면역세포 치료제 개발 전망에 대해 발표하였다. NK 세포를 활용한 항암제는 기존 면역항암제의 안전성·경제적 문제 문제를 해결할 수 있을 것이라고 발표하였다. NK 세포치료제는 타인에게 이식할 경우에도 이식편대숙주병(GVHD)가 없고, 이미 조혈모이식 등을 통해 항암기능과 안전성이 입증되었고 2016년 기준 전세계적으로 89건의 임상이 진행중이다. 국내에서도 11건의 임상이 진행중이고 NK 세포를 이용한 항암치료제의 효과는 실제 임상에서 긍정적인 결과를 보이고 있다. 건강한 비혈연 공여자의 NK 세포를 확장 배양해 투여한 임상 1상(MG4101)에 따르면 NK 세포 항암면역세포 치료제는 최대용량에도 안전하고, 전 처치 없이도 환자 47.1%에서 안정병변, 52.9%에서 진행성 병변을 보였다. 배양한 동종 NK 세포는 유용하고 안전한 종양 치료법이 될 수 있지만, NK 세포의 취급이 매우 까다로워 순수배양이 용이하지 않아이 문제는 반드시 해결되어야 할 것이다.
[7]
엔케이맥스(NKMAX)는 환자 자신의 세포를 이용하는 자가 NK세포 치료제로 올해 식약처에 임상 1/2상 승인신청서를 제출할 계획이다. 또한, 안정성과 유효성을 입증해 2022년에 의약품 허가를 받는 것을 목표로 하고 있으며, 이미 일본에서는 3월부터 생산을 시작해 환자에 투약하였고 미국, 멕시코에서도 임상을 준비중에 있다.
[8]
그뿐 아니라, 이뮤니스바이오는 NK 세포 면역치료에 대해 일본 심사위원회의 승인을 얻고 일본 시장에 진출하였다. 일본의 니즈하시클리닉과 협력해서 NK 세포면역치료를 진행하여 올해 간암과 뇌종양을 대상으로 임상 1상을 시작할 계획이다.
[9]
현재 임상에 시도되고 있는 치료용 면역세포인 수지상세포, NK 세포, T 세포는 주입된 많은 양이 주입 부위에 머물거나 생체 내 순환과정에서 기능을 다하지 못하고 소멸되는 단점이 있다는 점이 보고되었다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 실제 임상분야에서는 많은 수(109)의 치료용 면역세포를 생체 내 주입함으로써, 암치료효능을 높이기 위한 시도가 진행되고 있다. 그러나 많은 수의 세포를 체외에서 배양하는 데 많은 시간과 비용이 소요되며, 치료비용도 매우 높다는 문제점이 남아있다.
[10]
또한 체외에서 배양된 많은 수의 세포는 지정된 기간 내에 환자에 사용되어야 하며, 그렇지 못한 경우에는 고가의 비용으로 제조된 많은 수의 치료용 세포가폐기처분 되어야 하는 치명적 단점을 갖고 있다(Nat Rev Immunol. 2018; 18(11):671-688). 따라서 많은 수의 살아있는 NK 세포를 확보하고 항암활성을 보유하고 있는 NK 세포를 얻기 위해서는 기존의 세포 배양방식이 아닌 다공성 스캐폴드를 이용한 새로운 3차원 배양방식의 NK 세포의 배양이 필요한 실정이다.
[11]
바이오 및 의료분야에 사용되는 다공성 스캐폴드는 그 용도와 목적에 따라서, 분해도나 스웰링비 (Swelling ration)가 자유롭게 조절되어야 하지만, 위에서 언급된 기법에 의해 제조된 다공성 스캐폴드는 모두 획일적인 분해도를 가지고 있거나, 스웰링비가 매우 낮다는 단점이 있다. 특히, 분해도를 조절하기 위해 저분자량 (low molecular weight)의 구성물질을 사용하거나 가교밀도 (crosslinking density)를 낮게 할 경우, 기계적 물성이 낮아지는 단점이 있다는 점이 알려져 있다.
[12]
한편, 세포치료제나 암백신은 주로 혈액암 관련 질병에 주로 사용되고 있고, 고형암에서는 대부분 그 치료효능이 매우 낮다는 단점을 갖고 있다. 이러한 이유 중의 하나는 고형암 주위에서 면역기능을 억제하는 미세환경 요인이 있다. 실제로 종양미세환경에서 면역세포의 기능을 저하시키는 세포(MDSC: myeoloid-derived stromal cells, Treg: regulatory T cell, TAM: tumor-assocaited macrophages)나 면역억제유발 사이토카인, 대사체 등이 활발하게 작용함으로써, 면역활성화 물질과 치료용 면역세포의 활성을 급격하게 저하시킨다고 알려져 있다(Nat Rev Immunol. 2016; 16(2):112-123).

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[13]
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함 하는 항암용 약학조성물, 항암치료방법 및 이의 상기 스캐폴드 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[14]
또한 본 발명은 3차원 생분해성 스캐폴드를 이용하여 세포를 배양하고 이를 직접 생체내에 투입하여 암 치료에 사용할 수 있는 조성물 및 스캐폴드를 제공하는데 목적이 있다.

과제 해결 수단

[15]
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학조성물을 제공한다.
[16]
또한 본 발명은 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드 의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학조성물을 유효한 양으로 개체에 투여되는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 보다 바람직하게 상기 암 치료방법은 고형암 및 혈액암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
[17]
일 구현예에 따르면, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트 (Hyaluronic acid-methacrylate, HA-MA) 유도체이고, 상기 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트 유도체(oxHA-MA) 또는 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (HA-ald-MA) 이다.
[18]
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트이고, 제2성분은 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (HA-ald-MA)이다.
[19]
다른 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트이고, 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA)이다.
[20]
상기 세포는 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 분화된 줄기 세포, T세포, 자연살해(NK)세포, 및 B세포로 이루어진 군에서 하나 이상 포함될 수 있다.
[21]
다른 특정예에서, 상기 세포는 자연살해(NK)세포이며, 하나의 특정예에서 상기 자연살해(NK)세포는 키메릭항원수용체-자연살해(CAR-NK)세포이다. 상기 키메릭항원수용체-자연살해(CAR-NK)세포는 암 특이적 항 EGFR 애피바디 (tumor-specific zEGFR affibodies) 의 엑토도메인(ecto-domain), 힌지(hinge), 막통과 (transmembrane), CD28, DAP10 및 CD3ζ을 포함한다.
[22]
또한 본 발명은 상기 생체내 세포 투입용 조성물을 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
[23]
또한 본 발명은 상기 생체내 세포 투입용 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
[24]
상기 암은 고형암 또는 혈액암인 것이며, 상기 고형암은 폐암, 뇌암, 간암, 유방암, 난소 암 또는 대장암인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 혈액암은 백혈병, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈 또는 악성림프종인 것을 특징으로 한다.
[25]
또한 본 발명은 히알루론산 메타아크릴레이트 및 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트가 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드를 포함하는 세포배양용 조성물을 제공한다.

발명의 효과

[26]
일 양상에 따른 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드 의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학조성물은 상기 스캐폴드가 종래의 2차원 배양과 비교하여, 세포의 성장률, 생존율, 암세포 살상능, 암전이 감소 효과를 나타내어, 암 치료방법 또는 암 치료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

[27]
도 1은 본 발명의 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold)로, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트 유도체이고, 상기 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트 유도체(oxHA-MA)인, 3D engineered hyaluronic acid based niche for cell expansion, 3D ENHANCE 스캐폴드의 제작 과정 및 세포 배양 방법을 나타낸 것이다.
[28]
도 2a는 Hyaluronic acid를 이용하여 제조된 3D ENHANCE 스캐폴드의 전자현미경 사진과 형태의 이미지 사진을 나타낸 것이다. 도 2b는 3D ENHANCE 스캐폴드에 로딩된 (로딩 후 4일) NK92 세포주의 스페로이드 (spheroid) 형성 결과를 나타낸 것이다.
[29]
도 3은 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드의 기공구조에 대한 확인을 기존의 conventional gel과 비교한 결과를 나타낸 것이다. 상기 3D ENHANCE 스캐폴드는 bio-degradable cryogel로, 상기 conventional gel과 동일하게 Hyaluronic acid를 기본으로 제작되었다.
[30]
도 4는 상기 도 3b의 bio-degradable cryogel의 3D ENHANCE 스캐폴드와 conventional gel의 특성을 나타낸 것이다.
[31]
도 5a는 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드의 분해 과정을 나타낸 것이다. 또한 도5b는 상기 3D ENHANCE 스캐폴드의 구성 성분에서, hyaluronic acid와 oxidized hyaluronic acid의 비율과 상기 비율을 조절을 통한 스캐폴드 분해 정도 조절 결과를 나타낸 것이다. 또한 도 5c는 본 발명의 제1성분이 히알루론산 메타아크릴레이트 (HA-MA)이고, 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트 (oxHA-MA)인 3D EVHANCE 스캐폴드의 다양한 비율에 따른 생체 분행 특성과 쥐에 상기 스캐폴드를 삽입후 무게를 측정함으로써 독성에 영향을 미치지 않는 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[32]
도 6은 현재 3D culture system으로 많이 사용하고 있는 hyaluronic acid based-conventional gel과 2D culture와 비교 결과를 나타낸 것이다. 도6a는 48-well plate culture (2D culture) 에 비해 conventional gel에 대한 세포성장을 배양 후 5일 후 회수된 세포 수를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도6b는 FACS를 이용하여, 상기 48-well plate culture (2D culture) 에 비해 conventional gel에 대한 세포생존율과 죽은 세포를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[33]
도 7은 본 발명의 bio-degradable cryogel의 3D ENHANCE 스캐폴드와 2D cell culture (24 well plate culture 또는 48 well plate culture)에 대한 비교 결과를 나타낸 것이다. 도 7a는 세포성장을 배양 후 5일 후 회수된 세포 수를 측정하여 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 7b는 FACS를 이용하여, 상기 3D ENHANCE 스캐폴드와 2D cell culture (24 well plate culture 또는 48 well plate culture)에 대한 비교 결과를 나타낸 것이다. 도 7c와 도 7d는 SK-SC1 스캐폴드 내에서의 자연살해세포, NK 세포의 세포 사멸 또는 세포 생존율에 대한 결과를 나타낸 것이다.
[34]
도 8은 HA-MA와 oxHA-MA비율이 서로 다른 3D-ENHANCE 스캐폴드에 자열살해세포 (Natural killer cell, NK cell)를 로딩 후 2D cell culture와 비교하여, 상기 자연살해세포의 proliferation 과 activity를 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 8a는 형광현미경관찰을 통한 fluorescence image로 live cell을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 도 8b는 2D culture와 3D ENHANCE 스캐폴드의 NK cell proliferation, 도 8c는 세포생존율, cell viability를, 도8d는 NK cell migration activity에 대한 2D culture와 3D ENHANCE 스캐폴드 비교, 도8e는 K562 myelogeniys leukemia cell과, Raji Burkitt’s lymphoma cell에 대한 tumor lytic activity에 대한 효과를 2D culture와 3D ENHANCE 스캐폴드 비교하여 나타낸 것이다. 또한 도 8f는 본 발명의 SK-SC1 스캐폴드에서의 NK 세포 활성도 중 NK cell proliferation 증가 효과, 도 8g는 Nk cell migration 증가 효과, 도 8h는 상기 K562 myelogeniys leukemia cell과, Raji Burkitt’s lymphoma cell에 대한 tumor lytic activity 또는 cell cytotoxicity 증가 효과를 2D cell culture와 비교하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 8i는 SK-SC1 스캐폴드에 대한 상기 NK 세포 cell proliferation, cytokine/chemokine, NK-medicated cell cytotoxicity 관련 유전자 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 또한 도 8j는 상기 3D ENHANCE 스캐폴드에 대한 2D culture (2D)와 비교하여 NK cell proliferation, cytokine receptor interaction, NK cell mediated cytotoxicity 관련 유전자 발현 증가 효과 결과를 나타낸 것이다.
[35]
도 9는 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold)로, 도 9a는 Collagen/Hyaluronic acid, Hyaluronic acid derivative를 저온에서 가교공정(cryogel)을 통하여, pore의 크기가 150-300 μm 인 스캐폴드, Collagen/Hyaluronic acid를 포함하는 스캐폴드(콜라겐 매트릭스 스캐폴드)를 나타낸 것이다. 도 9b는 상기 Collagen/Hyaluronic acid, Hyaluronic acid derivative를 저온에서 가교공정(cryogel)을 통해 제작된 스캐폴드에 대한 세포 생존율을 2D와 비교하여 나타낸 것이고, 도 9c는 상기 Collagen/Hyaluronic acid를 포함하고, 자연살해세포를 포함하는 히알루론산 스캐폴드에 대한 암세포 살사능의 효과를 2D와 비교하여, 형광현미경으로 관찰 후 형광 image 기록과 암세포 살상능을 그래프로 나타낸 것이다. 도 9d와 도 9f는 상기 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 배양된 NK-92에서 1,162개 유전자의 발현 확인을 나타낸 것이며, 또한 도 9g와 도 9h는 상기 콜라겐 매트릭스 스캐폴드 배양된 NK-92에서의 LTA (Lymphotoxin-alpha), HSPE1 (Heat shock protein), HSPA5 (Glucose-regulated protein), CST7 (Cystatin-F, immune regulator), HYOU1 (Hypoxia up-regulated protein 1) 등 암세포 살사능과 관련된 유전자 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
[36]
도 10은 이차원적 세포 배양 (2D culture) 와 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드를 이용한 적응입양세포 (adoptive cell transfer (ACT)) 세포 치료효과를 비교하여 나타난 것이다. 상기 세포치료효과는 혈액암 세포를 마우스에 주입 후 상기 이차원적 세포 배양 (2D culture) 와 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드에서 배양한 NK 세포를 주입하여 혈액암 세포 제거정도를 확인하였다. 도 10A는 소동물용 인비보 이미징 장비를 이용하여, 생체 내 형광 신호를 실시간으로 고속으로 촬영하여, 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 survival rate로 결과를 나타낸 것이고, 도 10c는 Body weight로 비교하여 결과를 나타낸 것이다.
[37]
도 11은 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드에 EGFR affibody를 포함하는 NK-CAR (자연살해세포-키메릭항원수용체)와 NK 92 세포를 로딩한 후 MDA-MB-231 유방암세포주를 주입한 마우스에 통해 암전이 감소 효과를 확인한 것을 나타낸 것이다. 도 11a는 상기 EGFR 애피바디 (affibody)를 포함하는 NK-CAR (자연살해세포-키메릭항원수용체, zEGFR-CAR) 정보를 나타낸 것이고, 도 11b는 상기 유방암세포주인 MDA-MB-231 EGFR 발현을 FACS로 확인한 것이며, 도 11c는 NK-92와 zEGFR-CAR의 암세포 lyctic activity를 나타낸 것이고, 도 11d는 상기 마우스에 통해 암전이 감소 효과를 확인 실험에 대한 개요를 나타낸 것이며, 도 11e는 FACS를 통해, MDA-MB-231 유방암세포주에 대한 종양마커인 CK18 (cytokeratins 18) 발현을 측정 및 그래프로 나타낸 것이고, 도 11f는 상기 도 11d에서의 MDA-MB-231 유방암세포주를 주입한 마우스에 NK 92와 EGFR affibody를 포함하는 NK-CAR (자연살해세포-키메릭항원수용체, 키메릭항원수용체-자연살해(CAR-NK))를 주입 한 후 유방암 조직에 대해 종양마커 CK18 발현을 비교하여 그래프로 나타낸 것이며, 도 11g는 면역조직화학염색법(Immunohistochemistry staining)을 사용하여 조직변화, 암세포 전이 감소를 확인한 것을 나타낸 것이다. 도 11h는 NK세포가 포함된 SK-SC1 스캐폴드의 암조직에 대한 lytic activity를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 실시를 위한 형태

[38]
본 발명은 서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold) : 및 상기 스캐폴드 의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함 하는 항암용 약학조성물을 제공한다.
[39]
상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트 (Hyaluronic acid-methacrylate: HA-MA)이고, 제2성분은 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (Hyaluronic acid-aldehyde methacrylate HA-ald-MA) 또는 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA) 이다.
[40]
또한, 본 발명은 상기 히알루론산 메타아크릴레이트(HA-MA) 1 내지 2 : 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA)가 0 내지 2의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
[41]
상기 히알루론산 메타아크릴레이트 (HA-MA)는 하기 화학식1로 정의될 수 있고, 상기 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (HA-ald-MA)는 하기 화학식2로 정의될 수 있으며, 상기 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA) 는 하기 화학식3으로 정의될 수 있다.
[42]
[화학식1]


[43]
[화학식2]


[44]
[화학식3]


[45]
[46]
본 발명 에서 용어 “크라이오젤”이란, 0℃ 이하(subzero temperature)에서 제조된 다공성 하이드로젤을 의미하는 것으로서, 서로 연결된 기공 구조(interconnected pore structure)를 가지며, 상기 기공의 직경은 2단계의 쿨링(cooling) 기법에 의 해 20 내지 900 ㎛로 조절될 수 있으나, 200 ㎛가 바람직하다.
[47]
본 발명에서 용어 “가교”는 하나의 중 합체쇄가 다른 중합체쇄에 공유결합으로 연결된 것을 의미한다.
[48]
본 발명에서 용어, “스캐폴드 (Scaffold)”는 생체 내에서 손상된 장기나 조직의 일부를 대체하여 이들의 기능을 보안 또는 대신하는 물질을 의미하며, 이에 더하여 1 또는 2 이상의 약물을 수용하여 원하는 부위로 전달할 수 있는 물질 일 수 있고, 그 기능과 역할을 충분히 수행할 때 까지 생체 내에서 유지된 후 완전히 분해되어 없어질 수 있는 생분해성 소재일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 관련하 여, 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 의미하기도 한다. 이와 관련하여, 치료를 위한 이종이식제 (xenograft) 또는 자가이식제 (Allograft)도 포함된다.
[49]
선택적으로 본 발명의 스캐폴드는 세포 운반에 사용되거나, 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 적절한 성장인자의 추가에 의해 분화 또는 다른 생리학적 과정들이 진행되도록 자극될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인, 성장인자, 호르몬 또는 그의 혼합물을 포함하는 배양배지가 세포를 미분화 상태로 유지하기 위하여 또는 세포를 특정 경로로 분화시키기 위하여 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 스캐폴드는 생물반응기 내에 세포의 정착을 위한 생물학적 환경을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또한 생리학적 및 병리학적 과정, 종양형성 분화 및 혈관 형성을 연구하기 위해서도 사용될 수 있다. 또한 상기 세포 운반은 치료적 사용을 위한 세 포 운반으로 사용될 수 있다.
[50]
본 발명에서 용어 “약물”은, 질환 또는 기능이상을 치료하거나 달리 개체의 건강에 영향을 끼치기 위해 피험자에게 투여되는 소분자, 화학 물질, 핵산, 핵산 유도체, 펩타이드, 펩타이드 유도체, 천연 발생 단백질, 비-천연 발생 단백질, 당단백질 및 스테로이드를 지칭할 수 있다. 약물의 비제한적 예는 폴리펩타이드, 예를 들어, 효소, 호르몬, 사이토킨 , 항체 또는 항체 단편, 항체 유도체, 대사 기능에 영향을 끼치는 약물, 유기 화합물, 예를 들어, 진통제, 해열제, 소염제, 항생제, 심혈관 약물, 신장 기능에 영향을 끼치는 약물, 전해질 대사물, 중추 신경계에 작용 하는 약물, 화학요법 화합물, 수용체 작용제 및 수용체 길항제를 포함한다. 또한 상기 약물은, 예를 들어, 세포외 분자, 예를 들어, 혈청 알부민, 면역글로불린, 아 포지단백질 또는 트랜스페린과 같은 혈장 단백질 또는 적혈구 또는 림프구의 표면 에서 발견되는 단백질을 포함하고 이로 제한되지 않는 혈청 인자들을 포함한다. 따라서, 예시적인 약물은 소분자, 화학물질, 핵산, 핵산 유도체, 펩타이드, 펩타이드 유도체, 천연 발생 단백질, 비-천연 발생 단백질, 펩타이드-핵산 (PNA), 스테이플 식 펩타이드, 포스포로디아미데이트 모폴리노, 안티센스 약물, RNA-기반 사일런싱 약물, 압타머, 당단백질, 효소, 호르몬, 사이토킨, 인터페론, 성장 인자, 혈액 응고 인자, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 독소-접합된 항체, 대사 효능제, 진통제, 해열제, 소염제, 항생제, 항미생물제, 항바이러스제, 항진균제, 근골격 약물, 심혈관 약물, 신장 약물, 폐 약물, 소화 질환 약물, 혈액 약물, 비뇨기 약물, 대사 약물, 간 약물, 신경 약물, 항암 약물, 위 병태 치료 약물, 결장 병태 치료 약물, 피부 병태 치료 약물 및 림프 병태 치료 약물을 포함한다. 상기 약물들 중 본 발명의 스캐폴드에 탑재될 수 있는 것이라면 어느 것이라도 적용 가능하며, 단일 약물 뿐 만 아니라 약물의 조합도 적용될 수 있다. 따라서 본 발명의 스캐폴드는 다양한 질환의 치료 용도 또는 조직 재생 용도로 제한 없이 이용될 수 있으며, 이러한 약물 의 선택 및 조합은 당업자가 적절히 선택할 수 있는 것이다.
[51]
본 발명의 스캐폴드는 다공성 스캐폴드로, 상기 다공성 스캐폴드는 알지네이트, 젤라틴, 콜라겐, 히알루론산과 같 은 세포외기질(extracellular matrix, ECM)의 주성분을 이용하고, 물리 /화학적 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
[52]
또한 본 발명의 항암용 약학 조성물의 암은 고형암 또는 혈액암인 것이며,자연살해(NK)세포를 특징으로 하며, 상기 자연살해세 포는 키메릭항원수용체-자연살해(CA R-NK)세포가 바람직하다. 상기 키메릭항원수용체(CAR)는 암 특이적 항 EGFR 애피바디 (tumor-specific zEGFR affibodies)의 엑토도메인(ecto-domain)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 키메릭항원수용체(CAR)는 힌지(hinge), 막통과 (transmembrane), CD28, DAP10 및 CD3ζ을 포함한다.
[53]
본 발명에서 용어 “애피바디 (affibody, affibo dies)”특정 타겟 단백질 (수용체)에 결합 할 수 있는 항체 모사체를 의미할 수 있다. 일반적으로 애피바디는 20 내지 150의 아미노산 잔기 로 구성되며, 2 내지 10개의 알파 헬릭스로 구성될 수 있고, 세포의 특 정 수용체 또는 표적 단백질을 인식할 수 있는 애피바디 또는 애피바디 분자를 모두 포함할 수 있다. 본 발명에서는 상세하게 EGFR을 타겟으로, EGFR 단백질을 인식할 수 있는 애피바디를 의미할 수 있다. 상기 EGFR은 성장인자 수용체 epidermal growth receptor로, 고형암 또는 혈액암 등 많은 암세포에서 과발현되는 것으로 보고되어져 있다.
[54]
한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 본 발명의 약제 학적 조성물은 상기 성분들 이외에 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
[55]
본 발명의 약학적 조성물이 객체에 투여되는 방식으로 사용되는 경우, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환 자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다.
[56]
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
[57]
본 발명의 약학적 조성물은 주사용 앰플을 통해 사용될 수 있다. 상기 주사용 앰플 은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도 당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식 및 기타 용도에 사용되는 세포와 함께 혼합물의 형태로 투여될 수 있다. 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
[58]
본원 발명의 조성물은 세포를 현탁하기 위한 배지, 고형암 또는 혈액암에 효과적인 유전자 (예: 항-염증성 사이토카인 (anti-inflammatory cytokine) 유전자, 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokine)에 대한 siRNA 또는 안티-센스 프라이머 (antisenseprim er)) 또는 이를 포함하는 발현벡터, 자가분비 (autocrine) 또는 측분비 (paracrine) 효과를 제공하는 사이토카인, 성장인자 (growth factor), 및 이 들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 보조성 분을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 배지는 상기 배양용 배지와 동일한 종류의 배지일 수 있으며, 혈청, 항생제 및 항진균제는 전혀 포함하지 않는다.
[59]
[60]
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 생체 투입용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 20 내지 40 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
[61]
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
[62]
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 암 발생 부위에 1개소 또는 복수 개소(예를 들면 2~50개소)에 투여할 수 있으며, 투여량은 구체적으로는 1.0 × 105 내지 1.0 × 108 세포수/kg(체중), 보다 구체적으로는 1.0 × 106 내지 1.0 × 107 세포수/kg(체중)이 될 수 있다.
[63]
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약학 조성물을 장기, 혈관 조직 등에 발생한 고형암 또는 혈액암이 발생된 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료방법을 제공한다.
[64]
또한, 상기 치료방법은 타 치료약물을 추가로 투여하는 단계를 또는 병행하여 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[65]
[66]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[67]
[68]
<실시예1.> 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다 공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold) 제조
[69]
생리 화학적 조건 하에서 분해도가 서로 다른 물질, 제 1성분과 제 2성분을 수용액상에서 혼합한 후에, 제조된 몰드위에 붇고, 저온에서 얼린 후에 가교를 서서히 진행하고, 가교 후 동결건조방 법을 이용하여 얼음층(ice crystal)을 제거하여 서로 연결된(cross-linked) 구조의 기공(pore)을 갖는 크라이오젤 스캐폴드를 제조하였다. 제1성분에는 히알루론산 메타아크릴레이트(HA-MA), 콜라겐(Collagen)이 있고, 이에 대응하는 제2성분에는 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트(HA-ald-MA), 히알루론산(Hyaluronic acid) 또는 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA)이 있다.
[70]
1-1. 제1성분이 히알루론산 메타아크릴레이트 (HA-MA)이고, 제2성분은 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (HA-ald-MA)인 스캐폴드 제조 (SK-SC1 스캐폴드 제조)
[71]
히알루론산(Hyal uronic acid: HA, 500 kDa)을 10㎎/㎖의 농도로 100㎖의 증류수에 녹이고, 3.85g의 메타크릴 무수화물(Methacrylic anhydride: MA)을 첨가한다. 5N의 수산화나트륨을 사용하여 pH를 8로 맞추고, 상온, 암실에서 교반시킨 후, 48시간 동안 증류수에 투석(12-14 KDa cutoff)하고 동결건조하여 HA-MA을 제조하였다. 그 다음, 히알루론산(HA, 500 kDa)을 10㎎/㎖의 농도로 100㎖의 증류수에 녹이고 과아 이오딘산나트륨(NaIO4) 534㎎을 첨가하여 24시간 동안 암실, 상온에서 교반하여 산화반응이 충분히 일어나도록 하였다. 산화반응을 종결시키기 위해 에틸렌 글리 콜(Ethylene glycol) 1g을 첨가하여 1시간 동안 상온에서 교반시킨 후, 48시간 동 안 증류수에 투석(12-14 KDa cutoff)하고 동결건조 하여 HA-ald을 제조하였다. 제조한 HA-ald 1g을 100㎖의 증류수에 녹이고 3.85g의 메타크릴 무수화물(MA)을 첨가하였다. 이어서 5N의 수산화나트륨을 사용하여 pH를 8로 맞추고 암실, 실온에서 교반시킨 후, 48시간 동안 증류수에 투석(12-14 KDa cutoff)하고, 동결건조 하여 HA-ald-MA을 제조하였다. 상기 HA-MA 100㎎과 HA-ald-MA 100㎎을 10㎎/㎖의 농도로 4℃에서 다양한 비율(HA-MA:HA-ald-MA=1:0, 2:1, 1:1)로 PBS에 녹인다. 상기 혼합 용액에 30㎎의 과산화황산암모늄(ammonium persulfate)을 첨가하여 섞어주었다. HA-MA과 HA-ald-MA의 가교결합 반응을 유도하기 위해 테트라메틸에틸디아 민(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine) 60㎕를 상기 혼합용액에 첨가하여 완전 히 섞어주었다. 상기 혼합물을 재빨리 PDMS 몰드(mold)에 옮기고 -20℃에 24시간 동안 보관하여 HA-MA/HA-ald-MA를 포함하는 크라이오젤 스캐폴드 (SK-SC1 스캐폴 드)를 제조하였다. 상기 스캐폴드는 70% 에탄올 용액을 이용하여 살균한 후, PBS 를 이용하여 3번 세척하였다.
[72]
1-2. 제1성분이 히알루론산 메타아크릴레이트(HA-MA)이고, 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA)인 스캐폴드 제조 (3D ENHANCE 스캐폴드 제조)
[73]
히알루론산 메타아크릴레이트(Methacrylate Modified Hyaluronic Acid (HA-MA) 100mg과 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트 methacrylate-m odified oxidized HA (oxHA-MA) 100㎎을 10㎎/㎖의 농도로 4℃에서 다양한 비율(HA-MA:ox-MA=1:0, 2:1, 1:1)로 PBS에 녹인다. 상기 혼합 용액에 30㎎의 과산화황산암모늄(ammonium persulfate)을 첨가하여 섞어 주었다. HA-MA과 oxHA-MA의 가교결합 반응을 유도하기 위해 테트라메틸 에틸디아민(N,N,N',N'- tetramethylethylenediamine, TEMED) 60㎕를 상기 혼합용액에 첨가하여 완전히 섞어주었다. 상기 혼합물을 재빨리 PDMS 몰드(mold)에 옮기고 -20℃에 24시간 동안 보관하여 HA-MA/oxHA-MA를 포함하는 크라이오젤 스캐폴드를 제조하였다. 상기 스캐폴드는 70% 에탄올 용액을 이용하여 살균 한 후, PBS를 이용하여 3번 세척하였다 (도 1). 상기와 같이 Hyaluronic acid를 이용하여 제조된 3D ENHANCE 스캐폴드의 전자현기명 사진과 형태의 이미지 사진을 기록한 후 (도 2a) NK-92 세포를 dropping 방법을 통하여, hyaluronic acid를 중합에 이용한 3D-engineered hyaluronic acid-based niche for cell expansion (3D- ENHANCE)에 로딩 후 7일간 세포의 proliferation 경향을 형광 현미경을 통하여 관찰하였다(도 2b).
[74]
[75]
<실시예2.> 다공성 삼차원 중합 스캐폴드의 기공구조 또는 분해 과정 분석
[76]
본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드의 기공구조에 대한 확인을 기존의 conventional gel과 비교하였다 (도 3). 상기 3D ENHANCE 스캐폴드는 bio-degradable cryogel로 상기 conventional gel과 동일하게 Hyaluronic acid를 기본으로 제작되었다. 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드, Bio-degradable cryogel의 경우 -20℃에서 24시간 동안 냉동겔화(cryogelation)를 통해 만들어졌기 때문에 내부에 일정한 크기의 기공구 조(interconnected pore structure)가 생성된다. 이러한 일정한 크기의 기공구조에 세포가 spheroid 형태로 자라게 된다. NK 세포의 spheroid 형성은 세포의 증식력, 생존력, 살상력을 높여준다. 이와는 다르게 conventional gel은 기공의 크기가 일 정하지 않으며 기공구조 자체가 제대로 형성되지 않는다. 따라서 세포의 로딩이 어 렵고 기공 내에 세포가 제대로 안착되지 않는다. 도 4에 상기 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드 bio-degradable cryogel의 3D ENHANCE 스캐폴드와 conventional gel의 특성을 나타내었다.
[77]
그 다음으로, 도 5a 또는 도 5b와 같이, 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드의 분해 과정 분석하였다. Bio-degradable cryogel의 가장 큰 장점은 scaffold의 분해 정도를 조절 할 수 있다는 점이다. Bio-degradable cryogel은 크게 두 단계의 분해를 거친다. 첫 번째 단계의 분해는 oxidize d hyaluronic acid의 분해로 빠르게 일어난다. 두 번째 단계의 분해는 hyaluronic acid의 분해로 비교적 천천히 일어난다(도 5a). 따라서 hyaluronic acid와 oxidized hyaluronic acid의 비율을 조절함으로써 scaffold의 분해 정도를 조절 할 수 있다(도 5b).
[78]
또한 본 발명의 제1성분이 히알루론산 메타아크릴레이트 (HA-MA)이고, 제2성분은 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트 (HA-ald-MA)인 스캐폴드인 SK-SC1 스캐폴드에 대한 생체 분해 특성을 확인한 결과, 도 5c와 같이 분해가 되는 것을 확인하였으며, 상기 SK-SC1 스캐 폴드를 쥐 또는 마우스에 삽입한 후 쥐의 무게를 측정한 결과, 상기 삽입된 스캐폴드가 쥐에 독성을 미치지 않는 것을 확인하였다.
[79]
[80]
<실시예3.> 3D 스캐폴드와 2D cell culture 비교
[81]
도 6과 같이, 3D culture system으로 많이 사용하고 있는 hyaluronic acid based- conventional gel과 2D culture와 비교하였다. 48-well plate(2D)와 conventional gel 에 동일 양의 세포 (1.25x10 5cells)를 배양하고 5일 후 회수된 세포 수를 측정하여 세포성장률을 확인해 본 결과 48-well plate culture에 비해 conventional gel에서 세포성장률이 높음을 확인하였으나 깔아주었던 세포 수에 비해서는 전혀 자라지 않았음을 확인하였다(도 6a). 그리고 회수된 세포 수의 오차범위가 크고 48-well plate culture에 비해 세포생존율이 낮은 뿐만 아니라 80% 이상 죽은 세포였다(도 6b).
[82]
그 다음 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드와 2D cell culture 비교를 도 7과 같이 진 행하였다. 본 발명의 bio-degradable cryogel의 3D ENHANCE 스캐폴드와 2D culture (24 well plate culture 또는 48 well plate culture)에 대한 비교 결과, bio- degradable cryogel culture(0.5x10 5cells)의 경우 세포배양 5일 후 20배 이상 세포 가 자란 것을 확인하였다. 그에 비해 24-well plate culture (2.5x10 5cells)시 오히려 세포가 줄었으며 48-well plate culture (0.25x10 5cells)에서는 대략 5배 정도 증가하였다 (도 7a). 세포생존률을 측정하였을 경우 24-well plate culture의 경우 죽은 세포가 70% 이상이였으며, 48-well plate culture시에는 살아있는 세포와 죽 은 세포가 대략 절반씩 차지하였으나 bio-degradable cryogel의 경우 대략 20%의 세포만이 죽어있었다(도 7b).
[83]
그 다음으로, SK-SC1 스캐폴드 내에서의 자연살해세포(NK) 세포의 세포 생존율을 도 7c 또는 도 7d와 같이 비교한 결과, 2D cell culture (2D ) 에서의 세포 배양은 5일 이후부터 세포 사멸히 급격하게 증가하였지만, 본 발명의 상기 3D, SK-SC1 스캐폴드에서는 2D에 비해 적은 수의 세포 사멸을 확인하였다.
[84]
그 다음, 자연살해세포 (Natural killer cell, NK cell)을 이용하여 3D ENHANCE 스캐폴드(3D) 와 2D cell culture (2D) 비교를 하였다. 먼저 형광 현미경 (광학전자형광현미경) 관찰을 통한 fluorescence image로 live cell을 비교를 하였다. 도 8a와 같이 2D와 비교하여, live cell이 증가 한 것으로 확인되었고, 도 8b과 같이 2D culture와 3D ENHANCE 스캐폴 드의 NK cell proliferation을 비교한 결과, 상기 2D보다 본 발명의 3 D에서, cell proliferation이 증가한 것이 확인되었다. 또한 도 8c는 세포생존율을 확인한 결과로, 2D와 비교하여, 본 발명의 3D에서 Cell death가 감소한 것으로 나타났으며(cell viability 증가), 도 8d과 같이 NK cell migration activity에 대한 2D cell culture와 3D ENHANCE 스캐폴드 비교한 결과, 상기 2D와 비교하여, 본 발명의 3D에서 NK-92 Cell migration activity가 증가한 것으로 나타났다. 또한 도 8e와 같이 K562 myelogeniys leukemia cell과, Raji Burkitt’s lymphoma cell에 대한 tumor lytic activity에 대한 효과를 2D culture와 3D ENHANCE 스캐폴드 비교한 결과, 2D와 비교하여, 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드에서 암세포 용해능(tumor lytic activity)이 증가한 것으로 나타났다. 또한 NK 세포 활성과 관련하여, 도8j와 같이 2D culture (2D)와 비교하여 NK cell proliferation, cytokine receptor interaction, NK cell mediated cytotoxicity 관련 유전자 발현을 확인한 결과 2D에 비해 본 발명의 3D ENHANCE 스캐폴드에서 상기의 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
[85]
또한 SK-SC1 스캐폴드에서의 NK 세포 활성도를 2D cell culture(2D)와 비교하여 확인한 결과, 도 8f와 같이 NK 세포주인 NK 92 세포의 cell proliferation 증가하였고, 또한 도 8g와 같이 cell migration이 증가한 것을 확인하였다. 또한 도 8h와 같이 상기 K562 m yelogeniys leukemia cell과, Raji Burkitt’s lymphoma cell에 대한 tumor lytic activity 또는 cell cytotoxicity가 증가한 것을 확인하였다. 또한 도 8i와 같이 SK-SC1 스캐폴드에 대한 상기 NK 세포 cell proliferation, cytokine/chemokine, NK-medicated cell cytotoxicity 관련 유전자 변화를 확인하 였다.
[86]
[87]
<실시예4.> 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold)로, 콜라겐과 히알루론을 포함하는 스 캐폴드 (콜라겐 매트릭스 스캐폴드) 제조 및 세포 활성 측정
[88]
히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2 성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold)로, 콜라겐과 히알루론산을 포함하는 스캐폴드로, Collagen/H yaluronic acid를 포함하는 스캐폴드 (콜라겐 매트릭스 스캐폴드) 제조 및 세포 활성을 측정하였다(도 9). Collagen/Hyaluronic acid, Hyaluronic acid derivative를 저온에서 가교공정(cryogel)을 통하여, pore의 크기가 150-300 μm 인 스캐폴드 제작 (200μm가 바람직)한 다음(도 9a), NK-92 세포주를 injection 방 법을 통하여, Collagen/Hyaluronic acid porous scaffold (C.S)에 로딩 후 7일까지 NK 세포의 활성을 측정하였다. 상기 스캐폴드에서 배양된 NK 세포는 2D cell culture(2D) 보다 세포의 생존률 (Viability, 도면 9b)과 암세포 살상능 (Cytotoxicity)이 증가된 것을 확인하였다(도 9c).
[89]
그 다음으로, 2D cell culture (2D) 또는 상기 Collagen/Hyaluronic acid를 포함하는 스캐폴드(콜라겐 매트릭스 스캐폴드)에서 NK-92 세포를 배양 후 유전자 발현 변화를 측정하였다. 2D 또는 매트릭스에서 NK-92 세포를 배양 후 NGS(next generation sequencing) 스터디를 진행하였다. 5일째에 2D 대비해서 Collagen/Hyaluronic acid를 포함하는 스캐폴드 배양된 NK-92에서 1,162개 유전자의 발현 증가 또는 감소가 확인되었다(도 9d와 도 9f). 또한 암세포 살상능과 관련된 유전자 발현 정도를 확인한 결과, Volum plot 분석을 통해 2D 배양 조건과 가장 크게 차이가 나는 5개의 유전자는 LTA (Lymphotoxin-alpha), HSPE1 (Heat shock protein), HSPA5 (Glucose-regulated protein), CST7 (Cystatin-F, immune regulator), HYOU1 (Hypoxia up-regulated protein 1)이었다(도 9g). 또한 NK 세포의 살상능과 관련된 유전자의 mRNA 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 9h).
[90]
[91]
<실시예5.> 이차원적 세포배양과 3D-ENAHNCE를 이용한 Adoptive cell transfer (ACT)세포치료의 효과 비교
[92]
Adoptive cell transfer(ACT)는 면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitor)와 더불어 대표적인 항암면역치료방법이다. 따라서 ACT 치료법에서 3D-ENHANCE 스캐폴드에서 키운 NK세포가 이차원적 세포배양으로 키운 NK세포보다 더욱 효과적인지 알아보기 위하여 혈액암세포를 마우스에 주입 후 이차원적 세포배양법과 3D-ENHANCE에서 키운 NK세포를 각각 주입하여 혈액암세포의 제거 정도를 확인하였다. 그 결과 3D-ENHANCE에서 키운 NK세포를 주입한 마우스에서 혈액암세포가 더욱 효과적으로 제거되었으며, 마우스의 생존률이 증가함을 확인하였다(도 10).
[93]
[94]
<실시예6.> 암조직에 대한 스캐 폴드 치료용 효과 검증
[95]
6-1. 3D-ENHANCE 스캐폴드의 암조직에 대한 치료 효과 검증
[96]
암 조직이 절제된 부위에 NK세포가 포함된 3D-ENHANCE 스캐폴드를 이식하여 치료용 효과에 대한 검증하기 위하여 도 11과 같이 동물실험을 진행하였다. 유방암 세포주 인 MDA-MB-231를 마우스에 이식한 후 자란 암세포를 절제하고 그 부위에 3D- ENAHNCE 스캐폴드를 이식하여 암세포가 전이된 정도를 확인하였다. 상기 동물실험 에는 EGFR affibody를 포함하는 NK-CAR (자연살해세포-키메릭 항원수용체 또는 키 메릭항원수용체-자연살해, CAR-NK, zEGFR-CAR)와, NK-92 자연살해세포가 사용되었다. 상기 NK-92와 상기 zEGFR-CAR를 3일 동안 배양 후, MDA-MB-231 유방암세포주 에 대한 lyctic activity를 측정하였다(도 11c). 상기와 같이 유방암 세포주인 MDA-MB-231를 마우스에 이식한 후 자란 암세포를 절제하고 그 부위에 3D-ENAHNCE (NK92 또는 zEGFR-CAR를 로딩 후 배양한 3D-ENAHNCE scaffold)를 이식하여 암세포가 전이된 정도를 확인하였다. 마우스 폐 조직을 갈아 암세포 특이적인 마커인 CK-18의 발현 정도를 확인한 결과, 도 11f와 같이 본 발명의 zEGFR-CAR를 로딩 후 배양한 3D ENHACE 스캐폴드 (zEGFR-CAR, zEGFR-CAR scaffold) 시험군에서 40%의 암세포 전이 감소 효과를 나타내었다. 상기와 같이 3D-ENHANCE 스캐폴드가 마우스 생체 내 이식이 가능하며, 암세포의 전이를 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
[97]
6-2. SK-SC1 스캐폴드에 대한 암 조직에 대한 치료 효과 검증
[98]
상기 실시예 6-1의 방법으로 유방암 세포주인 MDA-MB-231를 마우스에 이식한 후 자란 암세포를 절제하고 그 부위에 SK-SC1 스캐폴드를 이식하여 암세포가 전이된 정도를 확인하였다. 상기 동물실험에는 zEGFR-CAR와 NK-92 자연살해세포가 사용되었다. NK-92 와 zEGFR-CAR를 3일 동안 배양 후, 유방암 세포주인 MDA-MB-231세포에 대한 lyctic activity를 측정하였다. 도 11h와 같이 MDA-MB-231 세포에서 EGFR이 과 발현되는 것을 확인하였고, 유방암세포주인 MDA-MB-231에 대한 lyctic activity 활성 있는 것을 확인하였다.

청구범위

[청구항 1]
서로 다른 화학적 구조를 지닌 히알루론산 유도체의 제1성분 및 제2성분이 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드(scaffold): 및 상기 스캐폴드의 챔버내에서 배양된 세포를 포함하는, 생체내 세포 투입칩을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학조성물.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트(HA-MA) 또는 이의 유도체이고, 상기 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA), oxHA-MA 유도체(oxHA-MA) 또는 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트(HA-ald-MA)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 3]
제2항에 있어서, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트이고, 제2성분은 히알루론산 알데히드 메타아크릴레이트(HA-ald-MA)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 4]
제2항에 있어서, 상기 제1성분은 히알루론산 메타아크릴레이트이고, 제2성분은 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트(oxHA-MA)인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 세포는 랑게르한스섬 세포, 세르토리 세포, 도파민성 뉴런, 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 제대혈 세포, 배아 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 분화된 줄기 세포, 자연살해(NK)세포, 및 B세포로 이루어진 군에서 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 6]
제1항에 있어서, 상기 세포는 자연살해(NK)세포인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 7]
제6항에 있어서, 상기 자연살해(NK)세포는 키메릭항원수용체-자연살해(CAR-NK)세포인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 8]
제7항에 있어서, 상기 키메릭항원수용체(CAR)는 암 특이적 항 EGFR 애피바디 (tumor-specific zEGFR affibodies)의 엑토도메인(ecto-domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
[청구항 9]
제8항에 있어서, 상기 CAR는 힌지(hinge), 막통과(transmembrane), CD28, DAP10 및 CD3ζ을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
[청구항 10]
제1항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인 것인 것을 특징으로 하는 항암용 약학조성물.
[청구항 11]
제10항에 있어서, 상기 고형암은 폐암, 뇌암, 간암, 유방암, 난소암 또는 대장암인 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
[청구항 12]
제10항에 있어서, 상기 혈액암은 백혈병, 다발성 골수종, 재생불량성 빈혈 또는 악성림프종인 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
[청구항 13]
히알루론산 메타아크릴레이트 및 산화된 히알루론산 메타아크릴레이트가 가교된 구조를 포함하는 다공성 3차원 크라이오젤 스캐폴드를 포함하는 세포배양용 조성물.

도면

[도1]

[도2]

[도3]

[도4]

[도5]

[도6]

[도7]

[도8]

[도9]

[도10]

[도11]