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1. WO2020113460 - ROLLING CIRCLE AMPLIFICATION METHOD, METHOD FOR PREPARING SEQUENCING LIBRARY, AND DNA NANOSPHERE PREPARED THEREFROM

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26  

附图

1   2   3   4   5  

说明书

发明名称 : 滚环扩增方法、测序文库制备方法及制得的DNA纳米球

技术领域

[0001]
本发明涉及测序技术领域,具体涉及一种制备DNA纳米球的滚环扩增方法、测序文库制备方法及制得的DNA纳米球。

背景技术

[0002]
滚环扩增(RCA)是以单链环状DNA/RNA为模版,将DNA/RNA进行大量复制的过程。因其具有快速、准确、所需模板量少等特点,目前已成为生物医学技术和生物纳米技术领域重要的研究手段。华大基因(BGI)基于RCA方法形成的DNA纳米球(DNB)的测序方法,扩增发生的错误率不累积,从而在测序准确性的源头上就优于其他测序平台,得到了越来越广泛的应用。但是,由于DNB需要以单链环状DNA为模板制备而成,在文库制备中需要额外增加单链环化的制备过程,增加了文库制备的复杂度。具体而言,在样品制备中,必须先得到单链环状DNA,其文库制备流程包括DNA提取,打断,加接头,PCR扩增(可选),纯化,单链环化,纯化等步骤。如图1所示,现有制备DNB的技术中,双链DNA经变性后的单链两端与介导序列(Splint oligo)互补配对,在T4连接酶的作用下环化,然后消化线性DNA并进行磁珠纯化,之后再在Phi29聚合酶的作用下滚环扩增(RCA)得到DNB。
[0003]
由于基于DNB的测序方法多了后期环化和纯化两个步骤,增加了样品制备难度及时间,同时增加了样品制备的成本。另外,由于环化效率和纯化效率等综合因素影响,此两步的效率仅10%~30%,大大增加了样品投入量。因而目前基于DNB的测序技术所需要的样品量偏多,限制了其在珍稀样品测序的使用范围。虽然可以通过PCR扩增来弥补样品量不足的缺陷,但是PCR会引入错误,越来越不被业界人士所认可。
[0004]
发明内容
[0005]
本发明提供一种滚环扩增方法、测序文库制备方法及制得的DNA纳米球,该方法不再以单链环化DNA为模版,而是直接以双链DNA为模板进行DNB制备,省去DNB制备过程中单链环化过程,简化了DNB制备流程,缩短了制备时间,节约了制备成本,且降低了样品的使用量。
[0006]
根据第一方面,一种实施例中提供一种滚环扩增方法,包括:将双链DNA和介导序列(Splint oligo)在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在上述体系中同时引入连接酶和聚合酶,在上述连接酶作用下使上述单链DNA两端连接,同时在上述聚合酶作用下以上述介导序列为引物、以上述单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到扩增产物,在优选实施例中为DNA纳米球。
[0007]
在优选实施例中,上述双链DNA选自PCR扩增得到的双链DNA、连接产物,其中连接产物为DNA打断后加上接头的DNA。
[0008]
在优选实施例中,上述介导序列仅与上述双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对。
[0009]
在优选实施例中,上述连接酶是T4DNA连接酶。
[0010]
在优选实施例中,上述聚合酶是Phi 29聚合酶。
[0011]
在优选实施例中,上述变性在95℃下进行。
[0012]
在优选实施例中,上述退火在40℃下进行。
[0013]
在优选实施例中,上述连接酶和聚合酶作用下的反应在30℃下进行。
[0014]
在优选实施例中,上述连接酶和聚合酶作用下的反应进行20min以上。
[0015]
在优选实施例中,上述体系中还引入ATP为上述连接酶提供能量。
[0016]
在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是飞摩尔(fmol)水平。
[0017]
在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。
[0018]
在优选实施例中,上述方法是用于BGI测序平台上的滚环扩增方法。
[0019]
根据第二方面,一种实施例中提供一种测序文库制备方法,包括制备DNA纳米球的步骤,该步骤包括:将双链DNA和介导序列(Splint oligo)在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在上述体系中同时引入连接酶和聚合酶,在上述连接酶作用下使上述单链DNA两端连接,同时在上述聚合酶作用下以上述介导序列为引物、以上述单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到DNA纳米球。
[0020]
在优选实施例中,上述双链DNA选自PCR扩增得到的双链DNA、连接产物,其中连接产物为DNA打断后加上接头的DNA。
[0021]
在优选实施例中,上述方法在制备DNA纳米球的步骤之前,还包括DNA打断、加接头步骤以得到上述双链DNA,任选地,在加接头之后还包括PCR步骤。
[0022]
在优选实施例中,上述介导序列仅与上述双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对。
[0023]
在优选实施例中,上述连接酶是T4DNA连接酶;上述聚合酶是Phi 29聚合酶。
[0024]
在优选实施例中,上述变性在95℃下进行;上述退火在40℃下进行。
[0025]
在优选实施例中,上述连接酶和聚合酶作用下的反应在30℃下进行。
[0026]
在优选实施例中,上述连接酶和聚合酶作用下的反应进行20min以上。
[0027]
在优选实施例中,上述体系中还引入ATP为上述连接酶提供能量。
[0028]
在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是飞摩尔水平。
[0029]
在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选 10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。
[0030]
在优选实施例中,上述方法是用于BGI测序平台上的测序文库制备方法。
[0031]
根据第三方面,一种实施例中提供一种第一方面的滚环扩增方法或第二方面的测序文库制备方法得到的DNA纳米球。
[0032]
根据第四方面,一种实施例中提供一种第三方面的DNA纳米球在测序中的用途。
[0033]
在优选实施例中,第一方面的滚环扩增方法或第二方面的测序文库制备方法在文库制备中用于降低DNA的起始量。
[0034]
本发明的滚环扩增方法,以双链DNA为模板,PCR纯化后或加接头的双链DNA即可用于DNB制备,无需进行单链环化和纯化步骤,简化了样品制备流程,节省时间和成本。更具优势的地方在于,由于无需后续单链环化和纯化的步骤,样品所需量大大减少,即使不做PCR扩增,也能满足后续测序所需,避免了PCR扩增引入的错误。因此,此方法利于发展无需PCR(PCR free)的样品制备方法,针对无需PCR的样品以及珍稀样品的DNB制备,此方法的优势更为明显。

附图说明

[0035]
图1为现有技术中制备DNA纳米球的滚环扩增方法原理示意图;
[0036]
图2为本发明实施例中制备DNA纳米球的滚环扩增方法原理示意图;
[0037]
图3为现有技术和本发明方法制备的DNB在第一循环(cycle1)测序中装载效率(BIC)、装载质量(Fit)和反映DNB质量值的ESR值的情况;
[0038]
图4为现有技术制备的DNB测序显示的四种碱基分布曲线图,其中曲线1-4分别表示碱基A、T、C、G百分含量;
[0039]
图5为本发明方法制备的DNB测序显示的四种碱基分布曲线图,其中曲线 1-4分别表示碱基A、T、C、G百分含量。

具体实施方式

[0040]
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
[0041]
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0042]
如图2所示,本发明实施例中制备DNA纳米球的滚环扩增方法,包括:将双链DNA和介导序列(Splint oligo)在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在体系中同时引入连接酶和聚合酶,在连接酶作用下使单链DNA两端连接,同时在聚合酶作用下以介导序列为引物、以单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到DNA纳米球。
[0043]
本发明实施例中,介导序列两端分别与变性的单链DNA两端互补配对,因此能够将变性的单链DNA两端拉在一起,然后在连接酶的作用下单链DNA两端连接形成环状DNA,作为滚环扩增反应的模板。本发明实施例中,介导序列可以是一条仅与双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对的序列,选择两条单链中的一条单链进行环化,并以此环化单链作为滚环扩增反应的模板生成DNA纳米球。当然,作为优选方式,介导序列可能是两种或以上的序列,能够与双链DNA变性后的两条单链DNA两端互补配对,这样两条单链均能发生环化并作为滚环扩增反应的模板。
[0044]
本发明实施例中,双链DNA可以是任何来源的双链DNA。作为优选实施例,双链DNA是PCR扩增得到的双链DNA,尤其是来源于建库过程(如测序文库建库过程)中PCR扩增步骤得到的双链DNA。该方法以双链DNA为模板,PCR纯化后的双链DNA即可用于DNB制备,无需进行单链环化和纯化步骤,简化了样品制备流程,节省时间和成本。
[0045]
本发明实施例中,用于使单链DNA两端连接的连接酶可以是任何适合单链DNA环化连接的连接酶,例如,T4 DNA ligase(连接酶),T3 DNA ligase(连接酶),T7 DNA ligase(连接酶),Taq DNA ligase(连接酶)等,在优选实施例中,连接酶是T4 DNA连接酶。
[0046]
本发明实施例中,用于催化滚环扩增反应的聚合酶可以是任何适合滚环扩增反应的聚合酶,例如,phi29聚合酶,bst聚合酶等,在优选实施例中,聚合酶是Phi 29聚合酶。
[0047]
本发明实施例中,双链DNA可以通过任何合适的方式变性,包括但不限于热变性和碱变性等。但是从操作的便捷性和不对后续反应产生负面影响的角度,在优选实施例中,选用热变性对双链DNA进行变性处理。例如,在一个优选实施例中,变性在95℃下进行。变性时间可以是1分钟以上,优选3分钟以上,特别优选3分钟。
[0048]
本发明实施例中,介导序列与变性的单链DNA的退火可以在合适的温度进行,具体可以根据介导序列两端和变性的单链DNA两端互补配对的碱基序列长度、碱基组成等因素确定,一般而言,两端互补配对的碱基序列长度越长,相应的退火温度可以相对越高;两端互补配对的碱基中GC含量越高,相应的退火温度可以相对越高。在一个优选实施例中,退火在40℃下进行。
[0049]
本发明实施例中,连接酶和聚合酶作用下的反应的条件,如反应温度和时间等,可以根据选用的连接酶和聚合酶的种类来确定。为保证反应效率,尽量保证所选用的连接酶和聚合酶的最适反应条件(特别是反应温度)基本一致或 尽量接近。例如,在一个优选实施例中,连接酶选用T4 DNA连接酶,聚合酶选用Phi 29聚合酶,反应在30℃下进行效果较好。相应地,反应时间也可以根据连接酶和聚合酶的种类来确定,一般而言,尽量保证连接酶和聚合酶催化的反应都能获得比较充分的反应程度。在一个优选实施例中,在连接酶选用T4DNA连接酶、聚合酶选用Phi 29聚合酶的情况下,反应时间20min以上效果较好,特别是在30℃下进行20min的反应效果较佳。
[0050]
本发明实施例中,根据选用的连接酶的具体种类,还可能需要加入ATP为连接酶提供能量。例如,在一个优选实施例中,连接酶选用T4 DNA连接酶,体系中引入ATP为T4 DNA连接酶提供能量。
[0051]
由于本发明方法无需进行单链环化和纯化步骤,简化了样品制备流程的同时,更具优势的地方在于,样品所需量大大减少,即使不做PCR扩增,也能满足后续测序所需,避免了PCR扩增引入的错误。在优选实施例中,双链DNA在体系中的加入量可以低至飞摩尔(fmol)水平,例如,在一些优选实施例中,双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。本发明方法利于发展无需PCR(PCR free)的样品制备方法,针对无需PCR的样品以及珍稀样品的DNB制备,此方法的优势更为明显。
[0052]
本发明方法广泛适用于各种基于DNB的测序平台,特别是适用于华大基因(BGI)测序平台,测序策略可以是BGISEQ-500 SE50测序等。
[0053]
本发明的一种实施例中提供一种测序文库制备方法,包括制备DNA纳米球的步骤,该步骤包括:将双链DNA和介导序列(Splint oligo)在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在上述体系中同时引入连接酶和聚合酶,在上述连接酶作用下使上述单链DNA两端连接,同时在上述聚合酶作用下以上述介导序列为引物、以上述单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到DNA纳米球。
[0054]
在优选实施例中,上述双链DNA是PCR扩增得到的双链DNA。在优选实 施例中,上述方法在制备DNA纳米球的步骤之前,还包括DNA打断、加接头和PCR步骤以得到上述双链DNA。在优选实施例中,上述介导序列仅与上述双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对。在优选实施例中,上述连接酶是T4DNA连接酶;上述聚合酶是Phi 29聚合酶。在优选实施例中,上述变性在95℃下进行;上述退火在40℃下进行。在优选实施例中,上述连接酶和聚合酶作用下的反应在30℃下进行20min以上。在优选实施例中,上述体系中还引入ATP为上述连接酶提供能量。在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是飞摩尔水平。在优选实施例中,上述双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。在优选实施例中,上述方法是用于BGI测序平台上的测序文库制备方法。
[0055]
本发明实施例制备得到的DNA纳米球,可以直接上机测序,因此在本发明的一个实施例中,提供本发明实施例制备得到的DNA纳米球在测序中的用途。
[0056]
以下通过实施例对本发明进行详细描述,需要说明的是,该实施例仅是示例性的,不能理解为对本发明保护范围的限制。
[0057]
实施例1:两种方法比较
[0058]
(1)DNB制备
[0059]
大肠杆菌(E.coli)样品,按照BGISEQ-500 SE50测序的文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司)(插入片段平均170bp)说明书,进行DNA提取,打断,加接头,PCR扩增,纯化,定量等过程。
[0060]
取1pmol PCR产物,按照文库制备试剂盒说明书,采用介导序列(Splint oligo)进行环化及以及磁珠(beads)纯化,qubit定量,此过程用时约1h至1.5h,获得250fmol单链环化DNA。按照BGISEQ-500 SE50测序试剂盒的说明书,取其中40fmol单链环化DNA制备DNB。使用qubit进行定量,DNB浓度为12ng/ul,DNB命名为A待用。
[0061]
按照本发明方法,分别取120fmol、80fmol、40fmol PCR产物,按照以下步 骤进行DNB制备。
[0062]
(a)配置以下表1的反应体系:
[0063]
表1
[0064]
[0065]
(b)将表1的反应体系置于PCR仪中,按照如下表2的程序进行变性及退火。当程序进入第一个4℃时,按照BGISEQ-500 SE50测序试剂盒的说明书加入酶混合物(Enzyme mix)I和II,其中含有Phi 29聚合酶,并加入1ul BGI的T4 DNA连接酶(60U/ul)和1ul ATP(Thermo),混匀后按“skip(跳过)”键,进入30℃进行20min,进入4℃后加入DNB制备试剂盒中的终止缓冲液,进行qubit定量。120fmol、80fmol和40fmol PCR产物得到的DNB浓度分别是37ng/ul、23ng/ul、11ng/ul,分别命名为B、C、D待用。
[0066]
表2
[0067]
[表0001]
温度 时间
95℃ 3min
40℃ 2min
4℃
30℃ 20min

[0068]
[表0002]
4℃

[0069]
比较上述不同的DNB制备方法,从PCR产物到DNB,现有方法需要1.5h至2h,而本发明方法仅需30min内即可得到DNB,且缩短了很多的手动操作,减少了人工误差。从样品投入量来计算,本发明方法使用40fmol PCR产物得到的DNB量与现有方法使用160fmol PCR产物得到的DNB量相当,即本发明方法样品所需量仅为现有技术的25%。
[0070]
(2)DNB装载
[0071]
将现有DNB制备方法所得DNB A和本发明方法DNB制备方法所得DNB D按照BGISEQ500SE50测序试剂盒说明书进行DNB装载,并进行第一循环(cycle1)测序。比较根据两种方法所得DNB的装载情况,分析两种方法的DNB装载效率和质量。如图3所示,两种方法在装载效率(BIC)和装载质量(Fit)上无明显差异,同时比较ESR(反映DNB质量值),也无明显差异。说明本发明的DNB制备方法不会影响DNB质量和装载效率。
[0072]
实施例2:本发明方法的适用性
[0073]
实施例1使用大肠杆菌(E.coli)文库,平均插入片段为170bp,为了证明本发明方法的广泛适用性,使用人的文库NA12878制备平均插入片段320bp和400bp进行测试。按照BGISEQ500PE100和PE150文库制备试剂盒,进行DNA提取,打断,加接头,PCR扩增,纯化,定量等过程。
[0074]
两种文库各取40fmol,按照实施例1中本发明的DNB制备方法进行DNB制备与定量,分别标记为H400文库和H320文库,然后按照测序说明书进行SE50测序。BGI500下机报告显示,此方法制备的DNB,无论是H400还是H320,其测序质量都表现良好,Q30大于90%且ESR大于85%,芯片的产出率大于85%,都超出了该文库测序的标准参数(≥90%Q30,≥80%ESR,≥80%芯片产出率),其他测序指标(如lag,runon),也都符合基础参数(≤0.1)。这些结果表明,本发明的DNB制备方法能够适用于不用插入片段及不同物种的文库。以上结果显示本发明方法不影响测序质量。
[0075]
为测试本发明方法是否会引入CG和AT偏好(bias),使用H400文库,用现有方法和本发明方法分别进行PE100测序。其中DNB制备方法如实施例1,两种方法所制备的DNB分别装载到一张芯片的两条测序泳道(lane),PE100测序按照BGISEQ500 PE100试剂盒进行装载和测序。现有方法测序数据统计结果如表3和图4所示;本发明方法测序数据统计结果如表4和图5所示。二者在Q30,错误率(error rate)和GC含量上都无明显区别,但是比较碱基分布的情况,现有方法存在AT偏好(bias),尤其是读长2(read2)表现更为明显,而本发明方法几乎不存在AT偏好。
[0076]
表3
[0077]
[0078]
表4
[0079]
[0080]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。

权利要求书

[权利要求 1]
一种滚环扩增方法,其特征在于,所述方法包括:将双链DNA和介导序列在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在所述体系中同时引入连接酶和聚合酶,在所述连接酶作用下使所述单链DNA两端连接,同时在所述聚合酶作用下以所述介导序列为引物、以所述单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到扩增产物。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述双链DNA选自PCR扩增得到的双链DNA、连接产物,其中所述连接产物为DNA打断后加上接头的DNA。
[权利要求 3]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述介导序列仅与所述双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述连接酶是T4DNA连接酶。
[权利要求 5]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述聚合酶是Phi 29聚合酶。
[权利要求 6]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述变性在95℃下进行。
[权利要求 7]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述退火在40℃下进行。
[权利要求 8]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述连接酶和聚合酶作用下的反应在30℃下进行; 任选地,所述连接酶和聚合酶作用下的反应进行20min以上。
[权利要求 9]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述体系中还引入ATP为所述连接酶提供能量。
[权利要求 10]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述双链DNA在 体系中的加入量是飞摩尔水平。
[权利要求 11]
根据权利要求10所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。
[权利要求 12]
根据权利要求1所述的滚环扩增方法,其特征在于,所述方法是用于BGI测序平台上的滚环扩增方法。
[权利要求 13]
一种测序文库制备方法,其特征在于,所述方法包括制备DNA纳米球的步骤,该步骤包括:将双链DNA和介导序列在同一体系中依次进行变性和退火,使介导序列与变性的单链DNA两端互补配对;在所述体系中同时引入连接酶和聚合酶,在所述连接酶作用下使所述单链DNA两端连接,同时在所述聚合酶作用下以所述介导序列为引物、以所述单链DNA为模板进行滚环扩增反应,得到DNA纳米球。
[权利要求 14]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述双链DNA选自PCR扩增得到的双链DNA、连接产物,其中所述连接产物为DNA打断后加上接头的DNA。
[权利要求 15]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述方法在制备DNA纳米球的步骤之前,还包括DNA打断、加接头步骤以得到所述双链DNA,任选地,加接头后还包括PCR扩增步骤。
[权利要求 16]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述介导序列仅与所述双链DNA变性后的两条单链中的一条单链DNA两端互补配对。
[权利要求 17]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述连接酶是T4DNA连接酶;所述聚合酶是Phi 29聚合酶。
[权利要求 18]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述变性在95℃下进行;所述退火在40℃下进行。
[权利要求 19]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述连接酶和聚合酶作用下的反应在30℃下进行; 任选地,所述连接酶和聚合酶作用下的反应进行20min以上。
[权利要求 20]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述体系中还引入ATP为所述连接酶提供能量。
[权利要求 21]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述双链DNA在体系中的加入量是飞摩尔水平。
[权利要求 22]
根据权利要求21所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述双链DNA在体系中的加入量是1飞摩尔以上,优选10飞摩尔以上,更优选40飞摩尔以上。
[权利要求 23]
根据权利要求13所述的测序文库制备方法,其特征在于,所述方法是用于BGI测序平台上的测序文库制备方法。
[权利要求 24]
根据权利要求1至12所述的滚环扩增方法或权利要求13至23所述的测序文库制备方法得到的DNA纳米球。
[权利要求 25]
权利要求24所述的DNA纳米球在测序中的用途。
[权利要求 26]
根据权利要求1至12所述的滚环扩增方法或权利要求13至23所述的测序文库制备方法在文库制备中用于降低DNA的起始量。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]