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1. WO2020113409 - USE OF ACYL-COENZYME A: CHOLESTEROLACYLTRANSFERASE-1 IN DIAGNOSIS AND TREATMENT OF LIVER CANCER

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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26   27  

附图

1 (R26)   2 (R26)   3 (R26)   4 (R26)   5 (R26)   6 (R26)   7 (R26)   8 (R26)  

说明书

发明名称 : 酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶-1在肝癌诊疗中的应用

技术领域

[0001]
本发明属于生物医药领域,涉及一种酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶-1在肝癌诊疗中的应用。

背景技术

[0002]
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范围内的恶性肿瘤之一,有较高的发病率和死亡率,且其发病率有增高的趋势。全世界每年新发和死亡的肝癌患者55%发生在我国,肝癌疾病负担重,5年生存率仅10%左右。肝细胞癌的发生情况是一个多因素,多阶段,复杂的过程,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)慢性感染是重要的高危因素。肿瘤抑制、肝脏切除和移植是现阶段肝癌的主要治疗方法,但约60%到100%的患者会术后复发。即使是小于3cm的小肝癌,有的患者可生存达10年或20年之久,有些则在一年内死亡,数月内复发。因此,在高危人群特别是肝硬化(liver cirrhosis,LC)患者中筛查早期肝癌患者,在早期患者中筛查恶性度较高的患者及时采取治疗措施,可提高肝癌患者的生存率和生活质量。
[0003]
目前临床上常用的肝癌诊断标记物为甲胎蛋白(AFP)。然而,AFP诊断肝癌的敏感度和特异度并不十分理想。索拉菲尼(Sorafenib)是目前广泛用于肝癌治疗的靶向药,但只能有效延长患者3个月的生存期。其诊疗手段十分有限。因此,寻找肝癌早期诊断的标志物,并在此基础上指导有效的靶向治疗对肝癌的有效治疗非常重要。
[0004]
酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)作为细胞内催化游离胆固醇与长链脂肪酸形成胆固醇酯的酶,存在于人体内的所有组织细胞,其合成的胆固醇酯进入细胞内脂滴贮存,维持细胞内的胆固醇、脂肪酸等脂质代谢平衡。胆固醇是细胞脂质代谢中的重要成分。它具有调节胞膜表面的信号传递、组成脂伐等相关功能区域、影响细胞膜流动性等重要作用。SOAT1可能通过胞内及质膜的胆固醇水平影响跨膜的肿瘤相关信号的传递。但尚无应用于肝细胞癌诊疗的报道。
[0005]
发明公开
[0006]
本发明的目的是提供检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统以及检测SOAT1基因含量或表达量的系统含量或表达量的系统的新用途。
[0007]
本发明所提供的检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统以及检测SOAT1基因含量或表达量的系统的新用途具体为在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[0008]
本发明还保护检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统和检测甲胎蛋白含量或活性的系统在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[0009]
本发明还保护检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因含量或表达量的系统和检测甲胎蛋白基因含量或表达量的系统在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[0010]
上述应用中,所述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统包括检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器。
[0011]
所述检测胆固酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因含量或表达量的系统包括检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。
[0012]
所述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因含量或表达量所需的试剂包括:特异性扩增酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)的引物,或特异性检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)的抗体。
[0013]
上述应用中,所述检测甲胎蛋白蛋白含量或活性的系统包括检测甲胎蛋白含量或活性所需的试剂和仪器。
[0014]
在本发明的一个实施例中,检测血清或血浆中甲胎蛋白含量所需的试剂为AFP化学发光法试剂盒,仪器为罗氏全自动电化学发光免疫分析仪。
[0015]
上述应用中,所述检测所采用的样本为健康人或肝硬化(LC)患者或肝癌患者的血(如血液、血清、血浆)或组织(如肝组织)。
[0016]
以血为检测样本时,通常可采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血中SOAT1浓度。
[0017]
以组织为检测样本时,通常可采用免疫组化检测检测组织中SOAT1的表达量。
[0018]
上述应用中,所述产品可为系统,所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、 或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。
[0019]
本发明还保护一种产品。
[0020]
所述产品具有下述至少一种用途:1)筛查或辅助诊断癌症;2)预测癌症预后;3)癌症治疗的伴随诊断。
[0021]
本发明所提供的产品,其包括上述的检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统,或,检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统。
[0022]
检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)浓度或表达量的系统。
[0023]
其中,待测样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物。
[0024]
在本实施例中,所述用于检测SOAT1蛋白浓度的物质为SOAT1蛋白抗体,具体为免疫组化、免疫印迹所用SOAT1抗体(Merck Millipore公司,货号:ABN66)或ELISA所用SOAT1试剂盒(Mybiosource公司,货号:MBS9304160)。当然,也可以为其它类型的抗体或是其他可用于检测SOAT1蛋白浓度的物质。
[0025]
本发明还保护另一种产品。
[0026]
所述产品也具有下述至少一种用途:1)筛查或辅助诊断癌症;2)预测癌症预后;3)癌症治疗的伴随诊断。
[0027]
本发明所提供的产品,其包括上述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)蛋白含量或活性的系统和检测甲胎蛋白含量或活性的系统;
[0028]
或,检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统和检测甲胎蛋白基因含量或表达量的系统。
[0029]
所述产品可为系统;所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。
[0030]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)作为标志物的系统在制备筛查或辅助诊断癌症产品中的应用或在制备预测癌症预后产品中的应用或在制备癌症治疗的伴随诊断产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0031]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)作为标志物的系统和以其联合甲胎蛋白作为标志物的系统在制备筛查或辅助诊断癌症产品中的应用或在制备预测癌症预后产品中的应用或在制备癌症治疗的伴随诊断产品中的应用也同样属于本发明的保护范围。
[0032]
上述应用中,所述产品可为系统;所述系统可包括试剂和/或仪器。所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条。所述试剂盒可为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒或其它。
[0033]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)作为标志物的系统在筛查或辅助诊断癌症中的应用或在预测癌症预后中的应用或在癌症治疗的伴随诊断中的应用也属于本发明的保护范围。
[0034]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)作为标志物的系统和以甲胎蛋白作为标志物的系统在筛查或辅助诊断癌症中的应用或在预测癌症预后中的应用或在癌症治疗的伴随诊断中的应用也同样属于本发明的保护范围。
[0035]
在本发明中,所述产品的筛查或诊断对象是健康人或肝硬化(LC)患者。
[0036]
本发明还保护一种筛查或辅助诊断肝细胞癌或预测肝细胞癌预后或作为癌症治疗的伴随诊断的方法。
[0037]
所述方法包括:检测待测者样本中酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)的含量或表达量,根据所述含量或表达量进行诊断或辅助诊断癌症或预测癌症预后。其中,样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物。
[0038]
本发明还保护另一种筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗的伴随诊断的方法。
[0039]
所述方法包括:检测待测者样本中酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)和甲胎蛋白的含量或表达量,根据所述含量或表达量进行筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗的伴随诊断。
[0040]
其中,样本包括(但不限于)血液、血清、血浆及组织活检物(如肝组织活检物)。
[0041]
所述SOAT1蛋白为人SOAT1蛋白。
[0042]
在上述应用、产品或方法中,所述的癌症包括肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病;如本发明的一个实施例为肝细胞癌。
[0043]
以肝细胞癌为例,实验证明,SOAT1蛋白可作为肝细胞癌(HCC)的肿瘤标志物。基于68对肝癌的转录组数据及包括85个肝癌患者癌及癌旁的组织芯片数据,SOAT1转录本及蛋白丰度在肝癌中的表达显著高于癌旁。在肝癌患者血清中,SOAT1的丰度(均值89.11ng/ml)显著高于健康对照组(均值12.02ng/ml)和肝硬化组(均值4.75ng/ml)(P=0.001)。当以健康人作为筛查对象时,判定为HCC患者的阈值为血清SOAT1蛋白浓度>21.20ng/ml,此时,其灵敏度为65.63%、特异度为84.38%。SOAT1单独作为HCC筛查标志物的曲线下面积(AUC)是0.73,与AFP单独作为HCC筛查标志物的AUC(0.74)接近;当两者联合作为HCC筛查标志物时,AUC可达到0.90,说明SOAT1与AFP有良好的互补性,二者联合诊断可提高HCC的筛查准确率。当以肝硬化患者作为筛查对象时,判定为HCC患者的阈值为血清SOAT1蛋白浓度>12.69ng/ml,此时 敏感度为78.13%,特异性为81.82%,AUC为0.76。说明SOAT1可用于肝细胞癌和肝硬化患者判别诊断的潜在标志物。
[0044]
实验也证明,SOAT1蛋白可作为肝细胞癌(HCC)预后评估的标志物。SOAT1与肝癌的不良预后密切正相关,丰度越高,患者预后越差(P=0.002)。
[0045]
实验还证明,SOAT1的敲低和抑制剂(阿伐麦布)均可显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移。并且对SOAT1丰度较高的肝细胞(PLC/PRF/5)的抑制效果要强于SOAT1丰度较低的细胞系(HepG2),这提示靶向SOAT1可以为SOAT1为标志物筛选的恶性度较高的肝癌亚型提供潜在的精准治疗方式。说明SOAT1作为肝癌筛选和预后评估的标志物首先筛选出恶性度较高的肝癌患者,然后用靶向SOAT1的抑制剂进行精准治疗。SOAT1丰度同时具有筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或作为癌症治疗的伴随诊断的作用。
[0046]
本发明还提供了一种式I所示的阿伐麦布(Avasimibe,其CAS登记号为166518-60-1)的新用途。
[0047]
[0048]
(a)用于制备预防和/或治疗癌症的药物;
[0049]
(b)用于制备预防和/治疗癌症扩散转移的药物;
[0050]
(c)用于制备促进癌细胞凋亡的药物;
[0051]
(d)用于制备抑制癌细胞成癌的药物;
[0052]
(e)用于制备抑制癌细胞体外增殖生长的药物。
[0053]
所述的癌症包括肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病;如本发明的一个实施例为肝细胞癌。
[0054]
所述的癌细胞包括肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞;如本发明的一个实施例为肝癌细胞。
[0055]
所述肝癌细胞具体可为PLC/PRF/5,HepG2,Huh7或MHCC97H。
[0056]
所述宫颈癌细胞具体可为Hela细胞系,结肠癌细胞具体可为HCT116细胞系,非小细胞肺癌细胞具体可为A549细胞系,乳腺癌细胞具体可为MCF7细胞系,食管癌细胞具体可为ECA109细胞系及白血病细胞具体可为Jurkat细胞系。
[0057]
本发明还提供一种抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因表 达和/或蛋白活性的物质的新用途。
[0058]
所述用途选自下述至少一种:
[0059]
(a)用于制备预防和/或治疗癌症的药物;
[0060]
(b)用于制备预防和/治疗癌症扩散转移的药物;
[0061]
(c)用于制备促进癌细胞凋亡的药物;
[0062]
(d)用于制备抑制癌细胞成癌的药物;
[0063]
(e)用于制备抑制癌细胞体外增殖生长的药物。
[0064]
所述的癌症包括肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病;如本发明的一个实施例为肝细胞癌。所述的癌细胞包括肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞;如本发明的一个实施例为肝癌细胞。
[0065]
所述肝癌细胞具体可为PLC/PRF/5、HepG2、Huh7或MHCC97H。
[0066]
所述宫颈癌细胞具体可为Hela细胞系,结肠癌细胞具体可为HCT116细胞系,非小细胞肺癌细胞具体可为A549细胞系,乳腺癌细胞具体可为MCF7细胞系,食管癌细胞具体可为ECA109细胞系及白血病细胞具体可为Jurkat细胞系。
[0067]
抑制物质可以是从蛋白水平的抑制物质,如小分子化合物或抗体,也可以是从基因水平抑制的物质,如干扰RNA、CRSIPR-CAS9系统、同源重组DNA片段或载体等。小分子化合物可以是特异性抑制SOAT1,也可以是非特异性抑制剂SOAT1。
[0068]
所述SOAT1抑制剂具体可选自:阿伐麦布(Avasimibe,其CAS登记号为166518-60-1)、或具有相同效应的阿伐麦布衍生物与类似物、K604、或具有相同效应的K604衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1效应的化合物。
[0069]
所述K604的结构式如式Ⅱ所示,其英文名称为
[0070]
(2-[4-[2-(benzimidazol-2-ylthio)ethyl]piperazin-1yl]-N-[2,4-bis(methylthio)-6-methyl-3-pyridyl]acetamide.)。
[0071]
[0072]
本发明还提供了一种药物组合物,所述的药物组合物包括作为活性成分的抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因表达和/或蛋白活性的物质。
[0073]
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物优选被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,还可与其他治疗剂(如抗肿瘤剂)一起使用(包括之前、之中或之后使用)。使用药物组合物时,是将安全有效量的药物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0074]
所述的药物组合物还可包括额外的抗癌药物。
[0075]
所述的抗癌药物包括化疗药、肿瘤抗体等。
[0076]
所述的抗癌药物(但并不限于):阿霉素、长春新碱、紫杉醇、顺铂、卡铂、5-FU或其组合。
[0077]
所述的药物组合物的给药方式为局部给药或癌内给药。
[0078]
所述药物组合物具有下述至少一种功效:
[0079]
(a)用于预防和/或治疗癌症;
[0080]
(b)用于预防和/或治疗癌症扩散转移;
[0081]
(c)用于促进癌细胞凋亡;
[0082]
(d)用于抑制癌细胞成癌;
[0083]
(e)用于抑制癌细胞体外增殖生长。
[0084]
需要的时候,在上述药物组合物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
[0085]
所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
[0086]
本发明还提供了一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长的方法,包括:
[0087]
(Ⅰ)在添加酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的抑制剂的条件下,培养癌细胞,从而抑制癌细胞的生长;
[0088]
或(I')降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因的表达或降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的蛋白量或蛋白活性。
[0089]
所述的癌细胞包括肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞,如本发明的一个实施例为肝癌细胞。
[0090]
本发明还提供了一种用于治疗癌症的药盒,所述药盒包括组分:
[0091]
(a)第一治疗剂,所述第一治疗剂是抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因表达和/或蛋白活性的物质;在另一优选例中,所述药盒还包括:(b)第二治疗剂,所述第二治疗剂是抗癌药物,所述的抗癌药物含有不同于第一治疗剂的活性成分。
[0092]
本发明提供的药盒用于治疗癌症,所述的癌症包括肝癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病;更佳地为肝癌。所述肝癌包括转移与非转移的肝癌。
[0093]
本发明还提供了一种治疗癌症的方法,包括步骤:给需要的对象施用抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)基因表达和/或蛋白活性的物质,或本发明所述的药物组合物。
[0094]
所述的对象包括哺乳动物,较佳地为人。
[0095]
发明人通过实验证明酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)在肝癌组织明显高表达,其丰度高提示肝癌患者的预后较差。SOAT1抑制剂可在细胞水平有效抑制人肝癌及其它肿瘤细胞的生长,可作为肿瘤尤其肝癌的候选药靶。
[0096]
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

附图说明

[0097]
图1.SOAT1的表达与肝癌的发生及预后密切相关。图1A,基于68对肝癌及配对癌旁的转录组数据及组织芯片(包括95例HCC及85例癌旁样本)数据(图1B),发现SOAT1的转录本及蛋白在肝癌的表达均显著高于其配对癌旁的表达水平(图1B,C)。图1D,对组织芯片中高表达SOAT1及低表达SOAT1患者进行生存分析。结果表明SOAT1蛋白高表达患者总生存期明显低于SOAT1低表达患者。非配对Mann-Whitney检验(图1A,C),log-rank检验(图1D)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
[0098]
图2.为基于质谱法测定25对肝癌及对应癌旁组织中的胆固醇酯含量。图2A,SOAT1在细胞内主要的催化底物CE 18:1的浓度在HCC中的量明显高于配对癌旁组织。采用非配对Mann-Whitney检验。*P<0.05;图2B,SOAT1的催化产物胆固醇酯(6种)在人肝癌(T)里较癌旁组织(NT)的表达差异。结果表 明SOAT1的催化产物胆固醇酯在HCC的量明显高于配对癌旁组织,辅助证明其催化酶SOAT1在肝癌中的表达量明显高于配对癌旁组织。
[0099]
图3.基于ELISA试剂盒测定SOAT1在健康人、肝硬化及肝癌患者血清中的表达。结果表明SOAT1在肝癌患者血清中显著升高(图3A)。提示SOAT1可作为从健康人、肝硬化人群筛选肝癌的诊断标志物。HCC与健康组人群(图3B)及肝硬化人群(图3C)血清SOAT1蛋白水平的ROC曲线分析,结果表明SOAT1可作为从健康人群(AUC=0.77)和肝硬化人群(AUC=0.73)筛查肝癌的潜在标志物,与AFP联合使用后,从健康人及肝硬化人群筛选肝癌的AUC可分别达到0.92和0.90,说明SOAT1与AFP有良好的互补性,可联合用于肝癌筛查。
[0100]
图4.为SOAT1特异敲低可显著抑制肝癌细胞增殖和迁移。结果表明SOAT1shRNA只特异敲低SOAT1,对SOAT2的丰度没有影响(图4A)。图4B,SOAT1在PLC细胞的表达高于HepG2细胞。图4C,SOAT1特异敲低可以显著抑制肝癌细胞的增殖(图4C,D)和迁移(图4E,F),且对SOAT1丰度较高的PLC细胞(图4C,E)的抑制效果显著高于HepG2细胞(图4D,F)。非配对Mann-Whitney检验(图4C-F),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
[0101]
图5.为SOAT1抑制剂Avasimibe对肝癌细胞系增殖及迁移的影响检测。图5A,结果表明Avasimibe对PLC/PRF/5,HepG2,Huh7和MHCC97H的IC50值分别是6.9,11.6,6.8和25.2μM,可显著抑制肝癌细胞系的增殖。图5B,Avasimibe可以显著降低PLC/PRF/5及HepG2肝癌细胞系的迁移。提示用SOAT1筛选出来的恶性度较高的肝癌患者可以靶向SOAT1进行精准治疗。非配对Mann-Whitney检验(图5B)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
[0102]
图6.SOAT1特异抑制剂K604对Huh7、MHCC97H及HepG2肝癌细胞系增殖的影响检测。K604显著抑制肝癌细胞(Huh7及MHCC97H)的增殖。*P<0.05,**P<0.01。
[0103]
图7.为SOAT抑制剂Avasimibe对其他肿瘤细胞系增殖及迁移的影响检测。SOAT抑制剂Avasimibe显著抑制肿瘤细胞(宫颈癌Hela细胞系,结肠癌HCT116细胞系,非小细胞肺癌A549细胞系,乳腺癌MCF7细胞系,食管癌ECA109细胞系及白血病Jurkat细胞系)的增殖。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
[0104]
图8.为SOAT1敲低和抑制剂能显著降低负责胆固醇调控转录因子SREBF2,胞外摄入受体(LDLR)及质膜表面一些已知与肿瘤侵袭相关的受体分子,如整合素(ITGAV,ITGB4)和TGFBR1的表达。
[0105]
实施发明的最佳方式
[0106]
本发明人经过广泛而深入的研究,首次发现抑制SOAT1蛋白的活性可以在细胞水平和动物水平有效地抑制癌细胞(尤其是肝癌细胞)的生长。在此基础上完成了本发明。
[0107]
本发明中的术语:
[0108]
SOAT1
[0109]
如本文所用,术语“SOAT1”、“SOAT1蛋白”或“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白”可以互换使用。抑制SOAT1的活性可以在细胞水平和动物水平有效抑制肝癌的生长,SOAT1可以作为潜在的治疗癌症(如肝癌、晚期肝癌)的药物靶标。
[0110]
本领域的普通技术人员可以使用常规方法对SOAT1蛋白的表达量进行调节,降低SOAT1基因的表达或对SOAT1基因表达进行失活处理(中断失活,敲除,同源重组,干扰RNA等)。
[0111]
降低SOAT1蛋白表达量与活性的方法包括(但不限于):添加SOAT1特异性抑制剂。
[0112]
SOAT1抑制剂
[0113]
如本文所用,术语“SOAT1抑制剂”“SOAT1特异性的抑制剂”“酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的抑制剂”可以互换使用,都是指对酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1具有抑制效果的化合物,如阿伐麦布(Avasimibe),其CAS登记号为166518-60-1、或具有相同效应的阿伐麦布衍生物与类似物、K604、或具有相同效应的K604衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1效应的化合物。
[0114]
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0115]
材料和方法
[0116]
试剂:
[0117]
SOAT1抗体(ABN66)购自Merck Millipore公司;
[0118]
兔二抗(CW0103S)购自北京康为世纪生物科技有限公司;
[0119]
SOAT1抑制剂Avasimibe购自Sigma公司;
[0120]
SOAT1特异抑制剂K604由北京世康合成医药科技有限公司合成(参考文献:Lkenoya M.,Yoshinaka Y.,Kobayashi H.,et al.A selective ACAT-1 inhibitor, K-604,suppresses fatty streak lesions in fat-fed hamsters without affecting plasma cholesterol levels[J].Atherosclerosis,2007,191(2):290-297.);
[0121]
肝癌组织芯片(HLiv-HCC180Sur-05):生存期肝细胞癌95例:癌95例/癌旁85例。手术时间2006.8-2009.11,随访时间2013.9。随访4-7年。购自上海芯超生物科技有限公司;
[0122]
SOAT1ELISA试剂(MBS9304160)购自Mybiosource公司
[0123]
胆固醇酯标准品(CE 18:1)购自Sigma公司;
[0124]
细胞培养基(DMEM)和胎牛血清购自Invitrogen公司;
[0125]
细胞株和组织样本:
[0126]
PLC/PRF/5,HepG2,Huh7购自协和细胞库(中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心);
[0127]
MHCC97H购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所;
[0128]
Hela,HCT116,A549,MCF7,ECA109,Jurkat细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心
[0129]
用于胆固醇酯测定的肝癌和癌旁组织由上海市中山医院提供,取自进行外科手术治疗的肝癌病人,所有病人都签署了知情同意声明。
[0130]
用于血清ELISA测定的75例血清样本均来自于上海市中山医院。其中肝癌血清样本32例,体检正常人血清样本32例,肝硬化血清11例。所有研究对象在抽血前均禁食8h以上,采集空腹静脉血约5ml,室温静置30min后以3000r/min离心10min,收集血清,-20℃冻存用于SOAT1浓度监测。
[0131]
方法:
[0132]
一、68对肝癌及癌旁的转录组数据
[0133]
肝组织样本采用TRIzol试剂盒提取总RNA。用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片断成为短片段,再以片断后的mRNA为模板,用六碱基随机引物(random hexamers)合成cDNA第一链,并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链,经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A,加测序接头,再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段,并进行PCR扩增,从而完成整个文库制备工作,构建好的文库用Illumina HiSeq2500进行测序。整个实验过程由由诺禾致源公司负责并产出数据。
[0134]
二、通过免疫组化检测SOAT1在95例HCC及85例癌旁样本的表达差异:
[0135]
1)烘片:将组织芯片放入烘箱中,温度调至63度,烘蜡一小时。
[0136]
2)脱蜡:片子烘烤完成后,从烘箱内取出,放入全自动染色机中,进行脱蜡;脱蜡过程如下:
[0137]
二甲苯两缸,每缸15分钟(按仪器设置时间);
[0138]
无水乙醇两缸,每缸7分钟(按仪器设置时间);
[0139]
90%酒精1缸,5分钟(按仪器设置时间);
[0140]
80%酒精1缸,5分钟(按仪器设置时间);
[0141]
3)70%酒精1缸,5分钟(按仪器设置时间);
[0142]
4)抗原修复:从染色机中取出片子,用纯水冲洗3次,每次不少于1分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液或者EDTA修复液放至电磁炉上开始加热;
[0143]
5)阻断:使用商品化的即用阻断剂,将阻断剂滴在片子上,计时10-15分钟。
[0144]
6)按1:2000加入SOAT1一抗(即SOAT1抗体):取出片子,用PBS缓冲液冲洗3次,一次1分钟;冰箱中取出一抗,放入离心机里7200转离心不少于30秒;取出一抗,按1:2000抗体稀释液稀释滴加一抗,室温孵育,计时30分钟;
[0145]
7)加兔二抗:将片子用PBS缓冲液冲洗3次,一次1分钟;滴加二抗即用工作液,室温孵育,计时30分钟;时间到后用PBS冲洗3次,每次不少于1分钟。
[0146]
8)DAB显色:从冰箱里取出DAB试剂盒,按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制;在片子上滴加稀释后的DAB,观察显色强度,最长显色5分钟,到时后自来水冲洗5分钟。
[0147]
苏木素复染、封片:在片子上滴加哈氏苏木素(SIGMA)1分钟,时间到后在0.25%的盐酸酒精中浸没不少于2秒,用自来水冲洗大于2分钟,室温晾干后封片。
[0148]
三、基于ESI-MS检测25对肝癌及癌旁组织的胆固醇酯含量
[0149]
1)样本处理:组织非极性脂质代谢组前处理:称取100mg左右组织,匀浆,加入1ml氯仿:甲醇=3:1(v/v),超声提取1h。4℃13200r/min,离心10min,取下层氯仿200ul,离心冷冻浓缩干燥。用400ul异丙醇和乙腈混合液(1:1,v/v)复溶。液质进样检测。
[0150]
2)色谱分离:采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱使用反相色谱组织样本进行分析。色谱柱:waters UPLC CSH C18(1.7um 2.1mm*100mm);流动相:A(乙腈/水4:6,0.1%甲酸,10mM乙酸铵)和B(乙腈/异丙醇9:1,v/v,0.1%甲酸,10mM乙酸铵);流速:0.3ml/min;进样量为1.0μL;柱温:45℃。
[0151]
3)质谱分析采用装备了热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱仪(Q Exactive TM)。正负离子离子源电压分别为3.7kv和3.5kV。毛细管加热温度320℃。翘气压力30psi,辅助气压力10psi。容积加热蒸发温度300℃。翘气和辅助气均 为氮气。碰撞气为氮气,压力为1.5mTorr。一级全扫描参数为:分辨率70000,自动增益控制目标为1×10 6,最大隔离时间50ms,质荷比扫描范围150–1500。质谱质量轴校准采用外标法,质量误差为5ppm。校准质量正离子选择74.09643,83.06037,195.08465,262.63612,524.26496和1022.00341。负离子选择91.00368,96.96010,112.98559,265.14790,514.28440和1080.00999。代谢物鉴定采用dd-MS2扫描模式(数据依赖扫描模式)。具体参数为:分辨率17500,自动增益控制目标为1×10 5,最大隔离时间50ms,最大10个离子扫描二级碎片,动态排除。质量分离窗口2,碰撞能30v。强度限定1×10 5。液质系统由Xcalibur 2.2SP1.48软件控制,数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。
[0152]
4)代谢组数据处理:采用Progenesis QI软件处理,依次为导入原始数据、峰对齐、峰提取、归一化处理,最终形成保留时间、质荷比和峰强度的表格。反相色谱和亲水色谱提取峰的时间依次为0.5至19和0.5至9分钟。峰提取的强度限定为模式5。各种添加剂离子如加氢和加钠等均去卷积到每一个离子特征。代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级分子量匹配。为了评价样品采集过程中系统的稳定性和重复性,我们使用质控样本。质控样本是所有样本均移取固定体积混合均匀后得到的。指控样本的前处理方法和其他样品一样。为了得到可信赖的且可重复性的代谢物,本次实验首先采用5个空白样本平衡色谱柱,再采用3个质控样本平衡柱条件。然后每间隔6-8个样本插入1个质控样本用于监测整个液质系统的稳定性和重复性。同时计算质控样本中提取的代谢特征的变异系数值,变异系数超过15%的代谢特征被删除。本实验中,CE 18:1标准品作为外标用于评估样本中胆固醇酯的绝对浓度。
[0153]
四、采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中SOAT1浓度
[0154]
采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清样品中SOAT1的浓度,每组血清样本设置3个重复,使用多功能酶标仪中检测OD值,以3个重复的均值作为此组样本的最终OD值。分别比较肝癌组与正常组及肝硬化组的SOAT1表达水平。五、检测血清中AFP浓度
[0155]
使用罗氏全自动电化学发光免疫分析仪,利用AFP化学发光法试剂盒检测,详细步骤参照仪器说明书。
[0156]
六、SOAT1敲低
[0157]
敲低用载体:pLKO.1-TRC;shRNA的序列:5'-CCGGTGGTCCATGACTGGCTATATTCTCGAGAATATAGCCAGTCATGGACCATTtTTTG-3'(序列表序列1所示)。
[0158]
1)第一天,接种PLC/PRF/5或HepG2细胞于6孔板。
[0159]
2)第二天,细胞融合度约40-50%,加入SOAT1-sh或SOAT1-对照慢病毒200μl/孔,进行病毒感染。
[0160]
3)第三天,感染病毒的PLC/PRF/5或HepG2细胞,加入嘌呤霉素(puromycin)至终浓度2μg/ml进行筛选。
[0161]
4)第六天,按照常规方法收集细胞一部分做CCK8实验,一部分裂解蛋白做Western bolt检测。
[0162]
七、CCK8实验
[0163]
1)第一天,60mm培养皿中细胞常规胰酶消化计数后,5000个细胞/孔,接种4个96孔板。
[0164]
2)第二天,大约培养24小时后,细胞生长处于对数期,更换新的加入不同浓度SOAT1抑制剂的培养液,100μl/孔,分别设10μM 20μM浓度组及对照组,对照组为1‰的DMSO,每组设3个重复孔。取一个96孔板加入10%的CCK8,100μl/孔,1小时后450nm波长测0小时的OD值,无细胞孔为空白背景。
[0165]
3)第三天,取一个96孔板加入10%CCK8,1小时后450nm波长测24小时的OD值。
[0166]
4)第四天,取一个96孔板加入10%CCK8,1小时后450nm波长测48小时的OD值。
[0167]
5)第五天,最后一个96孔板加入10%CCK8,1小时后450nm波长测72小时的OD值。
[0168]
6)汇总所有时间点OD值,绘制生长曲线。
[0169]
八、细胞迁移实验
[0170]
第一天:
[0171]
(1)饥饿细胞:撤全培养基,PBS洗2遍,更换为无血清的DMEM。
[0172]
(2)Transwell下室加入2.5%血清的DMEM,600ul/孔。37℃培养箱中平衡过夜。Transwell小室为corning公司的3422。
[0173]
第二天:
[0174]
(3)昨天饥饿的细胞,加入胰酶消化(室温约30-50秒),迅速小心将胰酶吸干净,加入全培养基1ml,1.5ml离心管收集;
[0175]
(4)4min,800rpm离心;弃上清,加入无血清DMEM,洗一遍;再次4min,800rpm离心;弃上清,加入0.5%FBS的DMEM;
[0176]
(5)细胞计数,用含Avsimibe的0.5%的DMEM调整细胞浓度,约400000细胞/ml,Avasimibe浓度10μM;对照组不含Avasimibe,其余同。100μl/孔加入tanswell上室。
[0177]
第三天(20-24小时后):
[0178]
(6)弃培养液;
[0179]
(7)无水甲醇固定20分钟;
[0180]
(8)膜风干;
[0181]
(9)捏平棉签棉花,旋转擦净上室细胞,用棉球裹在镊子上轻轻擦去边缘细胞。
[0182]
(10)0.5%结晶紫染色;
[0183]
(11)清水缓慢冲洗;
[0184]
(12)倒置显微镜下观察拍照。
[0185]
九、免疫印迹检测用常规方法即可。
[0186]
十、统计分析
[0187]
所有分析均使用GraphPad Prism软件完成。P<0.05认为有显著性差异。
[0188]
实施例1、SOAT1在肝癌的高表达与肝癌的发生及预后密切相关
[0189]
为了证实SOAT1在肝癌高表达的现象,发明人比较了68对肝癌及配对癌旁的转录组数据(图1A)及组织芯片(包括95例HCC及85例癌旁样本)的癌及癌旁数据(图1B,C),发现SOAT1在HCC明显高表达,SOAT1高表达患者总生存期明显低于SOAT1低表达患者(图1D)。
[0190]
实施例2、SOAT1的催化产物胆固醇酯在人肝癌组织明显高表达
[0191]
为了证实SOAT1在肝癌高表达的现象,发明人利用质谱法测定25对肝癌及对应癌旁组织中的SOAT1催化产物胆固醇酯含量。结果显示,SOAT1在细胞内主要的催化底物胆固醇酯标准品(CE 18:1)的浓度在HCC中的量明显高于配对癌旁组织(图2A);SOAT1的催化产物胆固醇酯(6种)在人肝癌(T)里较癌旁组织(NT)的表达差异(图2B)。进一步辅助证明其催化酶SOAT1在肝癌中的表达量明显高于配对癌旁组织。
[0192]
实施例3、SOAT1在肝癌血清样本中显著升高
[0193]
为了证实SOAT1在肝癌高表达的现象,发明人利用人血清样本基于ELISA试剂盒检测SOAT1在不同人群的表达(图3)。
[0194]
SOAT1蛋白表达水平在正常组、肝硬化患者组、肝癌患者组的血清样本中的ELISA检测结果:正常组SOAT1蛋白的浓度平均值为12.02ng/ml,肝硬化患者组为4.75ng/ml,肝癌患者组为89.11ng/ml。对各组样本中SOAT1蛋白含量进行统计学分析(非配对Mann-Whitney检验),发现血清SOAT1蛋白在正 常组和肝癌患者组(p<0.001)以及肝硬化患者组和肝癌患者组(p<0.001)均有显著性差异(图3A)。提示SOAT1可作为从健康人、肝硬化人群筛选肝癌的诊断标志物。
[0195]
以正常组为对照组,肝癌患者组为疾病组,对血清中SOAT1蛋白水平进行ROC曲线分析(如图3B所示),曲线下面积AUC=0.77,灵敏度为66.7%、特异度为100%。
[0196]
以肝硬化患者为对照组,肝癌患者组为疾病组,对血清中SOAT1蛋白水平进行ROC曲线分析(如图3C所示),曲线下面积AUC=0.73,灵敏度为66.7%、特异度为100%。结果表明SOAT1可作为从健康及肝硬化人群筛查肝癌的潜在标志物。
[0197]
进行正常人和HCC患者的判别诊断时,若待测人血清中SOAT1蛋白浓度大于37.4ng/ml(表1,该浓度为约登指数最大时对应的浓度值。灵敏度为66.7%、特异度为100%),则该待测人为或候选为HCC患者。
[0198]
进行肝硬化患者和HCC患者的判别诊断时,若待测人血清中SOAT1蛋白浓度大于28.7ng/ml(表2,该浓度为约登指数最大时对应的浓度值。敏感度为66.7%,特异性为81.82%),则该待测人为或候选为HCC患者。
[0199]
上述两个判别诊断的浓度阈值为ROC曲线的最大约登指数对应的阈值,正常人/肝硬化患者和HCC患者的判别诊断的约登指数及对应阈值详见表1及表2(最大约登指数及对应阈值粗体标注)。
[0200]
表1以正常组为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数
[0201]
[0202]
[0203]
表2以肝硬化组为对照组的阈值、灵敏度、特异度及约登指数
[0204]
[0205]
实施例4、SOAT1蛋白和AFP蛋白在检测HCC患者中的应用
[0206]
正常组AFP蛋白的血清浓度均小于20ng/ml,肝硬化患者组为6.34ng/ml,HCC患者组为375.5ng/ml。SOAT1蛋白浓度在正常组、LC患者组、HCC患者组的血清样本中的ELISA检测结果:正常组SOAT1蛋白的浓度平均值为12.02ng/ml,肝硬化患者组为4.75ng/ml,肝癌患者组为89.11ng/ml。对各组样本中SOAT1蛋白和AFP蛋白浓度进行统计学分析(非配对Mann-Whitney检验),发现血清SOAT1蛋白和AFP蛋白浓度在正常组和HCC患者组(P<0.001)以及肝硬化患者组和HCC患者组(P<0.001)均有显著性差异。
[0207]
共同判断SOAT1蛋白和AFP蛋白的标准依据二元Logistic回归计算结果,区分HCC与正常组具体计算公式为:P=1/(1+e- (-4.585+0.407*AFP+0.082*SOAT1)),当P 大于0.57时,判断为HCC;区分HCC与LC的计算公式为:P=1/(1+e- (-1.945+0.077*AFP+0.068*SOAT1)),当P大于0.67时,判断为HCC。
[0208]
用SPSS 19.0软件分别对正常人(N)和肝细胞癌患者(HCC)、肝硬化(LC)和肝细胞癌患者(HCC)进行AFP与SOAT1联合使用诊断HCC的ROC曲线分析。
[0209]
以正常组为对照组,HCC患者组为疾病组,血清SOAT1蛋白与AFP蛋白联合使用判别诊断HCC患者的曲线下面积AUC=0.92(如图3B所示),灵敏度为88.9%、特异度为100%;以LC患者组为对照组,HCC患者组为疾病组(如图3C所示),两者联合使用判别诊断HCC患者的AUC=0.90,灵敏度为83.3%、特异度为100%。
[0210]
由上述结果可知,血清中SOAT1蛋白和AFP蛋白可用作正常人与HCC患者、以及LC与HCC患者进行判别诊断的潜在标志物。
[0211]
上述结果汇总于表3和表4,展示了SOAT1蛋白、AFP蛋白及其联合应用用于肝细胞癌患者与正常人或LC患者鉴别诊断的效果。
[0212]
表3 SOAT1蛋白和AFP蛋白判别诊断正常人和肝细胞癌患者效果比较(SOAT1或SOAT1与AFP联合使用效果优于AFP)
[0213]
[0214]
表4 SOAT1蛋白和AFP蛋白判别诊断肝硬化和肝细胞癌患者效果比较(SOAT1或SOAT1与AFP联合使用效果优于AFP)
[0215]
[0216]
由上述结果可知,SOAT1与AFP有良好的互补性,可联合用于肝癌筛查。
[0217]
实施例5、SOAT1敲低能抑制肝癌细胞的增殖和迁移
[0218]
在本实施例中,发明人研究了SOAT1特异敲低对肝癌细胞增殖和迁移的抑 制作用。结果表明SOAT1shRNA只特异敲低SOAT1,对SOAT2的丰度没有影响(图4A)。SOAT1特异敲低可以显著抑制肝癌细胞的增殖(图4C,D)和迁移(图4E,F),提示SOAT1可能作为肝癌治疗的一个靶点。
[0219]
实施例6、SOAT1抑制剂Avasimibe能抑制肝癌细胞的生长
[0220]
在本实施例中,发明人研究了SOAT1抑制剂在抑制肝癌细胞生长中的作用。结果表明SOAT1非特异抑制剂Avasimibe可显著抑制肝癌细胞(PLC/PRF/5,HepG2,Huh7和MHCC97H)的增殖(图5A)和迁移(图5B)。提示用SOAT1筛选出来的恶性度较高的肝癌患者可以靶向SOAT1进行精准治疗。
[0221]
实施例7、SOAT1抑制剂K604能抑制肝癌细胞的生长
[0222]
在本实施例中,发明人研究了SOAT1抑制剂K604在抑制肝癌细胞生长中的作用。结果表明SOAT1特异抑制剂K604可显著抑制肝癌细胞(Huh7及MHCC97H)的增殖(图6)。
[0223]
实施例8、SOAT1抑制剂Avasimibe能抑制癌症细胞的生长
[0224]
在本实施例中,发明人研究了SOAT1抑制剂在常见癌症细胞生长中的作用。
[0225]
结果表明SOAT1抑制剂Avasimibe显著抑制常见癌症细胞系(宫颈癌Hela细胞系,结肠癌HCT116细胞系,非小细胞肺癌A549细胞系,乳腺癌MCF7细胞系,食管癌ECA109细胞系及白血病Jurkat细胞系)的增殖(图7)。说明Avasimibe可明显抑制癌症细胞系的增殖,可能作为癌症治疗的一个药物。
[0226]
实施例9、SOAT1敲低及阿伐麦布处理抑制肝癌发生发展的机制
[0227]
SOAT1敲低和抑制剂(阿伐麦布)能显著抑制负责胆固醇调控转录因子SREBF2,胞外摄入受体(LDLR)及质膜表面一些已知与肿瘤侵袭相关的受体分子,如整合素(ITGAV,ITGB4)和TGFBR1的表达(图8)。
[0228]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
[0229]
工业应用
[0230]
发明人通过实验证明酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1(SOAT1)在肝癌组织明显高表达,其丰度高提示肝癌患者的预后较差。SOAT1抑制剂可在细胞水平有效抑制人肝癌及其它肿瘤细胞的生长,可作为肿瘤尤其肝癌的候选药靶。

权利要求书

[权利要求 1]
检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白含量或活性的系统或检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[权利要求 2]
检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白含量或活性的系统和检测甲胎蛋白含量或活性的系统,或检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统和检测甲胎蛋白基因含量或表达量的系统,在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[权利要求 3]
根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白含量或活性的系统包括检测胆酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白含量或活性所需的试剂和/或仪器; 所述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统包括检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量所需的试剂和/或仪器。
[权利要求 4]
根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量所需的试剂包括:特异性扩增酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的引物,或特异性检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的抗体。
[权利要求 5]
根据权利要求1-4中任一项所述的应用,其特征在于:所述检测所采用的样本为健康人或肝硬化患者或肝癌患者的血或组织; 所述系统包括试剂和/或仪器;所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条;所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒或ELISA试剂盒或免疫组化试剂盒或其它。
[权利要求 6]
根据权利要求1-5中任一项所述的应用,其特征在于:所述检测甲胎蛋白蛋白含量或活性的系统包括检测甲胎蛋白含量或活性所需的试剂和仪器; 所述检测甲胎蛋白蛋白级基因含量或表达量的系统包括检测甲胎蛋白基因含量或表达量所需的试剂和仪器。
[权利要求 7]
一种产品,包括权利要求1或权利要求3-5中任一项所述的检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1蛋白含量或活性的系统或检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统; 或者,包括权利要求1、3-5中任一项所述的检测酰基辅酶A:胆固醇酰基 转移酶-1蛋白含量或活性的系统和权利要求2-6中任一项所述的检测甲胎蛋白蛋白含量或表达量的系统; 或者,包括权利要求1、3-5中任一项所述的检测酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因含量或表达量的系统和权利要求2-6中任一项所述的检测甲胎蛋白基因含量或表达量的系统; 所述产品具有下述至少一种用途:1)筛查或辅助诊断癌症;2)预测癌症预后;3)癌症治疗的伴随诊断。
[权利要求 8]
根据权利要求7所述的产品,其特征在于:所述产品为系统;所述系统包括试剂和/或仪器;所述试剂包括芯片、制剂、试剂盒或核酸膜条;所述试剂盒为荧光定量PCR试剂盒、或ELISA试剂盒、或免疫组化试剂盒,或其它。
[权利要求 9]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1作为标志物的系统在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[权利要求 10]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1作为标志物的系统和以甲胎蛋白作为标志物的系统在下述至少一方面的应用:1)制备筛查或辅助诊断癌症的产品;2)制备预测癌症预后的产品;3)制备癌症治疗的伴随诊断产品。
[权利要求 11]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1作为标志物的系统在下述至少一方面的应用:1)在筛查或辅助诊断癌症中的应用;2)在预测癌症预后中的应用;3)在癌症治疗的伴随诊断中的应用。
[权利要求 12]
以酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1作为标志物的系统和以甲胎蛋白作为标志物的系统在下述至少一方面的应用:1)在筛查或辅助诊断癌症中的应用;2)在预测癌症预后中的应用;3)在癌症治疗的伴随诊断中的应用。
[权利要求 13]
一种筛查或辅助诊断肝细胞癌或预测肝细胞癌预后的方法,包括:检测待测者样本中酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的含量或表达量,根据所述含量或表达量进行诊断或辅助诊断癌症或预测癌症预后或进行癌症治疗的伴随诊断。
[权利要求 14]
一种筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后的方法,包括:检测待测者样本中酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1和甲胎蛋白的含量或表达量,根据所述含量或表达量进行筛查或辅助诊断癌症或预测癌症预后或进行癌症治疗的伴随诊断。
[权利要求 15]
根据权利要求13或14所述的方法,其特征在于:所述待测者的样本为健康人或肝硬化患者或肝癌患者的血或组织。
[权利要求 16]
根据权利要求1-6、9-12中任一项所述的应用或权利要求7或8所述的产品或权力要求13-15任一项所述的方法,其特征在于:所述的癌症包括肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、白血病。
[权利要求 17]
一种抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因表达和/或蛋白活性的物质的用途,其特征在于:所述用途选自下述至少一种: (a)用于制备预防和/或治疗癌症的药物; (b)用于制备预防和/或治疗癌症扩散转移的药物; (c)用于制备促进癌细胞凋亡的药物; (d)用于制备抑制癌细胞成癌的药物; (e)用于制备抑制癌细胞体外增殖生长的药物。
[权利要求 18]
根据权利要求17所述的应用,其特征在于:所述癌症包括下述至少一种:肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌和白血病; 所述癌细胞包括下述至少一种:肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞和白血病细胞;优选为肝癌细胞。
[权利要求 19]
根据权利要求17或18所述的应用,其特征在于:所述抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因表达和/或蛋白活性的物质为酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1抑制剂。
[权利要求 20]
根据权利要求19所述的应用,其特征在于:所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1抑制剂选自下述至少一种:阿伐麦布、或具有相同效应的阿伐麦布衍生物与类似物、K604、或具有相同效应的K604衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1效应的化合物; 所述阿伐麦布的CAS登记号为166518-60-1; 所述K604的结构式如式I所示:
[权利要求 21]
一种药物组合物,其包括作为活性成分的抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因表达和/或蛋白活性的物质; 所述药物组合物具有下述至少一种功效: (a)用于预防和/或治疗癌症; (b)用于预防和/或治疗癌症扩散转移; (c)用于促进癌细胞凋亡; (d)用于抑制癌细胞成癌; (e)用于抑制癌细胞体外增殖生长。
[权利要求 22]
根据权利要求21所述的药物组合物,其特征在于:所述癌症包括下述至少一种:肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌和白血病; 所述癌细胞包括下述至少一种:肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞和白血病细胞。
[权利要求 23]
根据权利要求21或22所述的药物组合物,其特征在于:所述抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因表达和/或蛋白活性的物质为酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1抑制剂。
[权利要求 24]
根据权利要求23所述的药物组合物,其特征在于:所述酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1抑制剂选自下述至少一种:阿伐麦布、或具有相同效应的阿伐麦布衍生物与类似物、K604、或具有相同效应的K604衍生物与类似物、或同样具有抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1效应的化合物; 所述阿伐麦布的CAS登记号为166518-60-1; 所述K604的结构式同权利要求19中所述式I。
[权利要求 25]
一种体外非治疗性的抑制癌细胞生长的方法,包括: (Ⅰ)在添加酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的抑制剂的条件下,培养癌细胞,从而抑制癌细胞的生长; 或(I')降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因的表达或降低酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的蛋白量或蛋白活性。
[权利要求 26]
一种治疗癌症的方法,包括步骤:给需要的对象施用权利要求17-20中任一项所述的抑制酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1基因表达和/或蛋白活性的物质,或权利要求21-24中任一项所述的药物组合物。
[权利要求 27]
根据权利要求25或26所述的方法,其特征在于:所述癌症包括下述至少一种:肝细胞癌、宫颈癌、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌和白血病; 所述癌细胞包括下述至少一种:肝癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、乳腺癌细胞、食管癌细胞和白血病细胞。

附图

[ 图 1]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 2]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 3]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 4]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 5]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 6]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 7]   [根据细则26改正 16.04.2019] 
[ 图 8]   [根据细则26改正 16.04.2019]