Processing

Please wait...

Settings

Settings

Goto Application

1. WO2020108636 - FULLY HUMANIZED ANTI-GITR ANTIBODY AND PREPARATION METHOD THEREFOR

Document

说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076   0077   0078   0079   0080   0081   0082   0083   0084   0085   0086   0087   0088   0089   0090   0091   0092   0093   0094   0095   0096   0097   0098   0099   0100   0101   0102   0103   0104   0105   0106   0107   0108   0109   0110   0111   0112   0113   0114   0115   0116   0117   0118   0119   0120   0121   0122   0123   0124   0125   0126   0127   0128   0129   0130   0131   0132   0133   0134   0135   0136   0137   0138   0139   0140   0141   0142   0143   0144   0145   0146   0147   0148   0149   0150   0151   0152   0153   0154   0155   0156   0157   0158   0159   0160   0161   0162   0163   0164   0165   0166   0167   0168   0169   0170   0171   0172   0173   0174   0175   0176   0177   0178   0179   0180   0181   0182   0183   0184   0185   0186   0187   0188   0189   0190   0191   0192   0193   0194   0195   0196   0197   0198   0199   0200   0201   0202   0203   0204   0205   0206   0207   0208   0209   0210   0211   0212   0213   0214   0215   0216   0217   0218   0219   0220   0221   0222   0223   0224   0225   0226   0227   0228   0229   0230   0231   0232   0233   0234   0235   0236   0237   0238   0239   0240   0241   0242   0243   0244   0245   0246   0247   0248   0249   0250   0251   0252   0253   0254   0255   0256   0257   0258   0259   0260   0261   0262   0263   0264   0265   0266   0267   0268   0269   0270   0271   0272   0273   0274   0275   0276   0277   0278   0279   0280   0281   0282   0283   0284   0285   0286   0287   0288   0289   0290   0291   0292   0293   0294   0295   0296   0297   0298   0299   0300   0301   0302   0303   0304   0305   0306   0307   0308   0309   0310   0311   0312   0313   0314   0315   0316   0317   0318   0319   0320   0321   0322   0323   0324   0325   0326   0327   0328   0329   0330   0331   0332   0333   0334   0335   0336   0337   0338   0339   0340   0341   0342   0343   0344   0345   0346   0347   0348   0349   0350   0351   0352   0353   0354   0355   0356   0357   0358   0359   0360   0361   0362   0363   0364   0365   0366   0367   0368   0369   0370   0371   0372   0373   0374   0375   0376   0377   0378   0379   0380   0381   0382   0383   0384   0385   0386   0387   0388   0389   0390   0391   0392   0393   0394   0395   0396   0397   0398   0399   0400   0401   0402   0403   0404   0405   0406   0407   0408   0409   0410   0411   0412   0413   0414   0415   0416   0417   0418   0419   0420   0421   0422   0423   0424   0425   0426   0427   0428   0429   0430   0431   0432   0433   0434   0435   0436   0437   0438   0439   0440   0441   0442   0443   0444   0445   0446   0447   0448   0449   0450   0451   0452   0453   0454   0455   0456   0457   0458   0459   0460   0461   0462   0463   0464   0465   0466   0467   0468   0469   0470   0471   0472   0473   0474   0475   0476   0477   0478   0479   0480   0481   0482   0483   0484   0485   0486   0487   0488   0489   0490   0491   0492   0493   0494   0495   0496   0497   0498   0499   0500   0501   0502   0503   0504   0505   0506   0507   0508   0509   0510   0511   0512   0513   0514   0515   0516   0517   0518   0519   0520   0521   0522   0523   0524   0525   0526   0527   0528   0529   0530   0531   0532   0533   0534   0535   0536   0537   0538   0539   0540   0541   0542   0543   0544   0545   0546   0547   0548   0549   0550   0551   0552   0553   0554   0555   0556   0557   0558   0559   0560   0561   0562   0563   0564  

权利要求书

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17  

附图

1   2   2(续)   3   4   5   5(续)   6   7   8   8(续)   9   9(续)   10   11   12  

说明书

发明名称 : 全人抗GITR抗体及其制备方法

技术领域

[0001]
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种GITR抗体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002]
免疫检查点是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路,通过调节外周组织中免疫反应的持续性和强度避免组织损伤,并参与维持对于自身抗原的耐受。免疫检查点疗法就是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径以调节T细胞活性来提高肿瘤免疫反应的治疗方法。靶向阻断免疫检查点疗法目前正逐渐成为抗肿瘤免疫的有效策略之一。
[0003]
免疫检查点蛋白/抗体抑制剂具有治疗各种肿瘤类型(如转移性黑素瘤,肺癌,乳腺癌,肾细胞癌等)的潜力。在过去数年中,靶向免疫检查点分子治疗方面取得了重大的突破,展现出巨大的临床应用价值。作为一类免疫抑制分子,免疫检查点分子能够通过调节免疫反应的强度和广度,从而避免正常组织的损伤和破坏,在肿瘤等多种疾病的发生、发展过程中发挥着关键作用。通过阻断免疫检查点分子的作用以解除肿瘤患者体内的免疫抑制,是靶向免疫检查点分子治疗肿瘤的基本思路。目前研究和应用最热门的免疫检查点分子是CTLA-4和PD-1/PD-L1。而针对新的作用靶点GITR研究较少。
[0004]
肿瘤坏死因子超家族受体糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)属同源二聚体跨膜糖蛋白,分子量为70KD,其胞外结构域富含半胱氨酸,是一种能够增强细胞和体液免疫的刺激免疫调节受体。GITR表达于各种免疫细胞亚群,包括T细胞,自然杀死细胞,B细胞和调节性T细胞,其中在调节性T细胞(Tregs)上的表达量最高。恶性肿瘤环境中存在多种类型的免疫抑制性细胞,目前认为Tregs在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用。研究表明Tregs功能降低和/或搬运减少可以提高神经胶质瘤的临床前模型的存活率。因此,以Treg及免疫抑制性分子作为靶点,清除Treg,控制Treg的数量和功能,增强机体对肿瘤的免疫应答,为肿瘤免疫治疗提供了新的思路。另有研究表明,人源化抗GITR抗体具有提高 和肿瘤浸润T细胞增殖的功能,降低Tregs诱导和抑制的功能,参与触发NF-κB在调节性T细胞和效应T细胞中的磷酸化。
[0005]
GITR在免疫应答中发挥的关键作用使其逐渐成为免疫疗法中极具吸引力的靶标,其作用包括诱导或增强针对所需肿瘤抗原或致病抗原(如病毒及其他致病生物)的免疫应答。GITR的生物学功能使其成为用于治疗多种癌症的潜在靶标,因此GITR具有激活免疫系统的功能。因此,抗GITR抗体在治疗各种癌症和感染性疾病中具有良好效用。
[0006]
基于目前GITR抗体在研数量很少,急需开发出活性更好、适应症广和产量高的GITR抗体,进一步以提高治疗和检测效果。
[0007]
发明内容
[0008]
为了开发活性好、适应症广和产量高的GITR抗体,本发明提供一种亲和力高、特异性强的GITR抗体及其制备方法。
[0009]
在本发明的第一方面,提供了一种抗体的重链可变区,所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
[0010]
SEQ ID NO:8n+2所示的VH-CDR1,
[0011]
SEQ ID NO:8n+3所示的VH-CDR2,和
[0012]
SEQ ID NO:8n+4所示的VH-CDR3;
[0013]
其中,各n独立地为0、1、2或3;
[0014]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0015]
在另一优选例中,所述VH-CDR3为SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
[0016]
在另一优选例中,所述VH-CDR3为SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
[0017]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:8n+1所示的氨基酸序列,其中,n为0、1、2或3。
[0018]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:1的第84位丝氨酸S突变成天门冬酰氨N,第86位缬氨酸V突变成亮氨酸L和第88位脯氨酸P突变成丙氨酸A。
[0019]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:1的第84位丝氨酸S突变成天门冬酰氨N,第86位缬氨酸V突变成亮氨酸L,第88位脯氨酸P突变成丙氨酸A和第103位天门冬氨酸D突变成谷氨酸E。
[0020]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:1的第84位丝氨酸S突变成天门冬酰氨N,第86位缬氨酸V突变成亮氨酸L,第88位脯氨酸P突变成丙氨酸A和第104位甘氨酸G突变成丙氨酸A。
[0021]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:25的第85位天门冬酰氨N突变成丝氨酸S。
[0022]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
[0023]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
[0024]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。
[0025]
在另一优选例中,所述重链可变区具有SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
[0026]
在本发明的第二方面,提供了一种抗体的重链,所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区。
[0027]
在另一优选例中,所述重链还包括重链恒定区。
[0028]
在另一优选例中,所述重链恒定区为人源或鼠源的。
[0029]
在本发明的第三方面,提供了一种抗体的轻链可变区,所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
[0030]
SEQ ID NO:8n+6所示的VL-CDR1,
[0031]
SEQ ID NO:8n+7所示的VL-CDR2,和
[0032]
SEQ ID NO:8n+8所示的VL-CDR3;
[0033]
其中,各n独立地为0、1、2或3;
[0034]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0035]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8n+5所示的氨基酸序列,其中,n为0、1、2或3。
[0036]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:13的第87位半胱氨酸C突变成酪氨酸Y。
[0037]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:21的第87位半胱氨酸C突变成酪氨酸Y。
[0038]
在另一优选例中,所述取代为SEQ ID NO:29的第42位苏氨酸T突变成赖氨酸K和第87位半胱氨酸C突变成酪氨酸Y。
[0039]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
[0040]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
[0041]
在另一优选例中,所述轻链可变区具有SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
[0042]
在本发明的第四方面,提供了一种抗体的轻链,所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区。
[0043]
在另一优选例中,所述轻链还包括轻链恒定区。
[0044]
在另一优选例中,所述轻链恒定区为人源或鼠源的。
[0045]
在本发明的第五方面,提供了一种抗体,所述抗体具有:
[0046]
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区;和/或
[0047]
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区;
[0048]
或者,所述抗体具有:如本发明的第二方面所述的重链;和/或如本发明的第四方面所述的轻链,
[0049]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0050]
在另一优选例中,上述任一CDR的氨基酸序列中包含经过添加、缺失、修饰和/或取代1、2或3个氨基酸的衍生CDR序列,并且使得含有所述衍生CDR序列的VH和VL所构成的衍生抗体能够保留与GITR结合的亲和力。
[0051]
在另一优选例中,所述的衍生抗体与GITR结合的亲和力F1与相应非衍生的抗 体与GITR结合的亲和力F0之比(F1/F0)为0.5-2,较佳地为0.7-1.5,和更佳地0.8-1.2。
[0052]
在另一优选例中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量为1-5个(如1-3个,较佳地1-2个,更佳地1个)。
[0053]
在另一优选例中,所述的经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列为同源性或序列相同性为至少96%的氨基酸序列。
[0054]
在另一优选例中,所述的抗体还包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
[0055]
在另一优选例中,所述的重链恒定区为人源的,和/或所述的轻链恒定区为人源的。
[0056]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区还包括人源的框架区,和/或所述抗体的轻链可变区还包括人源的框架区。
[0057]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区还包括鼠源的框架区,和/或所述抗体的轻链可变区还包括鼠源的框架区。
[0058]
在另一优选例中,所述抗体选自下组:动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、或其组合。
[0059]
在另一优选例中,所述的嵌合抗体在人中的免疫原性Z1与非嵌合的抗体(如鼠源抗体)在人中的免疫原性Z0之比(Z1/Z0)为0-0.5,较佳地0-0.2,更佳地0-0.05(如0.001-0.05)。
[0060]
在另一优选例中,所述的抗体是部分或全人源化、或全人的单克隆抗体。
[0061]
在另一优选例中,所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。
[0062]
在另一优选例中,所述抗体为抗体全长蛋白、或抗原结合片段。
[0063]
在另一优选例中,所述抗体为双特异性抗体、或多特异性抗体。
[0064]
在另一优选例中,所述的抗体为药物偶联物形式。
[0065]
在另一优选例中,所述抗体具有选自下组的一个或多个特性:
[0066]
(a)抑制肿瘤细胞迁移或转移;
[0067]
(b)抑制肿瘤生长。
[0068]
在另一优选例中,所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区;
[0069]
其中,所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR:
[0070]
[0071]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0072]
在另一优选例中,所述的抗体具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和如本发明的第三方面所述的轻链可变区;其中,
[0073]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0074]
SEQ ID NO:2所示的VH-CDR1,
[0075]
SEQ ID NO:3所示的VH-CDR2,和
[0076]
SEQ ID NO:4或43或45所示的VH-CDR3;
[0077]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0078]
SEQ ID NO:6所示的VL-CDR1,
[0079]
SEQ ID NO:7所示的VL-CDR2,和
[0080]
SEQ ID NO:8所示的VL-CDR3;
[0081]
[0082]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0083]
SEQ ID NO:10所示的VH-CDR1,
[0084]
SEQ ID NO:11所示的VH-CDR2,和
[0085]
SEQ ID NO:12所示的VH-CDR3;
[0086]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0087]
SEQ ID NO:14所示的VL-CDR1,
[0088]
SEQ ID NO:15所示的VL-CDR2,和
[0089]
SEQ ID NO:16所示的VL-CDR3;
[0090]
[0091]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0092]
SEQ ID NO:18所示的VH-CDR1,
[0093]
SEQ ID NO:19所示的VH-CDR2,和
[0094]
SEQ ID NO:20所示的VH-CDR3;
[0095]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0096]
SEQ ID NO:22所示的VL-CDR1,
[0097]
SEQ ID NO:23所示的VL-CDR2,和
[0098]
SEQ ID NO:24所示的VL-CDR3;
[0099]
[0100]
所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0101]
SEQ ID NO:26所示的VH-CDR1,
[0102]
SEQ ID NO:27所示的VH-CDR2,和
[0103]
SEQ ID NO:28所示的VH-CDR3;
[0104]
所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
[0105]
SEQ ID NO:30所示的VL-CDR1,
[0106]
SEQ ID NO:31所示的VL-CDR2,和
[0107]
SEQ ID NO:32所示的VL-CDR3。
[0108]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、9、17、25、41、42、44或46所示的氨基酸序列;和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列。
[0109]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0110]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列;且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0111]
在另一优选例中,所述的抗体选自下组:
[0112]
[表0001]
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1(3503-mAb019) 96A10H9 1 5
2(3503-mAb070) 272G5E1 9 13
3(3503-mAb076) 277C12G4 17 21
4(3503-mAb064) 265G9A11 25 29
5(3503-hab019e1) 96A10H9 41 5
6(3503-hab019e2) 96A10H9 42 5
7(3503-hab019e3) 96A10H9 44 5
8(3503-hab070e1) 272G5E1 9 48
9(3503-hab076e1) 277C12G4 17 49
10(3503-hab064e1) 265G9A11 46 47。

[0113]
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:1、9、17、25、41、42、44或46所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
[0114]
在另一优选例中,所述轻链可变区的氨基酸序列与如序列表中SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性。
[0115]
在本发明的第六方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白包括:
[0116]
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体;以及
[0117]
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0118]
在另一优选例中,所述的标签序列包括6His标签。
[0119]
在另一优选例中,所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
[0120]
在另一优选例中,所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。
[0121]
在另一优选例中,所述重组蛋白包括:
[0122]
(i)选自下组的抗体,
[0123]
[表0002]
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1(3503-mAb019) 96A10H9 1 5
2(3503-mAb070) 272G5E1 9 13
3(3503-mAb076) 277C12G4 17 21
4(3503-mAb064) 265G9A11 25 29
5(3503-hab019e1) 96A10H9 41 5
6(3503-hab019e2) 96A10H9 42 5
7(3503-hab019e3) 96A10H9 44 5
8(3503-hab070e1) 272G5E1 9 48
9(3503-hab076e1) 277C12G4 17 49
10(3503-hab064e1) 265G9A11 46 47

[0124]
以及
[0125]
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0126]
在本发明的第七方面,提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
[0127]
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体;以及
[0128]
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
[0129]
在另一优选例中,编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:33、35、37、39、50、51、52或53所示;和/或,编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:34、36、38、40、54、55或56所示。
[0130]
在另一优选例中,编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组:
[0131]
[0132]
[0133]
在本发明的第八方面,提供了一种载体,所述载体含有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
[0134]
在另一优选例中,所述的载体包括:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
[0135]
在本发明的第九方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,所述宿主细胞含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
[0136]
在本发明的第十方面,提供了一种抗体偶联物,该抗体偶联物含有:
[0137]
(a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、或其组合;和
[0138]
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[0139]
在另一优选例中,所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
[0140]
在本发明的第十一方面,提供了一种免疫细胞,所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第五方面所述的抗体。
[0141]
在另一优选例中,所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。
[0142]
在另一优选例中,所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
[0143]
在本发明的第十二方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有:
[0144]
(i)活性成分,所述活性成分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合;以及
[0145]
(ii)药学上可接受的载体。
[0146]
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
[0147]
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂。
[0148]
在另一优选例中,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的如本发明的第五方面 所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0149]
在本发明的第十三方面,提供了一种活性成分的用途,所述活性成分选自下组:如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合,其中所述活性成分被用于(a)制备诊断试剂或试剂盒;和/或(b)制备预防和/或治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病的药物。
[0150]
在另一优选例中,所述的诊断试剂为检测片或检测板。
[0151]
在另一优选例中,所述GITR表达或功能异常相关的疾病选自下组:癌症、肿瘤、感染性疾病。
[0152]
在另一优选例中,所述诊断试剂或试剂盒用于:
[0153]
(1)检测样品中GITR蛋白;和/或
[0154]
(2)检测肿瘤细胞中内源性的GITR蛋白;和/或
[0155]
(3)检测表达GITR蛋白的肿瘤细胞;
[0156]
而所述药物用于预防和/或治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病,所述与GITR表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤、感染性疾病。
[0157]
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:黑色素瘤,胚细胞瘤,淋巴瘤,血液瘤,肉瘤,腺瘤。
[0158]
在另一优选例中,所述的抗体为药物偶联物(ADC)形式。
[0159]
在另一优选例中,所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断GITR相关疾病。
[0160]
在另一优选例中,所述的诊断试剂或试剂盒用于检测样品中GITR蛋白。
[0161]
在本发明的第十四方面,提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中GITR蛋白的方法,所述方法包括步骤:
[0162]
(1)在体外,将所述样品与如本发明的第五方面所述的抗体接触;
[0163]
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物,其中形成复合物就表示样品中存在GITR蛋白。
[0164]
在本发明的第十五方面,提供了一种体外检测样品中GITR蛋白的组合物,其包括如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合作为活性成分。
[0165]
在本发明的第十六方面,提供了一种检测板,所述的检测板包括:基片(支撑板)和测试条,所述的测试条含有如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的 第六方面所述的重组蛋白、如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或其组合。
[0166]
在本发明的第十七方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包括:
[0167]
(1)第一容器,所述第一容器中含有本发明的抗体;和/或
[0168]
(2)第二容器,所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗;
[0169]
或者,
[0170]
所述试剂盒含有如本发明的第十六方面所述的检测板。
[0171]
在本发明的第十八方面,提供了一种重组多肽的制备方法,该方法包括:
[0172]
(a)在适合表达的条件下,培养如本发明的第九方面所述的宿主细胞;
[0173]
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是如本发明的第五方面所述的抗体或如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
[0174]
在本发明的第十九方面,提供了一种药物组合,包括:
[0175]
(i)第一活性成分,所述第一活性成分包括如本发明的第五方面所述的抗体1、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合;
[0176]
(ii)第二活性成分,所述第二活性成分包括第二抗体、或化疗剂。
[0177]
在另一优选例中,所述第二抗体选自下组:CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体。
[0178]
在另一优选例中,所述的化疗剂选自下组:多西他赛、卡铂、或其组合。
[0179]
在本发明的第二十方面,提供了本发明的第五方面所述的抗体,或本发明的第六方面所述的重组蛋白、或本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或本发明的第十一方面所述的免疫细胞、和/或本发明的第十二方面所述的药物组合物与第二抗体或化疗剂的组合在制备用于治疗GITR表达或功能异常相关的疾病的药物中的用途。
[0180]
在另一优选例中,所述第二抗体选自下组:CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体。
[0181]
在本发明的第二十一方面,提供了一种治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病的方法,向有需要的对象施用有效量的如本发明的第五方面所述的抗体、或如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的抗体偶联物、或如本发明的第十一方面所述的免疫细胞、或如本发明的第十二方面所述的药物组合物、或其组合。
[0182]
在另一优选例中,所述与GITR表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤、感染性疾病。
[0183]
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:黑色素瘤,胚细胞瘤,淋巴瘤,血液 瘤,肉瘤,腺瘤等等。
[0184]
在另一优选例中,所述的方法还包括:在施用第一活性成分之前、之中和/或之后,向所述对象施用安全有效量的第二抗体。
[0185]
在另一优选例中,所述的第二抗体选自下组:PD-1抗体、CTLA4抗体。
[0186]
在另一优选例中,所述的第二抗体为PD-1抗体。
[0187]
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。

附图说明

[0188]
图1显示了hGITR质粒转染的293F细胞(A)和Renca细胞(B)的FACS筛选检测结果。
[0189]
图2显示了ELISA测定全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc(A)和cGITR-ECD-hFc(B)的结合活性。
[0190]
图3显示了FACS测定全人抗GITR抗体对293F-hGITR(A)和293F-cGITR(B)的结合活性。
[0191]
图4显示了全人抗GITR抗体激活结合NF-κB活性;(A)非偶联(Non-crosslingking);(B)偶联(Crosslinking)。
[0192]
图5显示了全人抗GITR抗体激活T细胞的活性。
[0193]
图6显示了ELISA测定工程改造的全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc(A)和cGITR-ECD-hFc(B)的结合活性。
[0194]
图7显示了FACS测定工程改造的全人抗GITR抗体对293F-hGITR(A)和293F-cGITR(B)的结合活性。
[0195]
图8显示了工程改造的全人抗GITR抗体激活NF-κB的活性;(A)非偶联(Non-crosslinking);(B)偶联(Crosslinking)。
[0196]
图9显示了工程改造的全人抗GITR抗体激活T细胞的活性。
[0197]
图10显示了工程改造的全人抗GITR抗体对GITR人源化小鼠脾细胞的结合活性。
[0198]
图11显示了分组后小鼠体重变化。
[0199]
图12显示了分组后小鼠肿瘤体积变化。

具体实施方式

[0200]
本发明人通过广泛而深入的研究,分别使用人源GITR蛋白,人源GITR基因,以及表达人源GITR细胞系等三种抗原免疫harbour转基因小鼠H2L2,收获免疫小鼠脾细胞并将其与骨髓瘤细胞系进行融合获得杂交瘤细胞,并筛选及生 产获得一组具有全新氨基酸序列的人鼠嵌合抗人GITR抗体。然后通过基因工程技术将前导抗人GITR抗体的重链可变区基因序列克隆到含有信号肽和具有重链WT hIgG1恒定区的表达载体中,轻链可变区基因序列克隆到含有信号肽和hIgG1轻链κ恒定区的表达载体中,并表达纯化获得亲代全人源抗GITR抗体。并通过生物活性,理化活性等多方面筛选获得候选全人源抗GITR抗体,以用于进一步分析研究。本发明中采用大鼠-人嵌合抗体转基因小鼠获得全人抗体(例如采用293F-hGITR细胞及Renca-hGITR细胞对转基因小鼠进行免疫)可变区序列与现有抗体有差异。实验结果表明:本发明全人抗体具有较强的亲和力;具有很好的激活NF-κB活性;具有很好的刺激T细胞激活活性;在小鼠体内表现出显著抑制肿瘤生长和提高小鼠存活率的活性;并且,本发明全人抗体热稳定性较好。此外,本发明通过基因改造技术制备选出的亲代抗体的工程改造变体,并测试鉴别改造后抗体的生物功能和/或理化性质,挑选出候选全人源抗GITR变体抗体,并对候选抗体的生物活性,理化性质等多方面进一步评估。在此基础上完成了本发明。
[0201]
术语
[0202]
本发明中,“VH”指重链可变区,“VL”指轻链可变区。“VH-CDR1”指重链可变区的CDR1;“VH-CDR2”指重链可变区的CDR2;“VH-CDR3”指重链可变区的CDR3。“VL-CDR1”指轻链可变区的CDR1;“VL-CDR2”指轻链可变区的CDR2;“VL-CDR3”指轻链可变区的CDR3。
[0203]
GITR
[0204]
GITR(Glucocorticoid-Induced TNFR-related Protein)糖皮质激素诱导的TNFR相关基因,属于TNF受体家族的受体。GITR是I型跨膜蛋白,其胞外结构域富含半胱氨酸残基,此为TNFR家族成员的共同特征。
[0205]
抗体
[0206]
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0207]
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定 区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0208]
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
[0209]
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
[0210]
本发明不仅包括完整的抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0211]
在本发明中,抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体,例如嵌合的和人源化的单克隆抗体,包括人的和非人的部分,可以通过标准的DNA重组技术获得,它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子,其中不同的部分来自不同的动物种,例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区,和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4,816,567和美国专利4,816,397,在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子,具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5,585,089,在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
[0212]
在本发明中,抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
[0213]
在本发明中,本发明的抗体还包括其保守性变异体,指与本发明抗体的氨 基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表25进行氨基酸替换而产生。
[0214]
表25
[0215]
[表0003]
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu

[0216]
抗GITR的抗体
[0217]
本发明中,所述抗体为抗GITR的抗体。本发明提供一种针对GITR的高特异性和高亲和力的抗体,其包括重链和轻链,所述重链含有重链可变区(VH)氨基酸序列,所述轻链含有轻链可变区(VL)氨基酸序列。
[0218]
优选地,
[0219]
所述的重链可变区(VH)具有选自下组的互补决定区CDR:
[0220]
SEQ ID NO:8n+2所示的VH-CDR1,
[0221]
SEQ ID NO:8n+3所示的VH-CDR2,和
[0222]
SEQ ID NO:8n+4所示的VH-CDR3;
[0223]
其中,各n独立地为0、1、2或3;
[0224]
所述的轻链可变区(VL)具有选自下组的互补决定区CDR:
[0225]
SEQ ID NO:8n+6所示的VL-CDR1,
[0226]
SEQ ID NO:8n+7所示的VL-CDR2,和
[0227]
SEQ ID NO:8n+8所示的VL-CDR3;
[0228]
其中,各n独立地为0、1、2或3;
[0229]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0230]
优选地,重链可变区(VH)包括以下三个互补决定区CDR:
[0231]
SEQ ID NO:8n+2所示的VH-CDR1,
[0232]
SEQ ID NO:8n+3所示的VH-CDR2,和
[0233]
SEQ ID NO:8n+4所示的VH-CDR3;
[0234]
轻链可变区(VL)包括以下三个互补决定区CDR:
[0235]
SEQ ID NO:8n+6所示的VL-CDR1,
[0236]
SEQ ID NO:8n+7所示的VL-CDR2,和
[0237]
SEQ ID NO:8n+8所示的VL-CDR3;
[0238]
各n独立地为0、1、2或3;较佳地n为0;
[0239]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0240]
在另一优选例中,所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80%,较佳地至少85%,更佳地至少为90%,最佳地至少95%的氨基酸序列。
[0241]
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于:计算机分子生物学(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M.编,牛津大学出版社,纽约,1988;生物计算:信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.编,学术出版社,纽约,1993;序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data),第一部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,新泽西,1994;分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinje,G.,学术出版社,1987和序列分析引物(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.与Devereux,J.编M Stockton Press,纽约,1991和Carillo,H.与Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于:GCG程序包(Devereux,J.等,1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul, S,F.等,1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.等,1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
[0242]
本发明的抗体可以是双链或单链抗体,并且可以是选自动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体,更优选为人源化抗体、人-动物嵌合抗体,更优选为全人源化抗体。
[0243]
本发明所述抗体衍生物可以是单链抗体、和/或抗体片段,如:Fab、Fab'、(Fab')2或该领域内其他已知的抗体衍生物等,以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗体或其他亚型的抗体中的任意一种或几种。
[0244]
其中,所述动物优选为哺乳动物,如鼠。
[0245]
本发明抗体可以是靶向GITR(例如人GITR)的嵌合抗体、人源化抗体、CDR嫁接和/或修饰的抗体。
[0246]
本发明上述内容中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%,更优选为不超过35%,更优选为1-33%,更优选为5-30%,更优选为10-25%,更优选为15-20%。
[0247]
本发明上述内容中,更优选地,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,可以是1-7个,更优选为1-5个,更优选为1-3个,更优选为1-2个。
[0248]
在另一优选例中,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、9、17、25、41、42、44或46所示的氨基酸序列。
[0249]
在另一优选例中,所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列。
[0250]
在另一优选例中,所述靶向GITR的抗体的重链可变区(VH)氨基酸序列,和/或,轻链可变区氨基酸序列如下表26所示:
[0251]
表26
[0252]
[0253]
[0254]
在另一优选例中,所述靶向GITR的抗体为3503-mAb019、3503-mAb070、3503-mAb076、3503-mAb064、3503-hab019e1、3503-hab019e2、3503-hab019e3、3503-hab070e1、3503-hab076e1、3503-hab064e1。
[0255]
工程改造全人抗GITR抗体
[0256]
本发明中,第一步通过免疫获得人鼠嵌合抗体;第二步将其Fc段替换为人的Fc,获得全人抗体;第三步通过工程改造去除可变区的hotspot或与Germline序列对比后进行回复突变等相关操作改变1-3个碱基,获得的经工程改造的全人抗体,称作“工程改造全人抗GITR抗体”或“工程改造的全人抗GITR抗体”。
[0257]
重组蛋白
[0258]
本发明还提供一种重组蛋白,其包括GITR抗体的重链CDR1(VH-CDR1)、重链CDR2(VH-CDR2)和重链CDR3(VH-CDR3)中的一种或多种,和/或,GITR抗体的轻链CDR1(VL-CDR1)、轻链CDR2(VL-CDR2)和轻链CDR3(VL-CDR3)中的一种或多种,
[0259]
所述重链CDR1-3的序列如下:
[0260]
SEQ ID NO:8n+2所示的VH-CDR1,
[0261]
SEQ ID NO:8n+3所示的VH-CDR2,
[0262]
SEQ ID NO:8n+4所示的VH-CDR3;
[0263]
所述轻链CDR1-3的序列如下:
[0264]
SEQ ID NO:8n+6所示的VL-CDR1,
[0265]
SEQ ID NO:8n+7所示的VL-CDR2,和
[0266]
SEQ ID NO:8n+8所示的VL-CDR3;
[0267]
各n独立地为0、1、2或3;较佳地n为0;
[0268]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0269]
在另一优选例中,所述经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列优选为同源性或序列相同性为至少80%,较佳地至少85%,更佳地至少为90%,最佳地至少95%的氨基酸序列。
[0270]
在另一优选例中,本发明所述的重组蛋白包括GITR抗体的重链可变区和/或GITR抗体的轻链可变区,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、9、17、25、41、42、44或46所示的氨基酸序列;所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列。
[0271]
在另一优选例中,本发明所述的重组蛋白包括GITR抗体的重链可变区和GITR抗体的轻链可变区,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、9、17、25、 41、42、44或46所示的氨基酸序列,且所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列。
[0272]
在另一优选例中,所述重组蛋白及其包括的重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号如表27所示:
[0273]
表27重链CDR1-3、轻链CDR1-3的氨基酸序列的序列编号(SEQ ID No.)
[0274]
[0275]
其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[0276]
较佳地,所述的重组蛋白还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区,所述的抗体重链恒定区为本领域常规,较佳地为大鼠源抗体重链恒定区或人源抗体重链恒定区,更佳地为人源抗体重链恒定区。所述的抗体轻链恒定区为本领域常规,较佳地为大鼠源轻链抗体恒定区或人源抗体轻链恒定区,更佳地为人源抗体轻链恒定区。
[0277]
所述的重组蛋白为本领域常规的蛋白质,较佳地,其为抗体全长蛋白、抗原抗体结合域蛋白质片段、双特异性抗体、多特异性抗体、单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)、单域抗体(single domain antibody,sdAb)和单区抗体(Signle-domain antibody)中的一种或多种,以及上述抗体所制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制,包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等,主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
[0278]
所述的抗体全长蛋白为本领域常规的抗体全长蛋白,其包括重链可变区、轻链可变区、重链恒定区和轻链恒定区。所述的蛋白质的重链可变区和轻链可 变区与人源重链恒定区和人源轻链恒定区构成全人源抗体全长蛋白。较佳地,所述的抗体全长蛋白为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0279]
所述的单链抗体为本领域常规的单链抗体,其包括重链可变区、轻链可变区和15~20个氨基酸的短肽。
[0280]
所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为本领域常规的抗原抗体结合域蛋白质片段,其包括轻链可变区、轻链恒定区和重链恒定区的Fd段。较佳地,所述的抗原抗体结合域蛋白质片段为Fab和F(ab’)。
[0281]
所述的单域抗体为本领域常规的单域抗体,其包括重链可变区和重链恒定区。
[0282]
所述的单区抗体为本领域常规的单区抗体,其仅包括重链可变区。
[0283]
其中,所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为:从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法:将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中,将所得重组载体转化到转化体中,得到重组表达转化体,通过培养所得重组表达转化体,即可分离纯化获得所述重组蛋白。
[0284]
核酸
[0285]
本发明还提供一种核酸,其编码上述的抗体(例如抗GITR的抗体)或重组蛋白或抗GITR的抗体的重链可变区或轻链可变区。
[0286]
较佳地,编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33、35、37、39、50、51、52或53所示;和/或,编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34、36、38、40、54、55或56所示。
[0287]
更佳地,编码所述重链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:33、35、37、39、50、51、52或53所示;且编码所述轻链可变区的核酸的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:34、36、38、40、54、55或56所示。
[0288]
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地,包括以下的步骤:通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子,或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质的核酸分子。
[0289]
本领域技术人员知晓,编码上述蛋白质的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
[0290]
载体
[0291]
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
[0292]
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得,即:将本发明所述的 核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体,只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
[0293]
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
[0294]
其中,所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞,只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制,且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地,所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞(表达单链抗体或Fab抗体),或者HEK293或CHO细胞(表达全长IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中,即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法,较佳地为化学转化法,热激法或电转法。
[0295]
抗体的制备
[0296]
本发明抗体或其片段的DNA分子的序列可以用常规技术,比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外,还可将轻链和重链的编码序列融合在一起,形成单链抗体。
[0297]
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0298]
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0299]
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0300]
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
[0301]
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于):CHO-S、HEK-293细胞。
[0302]
通常,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
[0303]
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如,单克隆抗体的结合特异性可 用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
[0304]
本发明的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0305]
抗体-药物偶联物(ADC)
[0306]
本发明还提供了基于本发明抗体的抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)。
[0307]
典型地,所述抗体偶联药物包括所述抗体、以及效应分子,所述抗体与所述效应分子偶联,并优选为化学偶联。其中,所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外,所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
[0308]
本发明抗体与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和抗体形成共价键连接的化合物,如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
[0309]
抗体上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连,其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团),诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素),稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。抗体可以被偶联到功能剂以形成抗体-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物,检测试剂,稳定剂)被偶联(共价连接)至抗体上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于抗体。
[0310]
抗体可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地,ADC包含位于药物和抗体之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解,例如在目标位点处接头发生降解,从而使药物从抗体上释放出来。合适的可降解的接头包括,例如酶降解的接头,其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头,或者糖接头例如,可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括,例如二肽,例如缬氨酸-瓜氨酸,苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括,例如,pH敏感接头(例如 pH小于5.5时水解的接头,例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在抗体被蛋白酶水解的条件下释放药物。
[0311]
连接到抗体之前,接头具有能够和某些氨基酸残基反应的活性反应基团,连接通过活性反应基团实现。巯基特异性的活性反应基团是优选的,并包括:例如马来酰亚胺类化合物,卤代酰胺(例如碘、溴或氯代的);卤代酯(例如碘、溴或氯代的);卤代甲基酮(例如碘、溴或氯代),苄基卤代物(例如碘、溴或氯代的);乙烯基砜,吡啶基二硫化物;汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六环,而对离子是醋酸根、氯离子或者硝酸根;和聚亚甲基二甲基硫醚硫代磺酸盐。接头可以包括,例如,通过硫代丁二酰亚胺连接到抗体上的马来酰亚胺。
[0312]
药物可以是任何细胞毒性,抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中,接头连接抗体和药物,而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如,药物可以具有可以和连接物成键的氨基,羧基,巯基,羟基,或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下,药物在连接到抗体之前,具有反应的活性基团。
[0313]
有用的药物类别包括,例如,抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括,例如,DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs),吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
[0314]
在本发明中,药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中,双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如,半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应,并且在随后的步骤中,接头上的功能性基团与药物反应,从而形成ADC。
[0315]
通常,选择接头上功能性基团,以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子,基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成,从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括,例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应),膦(适合与叠氮反应);异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应);和活化的酯类,例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略,例如在《生物偶联技 术》,第二版(Elsevier)中所描述的,是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解,对于药物部分和接头的选择性反应,当选择了一个互补对的反应活性功能基团时,该互补对的每一个成员既可以用于接头,也可以用于药物。
[0316]
本发明还提供了制备ADC的方法,可进一步地包括:将抗体与药物-接头化合物,在足以形成抗体偶联物(ADC)的条件下进行结合。
[0317]
在某些实施方式中,本发明方法包括:在足以形成抗体-接头偶联物的条件下,将抗体与双功能接头化合物进行结合。在这些实施方式中,本发明方法还进一步地包括:在足以将药物部分通过接头共价连接到抗体的条件下,将抗体接头偶联物与药物部分进行结合。
[0318]
在一些实施方式中,抗体药物偶联物ADC如下分子式所示:
[0319]
[0320]
其中:
[0321]
Ab是抗体,
[0322]
LU是接头;
[0323]
D是药物;
[0324]
而且下标p是选自1到8的值。
[0325]
应用
[0326]
本发明还提供了本发明抗体、抗体偶联物ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途,例如用于制备诊断制剂或制备药物。
[0327]
较佳地,所述的药物是用于预防和/或治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病的药物。
[0328]
本发明中,所述与GITR表达或功能异常相关的疾病是本领域常规的与GITR表达或功能异常相关的疾病。较佳地,所述与GITR表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤。
[0329]
本发明中,所述癌症为本领域常规的癌症,较佳地为结肠癌、乳腺癌。本发明中,所述肿瘤疾病为本领域常规的肿瘤疾病,较佳地为黑色素瘤。
[0330]
本发明抗体、ADC、重组蛋白、和/或免疫细胞的用途,包括(但并不限于):
[0331]
(i)诊断、预防和/或治疗肿瘤发生、生长和/或转移,所述肿瘤包括(但并不限于):血液瘤、黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、腺瘤、胚细胞瘤。
[0332]
(ii)诊断、预防和/或治疗癌症,所述癌症包括(但并不限于):头颈癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、鳞状细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、睾丸癌、乳腺癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、前列腺癌、外阴癌、食道癌、甲状腺癌。
[0333]
(iii)诊断、预防和/或治疗肿瘤,所述肿瘤包括(但并不限于):黑色素瘤、 霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞瘤、神经胶质瘤、骨髓瘤、维尔姆斯氏瘤、血液瘤。
[0334]
检测用途和试剂盒
[0335]
本发明的抗体或其ADC可用于检测应用,例如用于检测样本,从而提供诊断信息。
[0336]
本发明中,所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
[0337]
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
[0338]
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中,本发明的抗体可以固定于检测板。
[0339]
药物组合物
[0340]
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
[0341]
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地,本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型,较佳地为固体、半固体或液体的形式,可以为水溶液、非水溶液或混悬液,更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
[0342]
本发明所述抗体也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗,比如,所述抗体用于嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)等。
[0343]
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
[0344]
本发明的药物组合物可直接用于结合GITR蛋白分子,因而可用于预防和治疗肿瘤等疾病。
[0345]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物 可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0346]
本发明中,较佳地,本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体,所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料,较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的上述蛋白质和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
[0347]
本发明中,较佳地,所述的药物组合物的施用量为有效量,所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定,并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
[0348]
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0349]
本发明提供上述药物组合物在制备预防和/或治疗与GITR表达或功能异常相关的疾病的药物中的应用。较佳地,所述与GITR表达或功能异常相关的疾病为癌症、肿瘤。
[0350]
检测样品中GITR蛋白的方法、组合物
[0351]
本发明还提供一种检测样品中GITR蛋白(例如检测过表达GITR细胞)的方法,包括如下的步骤:上述的抗体与待检样品在体外接触,检测上述的抗体与所述待检样品是否结合形成抗原-抗体复合物即可。
[0352]
所述的过表达的含义为本领域常规,指GITR蛋白在待检样品中的RNA或蛋白质的过表达(由于转录增加、转录后加工、翻译、翻译后加工以及蛋白质降解改变),以及由于蛋白质运送模式改变(核定位增加)而导致的局部过表达和功能活性提高(如在底物的酶水解作用增加的情况下)。
[0353]
本发明中,上述是否结合形成抗原-抗体复合物的检测方式是本领域常规的检测方式,较佳地为流式细胞实验(FACS)检测。
[0354]
本发明提供一种检测样品中GITR蛋白的组合物,其包括上述的抗体、重组蛋白、抗体偶联物、免疫细胞、或其组合作为活性成分。较佳地,其还包括上述的抗体的功能片段组成的化合物作为活性成分。
[0355]
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
[0356]
本发明的主要优点在于:
[0357]
(1)本发明采用的转基因小鼠,与野生型小鼠比能够更容易获得全人源抗体,从而降低抗体的免疫原性;与全人抗体的转基因小鼠比,获得的抗体数量多、亲和力强,序列多样性好并且活性高。
[0358]
(2)本发明采用杂交瘤技术获得抗体,与噬菌体库获得的抗体相比,抗体亲和力高,序列表达良好。
[0359]
(3)本发明采用重组表达的293F-hGITR及Renca-hGITR细胞,与蛋白或者多肽类免疫原相比,表达的目的蛋白构象更趋天然;与其他重组表达细胞相比,其表达量更高。
[0360]
(4)本发明获得了序列不同的抗体,能够与hGITR-ECD-hFc蛋白及cGITR-ECD-hFc蛋白特异性结合,并且能够与表达hGITR的293F稳定细胞株(293F-hGITR)及表达cGITR的293F稳定细胞株(293F-cGITR)特异性结合。
[0361]
(5)本发明抗体具有激活NF-κB活性。通过激活T细胞,从而提高INF-γ的分泌水平,并且在人GITR转基因小鼠体内能够抑制肿瘤生长和提高小鼠存活率,各项活性均好于或等同于来自对比文件的抗体。
[0362]
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译,北京:科学出版社,2002年)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件(例如商品说明书)。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0363]
实施例1 嵌合抗GITR抗体制备
[0364]
(一)免疫原A的制备
[0365]
将人源GITR蛋白胞外区氨基酸序列Gln26-Glu161,Thr45Ala(如序列表SEQ ID No.57所示)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen,V044-50)并依照已建立的标准分子生物学方法制备质粒,具体方法参见Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniais T.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Plainview,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)。瞬时转染(PEI,Polysciences)HEK293细胞(购自Invitrogen),并使用FreeStyle TM293(购自Invitrogen)在37℃下进行扩大培养。4天后收集细胞培养液,离心去除细胞成分,得到含有GITR蛋白胞外区的培养上清液。将 培养上清液上样到Protein A亲和层析柱(Mabselect Sure,购自GE Healthcare),同时用紫外(UV)检测仪监测紫外吸收值(A280)的变化。上样后,用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.2)清洗Protein A亲和层析柱,直到A280值回到基线,然后用0.1M甘氨酸盐(pH 2.5)洗脱获得带有hFc标签的人源GITR胞外区蛋白(hGITR-ECD-hFc)。用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.2)在4℃条件下透析过夜。透析后的蛋白经孔径为0.22μM的无菌过滤器过滤,即获得纯化的免疫原A。免疫原A在使用前需进行一些列质控检测,如检测蛋白浓度,纯度,分子量和与配体结合活性等。
[0366]
(二)免疫原B的制备
[0367]
将编码人源GITR全长氨基酸序列(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.58所示)克隆到pIRES载体(购自Glonech)并制备质粒。分别对293F细胞系,和Renca细胞系(均购自Invitrogen)进行质粒转染(转染使用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,购自Roche公司,货号Cat#06 366 236 001,并按说明书操作)后,在含有0.5μg/ml嘌呤霉素的含10%(w/w)FBS的DMEM培养基中选择性培养2周,用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆,并置于37℃,5%(v/v)CO 2培养。大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆用已知的CTLA-4抗体染色,经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养并液氮冻存,即获得免疫原B。具体选择结果如表1和图1所示,表1中阳性细胞(%)指阳性细胞占总细胞数的百分比。图1表明293F细胞(克隆号)和Renca细胞(克隆号)具有较高水平的hGITR的表达。
[0368]
表1 hGITR质粒转染的293F细胞和Renca细胞细胞FACS筛选检测结果
[0369]
[0370]
上述结果表明,本发明中获得了高表达人GITR基因的稳定细胞株293F-hKLB及Renca-hKLB,可用做免疫原和/或抗体筛选及功能鉴定。
[0371]
(三)免疫原C的制备
[0372]
将编码人GITR分子全长核苷酸序列(如序列表SEQ ID No.58所示)克隆到pCpC载体,并制备质粒。
[0373]
(四)杂交瘤细胞的制备和抗体筛选
[0374]
Harbour转基因小鼠引入了人免疫球蛋白可变区基因和大鼠免疫球蛋白恒定区基因,而小鼠本身的Ig表达则被沉默(F.G.Franklin,et al,patent#WO2010/070263Al)。该转基因小鼠经抗原免疫后能产生与正常小鼠(如Balb/c)相当的免疫反应和抗体效价。
[0375]
A、免疫原A免疫6-8周龄Harbour H2L2人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司),小鼠在SPF条件下饲养。初次免疫时,将50μg免疫原A与250μl完全弗氏佐剂(CFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中。初次免疫后间隔2周进行第一次加强免疫,将50μg的免疫原A与250μl不完全弗氏佐剂(IFA)一起注射到每只小鼠的腹腔中,随后相隔3周再次进行加强免疫。每次加强免疫1周后收集血样,用FACS检测血清中免疫原A的抗体效价和特异性。
[0376]
B、免疫原B免疫6-8周龄Harbour H2L2人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司),小鼠在SPF条件下饲养。将稳定转染的293F-hGITR细胞(克隆号:4C11)或Renca-hGITR细胞(克隆号:5F2)以2×10 6的细胞密度,接种到T-75培养瓶中,用含10%FBS和0.5μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养液培养。当细胞达到90%汇合度时,吸出培养基,并将细胞用DMEM培养基洗涤两次,并在37℃下用非酶细胞解离缓冲液处理,直到细胞从培养瓶中分离。收集细胞并用DMEM培养基洗涤两次,测定细胞数并使用PBS缓冲液(pH 7.2)调节至1×10 8cells/mL,用终浓度为25ug/mL丝裂霉素处理3小时,离心,用PBS洗一遍,测定细胞数并使用PBS缓冲液(pH 7.2)调节至1×10 7cells/mL。每只免疫注射小鼠500μl细胞悬浮液。在第一次免疫后两周,给予第一次加强免疫,并且随后间隔3周给予加强免疫。免疫后一周收集血样。通过FACS测定血清中的抗体滴度和特异性。
[0377]
C、免疫原C免疫6-8周龄Harbour H2L2人源抗体转基因小鼠(购自北京维通利华公司),小鼠在SPF条件下饲养。所有小鼠用Helios基因枪免疫4次,每次免疫注射4次。每次注射含有1μg DNA。在第一次免疫后间隔2周,给予第一次加强免疫,并且随后每间隔3周给予一次加强免疫。免疫后1周收集血液样品,通过FACS测定血清中的抗体滴度和特异性。
[0378]
实施细胞融合前,选择针对hGITR具有较好免疫应答的小鼠通过IP途径加强免疫100μg纯化的hGITR-ECD-hFc(对于用蛋白免疫原或基因免疫原免疫小 鼠),或通过IP途径加强免疫500μl(5×10 6cells)293F-hGITR或Renca-hGITR细胞免疫组进行最后加强免疫。3-5天后采用安乐死的方法处死小鼠,收集脾细胞。加入NH 4OH至终浓度1%以脾细胞悬液中的红细胞,用DMEM基础培养基离心清洗细胞2-3次,然后按5:1比率与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合,采用传统的PEG细胞融合方法或高效电融合方法进行细胞融合。融合后的细胞稀释到含20%胎牛血清、1xHAT的DMEM选择性培养基中,按1×10 5/20μL每孔加入到96孔细胞培养板中,放入5%CO 2,37℃培养箱中。10-14天后用FACS(流式细胞技术)或NF-κB报告基因实验筛选细胞融合板上清,阳性克隆扩增到24孔板扩大培养,2-3天后对24孔板上清进行抗体亚型分析,用ELISA、FACS确定对GITR蛋白和GITR阳性细胞的结合活性,荧光素检测确定对NF-κB报告基因激活活性,INF-γ检测确定对T细胞激活活性。
[0379]
根据24孔板筛选结果,选择所需克隆用有限稀释法在96孔板进行亚克隆。亚克隆后7-10天用FACS和NF-κB报告基因实验进行初步筛选,挑选3-4个阳性单克隆扩增到24孔板继续培养。2-3天后用FACS确定抗原结合阳性。根据24孔板样品检测结果,挑选一个最优克隆进行扩大培养、液氮冻存、抗体生产和纯化。
[0380]
(五)嵌合抗体生产及纯化
[0381]
将上述选定的阳性杂交瘤细胞在无血清培养基的T-75培养瓶中培养,并传3代。当杂交瘤细胞处于状态良好时,将细胞转移到250ml培养瓶中。向每个培养瓶中加入250mL DMEM+2.5%FBS(low IgG),将细胞密度调节至1×10 5cells/mL。将培养瓶放入37℃,转速3rpm的旋转培养箱中。培养杂交瘤细胞14天,收集细胞培养上清液,离心去除细胞成分,通过孔径为0.45μm过滤器过滤上清液。
[0382]
使用Protein G层析柱(购自GE Healthcare)从细胞培养上清中纯化获得嵌合抗GITR抗体。首先使用平衡液(PBS缓冲液,pH 7.2)平衡层析柱,然后上样杂交瘤培养物上清液,再平衡4个柱体积,用洗脱缓冲液(0.1mol/L乙酸盐缓冲液,pH 2.5)洗脱。然后将10%中和缓冲液(1.0mol/L Tris-HCl)加入到洗脱液进行中和,并将样品通过孔径为0.22μm过滤器过滤,获得无菌过滤的纯化的嵌合抗GITR抗体。
[0383]
实施例2 嵌合抗GITR抗体的鉴定
[0384]
(一)基于细胞水平的结合活性
[0385]
将实施例1步骤(二)中所述含有编码人源GITR全长核苷酸序列的pIRES质粒转染293F细胞株得含人GITR的293F稳转细胞株(此处称为293F-hGITR稳定细胞株),将带有猴源GITR全长基因的pIRES质粒,其中猴源GITR核苷酸 酸序列的数据库登录号为XP_005545180.1,转染293F细胞株得含猴GITR的的293F稳转细胞株(此处称为293F-cGITR稳定细胞株)。参照专利(US_2015_0064204_A1)构建工具抗体Tab9H6v3。将293F-hGITR稳定细胞株和293F-cGITR稳定细胞株在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90%汇合度,吸尽培养基,与嵌合抗GITR抗体或IgG1同型对照抗体在PBS+2%FBS中孵育1小时以便抗体与细胞表面表达的GITR蛋白结合。收集细胞并洗涤,然后在4℃下与偶联荧光染料的抗人抗体孵育1小时。结合至表达hGITR或cGITR细胞的嵌合抗GITR抗体的平均荧光强度(MFI)通过流式细胞术进行测定。使用GraphPad Prism软件计算拟合曲线的EC50。结果如表2所示,待测抗体可结合细胞表面的人或猴GITR蛋白。表中的数据为MFI所测细胞群的平均荧光强度值。
[0386]
表2 FACS检测嵌合抗GITR抗体与293F-hGITR或293F-cGITR的结合反应
[0387]
[0388]
上述结合实验结果表明,嵌合抗GITR抗体对表达人GITR的细胞293F-hGITR具有很高的结合活性,同时对表达猴GITR的细胞293F-cGITR具有良好的交叉反应性,体现为对293F-cGITR也具有很高的结合活性。
[0389]
(二)激活NF-κB活性
[0390]
将共表达NF-κB和hGITR细胞(Jurkat-NF-κB-Luc-hGITR-3C8)以2×10 6cells/ml的浓度接种于96孔细胞培养板中,50μl/孔。然后与50μl Crosslinking或Non-crosslinking的抗GITR抗体在37℃,5%CO 2条件下共孵育5小时。最后每孔加入100μl Luciferase检测缓冲液,避光震荡裂解5分钟后,使用Varioskan TM LUX读板器检测荧光强度。使用GraphPad Prism软件计算拟合曲线的EC50。以工具抗体Tab9H6v3和Tab6C8(US_8388967_B2)作为阳性对照。结果表3所示,待测抗体激活NF-κB活性对F(ab) 2具有依赖性。
[0391]
表3 嵌合抗GITR抗体激活NF-κB活性
[0392]
[0393]
[0394]
(三)激活T细胞活性
[0395]
在37℃下将抗人GITR抗体或IgG1同型对照抗体与平板结合的0.3μg/ml OKT3和2.7μg/ml抗hFc抗体的混合物共孵育30分钟。使用EasySep TM Human T cell Isolation Kit(Stemcell,Cat#17951)分离收获人外周血液中T细胞。37℃下每孔加入200ul,3×10 5T细胞,孵育3天。第五天收集细胞培养上清,使用Human IFN-γELISA kit检测培养上清中的INF-γ含量。使用GraphPad Prism软件计算拟合曲线的EC50。结果表4所示,待测抗体激活T细胞活性。
[0396]
表4 嵌合抗GITR抗体激活T细胞活性
[0397]
[0398]
上述结果表明,嵌合抗GITR抗体具有激活T细胞合成并释放INF-γ的活性。
[0399]
实施例3 轻重链可变区氨基酸序列测定
[0400]
(一)总RNA分离
[0401]
对筛选获得的先导抗体杂交瘤细胞进行培养,离心收集5×10 7个杂交瘤细胞。然后参照 Reagent’s protocol提取RNA。将1ml Trizol加入到细胞沉淀中,混合并转移到1.5ml离心管中,并在室温下温育5分钟。然后将0.2ml氯仿加入到样品中并涡旋15秒。静置2分钟后,将混合物在12,000g,4℃,离心5分钟。收集上清液并转移至新的1.5ml离心管中,加入0.5ml异丙醇并轻轻混合,并将样品在室温下温育10分钟。将样品以12,000g,4℃,离心15分钟。吸出上清液,用1ml 75%(v/v)乙醇洗涤沉淀。将混合物在12,000g,4℃,离心5分钟,小心去除上清液,将沉淀物风干。使用DEPC处理后的水溶解沉淀物(55℃水浴10分钟)获得总RNA。
[0402]
(二)逆转录与PCR
[0403]
根据 RACE 5’/3’Kit(Clontech,Cat#634858)手册进行RNA逆转录实验。使用随机decamer引物合成cDNA单链。PCR程序设置如下:95℃ 变性3分钟,35个变性循环(95℃,30秒),退火(55℃,30秒)和延伸(72℃,35秒),然后在72℃最后延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,然后根据试剂盒说明书,用PureLink快速凝胶萃取试剂盒纯化凝胶中的PCR产物。注:延伸温度可根据实际情况有所调整。
[0404]
(三)克隆与测序
[0405]
将扩增获得的DNA片段克隆插入到 18-T载体中,连接反应:样品50ng,载体50ng,连接酶0.5μl,缓冲液1μl,反应体系10μl,于16℃反应半小时;取5μl连接产物加入100μl的感受态细胞中,冰浴5分钟,而后于42℃水浴热击1分钟,放回冰上1分钟后加入650μl无抗生素SOC培养基,于37℃摇床上以200rpm复苏30分钟,取出200μl涂布于含抗生素的LB固体培养基上于37℃孵箱过夜培养;次日,使用T载体上引物M13F和M13R配置30μl PCR体系,进行菌落PCR,用移液器枪头蘸取菌落于PCR反应体系中吹吸,并吸出0.5μl点于另一块含抗生素的LB固体培养皿上以保存菌株;PCR反应结束后,取出5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测,将阳性样品进行测序。其中,测序的步骤参见Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。测序结果如表5A和表5B所示。
[0406]
表5A GITR抗体氨基酸序列编号
[0407]
[0408]
表5B GITR抗体基因序列编号
[0409]
[0410]
其中,表5中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号,如编码96A10H9的重链可变区(VH)核苷酸序列为序列表SEQ ID No.33。
[0411]
其中,编码96A10H9的VH-CDR1的核苷酸序列为SEQ ID No.33中的第91-105位;编码96A10H9的VH-CDR2的核苷酸序列为SEQ ID No.33中的第148-198位;编码96A10H9的VH-CDR3的核苷酸序列为SEQ ID No.33中的第295-339位;编码96A10H9的VL-CDR1的核苷酸序列为SEQ ID No.34中的第70-102位;编码96A10H9的VL-CDR2的核苷酸序列为SEQ ID No.34中的第148-168位;编码96A10H9的VL-CDR3的核苷酸序列为SEQ ID No.34中的第265-291位;
[0412]
编码272G5E1的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第91-105位;编码272G5E1的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第148-198位;编码272G5E1的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第295-333位;编码272G5E1的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.36中的第70-102位;编码272G5E1的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.36中的第148-168位;编码272G5E1的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.36中的第265-291位;
[0413]
编码277C12G4的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第 91-105位;编码277C12G4的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第148-198位;编码277C12G4的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第295-333位;编码277C12G4的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.38中的第70-102位;编码277C12G4的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.38中的第148-168位;编码277C12G4的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.38中的第265-291位;
[0414]
编码265G9A11的VH-CDR1的核苷酸序列为SEQ ID No.39中的第91-105位;编码265G9A11的VH-CDR2的核苷酸序列为SEQ ID No.39中的第148-198位;编码265G9A11的VH-CDR3的核苷酸序列为SEQ ID No.39中的第295-333位;编码265G9A11的VL-CDR1的核苷酸序列为SEQ ID No.40中的第70-102位;编码265G9A11的VL-CDR2的核苷酸序列为SEQ ID No.40中的第148-168位;编码265G9A11的VL-CDR3的核苷酸序列为SEQ ID No.40中的第265-291位。
[0415]
实施例4 全人抗体IgG转化和制备
[0416]
(一)质粒构建与准备
[0417]
实施例2已从杂交瘤细胞的培养上清液中获得了纯化的抗GITR抗体,并根据实施例3的测序结果明确了抗GITR抗体的重链可变区和轻链可变区序列。将抗GITR抗体的重链可变区序列重组到包含信号肽和人源重链抗体IgG1恒定区的表达载体(其中表达载体购买自Invitrogen)中,将抗GITR抗体的轻链可变区序列重组到包含信号肽和人源抗体轻链kappa恒定区的表达载体当中,获得重组质粒并经测序验证(测序方法与实施例3中测序方法相同)。使用碱裂解法试剂盒(购自MACHEREY-NAGEL)中量抽提高纯度的重组质粒,质量为500μg以上,经孔径为0.22μm滤膜(购自Millopore)过滤,供转染使用。
[0418]
(二)细胞转染
[0419]
使用FreeStyle 293培养基培养FreeStyle TM 293细胞,培养条件设定为37℃,130rpm,8%CO 2。将细胞密度调节至1.0-1.2×10 6cells/ml进行转染。首先,使用培养基将DNA质粒稀释至100ug/100ml,轻轻涡旋孵化5分钟。然后,向DNA质粒中加入终浓度为200ug/100mL PEI,轻轻涡旋孵化5分钟并将其混合物室温孵育15分钟。最后将DNA-PEI混合物轻轻滴加到细胞上。第二天,将蛋白胨添加至0.5%(w/v)的终浓度,37℃,130rpm,8%CO 2条件下继续培养。随后每天收集培养上清和细胞,并监测抗体/蛋白表达情况。约6-7天,将细胞培养物离心(3,000rpm,30分钟),收集上清液,并经孔径为0.22μm滤膜过滤,得滤好的细胞上清液,供抗体纯化。
[0420]
(三)抗体纯化
[0421]
对于连续生产的无内毒素的层析柱和Protein A填料(购自GE Healthcare), 使用0.1M NaOH处理30分钟或者5个柱体积的0.5M NaOH冲洗。对于长期未使用的柱料和层析柱至少使用1M NaOH浸泡1h,用无内毒的水冲洗至中性,用10倍柱体积的1%(v/v)TritonX-100清洗柱材。使用5个柱体积的PBS(PBS磷酸缓冲液,pH 7.2)进行平衡,将上述步骤(二)所得过滤好的细胞上清液上柱,必要时收集流穿液。上柱完成后,使用5倍柱体积的PBS清洗。用5倍柱体积的0.1M pH 3.0的Glycine-HCl进行洗脱,收集洗脱液,并用0.5倍柱体积洗脱液的pH 8.5的1M Tris-HCl(1.5M NaCl)中和,收获全人抗GITR抗体。上述所用溶液均需要新配置。收获全人抗GITR抗体后,在1×PBS中透析4小时,避免内毒素污染。透析结束后,使用分光光度或试剂盒测定浓度,使用SDS-PAGE和SEC-HPLC测定抗体纯度,使用内毒素检测试剂盒(购自Lonza)检测抗体内毒素含量。
[0422]
实施例5 全人抗GITR抗体鉴定
[0423]
(一)基于蛋白水平的结合活性
[0424]
依照实施例1,将编码猕猴GITR蛋白的胞外区氨基酸序列Gln20-Glu155(猴源GITR核苷酸酸序列的数据库登录号为XP_005545180.1)克隆到带有人IgG Fc片段(hFc)的pCpC载体(购自Invitrogen,V044-50),并通过转染、纯化等步骤获得cGITR-ECD-hFc蛋白。
[0425]
分别用PBS盐酸缓冲液(pH 7.2)稀释hGITR-ECD-hFc蛋白和cGITR-ECD-hFc蛋白至1μg/ml,并将100μl稀释液加入到96孔ELISA微孔板,4℃孵育过夜。使用300μl/孔洗涤缓冲液PBST(PBS+0.05%Tween-20)清洗微孔板3次,向每孔加入300μl封闭缓冲液(PBST+1%BSA),室温孵育2小时。清洗板3次,向每孔中加入100μl,10μg/ml的抗GITR抗体,37℃孵育1小时。清洗板3次,每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人Fab二抗,37℃孵育半小时。清洗板3次,每孔加入100μl四甲基联苯胺(TMB),显色15分钟后,每孔加入50μl 1N HCl终止液,并使用读板器读取OD450值。使用GraphPad Prism软件计算结合曲线的EC50。结果如表6和图2所示。
[0426]
表6 ELISA测定全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc和cGITR-ECD-hFc结合活性
[0427]
[0428]
[0429]
上述结果表明,本发明中的全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc蛋白具有较强的结合活性,同时对cGITR-ECD-hFc具有良好的交叉结合活性。
[0430]
(二)基于细胞水平的结合活性
[0431]
依照实施例2步骤(一),通过FACS检测全人抗GITR抗体对293F-hGITR稳定细胞株及293F-cGITR稳定细胞株的结合活性,结果如表7和图3所示。
[0432]
表7 FACS测定全人抗GITR抗体对293F-hGITR和293F-cGITR结合活性
[0433]
[0434]
上述结果表明,本发明中的全人抗GITR抗体对表达人GITR的稳定细胞株293F-hGITR具有与工具抗体类似的结合活性,同时对表达猴GITR的稳定细胞株293F-cGITR也具有良好的交叉结合活性。
[0435]
(三)激活NF-κB活性
[0436]
依照实施例2步骤(二),检测全人抗GITR抗体激活NF-κB活性,结果如表8和图4所示。
[0437]
表8 全人抗GITR抗体激活结合NF-κB活性
[0438]
[0439]
上述结果表明,本发明中的全人抗GITR抗体在偶联和非偶联条件下均具有激活NF-κB活性,其中非偶联条件下的激活效果更好。
[0440]
(四)激活T细胞活性
[0441]
依照实施例2步骤(三),检测全人抗GITR抗体激活T细胞活性,结果如表9和图5所示。
[0442]
表9 全人抗GITR抗体激活T细胞活性
[0443]
[表0004]
抗体ID 克隆ID T细胞激活(EC50/pM)
3503-hab019 96A10H9 0.6219
3503-hab064 265G9A11 0.6652
3503-hab070 272G5E1 2.5240
3503-hab076 277C12G4 0.5158
Tab9H6v3 N/A 0.2259

[0444]
上述结果表明,本发明中的全人抗GITR抗体具有激活T细胞合成并释放TNF-γ的活性。
[0445]
(五)基于抗原的结合解离平衡常数测定
[0446]
使用运行缓冲液HBS-EP+(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%P20,pH 7.4),按照手动模式将抗原hGITR-ECD-hFc固定在芯片表面。首先,用新鲜混合的50mM NHS和200mM EDC活化串联S CM5传感器芯片的流通池4。然后,用10mM NaAC(pH 5.0)稀释抗原至1μg/ml,并将其注射到流通池4,约40秒。最后,使用1M乙醇胺封闭剩余的活性偶联位点。
[0447]
使用运行缓冲液HBS-EP+稀释抗体至一系列浓度(0,3.125,6.25,12.5,25,50nM),并将其以30μl/min的流速注射到流通池1和4,持续180秒。缓冲液流动维持600秒以测定解离。为了从表面去除测试抗体,将10mM Glycine-HCl(pH1.5)以10μl/min的流速注入到流通池1和4,持续时间为30秒。对于每个浓度的连续稀释的抗体重复上述步骤。
[0448]
使用Biacore T200评估软件3.0评估每种抗体的KD值,其中流通池1用作参考流通池。结果示于表10。
[0449]
表10 全人抗GITR抗体与hGITR-ECD-hFc蛋白的结合动力学和亲和力
[0450]
[0451]
上述结果表明,本发明中的全人抗GITR抗体与hGITR-ECD-hFc蛋白结合的KD值均在纳摩水平,表明这些抗体对hGITR-ECD-hFc均有较好的亲和力。
[0452]
实施例6 工程改造全人抗GITR抗体设计及制备
[0453]
(一)工程改造全人抗GITR抗体设计
[0454]
对上述全人抗GITR抗体的CDR区序列进行分析,通过工程改造技术去除 序列中的hot spots位点。同时对抗体进行germline序列比对分析,将Frame work区域进行回复突变。工程改造的全人抗GITR抗体基因序列如表11所示,氨基酸序列如表12所示。
[0455]
表11 人源化抗GITR抗体基因序列编号
[0456]
[0457]
其中,表11中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号,如编码工程改造抗体3503-hab019e1的重链可变区(VH)核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50。
[0458]
其中,编码3503-hab019e1的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第91-105位;编码3503-hab019e1的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第148-198位;编码3503-hab019e1的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.50中的第295-339位;编码3503-hab019e1的VL-CDR1的核 苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第70-102位;编码3503-hab019e1的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第148-168位;编码3503-hab019e1的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第265-291位;
[0459]
编码3503-hab019e2的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第91-105位;编码3503-hab019e2的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第148-198位;编码3503-hab019e2的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.51中的第295-339位;编码3503-hab019e2的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第70-102位;编码3503-hab019e2的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第148-168位;编码3503-hab019e2的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第265-291位;
[0460]
编码3503-hab019e3的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第91-105位;编码3503-hab019e3的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第148-198位;编码3503-hab019e3的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.52中的第295-339位;编码3503-hab019e3的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第70-102位;编码3503-hab019e3的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第148-168位;编码3503-hab019e3的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.34中的第265-291位;
[0461]
编码3503-hab070e1的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第91-105位;编码3503-hab070e1的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第148-198位;编码3503-hab070e1的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.35中的第295-333位;编码3503-hab070e1的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第70-102位;编码3503-hab070e1的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第148-168位;编码3503-hab070e1的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.55中的第265-291位;
[0462]
编码3503-hab076e1的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第91-105位;编码3503-hab076e1的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第148-198位;编码3503-hab076e1的VH-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.37中的第295-333位;编码3503-hab076e1的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第70-102位;编码3503-hab076e1的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第148-168位;编码3503-hab076e1的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.56中的第265-291位;
[0463]
编码3503-hab064e1的VH-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.53中的第91-105位;编码3503-hab064e1的VH-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.53中的第148-198位;编码3503-hab064e1的VH-CDR3的核苷酸序列为序列 表SEQ ID No.53中的第295-333位;编码3503-hab064e1的VL-CDR1的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第70-102位;编码3503-hab064e1的VL-CDR2的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第148-168位;编码3503-hab064e1的VL-CDR3的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.54中的第265-291位。
[0464]
表12 工程改造全人抗GITR抗体氨基酸序列编号
[0465]
[0466]
其中,表12中的数字即为序列表“SEQ ID No.”编号,如工程改造抗体3503-hab019e1的重链可变区氨基酸序列为序列表SEQ ID No.41。
[0467]
其中,抗体3503-hab019e1的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.2,SEQ ID No.3和SEQ ID No.4;抗体3503-hab019e1的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.6, SEQ ID No.7和SEQ ID No.8;
[0468]
抗体3503-hab019e2的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.2,SEQ ID No.3和SEQ ID No.43;抗体3503-hab019e2的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.6,SEQ ID No.7和SEQ ID No.8;
[0469]
抗体3503-hab019e3的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.2,SEQ ID No.3和SEQ ID No.45;抗体3503-hab019e3的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.6,SEQ ID No.7和SEQ ID No.8;
[0470]
抗体3503-hab070e1的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.10,SEQ ID No.11和SEQ ID No.12;抗体3503-hab070e1的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.14,SEQ ID No.15和SEQ ID No.16;
[0471]
抗体3503-hab076e1的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.18,SEQ ID No.19和SEQ ID No.20;抗体3503-hab076e1的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.22,SEQ ID No.23和SEQ ID No.24;
[0472]
抗体3503-hab064e1的VH-CDR1,VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.26,SEQ ID No.27和SEQ ID No.28;抗体3503-hab064e1的VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列分别为序列表SEQ ID No.30,SEQ ID No.31和SEQ ID No.32。
[0473]
(二)工程改造全人抗GITR抗体制备
[0474]
参照实施例4制备工程改造全人抗GITR抗体。
[0475]
实施例7 工程改造全人抗GITR抗体鉴定
[0476]
(一)基于蛋白水平的结合活性
[0477]
依照实施例5步骤(一),通过酶联免疫吸附试验检测工程改造全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc蛋白或cGITR-ECD-hFc蛋白的结合活性,结果见表13和图6。
[0478]
表13 ELISA测定工程改造全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc和cGITR-ECD-hFc结合活性
[0479]
[0480]
[0481]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的工程改造全人抗GITR抗体对hGITR-ECD-hFc蛋白具有与工具抗体类似的结合活性,同时对cGITR-ECD-hFc蛋白具有良好的交叉结合活性。
[0482]
(二)基于细胞水平的结合活性
[0483]
依照实施例2步骤(一),通过FACS检测工程改造全人抗GITR抗体对293F-hGITR稳定细胞株及293F-cGITR稳定细胞株结合活性,结果如表14和图7所示。
[0484]
表14 FACS测定工程改造全人抗GITR抗体对293F-hGITR和293F-cGITR结合活性
[0485]
[0486]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的全人抗GITR抗体对表达人GITR基因的稳定细胞株293F-hGITR,及表达猴GITR基因的稳定细胞株293F-cGITR的结合活性与改造前类似,或比改造前的结合活性更高。
[0487]
(三)激活NF-κB活性
[0488]
依照实施例2步骤(二),检测工程改造全人抗GITR抗体激活NF-κB活性,结果如表15和图8所示。
[0489]
表15 工程改造全人抗GITR抗体激活NF-κB活性
[0490]
[0491]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的全人抗GITR抗体在偶联和 非偶联两个条件下对NF-κB均具有较好地激活活性。其中改造后的抗体的激活活性比改造前的抗体的激活活性更好,且都明显好于工具抗体Tab9H6v3。
[0492]
(四)激活T细胞活性
[0493]
依照实施例2步骤(三),检测工程改造全人抗GITR抗体对T细胞激活活性,结果如表16和图9所示。
[0494]
表16 工程改造全人抗GITR抗体激活T细胞活性
[0495]
[0496]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的全人抗GITR抗体激活T细胞合成并释放TNF-γ的活性与改造前的抗体相当。
[0497]
(五)基于抗原的结合解离平衡常数测定
[0498]
依照实施例5步骤(五),通过Biacore检测工程改造全人抗GITR抗体与抗原hGITR-ECD-hFc蛋白的结合动力学和亲和力,结果示于表17。
[0499]
表17 工程改造全人抗GITR抗体与hGITR-ECD-hFc蛋白的结合动力学和亲和力
[0500]
[0501]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的抗GITR全人抗体3503-hab019e2和3503-hab070e1具有和工具抗体Tab9H6v3相似的结合解离平衡常数(KD(M))。
[0502]
实施例8 工程改造全人抗GITR抗体抑制肿瘤生长活性
[0503]
(一)工程改造全人抗GITR抗体与人源化小鼠脾脏细胞结合活性
[0504]
将15μg Anti-mCD3抗体溶于400μl PBS中。抓取人源化小鼠B-hGITR,腹腔注射200μl。24h后,通过CO 2安乐死小鼠并快速摘取小鼠脾脏,放入含有5mL PBS的15mL离心管中。然后将脾脏转移至6孔板,并放置在70μm的筛网上,加入1ml PBS,用无菌注射器尾部进行研磨,再用2ml PBS冲洗筛网;将过滤好的细胞悬液,3,000rpm离心5min,弃上清,再瞬离去上清;每只脾加入1ml红细胞裂解液,冰上裂解5min;加入5ml PBS,混匀细胞,4℃离心3,000rpm3min,弃上清,再瞬离去上清;加入300μl PBS重悬细胞,并加入6μl anti-Mcd16/32封闭,冰上孵育15min;继续加入300μl PBS混匀细胞。流式染色后通过FACS检测荧光强度。FACS检测结果如图10所示。
[0505]
结果表明:3503-hab019e2和3503-hab070e1抗体具有和Tab9H6v3相似的结合GITR人源化小鼠脾细胞活性,而同型对照IgG对GITR人源化小鼠脾细胞没有结合活性。
[0506]
(二)工程改造全人抗GITR抗体小鼠体内抗肿瘤活性评价
[0507]
采用MC38同系小鼠模型,使用人GITR基因敲入的C57BL/6小鼠(B-hGITR小鼠,北京白奥赛图基因生物技术有限公司)评价抗体在小鼠体内的抗肿瘤活性。实验设计为:选择24只人GITR基因敲入的C57BL/6小鼠,分为4组,每组6只,使用Tab9H6v3和同型抗体hIgG1作为对照,样品为3503-hab019e2和3503-hab070e1。给药途径为腹腔注射,给药剂量为10mg/kg,每3天给药1次,共6剂。给药结束后持续观察两周。每周称量小鼠体重,同时使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次测量,测量肿瘤的长径和短径,其体积计算公式为:肿瘤体积=0.5×长径×短径 2
[0508]
所有实验动物在给药期间活动和进食状态良好,体重均有一定程度的上升。测试组和对照组在给药后21天动物体重无显著性差异(P>0.05)。所有动物体重变化情况见表18及图11。
[0509]
表18 受试品对MC38细胞移植B-hGITR小鼠体重的影响
[0510]
[0511]
注:a:平均数±标准误;b:给药组体重与溶剂对照组体重在给药21天后统计学比较,t-test。
[0512]
所有动物在试验过程中密切监测肿瘤生长状况,每周量瘤2次,记录结果并计算肿瘤抑制率(TGI%),根据肿瘤体积进行组间统计学分析,结果如表19和表20所示。
[0513]
表19 抗GITR抗体对MC38细胞移植B-hGITR小鼠肿瘤体积的影响
[0514]
[0515]
[0516]
注:a:平均数±标准误;b:给药组肿瘤体积与溶剂对照组肿瘤体积在给药21天后统计学比较,t-test。
[0517]
表20 各组间的肿瘤体积统计差异 a
[0518]
[0519]
注:a:各组肿瘤体积在给药21天后统计学比较,t-test。
[0520]
结果表明:给药21天后,受试品3503-hab070e1组和Tab9H6v3组的TGI%分别为10.0%和25.3%,与hIgG1对照组相比,P>0.05,表明GITR抗体3503-hab070e1和Tab9H6v3对肿瘤生长无显著抑制作用。受试品3503-hab019e2组的TGI%为38.3%,与hIgG1对照组相比,P<0.05,表明GITR抗体3503-hab019e2对肿瘤生长具有显著抑制作用。此外,Tab9H6v3,3503-hab070e1和3503-hab019e2组间肿瘤体积对比表明三组肿瘤体积给药后无显著差异(P>0.05)。结果如图12所示。
[0521]
本实验在首次给药29天后,对各组动物实施安乐死,剥取肿瘤称重。各组肿瘤重量结果平均值示于表21。
[0522]
表21 抗GITR抗体对MC38结肠癌移植B-hGITR人源化小鼠肿瘤重量的抑瘤作用
[0523]
[表0005]
组别 动物数(只) 瘤重(g) a P b
hIgG1 6 5.229±0.652 -
Tab9H6v3 6 4.261±0.337 0.22
3503-hab070e1 6 5.909±0.819 0.53
3503-hab019e2 6 3.824±0.449 0.11

[0524]
注:a:均数±标准误。
[0525]
经过数据分析,Tab9H6v3组、3503-hab019e2组与hIgG1对照组相比整组平均肿瘤重量有一定下降,但无显著性差异(P>0.05),说明抗GITR抗体3503-hab019e2与Tab9H6v3相似,对肿瘤生长具有抑制趋势。
[0526]
实施例9 工程改造全人抗GITR抗体稳定性研究
[0527]
(一)样品处理及理化理化性质测定
[0528]
选择20mM组氨酸体系,6%海藻糖、0.01%吐温80,pH5.5作为稳定性考察的缓冲体系,将样品浓缩后透析至该缓冲体系中,透析后蛋白含量为20.3mg/mL。
[0529]
采用iCIEF考察候选抗体的等电点,抗体分子等电点在9.0-9.5之间,其中主峰等电点为9.3。
[0530]
通过Gayman巯基检测试剂盒检测样品的自由巯基含量为0.83%。
[0531]
采用Micro-DSC分析候选抗体的Tonset和Tm值,热稳定性较好,结果如表22所示。
[0532]
表22 工程改造全人抗GITR抗体Tonset和Tm值
[0533]
[0534]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的抗GITR全人抗体3503-hab019e2在上述两种不同缓冲体系中均具有良好的热稳定性。
[0535]
(二)反复冻融、不同温度、不同pH条件下稳定性考察
[0536]
工程改造全人抗GITR抗体在20.3mg/ml浓度下,考察反复冻融、不同温度、不同pH值条件下对样品稳定性影响。处理后样品的SEC与CEX检测结果如下表23所示。
[0537]
表23 低浓度样品稳定性考察结果
[0538]
[0539]
[0540]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的抗GITR抗体在20.3mg/ml浓度下,反复冻融,或在不同温度,不同pH条件下具有很好的稳定性。且在浓缩至高浓度过程中也具有良好的稳定性。
[0541]
将工程改造全人抗GITR抗体浓缩至96.6mg/ml后,考察样品稳定性。结果如表24所示。在浓缩过程中未出现沉淀,外观澄清透明,粘度检测结果为4.679mPa·s。
[0542]
表24 高浓度浓度样品稳定性考察结果
[0543]
[0544]
上述结果表明,本发明中通过工程改造获得的抗GITR抗体在高浓度条件下仍然具有较好的稳定性。
[0545]
讨论
[0546]
(1)可以通过对野生型小鼠进行免疫获得抗体,但是需要对鼠源抗体进行人源化改造而获得人源化抗体,缺点在于改造后的抗体免疫原性可能更强、抗体结构可能会改变从而导致活性丢失或可生产性变差。
[0547]
(2)可以通过对全人源转基因小鼠进行免疫获得全人抗体,但是所获得抗体的数量或亲和力会较差。
[0548]
(3)可通过构建免疫小鼠抗体库用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选,但是涉及到抗体重轻链的随机重新组合,会导致形成的抗体可生产性较差。
[0549]
(4)可通过构建人源抗体库用噬菌体展示技术对抗体进行表达和活性筛选,但是因为未经免疫,所得抗体亲和力会较差。
[0550]
(5)免疫原可以为多肽,蛋白,其他种类细胞和基因等,但是会存在构象不正确、表达量低、免疫原性差等问题。
[0551]
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0552]
本发明的序列信息
[0553]
表28 GITR抗体重链和轻链氨基酸序列编号
[0554]
[0555]
表29 GITR抗体重链和轻链核苷酸序列编号
[0556]
[0557]
表30 序列信息
[0558]
[0559]
[0560]
[0561]
[0562]
[0563]
[0564]
注明:CDR划分采用Kabat划分方法。

权利要求书

[权利要求 1]
一种抗体的重链可变区,其特征在于,所述的重链可变区具有选自下组的互补决定区CDR: SEQ ID NO:8n+2所示的VH-CDR1, SEQ ID NO:8n+3所示的VH-CDR2,和 SEQ ID NO:8n+4所示的VH-CDR3; 其中,各n独立地为0、1、2或3; 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 2]
一种抗体的重链,其特征在于,所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区。
[权利要求 3]
一种抗体的轻链可变区,其特征在于,所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR: SEQ ID NO:8n+6所示的VL-CDR1, SEQ ID NO:8n+7所示的VL-CDR2,和 SEQ ID NO:8n+8所示的VL-CDR3; 其中,各n独立地为0、1、2或3; 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 4]
一种抗体的轻链,其特征在于,所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区。
[权利要求 5]
一种抗体,其特征在于,所述抗体具有: (1)如权利要求1所述的重链可变区;和/或 (2)如权利要求3所述的轻链可变区; 或者,所述抗体具有:如权利要求2所述的重链;和/或如权利要求4所述的轻链, 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 6]
如权利要求5所述的抗体,其特征在于,所述的抗体具有如权利要求1所述 的重链可变区和如权利要求3所述的轻链可变区; 其中,所述的重链可变区和所述的轻链可变区包括选自下组的CDR: 其中,上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的,并能够保留GITR结合亲和力的衍生序列。
[权利要求 7]
如权利要求5所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1、9、17、25、41、42、44或46所示的氨基酸序列;和/或所述抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:5、13、21、29、47、48或49所示的氨基酸序列。
[权利要求 8]
如权利要求6所述的抗体,其特征在于,所述的抗体选自下组: [表0001]
抗体编号 克隆 VH序列编号 VL序列编号
1(3503-mAb019) 96A10H9 1 5
2(3503-mAb070) 272G5E1 9 13
3(3503-mAb076) 277C12G4 17 21
4(3503-mAb064) 265G9A11 25 29
5(3503-hab019e1) 96A10H9 41 5
6(3503-hab019e2) 96A10H9 42 5
7(3503-hab019e3) 96A10H9 44 5
8(3503-hab070e1) 272G5E1 9 48
9(3503-hab076e1) 277C12G4 17 49
10(3503-hab064e1) 265G9A11 46 47。

[权利要求 9]
一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白包括: (i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体;以及 (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[权利要求 10]
一种多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸编码选自下组的多肽: (1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体;以及 (2)如权利要求9所述的重组蛋白。
[权利要求 11]
如权利要求10所述的多核苷酸,其特征在于,编码所述重链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:33、35、37、39、50、51、52或53所示;和/或,编码所述轻链可变区的多核苷酸如SEQ ID NO:34、36、38、40、54、55或56所示。
[权利要求 12]
如权利要求11所述的多核苷酸,其特征在于,编码所述重链可变区序列的多核苷酸和编码所述轻链可变区序列的多核苷酸选自下组:
[权利要求 13]
一种载体,其特征在于,所述载体含有本发明权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
[权利要求 14]
一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞含有权利要求13所述的载体或基因组中整合有权利要求10-12中任一项所述的多核苷酸。
[权利要求 15]
一种抗体偶联物,其特征在于,该抗体偶联物含有: (a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、或其组合;和 (b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。
[权利要求 16]
一种免疫细胞,其特征在于,所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有权利要求5-8中任一项所述的抗体。
[权利要求 17]
一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物含有: (i)活性成分,所述活性成分选自下组:如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5-8中任一项所述的抗体、如权利要求9所述的重组蛋白、如权利要求15所述的抗体偶联物、权利要求16所述的免疫细胞、或其组合;以及 (ii)药学上可接受的载体。

附图

[ 图 1]  
[ 图 2]  
[ 图 2(续)]  
[ 图 3]  
[ 图 4]  
[ 图 5]  
[ 图 5(续)]  
[ 图 6]  
[ 图 7]  
[ 图 8]  
[ 图 8(续)]  
[ 图 9]  
[ 图 9(续)]  
[ 图 10]  
[ 图 11]  
[ 图 12]