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1. WO2020064478 - METHOD FOR CHARACTERIZATION OF MODIFICATIONS CAUSED BY THE USE OF DESIGNER NUCLEASES

Publication Number WO/2020/064478
Publication Date 02.04.2020
International Application No. PCT/EP2019/075101
International Filing Date 19.09.2019
IPC
C12Q 1/6848 2018.01
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
68involving nucleic acids
6844Nucleic acid amplification reactions
6848characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
C12Q 1/6869 2018.01
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
68involving nucleic acids
6869Methods for sequencing
CPC
C12Q 1/6848
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms
68involving nucleic acids
6844Nucleic acid amplification reactions
6848characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
C12Q 1/6869
CCHEMISTRY; METALLURGY
12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS
1Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms
68involving nucleic acids
6869Methods for sequencing
Applicants
  • ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITÄT FREIBURG [DE]/[DE]
  • DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM STIFTUNG DES ÖFFENTLICHEN RECHTS [DE]/[DE]
Inventors
  • CATHOMEN, Toni
  • TURCHIANO, Giandomenico
  • BLATTNER, Georges
  • MONACO, Gianni
  • BÖRRIES, Melanie
  • ANDRIEUX, Geoffroy
Agents
  • KELLER, Günter
  • BEST, Michael
  • TEIPEL, Stephan
  • KALHAMMER, Georg
  • BINDER, Jörg-Thomas
Priority Data
18196438.825.09.2018EP
Publication Language English (EN)
Filing Language English (EN)
Designated States
Title
(EN) METHOD FOR CHARACTERIZATION OF MODIFICATIONS CAUSED BY THE USE OF DESIGNER NUCLEASES
(FR) PROCÉDÉ DE CARACTÉRISATION DE MODIFICATIONS PROVOQUÉES PAR L'UTILISATION DE NUCLÉASES DE CONCEPTEUR
Abstract
(EN)
Disclosed is a method for high-throughput detection of genome-wide modifications in a nucleic acid genome obtained from a cell or tissue caused by the activity of a designer nuclease comprising the following steps: a) Extraction of the genomic DNA from cells that were exposed to a designer nuclease under conditions which allow the designer nuclease to introduce a DNA double-strand break (DSB) in the genomic DNA of the cell, b) fragmentation of the nucleic acid to obtain random fragments, c) performing an end repair in order to obtain blunt ends, d) ligation with a linker comprising a sequence complementary to a so called "linker primer", e) performing a first nucleic acid amplification reaction with a "linker primer" and a so called "ON-target primer", whereby one primer is located upstream and one primer is located downstream of the on-target site, wherein at least one decoy primer is present in the reaction mixture, f) performing a second nucleic acid amplification reaction whereby so called "nested primers" are added to the reaction mixture, whereby one primer is complementary to the on-target locus and one primer complementary to the linker sequence, 9) performing a further nucleic acid amplification reaction whereby at least one code containing primers are added to the reaction mixture, h) sequencing of the nested and barcoded amplification product, and i) aligning the sequenced products with suitable bioinformatic means to a reference sequence to identify a chromosomal location that contains a genomic modification based on at least one DNA double strand break.
(FR)
L'invention concerne un procédé de détection à haut rendement de modifications à l'échelle du génome dans un génome d'acide nucléique obtenu à partir d'une cellule ou d'un tissu provoqué par l'activité d'une nucléase de conception comprenant les étapes suivantes : a) extraction de l'ADN génomique à partir de cellules qui ont été exposées à une nucléase de concepteur dans des conditions qui permettent à la nucléase de concepteur d'introduire une cassure double brin (CDB) de l’ADN dans l'ADN génomique de la cellule, b) fragmentation de l'acide nucléique pour obtenir des fragments aléatoires, c) réalisation d'une réparation d’extrémité afin d'obtenir des extrémités franches, d) ligature avec un lieur comprenant une séquence complémentaire à une "amorce de liaison",e) réalisation d'une première réaction d'amplification d'acide nucléique avec une "amorce de liaison" et une "amorce sur site", une amorce étant située en amont et une amorce étant située en aval du site sur cible, au moins une amorce leurre étant présente dans le mélange réactionnel, f) réalisation d'une seconde réaction d'amplification d'acide nucléique par laquelle des "amorces imbriquées" sont ajoutées au mélange réactionnel, une amorce étant complémentaire du locus sur cible et une amorce complémentaire de la séquence de liaison, g) réalisation d'une autre réaction d'amplification d'acide nucléique, au moins un code contenant des amorces étant ajouté au mélange réactionnel, h) séquençage du produit d'amplification imbriqué et à code à barres, et i) alignement des produits séquencés avec des moyens bioinformatiques appropriés à une séquence de référence pour identifier un emplacement chromosomique qui contient une modification génomique sur la base d'au moins une cassure double brin de l'ADN.
Also published as
Latest bibliographic data on file with the International Bureau