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1. (WO2019062799) METHOD FOR DETECTING CELL SURFACE HOLES USING ATOMIC FORCE MICROSCOPE
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说明书

发明名称 0001   0002   0003   0004   0005   0006   0007   0008   0009   0010   0011   0012   0013   0014   0015   0016   0017   0018   0019   0020   0021   0022   0023   0024   0025   0026   0027   0028   0029   0030   0031   0032   0033   0034   0035   0036   0037   0038   0039   0040   0041   0042   0043   0044   0045   0046   0047   0048   0049   0050   0051   0052   0053   0054   0055   0056   0057   0058   0059   0060   0061   0062   0063   0064   0065   0066   0067   0068   0069   0070   0071   0072   0073   0074   0075   0076  

权利要求书

1   2   3   4   5   6  

附图

1A   1B   1C   1D   1E   1F   1G   1H   1I   2A   2B   2C   3A   3B   3C   3D   3E   3F   3G   3H   3I   3J   3K   3L   4   5A   5B   6A   6B  

说明书

发明名称 : 一种采用原子力显微镜检测细胞表面孔洞的方法

技术领域

[0001]
本申请涉及生物技术领域。更具体而言,涉及一种利用原子力显微镜检测细胞(尤其是活细胞)表面特征的方法。尤其是,涉及一种利用原子力显微镜检测细胞(尤其是活细胞)表面孔洞的方法。

背景技术

[0002]
细胞死亡的起初是在细胞膜上形成一个个孔洞,进而细胞被杀灭。这些细胞膜上孔洞的形成在免疫监控、病原清除以及炎症性疾病方面都具有重要的作用。
[0003]
目前,已经鉴定出有几类分子可以在细胞膜上打孔,例如,T细胞或者NK细胞释放的穿孔素、以及炎症小体激活的GSDMD/GSDME等。但是,至今为止,没有文献报道显示细胞膜上的这些孔洞。尽管有报道显示人工合成的脂质膜上的孔洞(The EMBO Journal.2016;35:1766-1778),人工脂质膜不是真正的细胞膜。
[0004]
原子力显微镜(atomic force microscope,简称AFM)利用微悬臂感受和放大悬臂上的尖细探针与待测试细胞之间的作用力,对细胞进行无损伤扫描,最终获得至少纳米级别分辨率的细胞形貌图。
[0005]
原子力显微镜涉及这样的原理过程:原子力显微镜包括两个关键部件探针(Probe)和扫描管(Scanner);当探针和样品接近到一定程度时,如果有一个足够灵敏且随探针-样品距离单调变化的物理量P=P(z),那么该物理量可以用于反馈系统(Feedback System,FS),通过扫描管的移动来控制探针-样品间的距离,从而描绘材料的表面性质。
[0006]
以形貌成像为例:为了得到表面的形貌信息,扫描管控制探针的针尖在距离样品表面足够近的范围内移动,探测两者之间的相互作用;在作用范围内,探针产生信号来表示随着探针-样品距离的不同相互作用的大小,这个信号称为探测信号(Detector Signal)。
[0007]
为了使探测信号与实际作用相联系,需要预先设定参考阈值(Setpoint),当扫描管移动使得探针进入成像区域中时,系统检测探 测信号并与阈值比较,当两者相等时,开始扫描过程。
[0008]
扫描管控制探针在样品表面上方精确地按照预设的轨迹运动。当探针遇到表面形貌的变化时,由于探针和样品间的相互作用变化了,导致探测信号改变。因此,与阈值产生一个差值,叫做误差信号(Error Signal)。原子力显微镜使用Z向反馈来保证探针能够精确跟踪表面形貌的起伏。Z向反馈回路连续不断地将探测信号和阈值相比较,如果两者不等,则在扫描管上施加一定的电压来增大或减小探针与样品之间的距离,使误差信号归零。同时,软件系统利用所施加的电压信号来生成原子力显微镜图像。
[0009]
目前,已有报道将原子力显微镜应用于检测宫颈脱落细胞的刚度(CN104655879);CN105527462A公开了一种利用原子力显微镜来测量单个活心肌细胞动作电位及搏动力的方法。
[0010]
CN106199078A公开了一种原子力显微镜快速精确表征活体细胞表面形貌的方法。马亚敏等人(中国实验诊断学,2005,9(04):514-518;硕士论文《原子力显微镜对八种溶液及经溶液处理后人红细胞形态结构的观察》2004年)利用原子力显微镜观察人红细胞在不同溶液中细胞膜表面的细微结构;这种方法观察到红细胞的形态呈双凹圆盘状、细胞膜表面细微结构清晰、可见细胞膜表面有孔洞和条形隆起。
[0011]
然而,在上面这些方法中都未能实现对细胞表面的细微结构(例如,细胞死亡初期所形成的细小孔洞)的观测。在马亚敏等人2005所描述的方法中,虽然观察到了红细胞表面的“孔洞”,但是这里所说的“孔洞”准确而言应当理解为红细胞膜折叠而形成的凹陷,其细胞双分子层完整性并未遭到破坏;并且所用的探测参数尚不能实现对更加细小孔洞(例如,细胞死亡初期所形成的细小孔洞)的观测。再者,红细胞没有细胞核,和有核的活细胞相比在AFM检测中的表面受力是不同的。有细胞核的位置细胞硬度较大,而没有细胞核的位置细胞相对较软,这就导致在检测中对AFM各项参数的要求千差万别。
[0012]
鉴于上述原因,本领域仍然需要一种分辨率更高的方法来检测活细胞表面孔洞的方法。
[0013]
发明内容
[0014]
根据一些实施方式,本公开提供了一种利用原子力显微镜观测细胞膜上的孔洞的高分辨率方法。
[0015]
根据一些实施方式,本公开提供了一种检测细胞膜孔洞的方法,其包括步骤:
[0016]
1)提供细胞;
[0017]
2)任选固定或不固定所述细胞;以及
[0018]
3)用原子力显微镜观测所述细胞。
[0019]
在一些实施方式中,可以通过本领域公知的任何方法提供细胞,包括但不限于:细胞经培养、分离、洗涤之后,而提供细胞;也可以从生物体获得、分离细胞。
[0020]
在一些实施方式中,所提供的细胞是活细胞。即便所述细胞即将进入、或已经进入细胞坏死、细胞凋亡(程序性死亡)或者细胞焦亡的过程,该细胞仍处于活的状态。
[0021]
在一些实施方式中,所提供的细胞可以是动物、植物或微生物细胞。本公开的方法不依赖于细胞的具体物种,只要其具有双分子层细胞膜结构,均可以用本公开的方法进行观察。技术人员理解,有些植物细胞有细胞壁,用酶将细胞壁去掉后,仍适用于本公开的检测方法。
[0022]
在一些具体的实施方式中,所提供的细胞含有细胞核。
[0023]
在一些实施方式中,固定所述细胞更便于随后AFM观察。因此,任何本领域中,和AFM观察兼容的固定方法均可以用于本公开的方法。例如,在一些具体的实施方式中,用按体积比4%多聚甲醛固定5至15分钟。
[0024]
任选地,在原子力显微镜观察细胞之前,将固定的细胞在环境温度(例如,18至28℃)自然晾干。
[0025]
在一些实施方式中,所述的孔洞存在于:所述细胞膜之中、或贯穿所述细胞膜。
[0026]
在一些实施方式中,所述的孔洞涉及所述细胞膜完整性的破坏;或者涉及细胞膜双分子层连续性的破坏。
[0027]
在一些实施方式中,将原子力显微镜设置为轻敲模式。
[0028]
在本领域中,峰值力轻敲模式(Tapping Mode)涉及这样的原理过程:系统采用1至8kHz的频率在整个表面做力曲线,利用峰值力 做反馈,通过扫描管的移动来保持探针和样品之间的峰值力恒定,从而反映出表面形貌。
[0029]
峰值力轻敲模式的优点是直接用力做反馈使得探针和样品间的相互作用可以很小,这样就能够对很黏很软的样品成像;同时,使用力直接作为反馈,可以直接定量得到表面的力学信息。
[0030]
在一些实施方式中,探针的弹性常数为0.1N m -1至1N m -1,优选0.1N m -1至0.4N m -1
[0031]
在一些实施方式中,探针的选择曲率半径为2nm至70nm;优选2nm至20nm;更优选2nm至5nm。
[0032]
在一些实施方式中,将原子力显微镜工作温度设置为18℃至28℃,更优选20℃至24℃。
[0033]
在一些实施方式中,将原子力显微镜的成像力设置为0.5nN至10nN;优选0.5nN至6nN。
[0034]
在一些实施方式中,将峰值力轻敲模式的成像频率设置为1kHz至8kHz;优选1kHz至2kHz。
[0035]
在一些实施方式中,将峰值力轻敲模式的成像振幅设置为5nm至200nm;优选50nm至150nm。
[0036]
在一些实施方式中,将峰值力轻敲模式的成像增益设置为2至40;优选20至30。
[0037]
在一些实施方式中,细胞的孔洞是由于以下因素:细胞准备进入或已经进入细胞死亡过程,而产生的孔洞;物理因素所致孔洞;化学因素所致孔洞。
[0038]
在一些实施方式中,细胞死亡可以是细胞坏死;或细胞凋亡(也作程序性死亡)。
[0039]
在一些实施方式中,物理因素包括但不限于机械力、辐射或温度。
[0040]
在一些实施方式中,所述化学因素选自:穿孔素、颗粒酶、GSDMD/E、变性剂(如Triton X-100)。

附图说明

[0041]
图1A至1I:经SLO、Per处理、PBS处理的OVA-B16细胞的AFM形貌图。
[0042]
图2A至2C:局部放大的AFM图像(2μm)。
[0043]
图3A至3L:局部细胞形貌图及其剖面分析。
[0044]
图4:细胞膜上的孔洞数目。
[0045]
图5A至5B:细胞膜的孔洞尺寸比较。
[0046]
图6A至6B:经SLO或PBS处理的OVA-B16活细胞的AFM形貌图。

具体实施方式

[0047]
实施例1
[0048]
1.细胞培养
[0049]
OVA-B16细胞(黑色素瘤细胞系)培养于35mm细胞培养皿中。
[0050]
分别用PBS(对照组)、重组穿孔素(SLO组)、或者从T细胞分离的穿孔素(Per组)刺激15分钟后。
[0051]
2.样本处理
[0052]
细胞处理后,用PBS清洗两次,然后4%多聚甲醛固定10分钟,室温晾干后可在原子力显微镜下观察。
[0053]
3.原子力显微镜(AFM)参数设置
[0054]
基于力-距离曲线的原子力显微镜是由原布鲁克Dimension ICON原子力显微镜,将其设置成峰值力轻敲模式。
[0055]
原子力显微镜装有90μm的压电扫描器。
[0056]
所用的原子力显微镜的探针悬臂(布鲁克ScanAsyst-Air型):弹性常数标称值为0.4N m -1且曲率半径标称值为2nm的硅探针。
[0057]
基于力-距离曲线的原子力显微镜的工作温度为室温20-24℃,存放于噪音隔离箱内。
[0058]
成像力设置为1nN。
[0059]
峰值力轻敲模式的频率和振幅分别设置为2kHz和50nm;拍摄的图像用Nanoscope软件分析处理。
[0060]
为了检测轻敲模式图像中每个孔的深度和宽度,需要把每张图像拉平。检测孔的直径时,包括对长轴和短轴的检测。检测孔的深度,应从最突出的边缘到最凹的边缘。
[0061]
4.试验结果
[0062]
AFM大体形貌图显示:经SLO(图1B、1E、1H)或者Per处理(图1C、1F、1I)的OVA-B16细胞,其表面相比对照组(图1A、1D、1G)粗糙。
[0063]
进一步放大局部AFM图像(2μm)。结果显示,在SLO-或者Per-处理组,其细胞膜表面都有明显的黑洞形成,而在对照组则没有孔洞形成(图2A至2C)。
[0064]
细胞局部三维AFM形貌图也进一步证实了SLO-或者Per-处理组其细胞膜上存在明显的孔洞。我们进而对这些高分辨率的局部细胞形貌图进行剖面分析。结果显示:在对照组,剖面图显示所选的区域处于一个斜面(图3A至3D)。但是,在SLO处理组,剖面曲线图显示在所示区域出现明显的孔洞,检测其长轴的直径为248±19nm,短轴直径为202±11nm,其孔洞的深度约为50nm(图3E至3H;图5A至5B)。Per处理导致细胞膜的孔径进一步增大,其长轴直径为594±50nm,短轴直径为476±40nm,其孔洞深度约为150nm(图3I至3L;图5A至5B)。
[0065]
进而,我们计数这些细胞膜上的孔洞数目,发现在5μm×5μm 2的区域内,对照组很少有孔洞形成。但是,SLO或者Per处理组有6-10个孔洞形成(图4)。
[0066]
分辨率可以达到1nm的水平。
[0067]
上述结果充分证实通过AFM检测,我们可以清楚地看到OVA-B16细胞其细胞膜上孔洞的存在并且能精确地知道其孔洞的大小以及深度。
[0068]
实施例2
[0069]
1.细胞培养
[0070]
OVA-B16细胞(黑色素瘤细胞系)培养于35mm细胞培养皿中。分别用PBS(对照组)、重组穿孔素(SLO组)刺激15分钟后。
[0071]
2.样本处理
[0072]
细胞处理后,用PBS清洗两次,然后室温晾干后可在原子力显微镜下观察。
[0073]
3.原子力显微镜(AFM)参数设置
[0074]
除探针的曲率半径约63nm之外,其它参数同实施例1。
[0075]
4.试验结果
[0076]
用AFM检测活细胞表面,也可以得到和实施例1中相同的形貌结果。AFM大体形貌图显示:经SLO处理的OVA-B16细胞(图6A)显示有明显孔洞存在,其表面相比对照组(图6B)粗糙。分辨率同实施例1。

权利要求书

[权利要求 1]
一种检测细胞膜孔洞的方法,其包括步骤: -提供细胞; -任选地,固定所述细胞;以及 -用原子力显微镜观测所述细胞; 其中,所述的孔洞存在于所述细胞膜之中、或贯穿所述细胞膜; 其中,所述的孔洞涉及所述细胞膜完整性的破坏、或者涉及细胞膜双分子层连续性的破坏; 所述原子力显微镜的设置如下: -峰值力轻敲模式; -探针的弹性常数为0.1至1N m -1,优选0.1至0.4N m -1; -探针的曲率半径为2至70nm;优选2至20nm;更优选2至5nm; -工作温度:18℃至28℃,更优选20℃至24℃; -成像力:0.5至10nN;优选0.5至6nN; -频率:1至8kHz;优选1至2kHz; -振幅:5至200nm;优选50至150nm; -增益:2至40;优选20至30。
[权利要求 2]
根据权利要求1所述的方法,其中: 所述的细胞是活细胞; 所述的细胞选自:动物细胞、微生物细胞、植物细胞、或其组合; 优选,所述的细胞是有细胞核的活细胞。
[权利要求 3]
根据权利要求1所述的方法,其中, 所述的孔洞是选自以下的任一项:细胞死亡过程中所产生的孔洞、物理因素所致孔洞、化学因素所致孔洞、或其组合; 所述细胞死亡是细胞坏死、细胞凋亡或者细胞焦亡; 优选,所述物理因素选自:机械力、辐射、温度、或其组合; 优选,所述化学因素选自:穿孔素、颗粒酶、GSDMD/E、变性剂、或其组合; 其中所述变性剂是Triton X-100。
[权利要求 4]
根据权利要求1所述的方法,其中所述的固定是通过以下步骤进行的:用固定液将细胞固定5分钟至15分钟; 优选地,所述的固定液选自以下的任一项:按体积比4%多聚甲醛、酒精、冰醋酸溶液、改良卡诺氏固定液、或其组合。
[权利要求 5]
根据权利要求4所述的方法,其中 在固定步骤之后,还包括在18℃至28℃晾干的步骤。
[权利要求 6]
根据权利要求1所述的方法,其包括步骤: -提供细胞; -任选,将所述细胞用4%多聚甲醛固定8至11分钟; -在18℃至28℃晾干所述细胞,以及 -用原子力显微镜观测所述细胞的孔洞; 其中,所述的孔洞存在于所述细胞膜之中、或贯穿所述细胞膜; 其中,所述的孔洞涉及细胞膜双分子层连续性的破坏; 所述原子力显微镜的设置如下: -峰值力轻敲模式; -探针的弹性常数为0.4N m -1; -探针的曲率半径为2nm或63nm; -工作温度:20℃至24℃; -成像力:1nN; -频率:2kHz; -振幅:50nm; -增益:20至30。

附图

[ 图 1A]  
[ 图 1B]  
[ 图 1C]  
[ 图 1D]  
[ 图 1E]  
[ 图 1F]  
[ 图 1G]  
[ 图 1H]  
[ 图 1I]  
[ 图 2A]  
[ 图 2B]  
[ 图 2C]  
[ 图 3A]  
[ 图 3B]  
[ 图 3C]  
[ 图 3D]  
[ 图 3E]  
[ 图 3F]  
[ 图 3G]  
[ 图 3H]  
[ 图 3I]  
[ 图 3J]  
[ 图 3K]  
[ 图 3L]  
[ 图 4]  
[ 图 5A]  
[ 图 5B]  
[ 图 6A]  
[ 图 6B]