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1. (WO2019009640) METHOD FOR PREPARING INFLUENZA WORKING VIRUS SEED STOCK, METHOD FOR PREPARING INFLUENZA VACCINE USING SAME SEED STOCK, AND VIRUS SEED STOCK PREPARED BY SAME METHOD
Document

명세서

발명의 명칭

기술분야

1   2  

배경기술

3   4   5   6   7  

발명의 상세한 설명

기술적 과제

8   9   10  

과제 해결 수단

11   12   13   14   15  

발명의 효과

16   17   18  

발명의 실시를 위한 형태

19   20   21   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65  

청구범위

1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14  

명세서

발명의 명칭 : 인플루엔자 백신용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법, 상기 씨드 스톡을 이용한 인플루엔자 예방 백신의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이러스 씨드 스톡

기술분야

[1]
본 발명은 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡(Influenza Working Virus Seed Stock)의 제조 방법 및 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력을 증가시키는 방법, 상기 씨드 시톡을 이용한 인플루엔자 예방 백신의 제조 방법, 상기 방법을 이용해 제조된 인플루엔자 예방 백신 및 감염력이 증가된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡에 관한 것이다.
[2]

배경기술

[3]
인플루엔자 바이러스는 80~120nm 크기의 Orthomyxoviridae과에 속하는 막을 가진 RNA 바이러스로 A, B, C 등의 세 가지 형태가 존재하며, A형의 경우 돼지, 말, 사람, 조류 등에 모두 감염성이 있는 반면, 나머지 B와 C형은 사람에게만 감염된다. A형 바이러스는 18 종류의 헤마글루티닌(Hemagglutinin, HA)과 11 종류의 뉴라미니데이즈(Neuraminidase, NA)의 조합으로 더 세분화된 아형(subtype)들이 존재하며, B형과 C형에 있어서는 아형은 알려져 있지 않다.
[4]
인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스이므로 DNA 바이러스에 비하여 변이가 광범위하고 빈번하게 발생한다. 따라서, 타 백신과 달리 인플루엔자 백신은 WHO가 해마다 권고하는 백신주를 이용하여 매 해마다 새로이 제조되고 접종하도록 되어 있다. 이러한 계절성 인플루엔자 바이러스는 대개 A/H1N1, A/H3N2, B/Yamagata, B/Victoria 혈청형 등으로 구성된다. 이 외에, 변이로 인하여 항원성이 변함으로써 사람에게 기존에 면역이 없는 새로운 인플루엔자 바이러스가 나타나게 되면, 전 세계를 휩쓰는 대유행이 발생할 수 있으며 이들을 대유행 인플루엔자(Pandemic influenza) 바이러스라 하고 이러한 가능성이 있는 바이러스로 WHO는 H5 및 H7 혈청형을 주시하고 있다.
[5]
WHO는 백신 제조사들이 백신 제조 시 사용할 수 있도록 계절성 및 대유행 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 백신주를 공고 및 분양하고 있으며 이러한 백신주는 wild type, reassortment, reverse genetics 등 다양한 방법을 이용하여 준비된다. 각 백신 제조사들은 이렇게 준비된 백신주를 이용하여 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하게 되는데 이 때, 여러 배치에 사용할 수 있을 만큼 충분한 양으로 증대되고 높은 감염력을 지니는 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡 제조 방법이 요구된다.
[6]
세포배양을 이용하여 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조할 때 보통 일정 범위 내의 MOI(multiplicity of infection)를 기반으로 바이러스를 감염시킨다. MOI는 감염 세포에 대한 감염된 바이러스의 비율로서 인플루엔자 바이러스의 감염력 측정을 위한 plaque assay를 통하여 결정되며, plaque assay는 대개 3일 내지 7일의 기간이 소요된다. Heamagglutination assay(이하, 'HA assay'라 한다) 에서 HA 역가가 높은 것을 선택하거나, Plaque assay에서는 PFU(Plaque-forming unit) 역가를 비교하여 가장 높은 PFU 역가를 보이는 것을 선택하게 된다.
[7]

발명의 상세한 설명

기술적 과제

[8]
본 발명에서 해결하고자 하는 일 과제는 초기 분양 받은 바이러스에 비해 감염력이 개선된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법을 제공하는 것이며, 이로써, 단기간에 효율적으로 인플루엔자 예방 백신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
[9]
본 발명의 다른 일 과제는, 인플루엔자 예방 백신의 제조에 있어서 시간 및 비용을 단축시켜 제조 효율성을 증대시키고자 한다.
[10]

과제 해결 수단

[11]
본 발명의 일 양태는 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 방법으로, 상기 계대에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후 계대에 사용하는 것을 포함하는, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법에 관한 것이다.
[12]
본 발명의 다른 양태는, 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 것을 포함하며, 상기 계대에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후 계대에 사용하는 것을 포함하는 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
[13]
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 양태에 따라 제조되거나 상기 양태에 따라 감염력이 증가된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 대량 생산하고 이를 약독화 또는 불활성화시켜 인플루엔자 예방 백신을 제조하는 방법이 제공된다.
[14]
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 방법에 의해 제조된 감염력이 증가된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡 또는 상기 방법에 의해 제조된 인플루엔자 예방 백신이 제공된다.
[15]

발명의 효과

[16]
본 발명의 일 양태에 따른 제조 방법은 인플루엔자 바이러스의 감염력 측정을 위한 plaque assay를 생략함으로써 단기간에 효율적으로 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제공할 수 있다.
[17]
본 발명의 일 양태에 따른 방법은 분양 받은 초기 인플루엔자 바이러스에 비해 감염력이 증가된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제공하여, 인플루엔자 백신의 제조에 있어서 시간과 비용을 단축할 수 있어 대량 생산에 있어서 경제적인 이점이 있다.
[18]

발명의 실시를 위한 형태

[19]
본 발명의 일 양태는 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 방법으로, 상기 계대 배양에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후의 계대에 사용하는 것을 포함하는, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법에 관한 것이다.
[20]
본원에서 표현된 '무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주'란, 혈청이 실질적으로 첨가되지 않은 배지에 적응되어 있으며, 또한, 담체가 실질적으로 없는 상태에서 부유 배양(suspension culture)에 적응된 세포주를 말한다. 상기 "혈청이 실질적으로 첨가되지 않은"은 혈청을 0.5 v/v% 이하, 구체적으로는 0.2 v/v% 이하, 더욱 구체적으로는 0.01 v/v% 이하, 또는 전혀 첨가되지 않은 것을 의미한다. 상기 "담체가 실질적으로 없는"은 담체가 0.5 v/v% 이하, 구체적으로는 0.2 v/v% 이하, 더욱 구체적으로는 0.01 v/v% 이하, 또는 전혀 존재하지 않는 것을 의미한다. 상기 '적응된' 세포주란 무혈청 배양 및 부유 배양에서 증식가능한 세포주를 말한다.
[21]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주의 예로는 MDCK 세포주를 들 수 있으며, 구체적으로, MDCK B-702, MDCK KCLRF-BP-00297, MDCK Sky1023(DSM ACC3112), MDCK Sky10234(DSM ACC3114), MDCK Sky3851(DSM ACC3113) 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 MDCK Sky1023(DSM ACC3112), MDCK Sky10234(DSM ACC3114), MDCK Sky3851(DSM ACC3113)를 들 수 있다. 상기 세포주에서 바이러스를 계대 배양하여 분양 초기 대비 바이러스의 감염력을 보다 증가시킬 수 있다.
[22]
인플루엔자 바이러스는, 인간 인플루엔자 바이러스 또는 조류 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스인 경우 바이러스 A, B 또는 C일 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 외부 외피에 적어도 2개의 다른 표면 당단백질 항원인, 3개의 HA 단량체로 이루어진 헤마글루티닌(HA) 삼량체 및 사량체로 존재하는 뉴라미니다제(NA)를 가진다. HA 및 NA 모두 감염되기 쉬운 세포 내로 감염 시 면역원성이 커서 특이적인 항체 반응을 일으킨다. HA 및 NA 당단백질의 특성에 따라 인플루엔자 A 바이러스 서브 타입이 있다. 현재까지 18개의 HA(H1부터 H18) 및 11개의 NA(N1부터 N11까지)가 확인되었다. 일 예에서, 인플루엔자 바이러스 A의 서브 타입으로는 H5N1, H9N1, H7N7, H2N2, H7N1 또는 H1N1, H1N2, H3N2, H3N8, H4N8, H5N2, H5N3, H5N8, H5N9, H6N5, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H8N4, H9N2, H10N7, H11N7, H11N6, H12N5, H13N6, H14N5 등일 수 있다.
[23]
인플루엔자 바이러스 B는 인플루엔자 A 바이러스와 명백히 구별되며, 인간 중에서도 특히 어린 아이들을 감염시킨다.
[24]
인플루엔자 바이러스는 구체예에서 WHO 등에서 계절성 및 대유행 가능성 있다고 판단하여 분양하고 있는 바이러스일 수 있다.
[25]
분양 받은 인플루엔자 바이러스를 여러 희석 배수로 희석하고, 각 희석된 샘플을 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주에서 2회 이상 계대 배양할 수 있다. 1차 계대 시 인플루엔자 바이러스를 예컨데 1/1배 내지 1/10,000배, 또는 1/1배 내지 1/1,000배, 구체적으로 1/10배, 1/100배, 1/1000배 등의 여러 배수로 희석하여 일정량을 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주에 감염시킨다. 이후 배양 조건은 32℃ 내지 38℃에서, 10 rpm 내지 150 rpm의 교반 속도로, 4일 이하 동안, 구체적으로 1일 내지 3일 동안 배양할 수 있다. 이 때 배지에 트립신을 임의로 추가할 수 있으며, 이의 농도는 1 μg/mL 내지 10 μg/mL의 범위일 수 있다. 임의로, 약 1% 내지 약 10%의 CO 2의 존재 하에 배양할 수 있다. 상기 감염 시 세포주의 농도는 약 1.0E+4 cell/ml 내지 1.0E+8 cell/ml의 범위 구체적으로는 약 1.0E+5 cell/ml 내지 1.0E+7 cell/ml일 수 있다.
[26]
인플루엔자 바이러스의 적절한 수득 시점을 확인하기 위해 1DPI, 2DPI(Days post infection) 등에서 각 감염 희석 배수 별로 세포 생존도(cell viability) 및 HA 역가를 측정한다. 인플루엔자 바이러스의 수득 대상 및 시점은 상기 측정된 세포 생존도 및 HA 역가를 모두 고려하여 결정될 수 있다. 구체적으로는 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후 계대에 이용할 수 있다. 바이러스 배양액을 선택할 때 HA 역가가 가장 높은 것을 선택하는 것이 일반적이다. 하지만, 본원 발명에 이르러 세포 생존도를 우선적으로 고려해야 감염력이 높은 바이러스를 제조할 수 있음을 밝혀내었다. 구체적으로 세포 생존도는 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상 또는 약 100%, 또는 상기 수치 중 임의의 범위인 것이 좋다. 인플루엔자 바이러스의 적절한 수득 대상 및 시점을 판단함에 있어서 세포 생존도를 고려해야 한다는 것은 통상적인 기술 인식을 벗어나는 것이다. 종래에는 HA 역가가 최고치인 시점만을 고려하고 세포 생존도는 고려 대상이 아니었다. 따라서, HA 역가만으로 선택한 배양액은 세포 생존도는 최고점을 지나친 경우가 많았다. 그러나, 본원 발명에 이르러 세포 생존도가 가장 높은 배양액을 선택할 때 감염력이 높은 바이러스가 제조됨을 밝혀내었다. HA 역가는 0, 또는 약 100 이상, 약 200 이상, 약 300 이상, 약 400 이상, 약 500 이상, 구체적으로 1000 이상, 1100 이상, 1200 이상, 1300 이상, 또는 1400 이상, 보다 구체적으로는 1500 이상, 또는 상기 수치들 중 임의의 선택된 범위인 것을 선택할 수 있다. 다만, 여러 감염 희석 배수의 배양액에서 HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)만을 비교 시 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수를 선택하는 것이 좋다. HA 역가가 4배 이상 차이 나는 경우, 세포 생존도보다는 HA 역가를 고려해야 감염력이 가장 높은 배양액을 선택할 수 있다.
[27]
세포 생존도 및 HA 역가는 여러 감염 희석 배수의 배양액 중 그 값을 상대적으로 비교하여 최적의 결과를 선택하는 것이 좋다. 일 예에서는 여러 감염 희석배수의 배양액 중에서 세포 생존도가 가장 높은 배양액을 우선적으로 선택하고, 세포 생존도가 동일하다면, HA 역가가 가장 높은 배양액을 선택할 수 있다. 일 예에서는 여러 감염 희석배수의 배양액 중에서 세포 생존도가 가장 높은 배양액을 우선적으로 선택하되, 세포 생존도가 더 낮은 배양액이 HA 역가에 있어서는 세포 생존도가 가장 높은 상기 배양액의 HA 역가에 비해 4배 이상 높은 경우에는 상기 세포 생존도가 더 낮은 배양액이 선택될 수 있다. 일 예에서 여러 감염 희석배수의 배양액 중에서 세포 생존도가 가장 높으면서도 동일한 생존도를 나타내는 배양액이 2개 이상 존재한다면, 이 중 HA 역가가 가장 높은 것을 선택할 수 있다.
[28]
상기 선택된 1차 배양액을 바로 이어서 연속해서 2차 이상 계대에 이용하거나, 또는 다음 이용 시까지 -50℃ 내지 -80℃의 온도 범위, 예컨데, -55℃ 내지 -70℃의 온도 범위에서 냉동 보관하고 이후 1회 이상 수회 계대할 수 있다.
[29]
이후, 2차 계대 배양은 1차 배양액을 또한, 여러 희석 배수로 희석하여 새로운 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주에 감염시킬 수 있다. 2차 계대의 방법은 상기 1차 계대에서와 같다. 희석 배수는 예컨데, 1/1 내지 1/10,000배일 수 있으나, 1차 배양 시 HA세포 생존도 및 HA 역가가 높았던 감염 희석 배수를 고려할 수 있다. 이후, 상기 1차 배양 시와 동일한 방법으로 배양하고, 또한, 동일한 방법으로 세포 생존도 및 HA 역가를 측정하여, 1차 배양액보다 동등 이상이면서 가장 높은 세포 생존도를 나타내는 배양액을 선별한다. 선별된 배양액을 수거하여 이를 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡(Seed stock)으로 설정할 수 있다.
[30]
선택적으로, 이후의 3차 또는 그 이상의 계대를 상기와 동일한 방법으로 진행할 수 있다. 2회 이상 계대함으로써, 계대 전의 초기 인플루엔자 바이러스, 예컨데 분양받은 인플루엔자 바이러스에 비해 plaque titer가 약 10배 이상, 구체적으로 약 100배 이상, 약 200배 이상, 약 300배 이상, 약 400배 이상 증가된 바이러스를 얻을 수 있다.
[31]
본 발명의 다른 양태는, 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 것을 포함하며, 상기 계대에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후의 계대에 사용하는 것을 포함하는 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기 양태는 전술한 양태에 대한 설명을 참고하여 실시할 수 있으므로, 중복 기재를 피하기 위해 상기 양태에 대한 설명은 생략하도록 한다.
[32]
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 양태에 따라 제조되거나 상기 양태에 따라 감염력이 증가된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 대량 생산하고 이를 약독화 또는 불활성화시켜 인플루엔자 예방 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태에 따라 제조된 바이러스는 감염력이 증가하여, 계대 전의 초기 바이러스(예: 분양 바이러스)에 비해 단시간에 다량의 바이러스를 제공함으로써 대량 생산에 적합할 수 있다. 약독화 또는 불활성화된 바이러스는, 불활성화된 전(whole) 바이러스, 정제된 바이러스 입자가 지질 외피를 용해시키는 세척제 또는 그 밖의 시약으로 붕괴된 서브-비리온(소위 스플리트 백신), 또는 정제된 HA 및 NA (서브유닛 백신)일 수 있다.
[33]
본 발명의 또 다른 양태는, 상기 방법에 의해 제조된 감염력이 증가된, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 또는 상기 방법에 의해 제조된 인플루엔자 예방 백신이 제공된다. 상기 감염력 증가는 약 10배 이상의 감염력 증가, 구체적으로는, plaque titer에서 약 10배 이상, 구체적으로 약 100배 이상, 약 200배 이상, 약 300배 이상, 약 400배 이상 증가를 나타낼 수 있다.
[34]
[35]
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[36]
실시예
[37]
< 실시예 1> 백신용 바이러스주 배양 시 세포 생존도와 HA 역가에 따른 감염력 차이
[38]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주(MDCK Sky3851)를 교반속도는 80rpm이고 배양 온도 34℃이고 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 여러 차례 계대 배양을 통하여 세포가 일정 수준 이상으로 자랐을 경우, 배지 교환 후 4개의 125mL spinner flask에 세포 농도가 3.0E+6 cells/mL ~ 4.0+E6 cells/mL이 되도록 넣고 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 본 실험에 사용된 바이러스는 2005년~2006년, 2009년~2010년 및 2016년~2017년 시즌 인플루엔자 백신주였으며, 바이러스 배양 조건은 표 1과 같다.
[39]
[표1] <바이러스 배양 조건>
배양 조건 설정 값
감염 시 세포 농도 3.0E+6 ~ 4.0E+6 cells/mL
배양 규모 125mL spinner flask
배양 기간 2~3일
Spinner flask 교반 회전 수 80rpm
온도 34℃
농도 5%
트립신 농도 5μg/mL

[40]
바이러스 배양 시, 인플루엔자 바이러스 백신주를 1~1/1,000배 희석하여 일정량 감염하였으며 적절한 수득 시점을 판단하기 위하여 세포 생존도(cell viability) 및 HA titer를 DPI(Days post infection)별로 확인하였다. 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도가 상이하고 HA 역가가 2배 또는 4배 차이 나는 희석배수의 배양액 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
[41]
[표2] <인플루엔자 백신주 별 세포 생존도 및 HA titer 차이에 따른 감염력>
인플루엔자 백신주 감염 시 희석배수 / 감염 용량 DPI 세포 생존도 (%) HA titer(HAU/50μL) Plaque titer(pfu/mL)
NYMC X-283A(A/Lisboa/32/2015) 1 / 20μL 1 80 256 2.20E+6
10 / 20μL 90 128 5.40E+7
NYMC X-157(A/New York/55/2004) 100 / 20μL 1 84 512 3.51E+7
1000 / 20μL 92 256 1.50E+8
B/Malaysia/2506/2004 10 / 20μL 1 91 4096 6.12E+8
100 / 20μL 98 2048 4.18E+9
NYMC X-275(A/Michigan/45/2015) 1000 / 20μL 2 80 512 4.80E+7
10000 / 20μL 90 128 2.78E+7
NYMC X-175C (A/Uruguay/716/2007) 10 / 20μL 2 89 1024 6.70E+8
1000 / 20μL 94 256 1.25E+8
NYMC BX-35(B/Brisbane/60/2008) 1 / 20μL 2 41 1024 1.40E+8
1000 / 20μL 82 256 6.80E+7

[42]
상기 표 2에서, 예컨데 NYMC X-283A (A/Lisboa/32/2015)의 인플루엔자 백신주의 경우, 1배와 10배의 감염 희석 배수의 배양액의 세포 생존도 및 HA 역가를 비교하면, 세포 생존도는 10배의 감염 희석 배수의 배양액(90%)이 1배의 감염 희석 배수의 배양액(80%)에서 보다 높고, HA 역가는 2배 낮았다. Plaque assay 결과는 HA 역가가 2배 낮더라도 세포 생존도가 높은 10배 감염 희석 배수의 배양액이 약 24.5배 높은 titer를 나타내는 것으로 확인되었다.
[43]
마찬가지로 NYMC X-157 (A/New York/55/2004)과 B/Malaysia/2506/2004의 인플루엔자 백신주도 HA 역가는 2배 낮더라도 세포 생존도가 높은 감염 희석 배수의 배양액이 더 높은 plaque titer를 나타내는 것으로 확인되었다.
[44]
한편, NYMC X-275(A/Michigan/45/2015) 인플루엔자 백신주의 경우, 1000배와 10000배 감염 희석 배수의 배양액의 세포 생존도 및 HA 역가를 비교하면, 세포 생존도는 10000배의 감염 희석 배수의 배양액(90%)이 1000배의 감염 희석 배수의 배양액(80%)에서 보다 높고, HA 역가는 4배 낮았다. Plaque assay 결과는 세포 생존도가 낮더라도 HA 역가가 4배 높은 1000배 감염 희석 배수의 배양액이 약 1.7배 높은 titer를 나타내는 것으로 확인되었다.
[45]
이와 마찬가지로, NYMC X-175C(A/Uruguay/716/2007)와 NYMC BX-35(B/Brisbane/60/2008) 인플루엔자 백신주도 세포 생존도는 낮더라도 HA 역가가 4배 높은 감염 희석 배수의 배양액이 더 높은 plaque titer를 나타내는 것으로 확인되었다.
[46]
[47]
< 실시예 2> 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡 제조 (규모 125mL spinner flask)
[48]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주(MDCK Sky3851)를 교반속도는 80rpm이고 배양 온도 34℃이고 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 여러 차례 계대 배양을 통하여 세포가 일정 수준 이상으로 자랐을 경우, 배지 교환 후 4개의 125mL spinner flask에 세포 농도가 3.0E+6 cells/mL ~ 4.0E+6 cells/mL이 되도록 넣고 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 본 실험에 사용된 바이러스는 2004~2010년 인플루엔자 백신주였으며, 1차 및 2차 바이러스 배양 조건은 상기의 표 1과 같다.
[49]
[50]
1차 바이러스 배양 시, 인플루엔자 바이러스 백신주를 1~1/1,000배 희석하여 일정량 감염하였으며 적절한 수득 시점을 판단하기 위하여 세포 생존도(cell viability) 및 HA titer를 DPI(Days post infection)별로 확인하였다. 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하고 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다(HA 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우는 본 실시예에서는 존재하지 않았다). 상기 선택된 1차 배양의 2DPI 배양액을 수득하고 3,000rpm, 10분 동안 원심 후, 1mL씩 소분하여 - 70℃ 이하에서 보관하였다. 이 중 한 바이알을 녹여서 1~1/10,000배 희석하고 바이러스 2차 계대 배양을 위하여 감염하였으며, 1차 계대 배양과 동일하게 DPI별로 세포 생존도와 HA titer를 측정하였다. 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하고 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다(HA 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우는 본 실시예에서는 존재하지 않았다). 표 3에서 2차 배양의 2DPI 배양액을 최종적으로 선택 및 수득하고 3,000rpm, 10분 동안 원심 후, 1mL씩 소분하여 - 70℃ 이하에서 보관하며, 이를 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡으로 설정하였다.
[51]
[표3] <2004~2010년 인플루엔자 백신주 별 HA titer 및 세포 생존도>
인플루엔자 백신주 배양 회수 감염 시 희석배수 / 감염 용량 1DPI 2DPI
세포 생존도 (%) HA titer(HAU/50μL) 세포 생존도 (%) HA titer(HAU/50μL)
IVR-116 (A/New Caledonia/20/99) 1차 배양 1000 / 20μL 100 0 71 1024
2차 배양 10000 / 20μL 99 32 80 1024
IVR-145 (A/Solomon Islands/3/2006) 1차 배양 10 / 20μL 100 256 73 512
2차 배양 10000 / 20μL 96 0 75 512
IVR-148 (A/Brisbane/59/2007) 1차 배양 1000 / 20μL 100 512 83 2048
2차 배양 10000 / 20μL 99 256 84 1024
NYMC X-147 (A/Wyoming/03/2003) 1차 배양 1000 / 20μL 100 0 83 256
2차 배양 10000 / 20μL 100 0 91 256
NYMC X-161B (A/Wisconsin/67/2005) 1차 배양 1000 / 20μL 100 0 94 2048
2차 배양 10000 / 20μL 100 16 85 2048
NYMC X-175C (A/Uruguay/716/2007) 1차 배양 1000 / 20μL 99 0 93 1024
2차 배양 10 / 20μL 99 512 89 1024
B/Florida/4/2006 1차 배양 1 / 20μL 98 2048 7 4096
2차 배양 1000 / 20μL 95 0 77 1024

[52]
상기 표 3의 1차 배양 및 2차 배양의 2DPI에 수득된 상층액으로 감염력 확인을 위하여 plaque assay를 수행하였으며 결과는 표 4와 같다. 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주(MDCK Sky3851)에서 인플루엔자 백신주를 연달아 2차 계대배양함으로써 인플루엔자 백신주 보다 plaque titer가 약 10~1,000배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[53]
[표4] <인플루엔자 백신주의 배양 회수에 따른 Plaque titer>
Subtype Season Candidate influenza vaccine virus Plaque titer (pfu/mL)
인플루엔자 백신주 1차 배양액 2차 배양액
A/H1N1 2006-2007 IVR-116 (A/New Caledonia/20/99) 1.84E+7 1.60E+9 3.04E+9
2007-2008 IVR-145 (A/Solomon Islands/3/2006) 1.74E+7 4.64E+8 2.36E+9
2009-2010 IVR-148 (A/Brisbane/59/2007) 1.38E+8 1.82E+9 1.14E+9
A/H3N2 2004-2005 NYMC X-147 (A/Wyoming/03/2003) 1.74E+5 3.74E+8 2.44E+8
2007-2008 NYMC X-161B (A/Wisconsin/67/2005) 2.82E+6 2.06E+9 2.08E+9
2009-2010 NYMC X-175C (A/Uruguay/716/2007) 1.54E+7 5.86E+8 6.70E+8
B 2008-2009 B/Florida/4/2006 7.40E+6 8.20E+8 3.48E+9

[54]
< 실시예 3> 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡 제조 (규모 3L spinner flask)
[55]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주(MDCK Sky3851)를 교반속도는 80~100rpm이고 배양 온도 34℃이고 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 여러 차례 계대 배양을 통하여 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우, 배지 교환 후 1차 바이러스 배양은 4개의 125mL spinner flask, 2차 바이러스 배양은 4개의 3L spinner flask에 세포 농도가 3.0E+6 ~ 4.0E+6 cells/mL이 되도록 넣고 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 본 실험에 사용된 바이러스는 2013~2017년 인플루엔자 백신주였으며, 1차 및 2차 바이러스 배양 조건은 표 5와 같다.
[56]
[표5] <1차 및 2차 바이러스 배양 조건>
배양 조건 1차 바이러스 배양 시 설정 값 2차 바이러스 배양 시 설정 값
감염 시 세포 농도 3.0E+6 ~ 4.0E+6 cells/mL 3.0E+6 ~ 4.0E+6 cells/mL
배양 규모 125mL spinner flask 3L spinner flask
배양 기간 2~3일 2~3일
Spinner flask 교반 수 80rpm 100rpm
온도 34℃ 34℃
농도 5% 5%
트립신 농도 5μg/mL 5μg/mL

[57]
실시예 2와 동일하게 진행하여 바이러스 2차 배양의 1DPI 및 2DPI 배양액을 수득하였으며, 3,000rpm, 10분 동안 원심 후, 1mL씩 소분하여 - 70℃ 이하에서 보관하며, 이를 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡으로 설정하였다. 각 인플루엔자 백신주의 1차 및 2차 계대 배양 시 DPI(Days post infection)별 세포 생존도와 HA titer의 결과를 표 6에 나타내었다.
[58]
[표6] <2013~2017년 인플루엔자 백신주 별 HA titer 및 세포 생존도>
인플루엔자 백신주 배양 회수 감염 시 희석배수 / 감염 용량 1DPI 2DPI
세포 생존도 (%) HA titer(HAU/50μL) 세포 생존도 (%) HA titer(HAU/50μL)
NIB-74xp(A/Christchurch/16/2010) 1차배양 10 / 20μL 100 1024 - -
2차 배양 100 / 333μL 99 2048 - -
NYMC X-223A(A/Texas/50/2012) 1차배양 1 / 20μL 99 1024 - -
2차 배양 10 / 333μL 99 2048 - -
NYMC X-247(A/Switzerland/9715293/2013) 1차배양 1 / 20μL 94 1024 - -
2차 배양 10 / 333μL 97 1024 - -
NYMC X-263(A/Hong Kong/4801/2014) 1차배양 100 / 20μL 100 0 89 1024
2차 배양 100 / 333μL 100 512 95 1024
NIB-93(A/Hong Kong/7127/2014) 1차배양 1,000 / 20μL 100 0 85 512
2차 배양 1,000 / 333μL 100 0 89 512
B/Massachusetts/2/2012 1차배양 10 / 20μL 99 0 95 2048
2차 배양 100 / 333μL 100 0 85 4096
NYMC BX-35(B/Brisbane/60/2008) 1차배양 1 / 20μL 99 0 41 1024
2차 배양 10 / 333μL 98 0 88 2048
B/Phuket/3073/2013 1차배양 100 / 20μL 100 0 97 2048
2차 배양 1,000 / 333μL 100 0 75 4096

[59]
상기 표 6에서 열거한 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력 확인을 위하여, 최종 배양액에 대해 plaque assay를 수행하였으며 결과는 아래 표 7과 같다. 실시예 2의 표 4 결과와 유사하게 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주(MDCK Sky3851)에서 연달아 2회 계대 배양된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 plaque titer는 대부분 1.00E+8 pfu/mL 이상임을 확인할 수 있었다.
[60]
[표7] <2013~2017년 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 Plaque titer>
Subtype Season Candidate influenza vaccine virus Plaque titer (pfu/mL)
A/H1N1 2013-2017 NIB-74xp(A/Christchurch/16/2010) 1.01E0+9
A/H3N2 2013-2015 NYMC X-223A(A/Texas/50/2012) 3.31E0+8
2015-2016 NYMC X-247(A/Switzerland/9715293/2013) 1.70E+7
2016-2017 NYMC X-263(A/Hong Kong/4801/2014) 1.20E+9
NIB-93(A/Hong Kong/7127/2014) 3.30E+8
B 2013-2015 B/Massachusetts/2/2012 1.37E+9
NYMC BX-35(B/Brisbane/60/2008) 2.70E+8
2015-2017 B/Phuket/3073/2013 2.60E+9

[61]
< 실시예 4> 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 sequence 확인
[62]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주에서 인플루엔자 백신주를 3회 계대배양하는 동안 주요 표면 항원인 HA(Hemagglutinin) 및 NA(neuraminidase)의 항원성 변화가 일어나지 않았는지 확인하기 위하여, 염기서열의 변화 유무를 확인하였다. 백신주를 실시예2에서 기술한 방법과 동일하게 2회 계대 배양하고 1회 추가 계대배양하여 총 3회 배양을 실시한 후 바이러스로부터 PureLink Viral RNA/ DNA Kit(Invitrogen)를 이용하여 RNA를 추출한 후 SUPERSCRIPTIII ONE-STEP RT-PCR SYSTEM(Invitrogen)과 각 strain 별 바이러스의 HA 및 NA gene에 특이적인 primer를 이용한 PCR을 통해 HA 및 NA gene만 증폭시켰다. 이어서 QIAquick PCR Purification Kit로 PCR 산물에서 불순물을 제거하고 DNA sequence를 분석하였다. DNA sequence 분석은 ABI PRISM 3130x/ Genetic Analyser로 진행하였고 sequence data의 assembly는 DNA STAR, Lasergene 8.1 program중, SeqMan Pro와 MegAlign을 사용하여 진행하였다.
[63]
[표8] <염기 서열 분석 시 사용한 reference virus strain>
Subtype WVSS 제조용 virus strain Reference virus strain
A/H1N1 NYMC X-181A (A/California/07/2009) NYMC X-181A (A/California/07/2009)
A/H3N2 NYMC X-187 (A/Victoria/210/2009) NYMC X-187 (A/Victoria/210/2009)
B/Victoria NYMC BX-35 (B/Brisbane/60/2008) NYMC BX-35 (B/Brisbane/60/2008)

[64]
상기 분석 결과로부터, A/H1N1, A/H3N2, B subtype의 모든 인플루엔자 백신주는 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 MDCK 세포주에서 3회 계대 배양하여도 주요 표면 항원인 HA 및 NA gene의 염기 서열에 변화가 야기되지 않았으며, 따라서 항원성이 변화 없이 유지됨을 확인할 수 있었다.
[65]

청구범위

[청구항 1]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 방법으로, 상기 계대에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA(Heamagglutination assay) 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하여 이후의 계대에 사용하는 것을 포함하는, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 2]
제1항에 있어서, 상기 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주는 MDCK 세포주인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 3]
제2항에 있어서, 상기 MDCK 세포주가, MDCK B-702, MDCK KCLRF-BP-00297, MDCK Sky1023(DSM ACC3112), MDCK Sky10234(DSM ACC3114), 또는 MDCK Sky3851(DSM ACC3113)인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 4]
제1항에 있어서, 상기 배양 조건은 32℃ 내지 38℃의 온도 범위, 10 rpm 내지 150 rpm의 교반 속도, 및 1일 내지 3일 동안 배양하는 것인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 5]
제1항에 있어서, 상기 선택된 배양액을 이후 연속해서 2회 이상 계대 하거나 또는 -50℃ 내지 -80℃의 온도 범위에서 냉동 보관 후 2회 이상 계대하는 것을 포함하는, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 6]
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 선택된 배양액의 세포 생존도는 50% 이상인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 7]
제6항에 있어서, 상기 선택된 배양액의 HA(Heamagglutination assay) 역가는 0, 또는 약 100 이상인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 8]
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 여러 감염 희석 배수가 1/1배 내지 1/10,000배인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 제조 방법.
[청구항 9]
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 대량 생산하고, 상기 대량 생산된 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 약독화 또는 불활성화시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 예방 백신을 제조하는 방법.
[청구항 10]
제9항에 있어서, 상기 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡이 계대 전 인플루엔자 백신용 바이러스에 비해 감염력이 증가된 것인, 인플루엔자 예방 백신을 제조하는 방법.
[청구항 11]
무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주를 인플루엔자 백신용 바이러스로 감염시켜 배양하고, 이로써 얻어진 바이러스 배양액을 동일 세포주에 추가 계대함으로써 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡을 제조하는 것을 포함하며, 상기 계대에 있어서 바이러스 감염 시 사용한 여러 감염 희석 배수의 배양액들 중 세포 생존도(cell viability)가 가장 높은 감염 희석 배수의 배양액을 선택하되, HA 역가(단, O인 경우 제외)가 4배 이상 차이 나는 경우에는 HA 역가가 가장 높은 감염 희석 배수를 선택하여 이후 계대에 사용하는 것을 포함하는 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력을 증가시키는 방법.
[청구항 12]
제11항에 있어서, 상기 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 세포주는 MDCK 세포주인, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡의 감염력을 증가시키는 방법.
[청구항 13]
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 감염력이 계대 전 인플루엔자 백신용 바이러스에 비해 10배 이상 증가된, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡.
[청구항 14]
제13항에 있어서, 상기 감염력은 plaque titer로 측정된, 인플루엔자 백신 제조용 바이러스 씨드 스톡.